476实用预防医学 2005年6月 第12卷 第3期 PracticalPreventiveMedicine,Jun.2005,Vol12,No.3
文章编号:1006-3110(2005)03-0476-03
【论 著】
应用PCR法检测副溶血性弧菌
詹 铭,陈 纯,沈小明,张勇琪,李 婷,丁 明
摘要: 目的 研究副溶血性弧菌的PCR检测方法。 方法 引物选择副溶血性弧菌耐热溶血素(TDH)上的基因,应用PCR法,检测副溶血性弧菌。 结果 PCR能检测经选择性增菌液培养的副溶血性弧菌,扩增片段在430bp。 结论 应用PCR检测副溶血性弧菌,具有快速、特异、灵敏和简便的特点。
关键词: 副溶血性弧菌;PCR;检测
中图分类号:R37813 文献标识码:A
DetectionofVibrioParahemolyticusbyPolymeraseChainReaction ,CHENHENXiao-Ming,etal.(ShanghaiPudongNewAreaCenterforDiseaseControland,)
Abstract: Objective Tostudythemethodforpolymerasechainreaction(PCR). Method Basedonuniquesequencehemolysin(TDH),TDHwasamplifiedbypolymerasechainreaction. RregionofTDHgenespecifictoVibrioparahemolyticus.
Conclusion ofTDHisamethodofhighspecificity,goodreproducibilityand
highsensitivity.ItforVibrioparahemolyticusdetection.
Keywords: parahemolyticus;PCR;Detection
副溶血性弧菌是广泛分布于沿海地区的海洋性细菌,为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一,尤其是在夏秋季节,经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品或被此菌污染的食品,引起爆发性食物中毒。因此在饮水、食品检测和食物中毒源调查、传染病源调查等工作中,经常需要对副溶血性弧菌等致病菌进行检测。传统的副溶血性弧菌检测法主要分为增菌培养、分纯、镜检和生化试验等步骤。该法的阳性检出周期至少需要72h,且操作繁琐。我们针对副溶血性弧菌,结合国标方法(GB17012-1997,GB4789.7-1994),研究并设计了PCR反应体系,并通过大量实样验证,建立了基于PCR技术的快速检测方法,使之能应用于日常检测工作中。特别是应用于食物中毒病原菌检测,使副溶血性弧菌的检测判定周期大幅缩短至24h,同时提高了检测准确度和灵敏度。
1 材料与方法
1.1 PCR反应体系的建立
1.1.1 引物设计 与上海天能科技有限公司联合设计,选择
P1P2
5’5’
GGTCCA
ACTAAT
AAAACA
TGGTTT
CTGTAC
ACATTG
TC3’,G3’。
1.1.2 反应体系 PCR试剂盒:裂解液,Taq酶,PCR反应液,
均委托上海天能科技有限公司制备PCR反应条件:94℃预变性2min,再按94℃/40s变性、50℃/40s退火、72℃/90s延伸,循环扩增35次后72℃延伸至5min。
1.2 实验材料 标准菌株为副溶血性弧菌国家标准菌株K19,K58。样本菌株为来自各类肛拭、食品、海产品等样本。实
验试剂为Tris-Cl,EDTA-Na2.2H2O,HAC,EB,Agarose,纯水。所有化学试剂均为分析纯。
1.3 实验仪器 Hema480PCR仪,SCR-300电泳仪,GIS-1000凝胶成像仪,TGL-16B离心机。1.4 实验方法1.4.1 PCR方法
1.4.1.1 增菌 按国家标准检测方法中规定的步骤,采用选
择性增菌液进行培养。
1.4.1.2 DNA提取 取样品增菌液1.0ml于1.5ml离心管
