冬瓜多酚氧化酶的特性及抑制剂研究

食品开发与机械食品添加剂

冬瓜多酚氧化酶的特性及

抑制剂研究

高梦祥，杨凤琴

（长江大学生命科学学院，荆州４３４０２５）

摘要：以邻苯二酚为底物，采用分光光度法在４２０ｎｍ处测定冬瓜多酚氧化酶（ＰＰＯ）的活性，研究了不同温度和ｐＨ值对其活性的影响，并建立了酶促褐变反应动力学方程，探讨了抗坏血酸、亚硫酸氢钠、柠檬酸和ＥＤＴＡ－２Ｎａ４种抑制剂对冬瓜酶促褐变的抑制效果。结果表明，冬瓜多酚氧化酶的最适温度为２０℃，最适ｐＨ值为６．０；冬瓜多酚氧化酶的米氏方程符合单底物酶促反应动力学，相应的动力学参数为Ｋｍ＝０．０１１８ｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍ＝０．０５８６Ｕ／ｍｉｎ；化学抑制剂抗坏血酸、亚硫酸氢钠、柠檬酸和ＥＤＴＡ－２Ｎａ对多酚氧化酶都有抑制作用，其活性分别为对照的２５％、３２％、６２％和５７％。关键词：多酚氧化酶；冬瓜；褐变；抑制剂中图分类号：ＴＳ２０１．１

文献标志码：Ａ

文章编号：１００５－９９８９（２００８）０２－００１１－０４

ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅａｎｄＩｎｈｉｂｉｔｏｒ

ｉｎｗａｘ－ｇｏｕｒｄ

ＧＡＯＭｅｎｇ－ｘｉａｎｇ，ＹＡＮＧＦｅｎｇ－ｑｉｎ

（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＹａｎｇｔｚｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ４３４０２５）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｗａｘ－ｇｏｕｒｄｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ（ＰＰＯ）ｗａｓｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒａｔ４２０ｎｍｕｓｉｎｇｃａｔｅｃｈｏｌ

ａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ．

Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，

ｐＨａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｎＰＰＯｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄａｎｄｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃ

ｅｑｕａｔｉｏｎｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．

ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｐＨｗｅｒｅ２０℃ａｎｄｐＨ６．０

ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｅｑｕａｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｂｒｏｗｎｉｎｇｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｂｕｉｌｔａｃｃｏｒｄｅｄｗｉｔｈＭｉｃｈａｅｌｉｓ

收稿日期：２００７－０７－０４

作者简介：高梦祥（１９７１—），男，陕西武功人，副教授，博士，主要从事农产品深加工方面的研究工作。

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酶学性质的研究［Ｊ］．食品工业科技，２００４，（１）：１０８－１１０［７］梁华正，刘富梁，彭玲西，等．京尼平苷为底物测定β－葡萄

糖苷酶活力的方法［Ｊ］．食品科学，２００６，２７（４）：１８２－１８５［８］苏二正，夏涛，宛晓春，等．单宁酶和β－葡萄糖苷酶的共固

定化［Ｊ］．食品与生物技术学报，２００６，２５（１）：４０－４４

［９］张正竹，李英波，苏二正，等．β－葡萄糖苷酶的蚕丝素蛋白

膜固定化及其性质研究［Ｊ］．食品与发酵工业，２００４，３０（６）：６－９

［１０］李平，宛晓春，陶文沂，等．丝素蛋白膜固定β－葡萄糖苷酶

及其改良食品风味的研究［Ｊ］．菌物学报，２００４，２３（１）：７３－７８［１１］池玉杰，潘学仁，康海燕，等．硫磺菌原变种与淡红变种培

养特性的研究［Ｊ］．东北林业大学学报，１９９９，２７（３）：７９－８０［１２］ＳｈｉｏｎｏＹ，ＴａｍｅｓａｄａＹ，ＭｕｒａｖａｙｅｖＹＤ，ｅｔａｌ．Ｎ－Ｐｈｅｎ－

ｅｔｈｙｌｈｅｘａｄｅｃａｎａｍｉｄｅｆｒｏｍｔｈｅｅｄｉｂｌｅｍｕｓｈｒｏｏｍＬａｅ－ｔｉｐｏｒｕｓｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ［Ｊ］．ＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔＲｅｓｅａｒｃｈ，２００５，１９（４）：３６３－３６６

