２００６年第４ｌ卷第３期
生物学通报
１９
植物次生物的代谢途径
季志平
苏印泉
张存莉
陕西杨陵
７１２１００）
（西北农林科技大学林学院
摘要系统地介绍了关于植物次生物代谢途径方面的研究成果．归纳了植物次生物的３个主要代次生代谢物
射途径：酚类代谢途径、萜类代谢途径、生物碱代谢途径，并对其代谢机理进行了探讨。
关键词
代谢途径
机理
ｃｈａｎｎｅｌ）的形成存在。不同代谢频道分布在植物不同的器官、组织、细胞或细胞内不同的细胞器即分隔（ｃｏｍ．ｐａｒｔｒｎｅｎｔ）内，不同代谢频道ＱＴＬ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ｔｒａｉｔ
植物次生代谢产物是植物体利用某些初生代谢产物，在一系列酶的催化作用下，形成的一些特殊化
学物质。这些化学物质是细胞生命活动或植物正常生
长发育非必需的小分子有机化合物．其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。次
ｌｏｃｉ）
可能分布在不同的染色体上．次生代谢物生物合成“代谢频道”的存在，有效地隔绝了次生代谢物合成过程中间产物在细胞内扩散，有利于底物与酶的有效结合和酶
生代谢产物是植物对环境适应的结果。次生代谢物为
人类提供了丰富的药物、香料和工业原料．对人类的生产和生活具有重要的作用。
植物次生代谢物种类繁多，结构迥异，一般分为酚类、萜类、含氮有机物三大类，每一类已知化合物都有数千种甚至数万种以上，如黄酮类、酚类、香豆素、木脂素、生物碱、萜类、甾类、皂苷和多炔类等。这些次
促反应的顺利进行，减少次生代谢途径中不同支路之间
争夺底物的现象及有毒中间产物对细胞的伤害，并使细胞内多种类型次生代谢物的合成途径得以同时存在。
苯丙烷中央代谢途径、类黄酮和异黄酮合成支路均有代谢频道存在。例如，拟南芥细胞中的查尔酮合成酶（ＣＨＳ）、查尔酮异构酶（ＣＨＩ）、黄烷酮一３一氢氧化酮酶（Ｆ３Ｈ）和二氢黄酮醇还原酶（ＤＦＲ）酶之间相互联系，在这些多酶复合体中，Ｆ３Ｈ、肉桂酸一４一羟基化酶（Ｃ４Ｈ）、阿魏酰一５一羟基化酶等细胞色素Ｐ４５０酶多充
生代谢产物在植物体内主要通过苯丙烷代谢途径、异戊二烯代谢途径、生物碱合成途径形成。莽草酸途径主要能提供合成一些次生代谢物的前体。
１
酚类合成途径
酚类主要包括黄酮类、简单酚类和醌类等。黄酮
当细胞膜“锚”的作用，将相关的酶组装固定在内质网
膜上这些酶组成代谢频道。苯丙氨酸裂解酶（ＰＡＬ）肉桂酸一４一羟基化酶（Ｃ４Ｈ）、４一香豆酰一ＣｏＡ一连接酶（４ＣＬ）
类化合物系色原烷（ｃｈｒｏｍａｎｅ）或色原酮（ｃｈｍｍａｎｅ）的２一或３一苯基衍生物，泛指由两个芳香环（Ａ和Ｂ）通过
是苯丙烷类代谢途径中的关键酶．也是合成途径中的
限速酶，它们在植物苯丙烷次生代谢物合成途径中位于代谢支路的分叉口或位于次生代谢物合成途径的
中央三碳链相互连接而成一系列化合物．可以分为１４
种主要类型．酚类化合物主要是通过苯丙基类生物合成途径合成的（图１）。
植物次生代谢物的合成途径通常是以不同类别的次生代谢物合成途径为单位即代谢频道（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
总之，硒的生物活性及其与疾病相关性的研究正
下游，负责合成酚类次生代谢物一般合成前体。查尔酮合成酶（ＣＨＳ）是将苯丙烷类代谢途径引向黄酮类合成
的第１个酶，该酶基因的表达也会受到病原菌的诱导。
６
ｓｔａｐｌｅｔｏｎ
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２０
生物学通报
２００６年第４１卷第３期
ｌ草莽酸途径卜—一苯丙氨酸Ｈ芥子油苷ｌ
一
磊习
合成途径并不是倍半萜和二萜等高级萜类合成途径的分支．而是具有独特的酶促反应机制的单独合成途径。各种萜类次生代谢物的合成在细胞内具有明显的分隔，其中倍半萜主要在细胞质内合成，而二萜和单萜则在质体内合成。３含氮化合物合成途径
大多数含氮化合物是从普通氨基酸合成的，主要有生物碱、胺类、生氰苷、芥子油苷和非蛋白氨基酸等。
植物生物碱中萜类吲哚生物碱、苄基异喹啉生物碱、茛菪碱和烟碱和嘌呤生物碱等均有其特定的生物合成途径（图３）。
ｏ—————１————一Ｌ—————————Ｊ
０苯丙氨酸裂解酶（ＰＡＬ）
ｌ肉桂酸
千
晶《筹三薹翟与蛳捌脯㈣一黄烷酮一７一。一甲基ｒ一１］—］韩酬ｍＭ’爿黄酮合渊ＩＦｓ）圆
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ＳａｋｕｒａＩｌｅｌｉｎ｜．｝———————十黄烷酮Ｉ
ｌ异黄酮卜—————————叫异黄烷酮Ｊ
ｌ异黄酮合成酶（ＩＦｓ）
生一
ｌ竺。兰竺Ｉ
ｆｖｅｓｆｉｌｏｎｅ合成酶（ｖＲ）
异黄酮二甲烯丙基转移酶（ＩＤＭ攀ｂｉ—髻
图１
异黄酮二甲烯丙基转移酶（ＩＤＭＴ）
｜异戊烯基化异黄（烷）酮ｌ
酚类主要代谢途径
鸟氨酸卜｝——一１崩脱羧酶（ｏＤｃ
山托品酮还原酶（ＴＲ）
茛菪碱ｌ
莽草酸途径卜———————剖吲哚一３一甘油磷酸
ｃａＩＩｌｄｅｘｉｎ｜．｝————一吲哚ｌ
型型油磷酸酶（Ｂｘｌ）土上
／催化ＤＩＭＢｏ
单氧化酶（Ｂｘ２—５）
ｌ腐胺一Ｎ一甲基转移酶（ＰＭＴ）Ｉ色氨酸
２萜类合成途径
凡由甲羟戊二酸衍生、且分子式符合（Ｃ。Ｈ８）。通式的衍生物通称为萜类化合物或异戊二烯类化合物。在异戊二烯代谢途径中，可分别合成包括激动素、赤霉素、类萝卜素、甾醇和叶绿素等在内的单萜、倍半萜、二萜和多萜等次生代谢物。由乙酰一ＣｏＡ反应而成的焦磷酸异戊烯酯（ＩＰＰ）可进一步合成焦磷酸香叶酯（ＧＰＰ）、焦磷酸金合欢酯（ＦＰＰ）和焦磷酸香叶基香叶酯（ＧＧＰＰ），后者分别在单萜化酶、倍半萜环化酶和二萜环化酶的催化作用下被分别合成单萜、倍半萜和二萜次生代谢物：由ＦＰＰ也可进一步合成鲨烯、甾醇及多萜次生代谢物。
植物ＩＰＰ的合成有两条不同的途径。一条是由乙酰一ＣｏＡ经过甲羟戊酸合成。该途径合成的ＩＰＰ主要用于合成甾醇、半萜和三萜次生代谢物；另一条ＩＰＰ合成途径是ｌ一脱氧一木酮糖一５一磷酸合成支路，该途径合成的ＩＰＰ主要用于合成质体中的二萜、单萜、类胡萝卜素、异戊二烯等次生代谢物（图２）。
乙酰一ｃｏＡＩ‘
ｌ葡萄糖
ｌ氨酸脱羧
＜，嫠！搿啡ｏ｝引∞们．Ｉ．
酪氨酸
ｌ酪氮酸／多巴脱羧酶（ＴＹＤＣ）ｎ０Ｉｅｏｄａｕｄｎｅ一６一甲氧基转移酶（６０ＭＴ）
合成酶（ＳＴＲ）一Ｂ一葡萄糖苷酶１６一羟基化酶
０（ｓ）一Ｎ一甲基乌药碱３’一羟基化酶（ｃＹＰ８０ＢＩ）
（Ｓ）一网状番荔枝碱｛
０小檗碱桥酶（ＢＢＥ）
（Ｓ）一金黄紫堇碱
苯骈菲啶类生物碱
图３生物碱主要次生代谢逯径
在植物细胞中。生物碱长春多灵生物合成过程分别在细胞质、液泡、液泡膜、内质网膜、类囊体膜等５个以上细胞分隔区内完成：苯基异喹啉生物碱的合成途径中除了ＢＢＥ外，其他主要酶均依赖于细胞色素Ｐ４５０、位于内质网膜或内质网延伸膜分隔内。生物碱合成过程中的吲哚一３一甘油磷酸酶（ＢＸｌ）、ＳＴＤ、酪氨酸／多巴脱羧酶（ＴＹＤＣ）、小檗碱桥酶（ＢＢＥ）等可能是限速酶。
主要参考文献
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木酮糖一５一磷酸（ＤＸＰＳ）
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甲羟戊酸
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图２萜类主要代谢途径
万方数据 植物异戊二烯代谢途径中也存在代谢频道。单萜
（ＢＦ）
植物次生物的代谢途径
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
季志平， 苏印泉， 张存莉， Ji Zhiping， Su Yinquan， Zhang Cunli西北农林科技大学林学院,陕西,杨陵,712100生物学通报
BULLETIN OF BIOLOGY2006，41(3)1次
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相似文献(10条)
1.学位论文 马君兰 外源茉莉酸甲酯对大豆异黄酮代谢途径的影响 2007
本文探讨了外源茉莉酸甲酯对大豆异黄酮代谢途径的影响。本研究利用外源茉莉酸甲酯(MeJA)为诱导物，对大田栽培的大豆进行叶面喷施，旨在研究其对大豆异黄酮代谢途径的影响；大豆生殖生长过程中初生代谢物、次生代谢物以及相关酶类活性的动态变化和三者的相互关系，构建大豆异黄酮类次生代谢物的研究平台。结果表明：外源MeJA对叶片的苯丙氨酸解氨酶活力、籽粒的PAL活力、籽粒PAL mRNA含量、可溶性蛋白含量、色氨酸含量、黄豆苷元含量、染料木素含量以及总异黄酮含量均有促进作用，其诱导效应能够发生在转录水平。在0～450μmol/L的喷施浓度范围内，上述物质的含量随着MeJA浓度的增加而增加，600μmol/L的处理与450μmol/L，的处理相比，没有明显的提高，且大多数表现出含量略微降低。在0～600μmol/L的喷施浓度范围内，45μmol/L是最适浓度。
2.学位论文 郝佳 大豆异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建与表达 2007