了副溶血性弧菌耐热溶血素(TDH)上的基因,扩增片断为430
bp,并通过Genbank检索确认。
中,10000rpm离心5min,弃上清,沉淀中加40μl裂解液,搅匀后于100℃沸水浴10min,最后10000rpm离心1min,上清待测。同理将已知的阳性实样对照按上述步骤操作。
1.4.1.3 PCR扩增 取样本DNA提取液4μl,加反应液20μl
引物序列:
基金项目:上海市疾病预防控制中心立项课题(区2001-12)作者单位:上海市浦东新区疾病预防控制中心(上海 200135)
作者简介:詹铭(1969-),男,上海人,学士,副主任技师,主要从事检验工作。
和Taq酶1μl,混匀后再滴入2滴消毒液体石蜡,立即PCR扩增。同时做试剂空白对照、试剂盒阳性对照以及实样阳性对
实用预防医学 2005年6月 第12卷 第3期 PracticalPreventiveMedicine,Jun.2005,Vol12,No.3照。
1.4.1.4 电泳与结果判断 取15μl扩增液,2%琼脂糖凝胶
477
法检测所得结果进行比对。
2 结果
2.1 体系稳定性试验
2.1.1 贮存试验 PCR试剂在-20℃冷冻条件下可以保存60d。
2.1.2 反复冻溶试验 PCR试剂冻溶次数不宜超过4次。2.1.3 批间稳定性试验 在9个月内,先后使用了三个批次
含0.5mg/mlEB,电泳(5v/cm)30min后,在紫外灯下观察。若在阳性对照模板处出现橙黄色条带,则判定为阳性。
1.4.2 体系稳定性试验
1.4.2.1 贮存试验 使用新制备的PCR试剂对阳性对照进
行检验,确认结果呈阳性。再将该批PCR试剂分成4份,分别放置在不同条件下,贮存60d后,再次对该阳性对照进行检验并观察结果。
1.4.2.2 反复冻溶试验 取贮存于-20℃条件下的某批号PCR试剂,待其在室温下溶化后,对阳性对照进行检验,并将余
的试剂盒,累计重复检测了23次。每次观察到的结果均一致。
PCR试剂具有较好的稳定性。2.2 方法灵敏度试验
2.2.1 以梯度稀释的增菌液,作两种方法比较,经多次实验表
下的PCR试剂再次冷冻贮存。如此反复7次,记录每次试验结果。
1.4.2.3 批间稳定性试验 保留30件经国标方法检验确认
明,PCR法的灵敏度远比标准法高,最低检出浓度相差2～4个稀释度,见表1。
表1PCR法
-1
-+++
-139+
-15+
-62+
-70+
-80+
-90+
-100-
的样品增菌液,其中20件为阳性样本,10件为阴性样本。每隔
10～15d检测一次。每3个月换一个批次的试剂盒,连续试验9个月并记录结果。1.4.3 灵敏度试验
1.4.3.1 取经过18h培养的增菌液,10+3+++
+
度稀释。。
1.4.3.2,培
注:3:++表示多不可计
2.2.2 将浓度约108cfu/mL的菌液,作梯度稀释后检测 表
养24h后,洗下菌苔以麦氏比浊法调至菌液浓度约10cfu/ml,以灭菌盐水作10倍梯度稀释。从各稀释度中分别取100μl稀释液按标准法涂布于选择性琼脂平板培养后计数和,再取100μl稀释液按PCR法作检测。
1.4.4 特异性试验
1.4.4.1 标准菌株验证 以副溶血性弧菌的代表性菌株即国
8
明PCR法的检出浓度可达101cfu/mL,见表2。
表2 试验结果
稀释梯度平板计数PCR法
-1++3+
-2+++
-3+++
-4+++
-51190+
-6140+
-720+
家标准菌株K19,K58进行实验。
1.4.4.2 阳性菌株验证 以经过国标方法检验确认的阳性菌
注:3:++表示多不可计
2.3 方法特异性
2.3.1 标准菌株验证 以副溶血性弧菌的代表性菌株即国家
株(30株)进行实验。
1.4.4.3 弧菌、杂菌验证 以选择性琼脂平板上生长的弧菌
标准菌株K19,K58进行实验,结果均为阳性。
2.3.2 阳性菌株验证 以经国标方法检验确认的阳性菌株(30株)进行实验,结果均为阳性。
2.3.3 弧菌、杂菌验证 以选择性琼脂平板上生长的弧菌及
及其它杂菌(100株)进行实验。
1.4.4.4 菌株加入验证 取已知的副溶血性弧菌菌落分别加