［１３］ＤａｖｏｌｉＰ，ＭｕｃｃｉＡ，ＳｃｈｅｎｅｔｔｉＬ，ｅｔａｌ．Ｌａｅｔｉｐｏｒｉｃａｃｉｄｓ，ａ

ｆａｍｉｌｙｏｆｎｏｎ－ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｐｏｌｙｅｎｅｐｉｇｍｅｎｔｓｆｒｏｍｆｒｕｉｔ－ｂｏｄｉｅｓａｎｄｌｉｑｕｉｄｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆＬａｅｔｉｐｏｒｕｓｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，６６（７）：８１７－８２３

［１４］汪国轮，郭学武，龚建华．硫磺菌原变种液体培养代谢物生

物活性分析［Ｊ］．微生物学报，２００５，４５（５）：７０２－７０６

１１

食品开发与机械

ｅｑｕａｔｉｏｎｍｏｄｌｅ．ＴｈｅＫｍ，Ｖｍａｘｏｆｋｉｎｅｔｉｃｅｑｕａｔｉｏｎｗｅｒｅ０．０１１８ｍｏｌ／Ｌ，０．０５８６Ｕ／ｍｉｎｕｓｉｎｇｃａｔｅｃｈｏｌａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｆｏｕｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓａｓａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ，ＮａＨＳＯ３，ｃｒｉｔｉｃａｃｉｄａｎｄＥＤＴＡ－２Ｎａｈａｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍａｔｉｃｂｒｏｗｎｉｎｇ．ＴｈｅｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＰＰＯｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｏ２５％，３２％，６２％ａｎｄ５７％．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ－ｏｘｉｄａｓｅ；ｗａｘ－ｇｏｕｒｄ；ｂｒｏｗｎｉｎｇ；ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ

冬瓜是一年生攀缘性草本植物，属于葫芦科，起源于中国和印度，广泛分布于亚洲的热带、亚热带及温带地区。冬瓜易栽培，产量高，耐贮藏，能消暑，清热利水，为夏秋季主要蔬菜之一［１］。冬瓜是果蔬中唯一不含脂肪的食品，其钠盐也较一般蔬菜低得多，含有的矿物质和维生素对需要限制钠盐食物的肾脏病、高血压、浮肿病人大有益处，因其含有丙醇二酸，能控制体内的糖转化为脂肪，从而防止了体内的脂肪堆积，所以对防止人体发胖、减脂健美，具有重要作用［２］。冬瓜加工、果实和果汁的色泽是衡量加工品质好坏的重要指标，由于破碎或切割造成的机械伤导致果实中相关酶和底物充分接触，引起酶促褐变的发生［３］。本试验是通过丙酮法提取冬瓜中的ＰＰＯ，研究其酶学特性并考察几种抑制剂对酶活性的影响，旨在为冬瓜尤其是鲜切和机械损伤后的冬瓜的保鲜技术提供参考依据。１材料与设备１．１材料

供试冬瓜：市售的成熟的新鲜冬瓜；

邻苯二酚、冷冻丙酮、磷酸氢二钾、柠檬酸、抗坏血酸（Ｖｃ）：分析纯试剂；亚硫酸氢钠、ＥＤＴＡ－２Ｎａ：生化试剂。１．２设备

７２２Ｓ可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；ＨＨ－４型恒温水浴锅：金坛市富华电器有限公司；ＰＬ３０３精密电子天平：上海精密科学仪器有限公司；ＢＣＤ－１９８家用电冰箱：吉诺尔电器（集团）公司；九阳料理器：山东九阳小家电有限公司；０１Ｕ７２８９高速冷冻离心机：上海安亭仪器厂。２试验方法

２．１ＰＰＯ的提取与制备［４－６］

将新鲜冬瓜用榨汁机捣碎后，加入４倍体积的冰丙酮在－２０℃冷冻过夜提取，再用用布氏漏斗抽滤，得到的残渣用冰丙酮反复冲洗（直到出现白色粉末）。将所得的丙酮粉于低温下保藏（以上操作均在冰浴上进行）。