大豆异黄酮(Soybean Isoflavones，SiF)具有多重保健与药理作用，是近年来各相关领域的研究热点。从大豆中分离提取异黄酮一直是大豆异黄酮的主要获得途径。作为植物天然次生代谢物，大豆异黄酮在大豆中含量并不高，且植物生长周期较长，因此只靠从大豆中提取异黄酮比较有限。随着大豆基因组研究和现代生物技术的不断进展，使利用基因工程手段构建工程菌发酵生产大豆异黄酮成为可能，为寻找大豆异黄酮新的来源开拓了新的方法和思路，具有重要意义。
本文以经过紫外线诱导的大豆叶片为材料，利用SMART(Switching Mechanism At 5′end of theRNA Tanscript)思想和方法构建大豆叶片全长cDNA文库，并直接以一级库液稀释液为模板进行PCR，快速克隆得到异黄酮代谢途径相关的6个全长基因，测序结果表明各基因序列都是正确的。
将基因与pET质粒连接构建了各个单基因表达载体，在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，除c4h基因外都得到了特异性表达蛋白。对CHS进行质谱定性分析表明，在p
在各个单基因表达载体的基础上，构建了多基因表达载体，使除c4h外的5个基因由两个载体携带导入到E.coli BL21(DE3)中，各基因前都带有相应的T7启动子和核糖体结合位点(Ribosome Bind Site,RBS)。实验结果表明，在一定条件下携带多基因的双质粒稳定共存的时间较长，足够进行代谢及发酵研究。重组菌株经IPTG诱导，以酪氨酸为底物进行发酵研究，发酵产物经过HPLC测定，结果表明和空白对照相比有新的代谢产物生成，初步断定为异黄酮类化合物：利用二级质谱分析重组菌株代谢产物，证明其中有大豆异黄酮的代谢产物雌马酚。进一步鉴定实验还在进行中。
本文采用基因工程手段，将完整的大豆异黄酮代谢途径在大肠杆菌进行了构建，并进行了发酵和表达研究，得到了可以代谢生成异黄酮类化合物的重组菌株，这为寻找大豆异黄酮新来源的研究奠定了基础。
3.期刊论文 兰文智.余龙江.蔡永君.李默怡 类异戊二烯非甲羟戊酸代谢途径的分子生物学研究进展 -西北植物学报2001,21(5)
近期发现的类异戊二烯非甲羟戊酸代谢途径是类异戊二烯化合物生物合成的另一途径.文章对该代谢途径的分子生物学研究进展进行了综述.重点介绍非甲羟戊酸代谢途径的发现和5-磷酸脱氧木糖合成酶、5-磷酸脱氧木糖还原异构酶、异戊二烯焦磷酸合成酶的分子克隆的最新进展以及非甲羟戊酸代谢途径的发现在农业和医药等领域的应用.
4.学位论文 董新纯 UV胁迫下苦荞类黄酮代谢及其防御机制研究 2006
类黄酮(flavonoids)是植物体内主要的次生代谢物类型之一。紫外(UV)胁迫通常导致植物体内类黄酮代谢上调，类黄酮在植物体内可起紫外“吸收屏障(UV-filter)”的作用。本文以苦荞(FagopyrumtataricumL.)新品种9279-21为材料，研究了苦荞类黄酮代谢在UV胁迫适应中的一些作用机制。 1.苦荞类黄酮次生代谢对UV胁迫的响应利用HPLC法对苦荞类黄酮成分进行了分析，苦荞幼苗至少含有葛根素(puerarin)、柚皮苷(naringenin)、槲皮苷(quercetin)、芸香苷(rutin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)等类黄酮成分，其中含量最大的三种类黄酮成分依次为槲皮苷、芸香苷(芦丁)、柚皮苷。UV胁迫处理使苦荞类黄酮含量明显提高，幼苗株高降低、叶片直径减小、干重减少，外施类黄酮物质rutin可一定程度抑制苦荞幼苗生长。
UV胁迫上调莽草酸—苯丙烷类代谢途径的关键酶PAL(苯丙氨酸解氨酶)和莽草酸途径的关键酶DAHPS(3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶)的活性，使莽草酸—苯丙烷类代谢途径加速而提高类黄酮等次生代谢产物含量。而PAL、DAHPS活性的上调又调整G6PDH活性，更利于莽草酸—苯丙烷类代谢途径的进行而促进类黄酮的形成，这可能是UV胁迫下植物体短期内类黄酮等次生代谢物大幅增加的重要原因。
2.UV胁迫下呼吸、碳氮代谢、激素代谢的调整与类黄酮代谢的关系呼吸抑制剂实验证明，UV胁迫下PPP途径增强，UV胁迫通过上调PPP途径的关键酶G6PDH(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)的活性而提高PPP途径的比重，PPP途径产生的赤藓糖-4-磷酸(E4P)经关键酶DAHPS转化成莽草酸，而进入莽草酸途径，利于类黄酮等次生代谢物的合成。苦荞体内碳代谢的其它相关酶(如转化酶、SS、SPS)、氮代谢相关酶(如NR、GS、GOGAT)等也作出了适应这种代谢变化的调
整。TCA途径中的关键酶NADH-苹果酸脱氢酶(NADH-MDH)活性在紫外胁迫下也有所提高，但提高幅度小于G6PDH。
UV胁迫下，伴随着类黄酮含量的提高，苦荞体内促进生长的IAA下降，IAA的降低与IAA氧化酶活性的提高有关。UV胁迫下苦荞体内早期ABA的水平明显上升，脂氧合酶(LOX)活性抑制剂PG和外源ABA处理结果表明，ABA水平的提高与LOX活性表达高度联系，即LOX活性提高能促进ABA水平上升，而ABA水平的上升反过来对LOX活性有一定抑制作用。外源类黄酮rutin处理诱导ABA水平的上升，外源ABA处理也一定程度促进苦荞体内类黄酮的合成，表明类黄酮与ABA之间在UV胁迫下有一定联系。
3.草甘膦伤害与类黄酮代谢的关系草甘膦(glyphosate)抑制苦荞芳香族氨基酸Phe、Tyr、Trp的合成，而外施芳香族氨基酸可以缓解草甘膦的伤害效应，但效果一般，表明芳香族氨基酸的缺乏不是草甘膦伤害的唯一原因。草甘膦明显降低了苦荞类黄酮含量，外施类黄酮物质rutin能减轻草甘膦的伤害效应，表明阻断莽草酸途径而抑制类黄酮等次生代谢物的形成可能是草甘膦伤害的重要原因。
4.类黄酮在UV增强导致的氧化胁迫中的保护机制UV胁迫导致苦荞幼苗活性氧(AOS)大量产生、膜脂发生过氧化作用、MDA和电解质渗漏增加而导致氧化伤害。UV胁迫使LOX活性明显提高，引入LOX活性抑制剂没食子酸丙酯(PG)后，一定程度减少H2O2产生。
用草甘膦阻断莽草酸途径明显提高LOX活性，外施类黄酮物质rutin则抑制LOX活性和MDA形成；而用LOX活性抑制剂没食子酸丙酯(PG)处理则对内源类黄酮形成有一定抑制作用。表明紫外胁迫诱导LOX活性表达可能对次生代谢类黄酮形成有诱导作用，而类黄酮形成后又抑制LOX活性。
低辐照度UV胁迫下AOS增加时伴随着抗氧化酶活性的提高。草甘膦阻断莽草酸途径后，用类黄酮rutin处理提高抗氧化酶SOD、APX活性，并维持较高的AsA、GSH水平。在胁迫中后期主要通过APX、AsA-GR清除H2O2等活性氧，有效减轻和避免过氧化作用对膜和生物大分子的破坏。
5.类黄酮保护光合机构UV胁迫下，苦荞叶绿体色素降解加剧，用草甘膦阻断莽草酸途径导致叶绿体色素含量更大幅度下降，外源类黄酮rutin缓解叶绿体色素的下降，类黄酮缓解UV胁迫和草甘膦阻断莽草酸途径后AQY、CE、Pn的下降，表明类黄酮利于维持相对较高的光合作用。
低辐照度UV胁迫提高苦荞类胡萝卜素含量，使叶黄素循环库(V+A+Z)和(A+Z)/(V+A+Z)提高，从而加强叶黄素循环而耗散过剩光能；高辐照度UV胁迫使类胡萝卜素含量、(V+A+Z)和(A+Z)/(V+A+Z)降低，抑制叶黄素循环而加重强光抑制。类黄酮合成与类胡萝卜素合成存在一定关联性，类黄酮抑制过氧化从而保护膜组分类胡萝卜素及叶黄素循环库，这可能是UV胁迫下类黄酮减轻过剩光能对光合机构损伤的重要方式。
5.学位论文 朱再标 柴胡根系次生代谢物积累对干旱的响应与抗脂质过氧化保护机制 2009
中药材的质量是中药实现现代化、产业化、国际化的关键。但由于药用植物的生长和次生代谢过程受自然环境、栽培管理措施等多种因素的影响，中药材中次生产物含量“稳定、可控”成为一个难点。探讨药用植物次生代谢产物积累变化的内在规律及其影响因子，探索符合药用植物次生代谢物积累内在规律的代谢调控机制，将促使中药材的质量控制建立在科学的理论之上，对于提高活性物质含量、保证药材质量、稳定临床疗效等具有重要意义。
故需研究自然环境、栽培管理措施等因素与药用植物次生代谢产物种类和含量的相关性，确定影响次生产物积累的主要生态因子，并进一步揭示其生物合成机制。虽然阐明次生代谢途径是调控药用植物次生代谢产物合成积累的关键，然而由于其复杂性，一时难以达到令人满意的效果。但是，植物次生代谢产物能作为治疗人类疾病的药效成分，是人类利用了其某些理化特性；同为需氧生物，植物和人类有时面临着相同的问题，同时又有类似的解决方法。如果从某些植物次生产物在药理试验中的作用入手，联系其在植物体内的可能生理生化作用来探讨调控其在植物体内含量的途径，可能会为次生代谢产物的代谢调控提供新思路和方法。
本项工作通过野外调查采样、大田和控制栽培及室内分析等手段，以植物次生代谢理论为基础，结合药理学、自由基生物学和自由基医学以及植物逆境生理生态学等学科的研究基础，研究了柴胡的主要药效成分(柴胡皂苷和挥发油)对环境条件的响应规律及其次生代谢的可能调控机理，取得了如下主要结论：
1.通过建立的柴胡HPLC皂苷类成分指纹图谱，检出了18个特征峰作为定性鉴别的指标峰，能简便、快捷的鉴别不同种柴胡药材；发现11个批次柴胡的柴胡皂苷a(SSa)、柴胡皂苷d(SSd)、柴胡总皂苷含量及其指纹图谱中18个共有峰总峰面积相互之间存在极显著正相关关系，SSa或SSd均可作为柴胡中柴胡皂苷类成分的质控指标成分，提出建立柴胡药材质量综合评价体系的思路。