入到不同性质的样品中,与对照样同步进行增菌培养,再采用
PCR法检测。
1.4.4.5 实样比对验证 内部比对试验:结合日常检测工作,
其它杂菌(100株)进行实验,结果均为阴性。
2.3.4 菌株加入实验 挑取7个已知的副溶血性弧菌菌落分
按国标方法对样本进行检测的同时,同步采用PCR法检测,将两者的检测结果进行比对。
外部比对试验:通过协作单位,保留日常检测工作中获得的样本,采用PCR法检测,并将检测结果与协作单位按国标方法检测所得结果进行比对。
1.4.5 比对试验 内部比对试验:结合日常检测工作,按国
别加入到不同性质的21件样品中,与对照样同步进行增菌培养,再采用PCR法检测。加入的阳性样本均被检出。
2.3.5 实样比对验证 自2002年8月至2003年12月间,共
采集了70余批650件样本。以日常检测样品为主,其类别包括普通肛拭子、食品、海产品等。其中110件来自长宁区卫生检验所和闵行区卫生检验所。对上述样本进行检测,PCR法阳性样本数为430/650,国标方法阳性样本数为426/650,见表3。α=0.05),两种方法的阳 经统计检验χ,2=1.125,P>0.05(性检出率无显著性差异。
标方法对样本进行检测的同时,同步采用PCR法检测,将两者的检测结果进行比对。
外部比对试验:通过协作单位,保留日常检测工作中获得的样本,采用PCR法检测,并将检测结果与协作单位按国标方
478实用预防医学 2005年6月 第12卷 第3期 PracticalPreventiveMedicine,Jun.2005,Vol12,No.3
表3 两种方法检测结果比较
国标法
合计
+
-6218224
430220650
第一步。PCR技术本身是不能区分样本是否是活菌的,它检测的结果只是表示样本中是否含有特殊的DNA片断。
要判断所检测到的DNA片断是否来自活菌,可以采用比对检测的方法,即首先采集培养初期(约30min)的增菌液并冷藏,待增菌结束后再次采集,两者同时作PCR检测,观察阳性条带的亮度区别。当后者明显亮于前者,表示细菌量在培养后增加,即样本中存在活菌。
3.4 PCR法与国标法的相互应用配合 在副溶血性弧菌的
PCR法+-
4242426
合计
检测流程中,首先应对样品进行增菌培养,第二步可以对增菌
2.3.6 以上实验表明本PCR方法具有较高的特异性。2.4 方法的检测周期 PCR方法的检测周期一般不超过24h。第一个步骤与国标方法一致,即第1d进行增菌培养,而第2d则直接定性检测增菌液中的副溶血性弧菌,见表4。
表4 PCR与国标法的检测周期比较
周期(d)
方法
1
GB4789GB17012PCR法
2
3
4
5
6
液用PCR法检测,在较短的时间内即可获知结果;同时按国标法并参考PCR法的结果继续检验鉴定。在应急检测时,PCR法的快速性和灵敏性能明显体现出来,而国标法则作为标准方法用以作最后鉴定。在批量样品检测时,可以用PCR法作筛选,保留阳性继续按国标法检鉴定。
PCR,。
(闵
增菌增菌增菌
平板接种平板接种,斜面接种镜检-
镜检、嗜盐试验-
生化试验结果-
-
行区疾控中心微生物检验科杨丽华主任的大力支持和帮助,在此表示感
)谢。
3 讨论
3.1 增菌与DNA获取 本文所研究的PCR方法,其关键是要
[参考文献]
[1]Nishibuchi,M.andKaper,J.B.Duplicationandvariationofthether2
mostabledirecthaemolysin(tdh)geneinVibrioparahemolyticus[J].Mol.Microbiol,1990,4(1):87-991
[2]Honda,T,Abad-Lapuebla,M.A,Ni,Y.X,etal.Characterizationof
anewthermostabledirecthaemolysinproducedbyaKanagawa-phe2nomenon-negativeclinicalisolateofVibrioparahemolyticus[J].J.Gen.Microbiol,1991,137(2):253-2591