取１ｇ丙酮粉加入ｐＨ为５．５的磷酸盐－柠檬酸缓冲液搅拌１０ｍｉｎ，再用冷冻离心机离心２０ｍｉｎ（４０００ｒ／ｍｉｎ），过滤得滤液即为粗酶液（低温下保藏备用）。

１２

Ｎｏ．２．２００８

２．２冬瓜ＰＰＯ活性的测定

以１．５ｍＬｐＨ５．５的柠檬酸磷酸盐缓冲液和１．５ｍＬ０．１ｍｏｌ／Ｌ邻苯二酚溶液，加入０．１ｍＬ的酶液，混匀后，室温（１０℃）下反应８ｍｉｎ，于４２０ｎｍ处测定产物ＯＤ值，以ＯＤ值的大小表示冬瓜ＰＰＯ活性的大小。一个酶活力单位定义为每分钟引起ＯＤ值增加０．００１所需的酶量。３结果与分析

３．１室温下冬瓜多酚氧化酶的反应动力学

在室温（１０℃）、ｐＨ为５．５条件下测定不同底物（邻苯二酚）浓度时产物吸光度随时间的变化，并分别拟合所得直线斜率，即为反应初速度Ｖｏ，如图１所示。做出反应初速率随邻苯二酚浓度变化的反应动力学曲线，如图２所示。

由图２可以看出，冬瓜ＰＰＯ所催化的酶促褐变反应的反应初速率随底物浓度的变化曲线类似于米氏方程所描述的反应初速率随底物浓度的变化规律，因此对试验结果做相应地处理进行验证。

米氏方程：Ｖ＝Ｖｍａｘ×［Ｓ］／（Ｋｍ＋［Ｓ］）可转化为１／Ｖ＝Ｋｍ／Ｖｍａｘ×１／［Ｓ］＋１／Ｖｍａｘ

对试验结果进行处理做出１／Ｖ与１／［Ｓ］图，如图３

食品开发与机械食品添加剂

所示。拟合直线决定系数达到０．９８７３，可见冬瓜多酚氧化酶酶促褐变反应动力学符合米氏方程。根据直线斜率和纵轴截距，可求得该反应的米氏常数Ｋｍ＝０．０１１８ｍｏｌ／Ｌ，最大反应速率Ｖｍａｘ＝０．０５８６Ｕ／ｍｉｎ，相应的米氏方程为Ｖ＝０．０５８６×［Ｓ］／（０．０１１８＋［Ｓ］）。Ｋｍ是酶催化反应的一个重要特征常数，Ｋｍ越小，说明底物与酶结合的亲和力越强。

加工中采用高温处理能破坏活钝化酶的活力。温度对冬瓜ＰＰＯ活性的影响如图５所示。

由图５可看出，冬瓜ＰＰＯ的最适温度为２０℃，在１５～４０℃间反应速度较大，高于６０℃酶开始钝化，故可采用热处理的方法对冬瓜进行处理。３．４抑制剂对ＰＰＯ活性的影响３．４．１

不同浓度抗坏血酸对ＰＰＯ活性的抑制

配制

０．０２％～０．１％梯度为０．０２％的抗坏血酸溶液，在各试管中分别加入１．５ｍＬ０．１ｍｏｌ／Ｌ的底物邻苯二酚、１．５ｍＬ缓冲液、抗坏血酸０．５ｍＬ、酶液０．１ｍＬ，对照组为１．５ｍＬ０．１ｍｏｌ／Ｌ的邻苯二酚，室温（１０℃）下恒温８ｍｉｎ后测定其吸光值。结果如图６所示。

图３１／Ｖ－１／［Ｓ］双倒数图

３．２ｐＨ值对冬瓜ＰＰＯ活性的影响

图６抗坏血酸（Ｖｃ）对ＰＰＯ活性的影响

由图６可看出，随着抗坏血酸用量的增加，ＰＰＯ的活性呈下降趋势，在抗坏血酸含量大于０．０６％时，ＰＰＯ活性基本保持不变，此时ＰＰＯ活性仅为对照的２５％。因此用０．０６％的抗坏血酸能有效抑制ＰＰＯ的活性。