2.通过施肥和环境因素分析，发现氮、钙和锰元素是影响SSa、SSd和柴胡总皂苷含量的主要矿质元素。施用氮磷肥对于促进SSa和SSd的积累具有重要作用，而且可在一定程度上减轻干旱胁迫对SSa和SSd总产量的不利影响。年平均气温、七月平均气温、无霜期和SSa、SSd、柴胡总皂苷含量之间存在显著或极显著的正相关关系，尤其较高的七月平均气温对柴胡皂苷积累具有重要促进作用。气温日较差是影响SSd和柴胡总皂苷含量和产量的主要气候因子，而平均风速是影响SSa含量和产量的主要气候因子，且均为负向作用。中度干旱显著提高柴胡根系柴胡皂苷含量。
3.柴胡根系具有较强的抵御水分亏缺的能力。SSa和SSd含量随干旱程度加重而上升，但在严重干旱条件下或复水后下降。而且从适宜水分条件到中度干旱条件，SSa和SSd含量的上升伴随着O2-含量和超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的增强。值得注意的是，体外抗氧化试验表明柴胡根系甲醇提取液的抑制脂质过氧化能力与SSa、SSd含量正相关，其中与SSd含量的相关系数达到显著水平。由以上结果可以推测柴胡根系具有较强的抗氧化保护机制以适应干旱逆境，而且干旱诱导的柴胡根系SSa和SSd积累可能是受到活性氧的刺激，由于其较强的抑制脂质过氧化能力而减轻干旱造成的氧化伤害。另外，通过不同浓度外源H2O2直接处理柴胡幼苗根系，发现其可诱导柴胡皂苷含量升高，同时也促进了脂质过氧化以及SOD、APX活性增强。而在PEG导致的渗透胁迫条件下，施加外源AsA能降低MDA和H2O2含量，在一定程度上抑制脂质过氧化，但同时显著降低SSa和SSd含量。表明氧化胁迫条件利于柴胡皂苷积累，控制柴胡根系细胞氧化还原程度可在一定程度上对柴胡皂苷含量进行调控。
4.柴胡根系的挥发性成分以醛类物质为主体，其相对含量之和占总挥发性物质的57.24％-91.30％。不同产地样品的挥发油组分和相对含量差异悬殊，证明挥发油组分和相对含量因环境变化较大。在干旱复水进程中，大部分共有组分在适宜水分条件下相对含量最高，随干旱进程而下降。在干旱条件下2-甲基丁醛、正戊醛、正已醛、正壬醛和2-戊基呋喃的相对含量较高。在干旱复水进程中诱导产生29种新挥发性成分，而且其中多种为具有抗虫抗菌活性的物质。在干旱复水进程中共有组分的相对含量变化与LOX活性、脂质过氧化程度没有显著相关性，但LOX对于干旱复水过程中新诱导产生的挥发性组分及其含量变化具有重要影响。
6.期刊论文 王莉.张艳霞.史玲玲.刘玉军.WANG Li.ZHANG Yan-xia.SHI Ling-ling.LIU Yu-jun 功能基因组学和代谢组学技术在植物次生代谢物合成及调控研究中的应用 -北京林业大学学报2007,29(5)
植物次生代谢是植物在长期进化过程中与环境相互作用的结果,由初生代谢派生.萜类、生物碱类、苯丙烷类为植物次生代谢物的主要类型,其代谢途径多以代谢频道形式存在,具有种属、生长发育期等特异性.该文从植物次生代谢物的分类、代谢途径及代谢调控基因工程等方面展开论述,介绍了次生代谢物的生物合成途径,以及利用基因工程等技术对植物次生代谢途径进行遗传改良等方面的研究进展,为全面认识植物代谢网络、合理定位次生代谢及其关键酶、促进野生植物资源可持续利用等提供理论依据.
7.学位论文 乞永艳 大豆子叶异黄酮类次生代谢物的诱导及其微粒体部分蛋白的初步研究 2005
本研究综合利用分析高效液相色谱、制备高效液相色谱、同位素标记、薄层色谱、四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF/MS/MS)、二维电泳等现代技术，将分析化学、制备化学、蛋白质分离纯化和氨基酸序列测定充分结合，研究了外源硝酸银和茉莉酸诱导处理中黄13号和“Cultivar1”(荷兰)大豆子叶后，Glyceollins及其前体glycinol的诱导累积规律及其与其它固有的大豆异黄酮之间的联系；同时，对大豆中的异戊二烯转移酶进行了活性测定；并对硝酸银诱导后大豆子叶微粒体蛋白进行了初步研究。主要结论如下：
1、中黄13号与“Cultivar1”对外来刺激产生应激反应的能力有所不同，与“Cultivar1”相比，中黄13号对外界刺激更为敏感。
2、硝酸银诱导处理后，Glyceollin异构体比例不随保温时间的延长而改变；大豆苷元和染料木素含量上升，其相应的糖苷含量下降。茉莉酸处理后，GlyceollinⅠ和glyceollinⅢ所占比例下降，glyceollinⅡ所占比例增加；同时，游离苷元含量下降，糖苷含量增加。这表明：虽然硝酸银和茉莉酸都能够诱导大豆子叶中glycinol和glyceollins的累积，但是，其作用机制有可能不同。0.01M硝酸银诱导glycinol和glyceollins累积的能力最强，其次依次为0.001M和0.1M硝酸银。10μM茉莉酸诱导glyceollins累积的能力最强，20μM～100μM的茉莉酸诱导glyceollins累积的能力相近，1mM高浓度的茉莉酸非但未能增强诱导glyceollins累积的能力，反而有可能在某种程度上抑制了glyceollins的累积。
3、在glycinol和glyceollins累积过程中，苯丙氨酸代谢途径中的相关化合物在发生物质转化的同时，还发生着空间上的转移。植物抗毒素
glyceollins(glycinol)的累积只发生在遭遇刺激的部位；同时，该部位中与之有关的其它异黄酮浓度也高于健康部位。另外，这些化合物还存在着从健康部位向遭遇刺激部位转移的倾向，且与遭遇刺激部位垂直相连的部位有可能比与之横向相连的部位更容易与受刺激部位发生异黄酮间的转运和交换。 4、利用制备高效液相色谱，从390g(鲜重)0.01M硝酸银诱导的大豆子叶中分离纯化出约110mg高纯度的glycinol(282μg/g鲜重)，为大豆中异戊二烯转移酶的研究提供了难得的底物，并提供了一种分离纯化glycinol的有效方法。
5、利用[3H]DMAPP和glycinol为底物进行大豆中异戊二烯转移酶活性测定。用同位素标记与薄层色谱相结合，检验并分离、制备反应产物，经Q-TOF/MS分析鉴定，反应产物为glyceollidins。文中对glyceolldins难以大量累积的问题进行了初步分析。大豆中异戊二烯转移酶活性的成功测定为该酶的进一步研究提供了可靠保证，同时也有利于其它与之相关的微粒体蛋白的研究。
6、对二维电泳技术用于硝酸银诱导后大豆子叶微粒体膜蛋白分离的条件进行了优化。结果表明：在重新水化溶液组成中，还原剂比去垢剂对膜蛋白溶解性的影响更大，还原剂三丁基膦比二硫苏糖醇效果好，去垢剂(3-(4-hepty)phenyl3-hydroxypropyl)(dimethylammoniopropanesulfonate)(C7BZO)对蛋白质的增溶作用强于amidosulfobetaine-14(ASB-14)和Ⅰ3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulphonate(CHAPS)。由硫脲、尿素、去垢剂C7BZO和还原剂三丁基膦构成的重新水化溶液(TUC7T2)较适合大豆子叶微粒体膜蛋白的溶解。本研究的最佳操作条件确定为：TUC7T2为重新水化溶液，加样量为80μg，等电聚焦totalVhr为20,000(适用于70×3×0.5mmIPG胶条)。 7、二维电泳结果表明：总体来看，对照样品中蛋白量总量多于诱导样品，大部分大豆子叶微粒体蛋白的等电点位于pH4～6。总共发现14个由硝酸银诱导而产生的点，其中，在pH3～6范围内发现4个，在pH5～8范围内有10个。在pH7～10范围内，未发现只存在于诱导样品而不存在于对照样品的蛋白质点。
8、四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF/MS/MS)测定和氨基酸序列分析表明：硝酸银处理可以诱导大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(SKTI)及其5kDa小亚基和诱导蛋白“SAM22_SOYBN”的产生。
本研究结果对于调控大豆中异戊二烯化黄酮类化合物的合成、深入了解大豆“代谢网”、探讨激发子的作用机理、研究微粒体诱导蛋白、实施大豆次生代谢物调控和性状的定向改变等工作具有重要的理论和实践指导意义，必将推动这些工作的顺利进行，从而有助于利用分子生物学和基因工程手段改善和提高大豆的有益性状，使大豆能够为人类提供更多的健康植物化合物(health-promotingphotochemical)，最终将在更大程度上有助于大豆各方面价值的大幅度提升。
8.期刊论文 王莉.史玲玲.张艳霞.刘玉军.WANG Li.SHI Ling-Ling.ZHANG Yan-Xia.LIU Yu-Jun 植物次生代谢物途径及其研究进展 -武汉植物学研究2007,25(5)
植物次生代谢是植物在长期进化过程中与环境相互作用的结果,由初生代谢派生.萜类、生物碱类、苯丙烷类为植物次生代谢物的主要类型,其代谢途径多以代谢频道形式存在,具有种属、生长发育期等特异性.从植物次生代谢物的分类、代谢途径及代谢调控基因工程等方面展开论述,重点介绍了次生代谢物的生物合成途径,以及利用基因工程等技术对植物次生代谢途径进行遗传改良等方面的研究进展,为全面认识植物代谢网络、合理定位次生代谢及其关键酶、促进野生植物资源可持续利用等提供理论依据.