[3]Iida,T.andYamamoto,K.Cloningandexpressionoftwogenes
encodinghighlyhomologoushemolysinsfromaKanagawaphenomenon-positiveVibrioparahemolyticusT4750strain[J].Gene,1990,93(1):9-151
[4]ChiayinLee,ShwoFenPan.Rapidandspecificdetectionofthether2
mostabledirecthaemolysisgeneinvibrioparahemolyticusbythepoly2merasechainreaction[J].JournalofGeneralMicrobiology,1993,139:3225-32311
[5]Baba,K,Shirai,H,Terai,A,etal.Similarityofthetdhgene-bearing
plasmidsofVibriocholeraenon-01andVibrioparahemolyticus[J].Microb.Pathog,1991,10:61-701
[6]GB17012-1997,感染性腹泻的诊断标准及原则[S]1[7]GB4789-1994,食品卫生检验方法微生物学部分[S]1
(收稿日期:2004-12-05)
从样品中捕捉到目标DNA,然后再进行DNA扩增并检测。为提高检出率、排除干扰,本方法将增菌培养作为第一步骤。
其优点在于:(1)选择性增菌培养,可以大大提高副溶血性弧菌的含量;(2)有助于检测含活菌量较少或分布不均匀的样品;(3)抑制非嗜盐菌的干扰;(4)通过增菌液的稀释作用,降低样品基质中的干扰物质浓度,减弱对PCR反应的离子干扰效应;(5)有助于识别DNA是否来自于活菌。
其缺点在于:(1)培养周期没有缩短,仍需要8～16h;(2)嗜盐菌的抑制作用。如果采用振荡培养的方式,可以获得较好的增菌效果,并大幅缩短增菌时间。对于肛拭样品,由于其含菌量相对较高,本底干扰物不多,可以采用先以灭菌生理盐水洗脱、离心,再进行检测的方法。
3.2 方法中的空白与对照 试剂空白:不加样本,用以观察试
剂、环境是否受到污染。试剂盒阳性对照:即阳性扩增产物,用以进行结果比对及观察反应体系是否正确。实样阳性对照:即保留的质控样(已知阳性样本),用以观察实验全过程是否正确。
3.3 活菌与DNA 根据传统的观念,细菌检测是要检测活的
细菌。所以通过培养达到增菌的目的往往是检测步骤的重要
476实用预防医学 2005年6月 第12卷 第3期 PracticalPreventiveMedicine,Jun.2005,Vol12,No.3
文章编号:1006-3110(2005)03-0476-03
【论 著】
应用PCR法检测副溶血性弧菌
詹 铭,陈 纯,沈小明,张勇琪,李 婷,丁 明
摘要: 目的 研究副溶血性弧菌的PCR检测方法。 方法 引物选择副溶血性弧菌耐热溶血素(TDH)上的基因,应用PCR法,检测副溶血性弧菌。 结果 PCR能检测经选择性增菌液培养的副溶血性弧菌,扩增片段在430bp。 结论 应用PCR检测副溶血性弧菌,具有快速、特异、灵敏和简便的特点。
关键词: 副溶血性弧菌;PCR;检测
中图分类号:R37813 文献标识码:A
DetectionofVibrioParahemolyticusbyPolymeraseChainReaction ,CHENHENXiao-Ming,etal.(ShanghaiPudongNewAreaCenterforDiseaseControland,)
Abstract: Objective Tostudythemethodforpolymerasechainreaction(PCR). Method Basedonuniquesequencehemolysin(TDH),TDHwasamplifiedbypolymerasechainreaction. RregionofTDHgenespecifictoVibrioparahemolyticus.