图４ｐＨ值对ＰＰＯ活性的影响

３．４．２不同浓度亚硫酸氢钠对ＰＰＯ活性的抑制配

ｐＨ值对冬瓜ＰＰＯ活性的影响如图４所示。从图４可以看出，ＰＰＯ对ｐＨ的变化比较敏感，ｐＨ值小于３．０时ＰＰＯ活性非常弱，这是因为在强酸条件下，酶中的Ｃｕ２＋解离出来，使酶失活；而在ｐＨ６．０酶的活性最高；随着ｐＨ值的增加，酶的活性又逐渐下降，这是因为在碱性条件下，Ｃｕ２＋易转变成不溶性氢氧化铜而与酶脱离使酶失活［７］。本试验中，冬瓜ＰＰＯ的最适ｐＨ值为６．０。

３．３温度对ＰＰＯ活性的影响

用温度调节来控制酶催化反应速度是非常重要的。一方面，在低温下保藏食品能减少酶对软化、不良风味的产生和成熟的影响；另一方面，在食品

制０．０２％～０．１％梯度为０．０２％的亚硫酸氢钠溶液，参照３．４．１操作，测定其吸光值。结果如图７所示。

图７亚硫酸氢钠与ＰＰＯ活性的关系

图７结果表明，在０．０２～０．０８％的用量范围内，随着亚硫酸氢钠在反应体系中浓度的增加，酶活性显著下降，浓度大于０．０８％时，ＰＰＯ活性基本上不再变化，亚硫酸氢钠浓度为０．０８％时，ＰＰＯ的活性仅为对照的３２％。因此，浓度为０．０８％的亚硫酸氢钠能有效抑制ＰＰＯ活性，防止褐变，但在实际应用中要考虑Ｎａ＋超标问题。３．４．３

不同浓度柠檬酸对ＰＰＯ活性的抑制

配制

０．０２％～０．１％梯度为０．０２％的柠檬酸溶液，参照３．４．１操作，测定其吸光值。结果如图８所示。

１３

食品开发与机械

的亚硫酸氢钠能有效地抑制ＰＰＯ的活性，其活性分别为对照的２５％和３２％。抗坏血酸既作为醌的还原剂，又作为酶分子中铜离子的螯合剂，通过与多酚氧化酶的辅基Ｃｕ２＋离子螯合；它甚至可以被多酚氧化酶直接氧化，起到竞争性抑制剂的作用［７－８］。二氧化硫或亚硫酸盐具有较强的抑制、护色作用也常用来预防果蔬的酶促褐变。它们既可直接作用于酶本身，降低对单酚和二酚类的催化反应活性，又可与

图８柠檬酸与ＰＰＯ活性的关系

第一步反应生成的醌类物质发生不可逆的结合形成无色物质［９］；同时，亚硫酸钠有漂白和抑制微生物生长的作用。一般只要有游离的二氧化硫存在就能起作用，虽然二氧化硫和亚硫酸盐是高效酶促褐变的抑制剂，但是亚硫酸盐用于生食或鲜售的果蔬时不具有公认安全性，已经被限制使用，故要考虑ＳＯ２在食品中的残留问题［１０￣１１］。在实际生产中较为理想的抑制剂是抗坏血酸，它既具有较好的抑制效果，又

配

是食品中固有的营养成分，且安全性高。但是抗坏血酸本身易于被氧化，所以要使其能保持一定的抑制效果就要保持其含量的稳定；同时其不能与亚硫酸盐混合使用，否则会降低抗坏血酸及亚硫酸盐的抑制效果［１０］。

参考文献：

［１］车双辉，杜琪珍．冬瓜中活性成分的提取分离研究［Ｊ］．食品

研究与开发，２００４，２５（１）：１０４－１０５

［２］许磊．浅谈冬瓜的营养价值［Ｊ］．果蔬与健康，２００４，（３）：４７［３］连毅，李燕．果蔬褐变及其影响因素研究进展［Ｊ］．食品与药

学，２００６，８（１０）：３２－３６

［４］孙蕾，王太明，乔勇进，等．果实褐变机理及研究进展［Ｊ］．经

济林研究，２００２，２０（２）：９２－９３

［５］蔡其洪．龙眼果皮中多酚氧化酶活性的研究［Ｊ］．莆田学院

学报，２００６，１３（２）：３１－３３

［６］李晓莉，沈金玉，黄家音．山药多酚氧化酶特性研究［Ｊ］．精

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［９］沈金玉，黄家音，李晓莉．果蔬酶促褐变机理及其抑制方