9.学位论文 黄蓓蓓 遗传改造的酿酒酵母分析技术平台的建立及其在萜类生物合成途径上各代谢物分析中的应用 2009
萜类化合物广泛分布于植物及微生物初级代谢物和次生代谢物中，其种类繁多，不仅在植物的生命活动中扮演重要的作用，而且还被广泛的应用于工业、医药卫生等方面，如倍半萜中的青蒿素、双萜中的紫杉醇可分别作为抗疟、抗癌的有效药物。但是萜类在生物体内的产量很低，而且分离和纯化操作复杂。由于萜类结构复杂，化学合成需要的步骤烦琐，非常困难。由于酵母自身存在甲羟戊酸(Mevalonate，即MVA)途径，可自我合成萜类前体，为利用代谢工程改造细胞代谢途径为提高萜类产量提供了一个很好的操作平台，然而酵母中萜类前体库不足够提供高产，有必要调节其参与萜类前体生物合成的代谢途径以提高产量。
本研究中，我们选择酿酒酵母作为宿主细胞，以酿酒酵母中的萜类生物合成途径为主要研究对象，建立遗传改造的酿酒酵母的分析技术平台，将最先进的分析技术用于测量代谢物及其在一定条件下含量的变化，有助于阐释遗传干预对感兴趣的途径的影响，同时对微生物的应激反应进行整体性无偏的描述，以进一步理解通过这个途径的代谢流的控制分子机制，得到如下结果：
(1)首次将基因敲除的分子生物学方法，引入酿酒酵母的次生代谢途径萜类生物合成途径中，以调节其代谢，增加其萜类前体库供给。酿酒酵母中的萜类生物合成途径主要分成六异戊二烯基焦磷酸合成途径以及麦角甾醇生物合成途径两个部分。为了增强通往萜类前体的代谢流，构建敲除盒，将负责FPP转为角鲨烯，竞争FPP的erg9基因，位于萜类前体下游的coql基因分别敲除，减少旁路消耗。用
(2)PCR方法构建敲除盒LoxP-kanMX/URA3-loxP，分别敲除erg9基因和coql基因，剔除筛选标记ura3后，分别得到新菌型BY4743-△erg9和BY4743-△coql。在BY4743-△erg9基础上，再利用敲除盒LoxP-URA3-loxP，敲除coql，基因，经PCR验证，并剔除筛选标记ura3，得到新菌型BY4743-△ erg9-△coql。同时考察其基础时间生长曲线的变化，为下一步的基因．生理机能机制深入研究，提供基础。野生菌株生长最快，缺失株生长较慢，双缺失菌生长最慢，形成的菌落也较小。
(3)为了考察上述遗传改造对萜类前体积累的效果，测定酿酒酵母的萜类生物合成途径上重要的指标性成分GGPP(二萜成分的前体)，分析它的变化，表征其随erg9，coql基因缺失的关联性，为阐明酿酒酵母中萜类合成途径的调节分子机制提供现实依据。本研究首次建立LC-MS方法测定遗传改造后酿酒酵母中GGPP含量的变化。应用4.6 mm×25 cm SB-Aq C185-μm(Agilent Tech．，USA)色谱柱进行液相分离，流动相75％(10mM三丁胺水溶液用15mM醋酸调成pH4.95)：25％甲醇，质谱负离子模式扫描质荷比范围50-600，选择离子检测GGPP([M-H]-)，质荷比449.2。标准曲线线性范围0.1-50ng/ml。在这个范围内的，日内相对标准偏差＜10％，日间相对标准偏差＜14％，精密度范围96.5-105.4％。结果显示，遗传改造有效，BY4743-△erg9-A coql的积累量在72小时后增加非常显著。遗传改造后的菌株与野生型菌株比较，含量有显著差异(P＜0.01)；随时间的长短，含量显著增高。说明erg9与coql对GGPP的代谢显著影响。
(4)为了研究遗传改造对萜类生物合成途径代谢流的影响，建立GC-MS方法测定萜类生物合成途径上各代谢物及其在酿酒酵母中的应用。本研究首次建立一个精确灵敏的非放射性的方法，同时定量酿酒酵母中萜类合成途径上的GPP，FPP，GGPP，角鲨烯，麦角甾醇和羊毛甾醇，考察代谢流的变化。这个方法建立在GPP，FPP和GGPP去磷酸化成相应的烯萜醇，用GC-SIM-MS分析。本研究考察了三种转化方法：酸解法、碱解法、酶解法。酸解法和碱解法的转化率都低于15％，不能应用于此，酶解法在不同的缓冲体系中的转化率相差很大，50mM Bis-Trispropane/HCl，1mM MgCl2，pH7.0，转化率＜1％；0.1M2-amino-2-methylpropanol/NaOH1mM MgCl2，pH10.35，转化率＜1％；50 mM Tris-HCl，10 mMMgCl2，pn9.0，转化率＜1％；0.1 M
glycine/1 M NaCl/40％MeOH，pH10.4，转化率＜2％，1 M diethanolamine，0.5 mM MgCl2，pH9.8，转化率可＞88％，符合研究的需要。本研究综合比较全发酵液提取法、细胞液离子交换柱提取法、细胞液超声提取法三种提取方法，正己烷、石油醚、乙酸乙酯、氯仿：乙酸乙酯(1：10)四种提取溶剂，0.5min、1.5min、3min这样3个涡旋时间，比较其效率，确定最终的前处理方法为：细胞液超声提取法，正己烷提取，涡旋3min。应用TRACETR-5MS柱(30m×0.25mm×0.25μm)进行气相分离，单重四极杆质谱选择离子监测GOH，FOH，GGOH，角鲨烯，麦角甾醇和羊毛甾醇，以保留时间和碎片信息进行定性定量分析。结果显示，方法准确有效，标准曲线线性良好，日内和日间精密度良好，加样回收率准确度高。将此方法应用于酿酒酵母中，发现不同基因对于酿酒酵母中萜类合成途径上的各个代谢物的代谢过程的作用是不一样的，双缺失erg9和coql，使得GPP、FPP、GGPP大量积累，而角鲨烯、麦角甾醇、羊毛甾醇的含量可维持细胞正常生理功能。
(5)通过考察不同遗传改造的酿酒酵母基础时间生长曲线的变化，发现其生理活动发生了变化。为了考察遗传改造对细胞生理活动的影响，建立荧光分析和化学发光方法测定分子操作后，与细胞生理特性和基因功能相关代谢物及其含量的变化，有助于阐明萜类代谢途径的基因敲除后，对细胞功能的影响。利用罗丹明6G，测得BY4743-△ erg9-△ coql离子外排作用低于野生型和单缺失菌，并且酿酒酵母的外排作用是能量依赖型的。利用JC-1，测得erg9与coql对线粒体膜电位的影响巨大，两者的缺失打破线粒体膜电位分布的平衡，但24h后，不同遗传改造的酿酒酵母建立的新的膜电位平衡无明显差别。利用DCFA-DA，测得erg9与coql的缺失引发大量内源性活性氧的产生。利用荧光素酶的化学发光，测得BY4743-△erg9-△ coqlATP的含量低于野生型和单敲除菌。
当前的工作力求将代谢工程，化学分析，数据处理等多个领域结合，在细胞水平分析代谢物的变化以详细地认识基因一代谢产物、基因一代谢流之间关联的分子机制，分析生理状态的变化以认识基因功能。本研究涉及多种技术的联用。这些方法包括分子生物学技术，微生物代谢活性瞬时淬灭，化合物的酶法衍生化、相关胞内代谢产物的提取，色谱与质谱的偶联(GC-MS，LC-MS)，荧光与化学发光的应用以及统计学上的数据挖掘等等。多种技术的创新和联用必将提供大量的代谢途径信息，有助于反映有机体的生理活动，理解潜在的调节机制，对以酿酒酵母为平台生产多种重要价值的萜类化合物具有重要意义。
10.期刊论文 李永丽.周洲.李科友 细胞培养生产药用次生代谢物研究进展 -安徽农业科学2006,34(2)
综述了近年来细胞培养生产药用次生代谢物的研究进展.许多药物来源于植物次生代谢途径,运用细胞培养生产代谢物是一种很有效的方法,提高细胞培养中次生代谢物产量一直是人们研究的热点.近年来筛选细胞系,优化培养条件,固相化培养,以及添加诱导子,毛状根培养等技术的运用都在提高产量上
都有很多研究,尤其是随着对植物代谢途径的了解和基因工程手段的成熟,应用基因工程技术改造代谢途径,从而提高次生物质的产率成为研究主流.