Conclusion ofTDHisamethodofhighspecificity,goodreproducibilityand
highsensitivity.ItforVibrioparahemolyticusdetection.
Keywords: parahemolyticus;PCR;Detection
副溶血性弧菌是广泛分布于沿海地区的海洋性细菌,为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一,尤其是在夏秋季节,经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品或被此菌污染的食品,引起爆发性食物中毒。因此在饮水、食品检测和食物中毒源调查、传染病源调查等工作中,经常需要对副溶血性弧菌等致病菌进行检测。传统的副溶血性弧菌检测法主要分为增菌培养、分纯、镜检和生化试验等步骤。该法的阳性检出周期至少需要72h,且操作繁琐。我们针对副溶血性弧菌,结合国标方法(GB17012-1997,GB4789.7-1994),研究并设计了PCR反应体系,并通过大量实样验证,建立了基于PCR技术的快速检测方法,使之能应用于日常检测工作中。特别是应用于食物中毒病原菌检测,使副溶血性弧菌的检测判定周期大幅缩短至24h,同时提高了检测准确度和灵敏度。
1 材料与方法
1.1 PCR反应体系的建立
1.1.1 引物设计 与上海天能科技有限公司联合设计,选择
P1P2
5’5’
GGTCCA
ACTAAT
AAAACA
TGGTTT
CTGTAC
ACATTG
TC3’,G3’。
1.1.2 反应体系 PCR试剂盒:裂解液,Taq酶,PCR反应液,
均委托上海天能科技有限公司制备PCR反应条件:94℃预变性2min,再按94℃/40s变性、50℃/40s退火、72℃/90s延伸,循环扩增35次后72℃延伸至5min。
1.2 实验材料 标准菌株为副溶血性弧菌国家标准菌株K19,K58。样本菌株为来自各类肛拭、食品、海产品等样本。实
验试剂为Tris-Cl,EDTA-Na2.2H2O,HAC,EB,Agarose,纯水。所有化学试剂均为分析纯。
1.3 实验仪器 Hema480PCR仪,SCR-300电泳仪,GIS-1000凝胶成像仪,TGL-16B离心机。1.4 实验方法1.4.1 PCR方法
1.4.1.1 增菌 按国家标准检测方法中规定的步骤,采用选
择性增菌液进行培养。
1.4.1.2 DNA提取 取样品增菌液1.0ml于1.5ml离心管
了副溶血性弧菌耐热溶血素(TDH)上的基因,扩增片断为430
bp,并通过Genbank检索确认。
中,10000rpm离心5min,弃上清,沉淀中加40μl裂解液,搅匀后于100℃沸水浴10min,最后10000rpm离心1min,上清待测。同理将已知的阳性实样对照按上述步骤操作。
1.4.1.3 PCR扩增 取样本DNA提取液4μl,加反应液20μl
引物序列:
基金项目:上海市疾病预防控制中心立项课题(区2001-12)作者单位:上海市浦东新区疾病预防控制中心(上海 200135)
作者简介:詹铭(1969-),男,上海人,学士,副主任技师,主要从事检验工作。
和Taq酶1μl,混匀后再滴入2滴消毒液体石蜡,立即PCR扩增。同时做试剂空白对照、试剂盒阳性对照以及实样阳性对
实用预防医学 2005年6月 第12卷 第3期 PracticalPreventiveMedicine,Jun.2005,Vol12,No.3照。
1.4.1.4 电泳与结果判断 取15μl扩增液,2%琼脂糖凝胶
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法检测所得结果进行比对。
2 结果
2.1 体系稳定性试验