引证文献(1条)
1.何丁 种皮中类黄酮含量的早期快速检测[期刊论文]-生物学通报 2008(4)
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_swxtb200603008.aspx
授权使用：电子科技大学(cddzkjdx)，授权号：54f88c27-fbff-4cbe-938b-9e5c00c8e713
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２００６年第４ｌ卷第３期
生物学通报
１９
植物次生物的代谢途径
季志平
苏印泉
张存莉
陕西杨陵
７１２１００）
（西北农林科技大学林学院
摘要系统地介绍了关于植物次生物代谢途径方面的研究成果．归纳了植物次生物的３个主要代次生代谢物
射途径：酚类代谢途径、萜类代谢途径、生物碱代谢途径，并对其代谢机理进行了探讨。
关键词
代谢途径
机理
ｃｈａｎｎｅｌ）的形成存在。不同代谢频道分布在植物不同的器官、组织、细胞或细胞内不同的细胞器即分隔（ｃｏｍ．ｐａｒｔｒｎｅｎｔ）内，不同代谢频道ＱＴＬ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ｔｒａｉｔ
植物次生代谢产物是植物体利用某些初生代谢产物，在一系列酶的催化作用下，形成的一些特殊化
学物质。这些化学物质是细胞生命活动或植物正常生
长发育非必需的小分子有机化合物．其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。次
ｌｏｃｉ）
可能分布在不同的染色体上．次生代谢物生物合成“代谢频道”的存在，有效地隔绝了次生代谢物合成过程中间产物在细胞内扩散，有利于底物与酶的有效结合和酶
生代谢产物是植物对环境适应的结果。次生代谢物为
人类提供了丰富的药物、香料和工业原料．对人类的生产和生活具有重要的作用。
植物次生代谢物种类繁多，结构迥异，一般分为酚类、萜类、含氮有机物三大类，每一类已知化合物都有数千种甚至数万种以上，如黄酮类、酚类、香豆素、木脂素、生物碱、萜类、甾类、皂苷和多炔类等。这些次
促反应的顺利进行，减少次生代谢途径中不同支路之间
争夺底物的现象及有毒中间产物对细胞的伤害，并使细胞内多种类型次生代谢物的合成途径得以同时存在。
苯丙烷中央代谢途径、类黄酮和异黄酮合成支路均有代谢频道存在。例如，拟南芥细胞中的查尔酮合成酶（ＣＨＳ）、查尔酮异构酶（ＣＨＩ）、黄烷酮一３一氢氧化酮酶（Ｆ３Ｈ）和二氢黄酮醇还原酶（ＤＦＲ）酶之间相互联系，在这些多酶复合体中，Ｆ３Ｈ、肉桂酸一４一羟基化酶（Ｃ４Ｈ）、阿魏酰一５一羟基化酶等细胞色素Ｐ４５０酶多充
生代谢产物在植物体内主要通过苯丙烷代谢途径、异戊二烯代谢途径、生物碱合成途径形成。莽草酸途径主要能提供合成一些次生代谢物的前体。
１
酚类合成途径
酚类主要包括黄酮类、简单酚类和醌类等。黄酮
当细胞膜“锚”的作用，将相关的酶组装固定在内质网
膜上这些酶组成代谢频道。苯丙氨酸裂解酶（ＰＡＬ）肉桂酸一４一羟基化酶（Ｃ４Ｈ）、４一香豆酰一ＣｏＡ一连接酶（４ＣＬ）
类化合物系色原烷（ｃｈｒｏｍａｎｅ）或色原酮（ｃｈｍｍａｎｅ）的２一或３一苯基衍生物，泛指由两个芳香环（Ａ和Ｂ）通过
是苯丙烷类代谢途径中的关键酶．也是合成途径中的
限速酶，它们在植物苯丙烷次生代谢物合成途径中位于代谢支路的分叉口或位于次生代谢物合成途径的
中央三碳链相互连接而成一系列化合物．可以分为１４
种主要类型．酚类化合物主要是通过苯丙基类生物合成途径合成的（图１）。
植物次生代谢物的合成途径通常是以不同类别的次生代谢物合成途径为单位即代谢频道（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
总之，硒的生物活性及其与疾病相关性的研究正
下游，负责合成酚类次生代谢物一般合成前体。查尔酮合成酶（ＣＨＳ）是将苯丙烷类代谢途径引向黄酮类合成
的第１个酶，该酶基因的表达也会受到病原菌的诱导。
６
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２０
生物学通报
２００６年第４１卷第３期
ｌ草莽酸途径卜—一苯丙氨酸Ｈ芥子油苷ｌ
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合成途径并不是倍半萜和二萜等高级萜类合成途径的分支．而是具有独特的酶促反应机制的单独合成途径。各种萜类次生代谢物的合成在细胞内具有明显的分隔，其中倍半萜主要在细胞质内合成，而二萜和单萜则在质体内合成。３含氮化合物合成途径
大多数含氮化合物是从普通氨基酸合成的，主要有生物碱、胺类、生氰苷、芥子油苷和非蛋白氨基酸等。
植物生物碱中萜类吲哚生物碱、苄基异喹啉生物碱、茛菪碱和烟碱和嘌呤生物碱等均有其特定的生物合成途径（图３）。
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ｌ竺。兰竺Ｉ
ｆｖｅｓｆｉｌｏｎｅ合成酶（ｖＲ）
异黄酮二甲烯丙基转移酶（ＩＤＭ攀ｂｉ—髻
图１
异黄酮二甲烯丙基转移酶（ＩＤＭＴ）
｜异戊烯基化异黄（烷）酮ｌ
酚类主要代谢途径
鸟氨酸卜｝——一１崩脱羧酶（ｏＤｃ
山托品酮还原酶（ＴＲ）
茛菪碱ｌ
莽草酸途径卜———————剖吲哚一３一甘油磷酸
ｃａＩＩｌｄｅｘｉｎ｜．｝————一吲哚ｌ
型型油磷酸酶（Ｂｘｌ）土上
／催化ＤＩＭＢｏ
单氧化酶（Ｂｘ２—５）
ｌ腐胺一Ｎ一甲基转移酶（ＰＭＴ）Ｉ色氨酸
２萜类合成途径
凡由甲羟戊二酸衍生、且分子式符合（Ｃ。Ｈ８）。通式的衍生物通称为萜类化合物或异戊二烯类化合物。在异戊二烯代谢途径中，可分别合成包括激动素、赤霉素、类萝卜素、甾醇和叶绿素等在内的单萜、倍半萜、二萜和多萜等次生代谢物。由乙酰一ＣｏＡ反应而成的焦磷酸异戊烯酯（ＩＰＰ）可进一步合成焦磷酸香叶酯（ＧＰＰ）、焦磷酸金合欢酯（ＦＰＰ）和焦磷酸香叶基香叶酯（ＧＧＰＰ），后者分别在单萜化酶、倍半萜环化酶和二萜环化酶的催化作用下被分别合成单萜、倍半萜和二萜次生代谢物：由ＦＰＰ也可进一步合成鲨烯、甾醇及多萜次生代谢物。
植物ＩＰＰ的合成有两条不同的途径。一条是由乙酰一ＣｏＡ经过甲羟戊酸合成。该途径合成的ＩＰＰ主要用于合成甾醇、半萜和三萜次生代谢物；另一条ＩＰＰ合成途径是ｌ一脱氧一木酮糖一５一磷酸合成支路，该途径合成的ＩＰＰ主要用于合成质体中的二萜、单萜、类胡萝卜素、异戊二烯等次生代谢物（图２）。
乙酰一ｃｏＡＩ‘
ｌ葡萄糖
ｌ氨酸脱羧
＜，嫠！搿啡ｏ｝引∞们．Ｉ．
酪氨酸
ｌ酪氮酸／多巴脱羧酶（ＴＹＤＣ）ｎ０Ｉｅｏｄａｕｄｎｅ一６一甲氧基转移酶（６０ＭＴ）
合成酶（ＳＴＲ）一Ｂ一葡萄糖苷酶１６一羟基化酶
０（ｓ）一Ｎ一甲基乌药碱３’一羟基化酶（ｃＹＰ８０ＢＩ）
（Ｓ）一网状番荔枝碱｛
０小檗碱桥酶（ＢＢＥ）
（Ｓ）一金黄紫堇碱
苯骈菲啶类生物碱
图３生物碱主要次生代谢逯径
在植物细胞中。生物碱长春多灵生物合成过程分别在细胞质、液泡、液泡膜、内质网膜、类囊体膜等５个以上细胞分隔区内完成：苯基异喹啉生物碱的合成途径中除了ＢＢＥ外，其他主要酶均依赖于细胞色素Ｐ４５０、位于内质网膜或内质网延伸膜分隔内。生物碱合成过程中的吲哚一３一甘油磷酸酶（ＢＸｌ）、ＳＴＤ、酪氨酸／多巴脱羧酶（ＴＹＤＣ）、小檗碱桥酶（ＢＢＥ）等可能是限速酶。
主要参考文献
ｌ一脱氧
木酮糖一５一磷酸（ＤＸＰＳ）
１
－
丙二酰ＣＯＡ
◆
甲羟戊酸
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焦磷酸３．３一二甲基烯丙基酯（ＤＭＡＰＰ）
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图２萜类主要代谢途径
万方数据 植物异戊二烯代谢途径中也存在代谢频道。单萜
（ＢＦ）
植物次生物的代谢途径
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
季志平， 苏印泉， 张存莉， Ji Zhiping， Su Yinquan， Zhang Cunli西北农林科技大学林学院,陕西,杨陵,712100生物学通报
BULLETIN OF BIOLOGY2006，41(3)1次
参考文献(5条)
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相似文献(10条)
1.学位论文 马君兰 外源茉莉酸甲酯对大豆异黄酮代谢途径的影响 2007
本文探讨了外源茉莉酸甲酯对大豆异黄酮代谢途径的影响。本研究利用外源茉莉酸甲酯(MeJA)为诱导物，对大田栽培的大豆进行叶面喷施，旨在研究其对大豆异黄酮代谢途径的影响；大豆生殖生长过程中初生代谢物、次生代谢物以及相关酶类活性的动态变化和三者的相互关系，构建大豆异黄酮类次生代谢物的研究平台。结果表明：外源MeJA对叶片的苯丙氨酸解氨酶活力、籽粒的PAL活力、籽粒PAL mRNA含量、可溶性蛋白含量、色氨酸含量、黄豆苷元含量、染料木素含量以及总异黄酮含量均有促进作用，其诱导效应能够发生在转录水平。在0～450μmol/L的喷施浓度范围内，上述物质的含量随着MeJA浓度的增加而增加，600μmol/L的处理与450μmol/L，的处理相比，没有明显的提高，且大多数表现出含量略微降低。在0～600μmol/L的喷施浓度范围内，45μmol/L是最适浓度。
2.学位论文 郝佳 大豆异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建与表达 2007
大豆异黄酮(Soybean Isoflavones，SiF)具有多重保健与药理作用，是近年来各相关领域的研究热点。从大豆中分离提取异黄酮一直是大豆异黄酮的主要获得途径。作为植物天然次生代谢物，大豆异黄酮在大豆中含量并不高，且植物生长周期较长，因此只靠从大豆中提取异黄酮比较有限。随着大豆基因组研究和现代生物技术的不断进展，使利用基因工程手段构建工程菌发酵生产大豆异黄酮成为可能，为寻找大豆异黄酮新的来源开拓了新的方法和思路，具有重要意义。
本文以经过紫外线诱导的大豆叶片为材料，利用SMART(Switching Mechanism At 5′end of theRNA Tanscript)思想和方法构建大豆叶片全长cDNA文库，并直接以一级库液稀释液为模板进行PCR，快速克隆得到异黄酮代谢途径相关的6个全长基因，测序结果表明各基因序列都是正确的。
将基因与pET质粒连接构建了各个单基因表达载体，在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，除c4h基因外都得到了特异性表达蛋白。对CHS进行质谱定性分析表明，在p
在各个单基因表达载体的基础上，构建了多基因表达载体，使除c4h外的5个基因由两个载体携带导入到E.coli BL21(DE3)中，各基因前都带有相应的T7启动子和核糖体结合位点(Ribosome Bind Site,RBS)。实验结果表明，在一定条件下携带多基因的双质粒稳定共存的时间较长，足够进行代谢及发酵研究。重组菌株经IPTG诱导，以酪氨酸为底物进行发酵研究，发酵产物经过HPLC测定，结果表明和空白对照相比有新的代谢产物生成，初步断定为异黄酮类化合物：利用二级质谱分析重组菌株代谢产物，证明其中有大豆异黄酮的代谢产物雌马酚。进一步鉴定实验还在进行中。
本文采用基因工程手段，将完整的大豆异黄酮代谢途径在大肠杆菌进行了构建，并进行了发酵和表达研究，得到了可以代谢生成异黄酮类化合物的重组菌株，这为寻找大豆异黄酮新来源的研究奠定了基础。
3.期刊论文 兰文智.余龙江.蔡永君.李默怡 类异戊二烯非甲羟戊酸代谢途径的分子生物学研究进展 -西北植物学报2001,21(5)
近期发现的类异戊二烯非甲羟戊酸代谢途径是类异戊二烯化合物生物合成的另一途径.文章对该代谢途径的分子生物学研究进展进行了综述.重点介绍非甲羟戊酸代谢途径的发现和5-磷酸脱氧木糖合成酶、5-磷酸脱氧木糖还原异构酶、异戊二烯焦磷酸合成酶的分子克隆的最新进展以及非甲羟戊酸代谢途径的发现在农业和医药等领域的应用.
4.学位论文 董新纯 UV胁迫下苦荞类黄酮代谢及其防御机制研究 2006
类黄酮(flavonoids)是植物体内主要的次生代谢物类型之一。紫外(UV)胁迫通常导致植物体内类黄酮代谢上调，类黄酮在植物体内可起紫外“吸收屏障(UV-filter)”的作用。本文以苦荞(FagopyrumtataricumL.)新品种9279-21为材料，研究了苦荞类黄酮代谢在UV胁迫适应中的一些作用机制。 1.苦荞类黄酮次生代谢对UV胁迫的响应利用HPLC法对苦荞类黄酮成分进行了分析，苦荞幼苗至少含有葛根素(puerarin)、柚皮苷(naringenin)、槲皮苷(quercetin)、芸香苷(rutin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)等类黄酮成分，其中含量最大的三种类黄酮成分依次为槲皮苷、芸香苷(芦丁)、柚皮苷。UV胁迫处理使苦荞类黄酮含量明显提高，幼苗株高降低、叶片直径减小、干重减少，外施类黄酮物质rutin可一定程度抑制苦荞幼苗生长。
UV胁迫上调莽草酸—苯丙烷类代谢途径的关键酶PAL(苯丙氨酸解氨酶)和莽草酸途径的关键酶DAHPS(3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶)的活性，使莽草酸—苯丙烷类代谢途径加速而提高类黄酮等次生代谢产物含量。而PAL、DAHPS活性的上调又调整G6PDH活性，更利于莽草酸—苯丙烷类代谢途径的进行而促进类黄酮的形成，这可能是UV胁迫下植物体短期内类黄酮等次生代谢物大幅增加的重要原因。
2.UV胁迫下呼吸、碳氮代谢、激素代谢的调整与类黄酮代谢的关系呼吸抑制剂实验证明，UV胁迫下PPP途径增强，UV胁迫通过上调PPP途径的关键酶G6PDH(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)的活性而提高PPP途径的比重，PPP途径产生的赤藓糖-4-磷酸(E4P)经关键酶DAHPS转化成莽草酸，而进入莽草酸途径，利于类黄酮等次生代谢物的合成。苦荞体内碳代谢的其它相关酶(如转化酶、SS、SPS)、氮代谢相关酶(如NR、GS、GOGAT)等也作出了适应这种代谢变化的调
整。TCA途径中的关键酶NADH-苹果酸脱氢酶(NADH-MDH)活性在紫外胁迫下也有所提高，但提高幅度小于G6PDH。
UV胁迫下，伴随着类黄酮含量的提高，苦荞体内促进生长的IAA下降，IAA的降低与IAA氧化酶活性的提高有关。UV胁迫下苦荞体内早期ABA的水平明显上升，脂氧合酶(LOX)活性抑制剂PG和外源ABA处理结果表明，ABA水平的提高与LOX活性表达高度联系，即LOX活性提高能促进ABA水平上升，而ABA水平的上升反过来对LOX活性有一定抑制作用。外源类黄酮rutin处理诱导ABA水平的上升，外源ABA处理也一定程度促进苦荞体内类黄酮的合成，表明类黄酮与ABA之间在UV胁迫下有一定联系。
3.草甘膦伤害与类黄酮代谢的关系草甘膦(glyphosate)抑制苦荞芳香族氨基酸Phe、Tyr、Trp的合成，而外施芳香族氨基酸可以缓解草甘膦的伤害效应，但效果一般，表明芳香族氨基酸的缺乏不是草甘膦伤害的唯一原因。草甘膦明显降低了苦荞类黄酮含量，外施类黄酮物质rutin能减轻草甘膦的伤害效应，表明阻断莽草酸途径而抑制类黄酮等次生代谢物的形成可能是草甘膦伤害的重要原因。
4.类黄酮在UV增强导致的氧化胁迫中的保护机制UV胁迫导致苦荞幼苗活性氧(AOS)大量产生、膜脂发生过氧化作用、MDA和电解质渗漏增加而导致氧化伤害。UV胁迫使LOX活性明显提高，引入LOX活性抑制剂没食子酸丙酯(PG)后，一定程度减少H2O2产生。
用草甘膦阻断莽草酸途径明显提高LOX活性，外施类黄酮物质rutin则抑制LOX活性和MDA形成；而用LOX活性抑制剂没食子酸丙酯(PG)处理则对内源类黄酮形成有一定抑制作用。表明紫外胁迫诱导LOX活性表达可能对次生代谢类黄酮形成有诱导作用，而类黄酮形成后又抑制LOX活性。
低辐照度UV胁迫下AOS增加时伴随着抗氧化酶活性的提高。草甘膦阻断莽草酸途径后，用类黄酮rutin处理提高抗氧化酶SOD、APX活性，并维持较高的AsA、GSH水平。在胁迫中后期主要通过APX、AsA-GR清除H2O2等活性氧，有效减轻和避免过氧化作用对膜和生物大分子的破坏。
5.类黄酮保护光合机构UV胁迫下，苦荞叶绿体色素降解加剧，用草甘膦阻断莽草酸途径导致叶绿体色素含量更大幅度下降，外源类黄酮rutin缓解叶绿体色素的下降，类黄酮缓解UV胁迫和草甘膦阻断莽草酸途径后AQY、CE、Pn的下降，表明类黄酮利于维持相对较高的光合作用。
低辐照度UV胁迫提高苦荞类胡萝卜素含量，使叶黄素循环库(V+A+Z)和(A+Z)/(V+A+Z)提高，从而加强叶黄素循环而耗散过剩光能；高辐照度UV胁迫使类胡萝卜素含量、(V+A+Z)和(A+Z)/(V+A+Z)降低，抑制叶黄素循环而加重强光抑制。类黄酮合成与类胡萝卜素合成存在一定关联性，类黄酮抑制过氧化从而保护膜组分类胡萝卜素及叶黄素循环库，这可能是UV胁迫下类黄酮减轻过剩光能对光合机构损伤的重要方式。
5.学位论文 朱再标 柴胡根系次生代谢物积累对干旱的响应与抗脂质过氧化保护机制 2009
中药材的质量是中药实现现代化、产业化、国际化的关键。但由于药用植物的生长和次生代谢过程受自然环境、栽培管理措施等多种因素的影响，中药材中次生产物含量“稳定、可控”成为一个难点。探讨药用植物次生代谢产物积累变化的内在规律及其影响因子，探索符合药用植物次生代谢物积累内在规律的代谢调控机制，将促使中药材的质量控制建立在科学的理论之上，对于提高活性物质含量、保证药材质量、稳定临床疗效等具有重要意义。
故需研究自然环境、栽培管理措施等因素与药用植物次生代谢产物种类和含量的相关性，确定影响次生产物积累的主要生态因子，并进一步揭示其生物合成机制。虽然阐明次生代谢途径是调控药用植物次生代谢产物合成积累的关键，然而由于其复杂性，一时难以达到令人满意的效果。但是，植物次生代谢产物能作为治疗人类疾病的药效成分，是人类利用了其某些理化特性；同为需氧生物，植物和人类有时面临着相同的问题，同时又有类似的解决方法。如果从某些植物次生产物在药理试验中的作用入手，联系其在植物体内的可能生理生化作用来探讨调控其在植物体内含量的途径，可能会为次生代谢产物的代谢调控提供新思路和方法。
本项工作通过野外调查采样、大田和控制栽培及室内分析等手段，以植物次生代谢理论为基础，结合药理学、自由基生物学和自由基医学以及植物逆境生理生态学等学科的研究基础，研究了柴胡的主要药效成分(柴胡皂苷和挥发油)对环境条件的响应规律及其次生代谢的可能调控机理，取得了如下主要结论：
1.通过建立的柴胡HPLC皂苷类成分指纹图谱，检出了18个特征峰作为定性鉴别的指标峰，能简便、快捷的鉴别不同种柴胡药材；发现11个批次柴胡的柴胡皂苷a(SSa)、柴胡皂苷d(SSd)、柴胡总皂苷含量及其指纹图谱中18个共有峰总峰面积相互之间存在极显著正相关关系，SSa或SSd均可作为柴胡中柴胡皂苷类成分的质控指标成分，提出建立柴胡药材质量综合评价体系的思路。