2.1.1 贮存试验 PCR试剂在-20℃冷冻条件下可以保存60d。
2.1.2 反复冻溶试验 PCR试剂冻溶次数不宜超过4次。2.1.3 批间稳定性试验 在9个月内,先后使用了三个批次
含0.5mg/mlEB,电泳(5v/cm)30min后,在紫外灯下观察。若在阳性对照模板处出现橙黄色条带,则判定为阳性。
1.4.2 体系稳定性试验
1.4.2.1 贮存试验 使用新制备的PCR试剂对阳性对照进
行检验,确认结果呈阳性。再将该批PCR试剂分成4份,分别放置在不同条件下,贮存60d后,再次对该阳性对照进行检验并观察结果。
1.4.2.2 反复冻溶试验 取贮存于-20℃条件下的某批号PCR试剂,待其在室温下溶化后,对阳性对照进行检验,并将余
的试剂盒,累计重复检测了23次。每次观察到的结果均一致。
PCR试剂具有较好的稳定性。2.2 方法灵敏度试验
2.2.1 以梯度稀释的增菌液,作两种方法比较,经多次实验表
下的PCR试剂再次冷冻贮存。如此反复7次,记录每次试验结果。
1.4.2.3 批间稳定性试验 保留30件经国标方法检验确认
明,PCR法的灵敏度远比标准法高,最低检出浓度相差2～4个稀释度,见表1。
表1PCR法
-1
-+++
-139+
-15+
-62+
-70+
-80+
-90+
-100-
的样品增菌液,其中20件为阳性样本,10件为阴性样本。每隔
10～15d检测一次。每3个月换一个批次的试剂盒,连续试验9个月并记录结果。1.4.3 灵敏度试验
1.4.3.1 取经过18h培养的增菌液,10+3+++
+
度稀释。。
1.4.3.2,培
注:3:++表示多不可计
2.2.2 将浓度约108cfu/mL的菌液,作梯度稀释后检测 表
养24h后,洗下菌苔以麦氏比浊法调至菌液浓度约10cfu/ml,以灭菌盐水作10倍梯度稀释。从各稀释度中分别取100μl稀释液按标准法涂布于选择性琼脂平板培养后计数和,再取100μl稀释液按PCR法作检测。
1.4.4 特异性试验
1.4.4.1 标准菌株验证 以副溶血性弧菌的代表性菌株即国
8
明PCR法的检出浓度可达101cfu/mL,见表2。
表2 试验结果
稀释梯度平板计数PCR法
-1++3+
-2+++
-3+++
-4+++
-51190+
-6140+
-720+
家标准菌株K19,K58进行实验。
1.4.4.2 阳性菌株验证 以经过国标方法检验确认的阳性菌
注:3:++表示多不可计
2.3 方法特异性
2.3.1 标准菌株验证 以副溶血性弧菌的代表性菌株即国家
株(30株)进行实验。
1.4.4.3 弧菌、杂菌验证 以选择性琼脂平板上生长的弧菌
标准菌株K19,K58进行实验,结果均为阳性。
2.3.2 阳性菌株验证 以经国标方法检验确认的阳性菌株(30株)进行实验,结果均为阳性。
2.3.3 弧菌、杂菌验证 以选择性琼脂平板上生长的弧菌及
及其它杂菌(100株)进行实验。
1.4.4.4 菌株加入验证 取已知的副溶血性弧菌菌落分别加
入到不同性质的样品中,与对照样同步进行增菌培养,再采用
PCR法检测。
1.4.4.5 实样比对验证 内部比对试验:结合日常检测工作,
其它杂菌(100株)进行实验,结果均为阴性。
2.3.4 菌株加入实验 挑取7个已知的副溶血性弧菌菌落分
按国标方法对样本进行检测的同时,同步采用PCR法检测,将两者的检测结果进行比对。
外部比对试验:通过协作单位,保留日常检测工作中获得的样本,采用PCR法检测,并将检测结果与协作单位按国标方法检测所得结果进行比对。
1.4.5 比对试验 内部比对试验:结合日常检测工作,按国
别加入到不同性质的21件样品中,与对照样同步进行增菌培养,再采用PCR法检测。加入的阳性样本均被检出。
2.3.5 实样比对验证 自2002年8月至2003年12月间,共