2.通过施肥和环境因素分析，发现氮、钙和锰元素是影响SSa、SSd和柴胡总皂苷含量的主要矿质元素。施用氮磷肥对于促进SSa和SSd的积累具有重要作用，而且可在一定程度上减轻干旱胁迫对SSa和SSd总产量的不利影响。年平均气温、七月平均气温、无霜期和SSa、SSd、柴胡总皂苷含量之间存在显著或极显著的正相关关系，尤其较高的七月平均气温对柴胡皂苷积累具有重要促进作用。气温日较差是影响SSd和柴胡总皂苷含量和产量的主要气候因子，而平均风速是影响SSa含量和产量的主要气候因子，且均为负向作用。中度干旱显著提高柴胡根系柴胡皂苷含量。
3.柴胡根系具有较强的抵御水分亏缺的能力。SSa和SSd含量随干旱程度加重而上升，但在严重干旱条件下或复水后下降。而且从适宜水分条件到中度干旱条件，SSa和SSd含量的上升伴随着O2-含量和超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的增强。值得注意的是，体外抗氧化试验表明柴胡根系甲醇提取液的抑制脂质过氧化能力与SSa、SSd含量正相关，其中与SSd含量的相关系数达到显著水平。由以上结果可以推测柴胡根系具有较强的抗氧化保护机制以适应干旱逆境，而且干旱诱导的柴胡根系SSa和SSd积累可能是受到活性氧的刺激，由于其较强的抑制脂质过氧化能力而减轻干旱造成的氧化伤害。另外，通过不同浓度外源H2O2直接处理柴胡幼苗根系，发现其可诱导柴胡皂苷含量升高，同时也促进了脂质过氧化以及SOD、APX活性增强。而在PEG导致的渗透胁迫条件下，施加外源AsA能降低MDA和H2O2含量，在一定程度上抑制脂质过氧化，但同时显著降低SSa和SSd含量。表明氧化胁迫条件利于柴胡皂苷积累，控制柴胡根系细胞氧化还原程度可在一定程度上对柴胡皂苷含量进行调控。
4.柴胡根系的挥发性成分以醛类物质为主体，其相对含量之和占总挥发性物质的57.24％-91.30％。不同产地样品的挥发油组分和相对含量差异悬殊，证明挥发油组分和相对含量因环境变化较大。在干旱复水进程中，大部分共有组分在适宜水分条件下相对含量最高，随干旱进程而下降。在干旱条件下2-甲基丁醛、正戊醛、正已醛、正壬醛和2-戊基呋喃的相对含量较高。在干旱复水进程中诱导产生29种新挥发性成分，而且其中多种为具有抗虫抗菌活性的物质。在干旱复水进程中共有组分的相对含量变化与LOX活性、脂质过氧化程度没有显著相关性，但LOX对于干旱复水过程中新诱导产生的挥发性组分及其含量变化具有重要影响。
6.期刊论文 王莉.张艳霞.史玲玲.刘玉军.WANG Li.ZHANG Yan-xia.SHI Ling-ling.LIU Yu-jun 功能基因组学和代谢组学技术在植物次生代谢物合成及调控研究中的应用 -北京林业大学学报2007,29(5)
植物次生代谢是植物在长期进化过程中与环境相互作用的结果,由初生代谢派生.萜类、生物碱类、苯丙烷类为植物次生代谢物的主要类型,其代谢途径多以代谢频道形式存在,具有种属、生长发育期等特异性.该文从植物次生代谢物的分类、代谢途径及代谢调控基因工程等方面展开论述,介绍了次生代谢物的生物合成途径,以及利用基因工程等技术对植物次生代谢途径进行遗传改良等方面的研究进展,为全面认识植物代谢网络、合理定位次生代谢及其关键酶、促进野生植物资源可持续利用等提供理论依据.
7.学位论文 乞永艳 大豆子叶异黄酮类次生代谢物的诱导及其微粒体部分蛋白的初步研究 2005
本研究综合利用分析高效液相色谱、制备高效液相色谱、同位素标记、薄层色谱、四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF/MS/MS)、二维电泳等现代技术，将分析化学、制备化学、蛋白质分离纯化和氨基酸序列测定充分结合，研究了外源硝酸银和茉莉酸诱导处理中黄13号和“Cultivar1”(荷兰)大豆子叶后，Glyceollins及其前体glycinol的诱导累积规律及其与其它固有的大豆异黄酮之间的联系；同时，对大豆中的异戊二烯转移酶进行了活性测定；并对硝酸银诱导后大豆子叶微粒体蛋白进行了初步研究。主要结论如下：
1、中黄13号与“Cultivar1”对外来刺激产生应激反应的能力有所不同，与“Cultivar1”相比，中黄13号对外界刺激更为敏感。
2、硝酸银诱导处理后，Glyceollin异构体比例不随保温时间的延长而改变；大豆苷元和染料木素含量上升，其相应的糖苷含量下降。茉莉酸处理后，GlyceollinⅠ和glyceollinⅢ所占比例下降，glyceollinⅡ所占比例增加；同时，游离苷元含量下降，糖苷含量增加。这表明：虽然硝酸银和茉莉酸都能够诱导大豆子叶中glycinol和glyceollins的累积，但是，其作用机制有可能不同。0.01M硝酸银诱导glycinol和glyceollins累积的能力最强，其次依次为0.001M和0.1M硝酸银。10μM茉莉酸诱导glyceollins累积的能力最强，20μM～100μM的茉莉酸诱导glyceollins累积的能力相近，1mM高浓度的茉莉酸非但未能增强诱导glyceollins累积的能力，反而有可能在某种程度上抑制了glyceollins的累积。
3、在glycinol和glyceollins累积过程中，苯丙氨酸代谢途径中的相关化合物在发生物质转化的同时，还发生着空间上的转移。植物抗毒素
glyceollins(glycinol)的累积只发生在遭遇刺激的部位；同时，该部位中与之有关的其它异黄酮浓度也高于健康部位。另外，这些化合物还存在着从健康部位向遭遇刺激部位转移的倾向，且与遭遇刺激部位垂直相连的部位有可能比与之横向相连的部位更容易与受刺激部位发生异黄酮间的转运和交换。 4、利用制备高效液相色谱，从390g(鲜重)0.01M硝酸银诱导的大豆子叶中分离纯化出约110mg高纯度的glycinol(282μg/g鲜重)，为大豆中异戊二烯转移酶的研究提供了难得的底物，并提供了一种分离纯化glycinol的有效方法。
5、利用[3H]DMAPP和glycinol为底物进行大豆中异戊二烯转移酶活性测定。用同位素标记与薄层色谱相结合，检验并分离、制备反应产物，经Q-TOF/MS分析鉴定，反应产物为glyceollidins。文中对glyceolldins难以大量累积的问题进行了初步分析。大豆中异戊二烯转移酶活性的成功测定为该酶的进一步研究提供了可靠保证，同时也有利于其它与之相关的微粒体蛋白的研究。
6、对二维电泳技术用于硝酸银诱导后大豆子叶微粒体膜蛋白分离的条件进行了优化。结果表明：在重新水化溶液组成中，还原剂比去垢剂对膜蛋白溶解性的影响更大，还原剂三丁基膦比二硫苏糖醇效果好，去垢剂(3-(4-hepty)phenyl3-hydroxypropyl)(dimethylammoniopropanesulfonate)(C7BZO)对蛋白质的增溶作用强于amidosulfobetaine-14(ASB-14)和Ⅰ3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulphonate(CHAPS)。由硫脲、尿素、去垢剂C7BZO和还原剂三丁基膦构成的重新水化溶液(TUC7T2)较适合大豆子叶微粒体膜蛋白的溶解。本研究的最佳操作条件确定为：TUC7T2为重新水化溶液，加样量为80μg，等电聚焦totalVhr为20,000(适用于70×3×0.5mmIPG胶条)。 7、二维电泳结果表明：总体来看，对照样品中蛋白量总量多于诱导样品，大部分大豆子叶微粒体蛋白的等电点位于pH4～6。总共发现14个由硝酸银诱导而产生的点，其中，在pH3～6范围内发现4个，在pH5～8范围内有10个。在pH7～10范围内，未发现只存在于诱导样品而不存在于对照样品的蛋白质点。
8、四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF/MS/MS)测定和氨基酸序列分析表明：硝酸银处理可以诱导大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(SKTI)及其5kDa小亚基和诱导蛋白“SAM22_SOYBN”的产生。
本研究结果对于调控大豆中异戊二烯化黄酮类化合物的合成、深入了解大豆“代谢网”、探讨激发子的作用机理、研究微粒体诱导蛋白、实施大豆次生代谢物调控和性状的定向改变等工作具有重要的理论和实践指导意义，必将推动这些工作的顺利进行，从而有助于利用分子生物学和基因工程手段改善和提高大豆的有益性状，使大豆能够为人类提供更多的健康植物化合物(health-promotingphotochemical)，最终将在更大程度上有助于大豆各方面价值的大幅度提升。
8.期刊论文 王莉.史玲玲.张艳霞.刘玉军.WANG Li.SHI Ling-Ling.ZHANG Yan-Xia.LIU Yu-Jun 植物次生代谢物途径及其研究进展 -武汉植物学研究2007,25(5)
植物次生代谢是植物在长期进化过程中与环境相互作用的结果,由初生代谢派生.萜类、生物碱类、苯丙烷类为植物次生代谢物的主要类型,其代谢途径多以代谢频道形式存在,具有种属、生长发育期等特异性.从植物次生代谢物的分类、代谢途径及代谢调控基因工程等方面展开论述,重点介绍了次生代谢物的生物合成途径,以及利用基因工程等技术对植物次生代谢途径进行遗传改良等方面的研究进展,为全面认识植物代谢网络、合理定位次生代谢及其关键酶、促进野生植物资源可持续利用等提供理论依据.
9.学位论文 黄蓓蓓 遗传改造的酿酒酵母分析技术平台的建立及其在萜类生物合成途径上各代谢物分析中的应用 2009
萜类化合物广泛分布于植物及微生物初级代谢物和次生代谢物中，其种类繁多，不仅在植物的生命活动中扮演重要的作用，而且还被广泛的应用于工业、医药卫生等方面，如倍半萜中的青蒿素、双萜中的紫杉醇可分别作为抗疟、抗癌的有效药物。但是萜类在生物体内的产量很低，而且分离和纯化操作复杂。由于萜类结构复杂，化学合成需要的步骤烦琐，非常困难。由于酵母自身存在甲羟戊酸(Mevalonate，即MVA)途径，可自我合成萜类前体，为利用代谢工程改造细胞代谢途径为提高萜类产量提供了一个很好的操作平台，然而酵母中萜类前体库不足够提供高产，有必要调节其参与萜类前体生物合成的代谢途径以提高产量。
本研究中，我们选择酿酒酵母作为宿主细胞，以酿酒酵母中的萜类生物合成途径为主要研究对象，建立遗传改造的酿酒酵母的分析技术平台，将最先进的分析技术用于测量代谢物及其在一定条件下含量的变化，有助于阐释遗传干预对感兴趣的途径的影响，同时对微生物的应激反应进行整体性无偏的描述，以进一步理解通过这个途径的代谢流的控制分子机制，得到如下结果：
(1)首次将基因敲除的分子生物学方法，引入酿酒酵母的次生代谢途径萜类生物合成途径中，以调节其代谢，增加其萜类前体库供给。酿酒酵母中的萜类生物合成途径主要分成六异戊二烯基焦磷酸合成途径以及麦角甾醇生物合成途径两个部分。为了增强通往萜类前体的代谢流，构建敲除盒，将负责FPP转为角鲨烯，竞争FPP的erg9基因，位于萜类前体下游的coql基因分别敲除，减少旁路消耗。用
(2)PCR方法构建敲除盒LoxP-kanMX/URA3-loxP，分别敲除erg9基因和coql基因，剔除筛选标记ura3后，分别得到新菌型BY4743-△erg9和BY4743-△coql。在BY4743-△erg9基础上，再利用敲除盒LoxP-URA3-loxP，敲除coql，基因，经PCR验证，并剔除筛选标记ura3，得到新菌型BY4743-△ erg9-△coql。同时考察其基础时间生长曲线的变化，为下一步的基因．生理机能机制深入研究，提供基础。野生菌株生长最快，缺失株生长较慢，双缺失菌生长最慢，形成的菌落也较小。
(3)为了考察上述遗传改造对萜类前体积累的效果，测定酿酒酵母的萜类生物合成途径上重要的指标性成分GGPP(二萜成分的前体)，分析它的变化，表征其随erg9，coql基因缺失的关联性，为阐明酿酒酵母中萜类合成途径的调节分子机制提供现实依据。本研究首次建立LC-MS方法测定遗传改造后酿酒酵母中GGPP含量的变化。应用4.6 mm×25 cm SB-Aq C185-μm(Agilent Tech．，USA)色谱柱进行液相分离，流动相75％(10mM三丁胺水溶液用15mM醋酸调成pH4.95)：25％甲醇，质谱负离子模式扫描质荷比范围50-600，选择离子检测GGPP([M-H]-)，质荷比449.2。标准曲线线性范围0.1-50ng/ml。在这个范围内的，日内相对标准偏差＜10％，日间相对标准偏差＜14％，精密度范围96.5-105.4％。结果显示，遗传改造有效，BY4743-△erg9-A coql的积累量在72小时后增加非常显著。遗传改造后的菌株与野生型菌株比较，含量有显著差异(P＜0.01)；随时间的长短，含量显著增高。说明erg9与coql对GGPP的代谢显著影响。
(4)为了研究遗传改造对萜类生物合成途径代谢流的影响，建立GC-MS方法测定萜类生物合成途径上各代谢物及其在酿酒酵母中的应用。本研究首次建立一个精确灵敏的非放射性的方法，同时定量酿酒酵母中萜类合成途径上的GPP，FPP，GGPP，角鲨烯，麦角甾醇和羊毛甾醇，考察代谢流的变化。这个方法建立在GPP，FPP和GGPP去磷酸化成相应的烯萜醇，用GC-SIM-MS分析。本研究考察了三种转化方法：酸解法、碱解法、酶解法。酸解法和碱解法的转化率都低于15％，不能应用于此，酶解法在不同的缓冲体系中的转化率相差很大，50mM Bis-Trispropane/HCl，1mM MgCl2，pH7.0，转化率＜1％；0.1M2-amino-2-methylpropanol/NaOH1mM MgCl2，pH10.35，转化率＜1％；50 mM Tris-HCl，10 mMMgCl2，pn9.0，转化率＜1％；0.1 M
glycine/1 M NaCl/40％MeOH，pH10.4，转化率＜2％，1 M diethanolamine，0.5 mM MgCl2，pH9.8，转化率可＞88％，符合研究的需要。本研究综合比较全发酵液提取法、细胞液离子交换柱提取法、细胞液超声提取法三种提取方法，正己烷、石油醚、乙酸乙酯、氯仿：乙酸乙酯(1：10)四种提取溶剂，0.5min、1.5min、3min这样3个涡旋时间，比较其效率，确定最终的前处理方法为：细胞液超声提取法，正己烷提取，涡旋3min。应用TRACETR-5MS柱(30m×0.25mm×0.25μm)进行气相分离，单重四极杆质谱选择离子监测GOH，FOH，GGOH，角鲨烯，麦角甾醇和羊毛甾醇，以保留时间和碎片信息进行定性定量分析。结果显示，方法准确有效，标准曲线线性良好，日内和日间精密度良好，加样回收率准确度高。将此方法应用于酿酒酵母中，发现不同基因对于酿酒酵母中萜类合成途径上的各个代谢物的代谢过程的作用是不一样的，双缺失erg9和coql，使得GPP、FPP、GGPP大量积累，而角鲨烯、麦角甾醇、羊毛甾醇的含量可维持细胞正常生理功能。
(5)通过考察不同遗传改造的酿酒酵母基础时间生长曲线的变化，发现其生理活动发生了变化。为了考察遗传改造对细胞生理活动的影响，建立荧光分析和化学发光方法测定分子操作后，与细胞生理特性和基因功能相关代谢物及其含量的变化，有助于阐明萜类代谢途径的基因敲除后，对细胞功能的影响。利用罗丹明6G，测得BY4743-△ erg9-△ coql离子外排作用低于野生型和单缺失菌，并且酿酒酵母的外排作用是能量依赖型的。利用JC-1，测得erg9与coql对线粒体膜电位的影响巨大，两者的缺失打破线粒体膜电位分布的平衡，但24h后，不同遗传改造的酿酒酵母建立的新的膜电位平衡无明显差别。利用DCFA-DA，测得erg9与coql的缺失引发大量内源性活性氧的产生。利用荧光素酶的化学发光，测得BY4743-△erg9-△ coqlATP的含量低于野生型和单敲除菌。
当前的工作力求将代谢工程，化学分析，数据处理等多个领域结合，在细胞水平分析代谢物的变化以详细地认识基因一代谢产物、基因一代谢流之间关联的分子机制，分析生理状态的变化以认识基因功能。本研究涉及多种技术的联用。这些方法包括分子生物学技术，微生物代谢活性瞬时淬灭，化合物的酶法衍生化、相关胞内代谢产物的提取，色谱与质谱的偶联(GC-MS，LC-MS)，荧光与化学发光的应用以及统计学上的数据挖掘等等。多种技术的创新和联用必将提供大量的代谢途径信息，有助于反映有机体的生理活动，理解潜在的调节机制，对以酿酒酵母为平台生产多种重要价值的萜类化合物具有重要意义。
10.期刊论文 李永丽.周洲.李科友 细胞培养生产药用次生代谢物研究进展 -安徽农业科学2006,34(2)
综述了近年来细胞培养生产药用次生代谢物的研究进展.许多药物来源于植物次生代谢途径,运用细胞培养生产代谢物是一种很有效的方法,提高细胞培养中次生代谢物产量一直是人们研究的热点.近年来筛选细胞系,优化培养条件,固相化培养,以及添加诱导子,毛状根培养等技术的运用都在提高产量上
都有很多研究,尤其是随着对植物代谢途径的了解和基因工程手段的成熟,应用基因工程技术改造代谢途径,从而提高次生物质的产率成为研究主流.
引证文献(1条)
1.何丁 种皮中类黄酮含量的早期快速检测[期刊论文]-生物学通报 2008(4)
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