采集了70余批650件样本。以日常检测样品为主,其类别包括普通肛拭子、食品、海产品等。其中110件来自长宁区卫生检验所和闵行区卫生检验所。对上述样本进行检测,PCR法阳性样本数为430/650,国标方法阳性样本数为426/650,见表3。α=0.05),两种方法的阳 经统计检验χ,2=1.125,P>0.05(性检出率无显著性差异。
标方法对样本进行检测的同时,同步采用PCR法检测,将两者的检测结果进行比对。
外部比对试验:通过协作单位,保留日常检测工作中获得的样本,采用PCR法检测,并将检测结果与协作单位按国标方
478实用预防医学 2005年6月 第12卷 第3期 PracticalPreventiveMedicine,Jun.2005,Vol12,No.3
表3 两种方法检测结果比较
国标法
合计
+
-6218224
430220650
第一步。PCR技术本身是不能区分样本是否是活菌的,它检测的结果只是表示样本中是否含有特殊的DNA片断。
要判断所检测到的DNA片断是否来自活菌,可以采用比对检测的方法,即首先采集培养初期(约30min)的增菌液并冷藏,待增菌结束后再次采集,两者同时作PCR检测,观察阳性条带的亮度区别。当后者明显亮于前者,表示细菌量在培养后增加,即样本中存在活菌。
3.4 PCR法与国标法的相互应用配合 在副溶血性弧菌的
PCR法+-
4242426
合计
检测流程中,首先应对样品进行增菌培养,第二步可以对增菌
2.3.6 以上实验表明本PCR方法具有较高的特异性。2.4 方法的检测周期 PCR方法的检测周期一般不超过24h。第一个步骤与国标方法一致,即第1d进行增菌培养,而第2d则直接定性检测增菌液中的副溶血性弧菌,见表4。
表4 PCR与国标法的检测周期比较
周期(d)
方法
1
GB4789GB17012PCR法
2
3
4
5
6
液用PCR法检测,在较短的时间内即可获知结果;同时按国标法并参考PCR法的结果继续检验鉴定。在应急检测时,PCR法的快速性和灵敏性能明显体现出来,而国标法则作为标准方法用以作最后鉴定。在批量样品检测时,可以用PCR法作筛选,保留阳性继续按国标法检鉴定。
PCR,。
(闵
增菌增菌增菌
平板接种平板接种,斜面接种镜检-
镜检、嗜盐试验-
生化试验结果-
-
行区疾控中心微生物检验科杨丽华主任的大力支持和帮助,在此表示感
)谢。
3 讨论
3.1 增菌与DNA获取 本文所研究的PCR方法,其关键是要
[参考文献]
[1]Nishibuchi,M.andKaper,J.B.Duplicationandvariationofthether2
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(收稿日期:2004-12-05)
从样品中捕捉到目标DNA,然后再进行DNA扩增并检测。为提高检出率、排除干扰,本方法将增菌培养作为第一步骤。
其优点在于:(1)选择性增菌培养,可以大大提高副溶血性弧菌的含量;(2)有助于检测含活菌量较少或分布不均匀的样品;(3)抑制非嗜盐菌的干扰;(4)通过增菌液的稀释作用,降低样品基质中的干扰物质浓度,减弱对PCR反应的离子干扰效应;(5)有助于识别DNA是否来自于活菌。
其缺点在于:(1)培养周期没有缩短,仍需要8～16h;(2)嗜盐菌的抑制作用。如果采用振荡培养的方式,可以获得较好的增菌效果,并大幅缩短增菌时间。对于肛拭样品,由于其含菌量相对较高,本底干扰物不多,可以采用先以灭菌生理盐水洗脱、离心,再进行检测的方法。
3.2 方法中的空白与对照 试剂空白:不加样本,用以观察试
剂、环境是否受到污染。试剂盒阳性对照:即阳性扩增产物,用以进行结果比对及观察反应体系是否正确。实样阳性对照:即保留的质控样(已知阳性样本),用以观察实验全过程是否正确。
3.3 活菌与DNA 根据传统的观念,细菌检测是要检测活的
细菌。所以通过培养达到增菌的目的往往是检测步骤的重要