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［１１］袁海娜．冬瓜贮藏过程中ＰＰＯ、ＰＯＤ和ＣＡＴ活性及同工

酶研究［Ｊ］．食品研究与开发，２００５，２６（１）：６１－６３

由图８可知，随着柠檬酸用量的增加，ＰＰＯ活性有所下降，但不是很明显，０．０６％的柠檬酸的ＰＰＯ的活性为对照的６２％，影响很小。柠檬酸抑制作用的机理主要有两个因素：首先，柠檬酸的螯合作用使得ＰＰＯ活性降低；此外，柠檬酸的酸性对反应体系的ｐＨ也有调节作用，使反应体系的ｐＨ值远离ＰＰＯ最适ｐＨ值而降低ＰＰＯ活性［８￣９］。３．４．４

不同浓度ＥＤＴＡ－２Ｎａ对ＰＰＯ活性的抑制制０．０２％～０．１％梯度为０．０２％的ＥＤＴＡ－２Ｎａ溶液，参照３．４．１操作，测定其吸光值。结果如图９所示。

图９ＥＤＴＡ－２Ｎａ与ＰＰＯ活性的关系

由图９可看出，０．０６％的ＥＤＴＡ－２Ｎａ对ＰＰＯ活性的抑制达到了最大，此时ＰＰＯ活性为对照的５７％。ＥＤＴＡ－２Ｎａ和柠檬酸的抑制效果差不多，对ＰＰＯ活性影响不是很大，其作用机理主要是作为金属螯合剂和多酚氧化酶中的Ｃｕ２＋作用，从而抑制了多酚氧化酶活性［９］。４结论与讨论

冬瓜多酚氧化酶催化的酶促褐变反应动力学曲线符合米氏方程所描述的动力学曲线，米氏常数Ｋｍ和Ｖｍａｘ分别为０．０１１８ｍｏｌ／Ｌ及０．０５８６Ｕ／ｍｉｎ。冬瓜多酚氧化酶的最适ｐＨ值为６．０，值为５．０～７．０范围内酶活力较大，在其他值下均表现出不同程度的抑制。温度小于６０℃对冬瓜多酚氧化酶的影响不是很大，曲线变化不明显，其最适的温度为２０℃。

抑制剂的加入对ＰＰＯ活性均有一定程度的抑制，抑制酶的效果的强弱顺序为抗坏血酸＞亚硫酸氢钠＞ＥＤＴＡ－２Ｎａ＞柠檬酸。０．０６％的抗坏血酸和０．０８％

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Ｎｏ．２．２００８

食品科技在线

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食品开发与机械食品添加剂

冬瓜多酚氧化酶的特性及

抑制剂研究

高梦祥，杨凤琴

（长江大学生命科学学院，荆州４３４０２５）

摘要：以邻苯二酚为底物，采用分光光度法在４２０ｎｍ处测定冬瓜多酚氧化酶（ＰＰＯ）的活性，研究了不同温度和ｐＨ值对其活性的影响，并建立了酶促褐变反应动力学方程，探讨了抗坏血酸、亚硫酸氢钠、柠檬酸和ＥＤＴＡ－２Ｎａ４种抑制剂对冬瓜酶促褐变的抑制效果。结果表明，冬瓜多酚氧化酶的最适温度为２０℃，最适ｐＨ值为６．０；冬瓜多酚氧化酶的米氏方程符合单底物酶促反应动力学，相应的动力学参数为Ｋｍ＝０．０１１８ｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍ＝０．０５８６Ｕ／ｍｉｎ；化学抑制剂抗坏血酸、亚硫酸氢钠、柠檬酸和ＥＤＴＡ－２Ｎａ对多酚氧化酶都有抑制作用，其活性分别为对照的２５％、３２％、６２％和５７％。关键词：多酚氧化酶；冬瓜；褐变；抑制剂中图分类号：ＴＳ２０１．１

文献标志码：Ａ

文章编号：１００５－９９８９（２００８）０２－００１１－０４

ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅａｎｄＩｎｈｉｂｉｔｏｒ

ｉｎｗａｘ－ｇｏｕｒｄ

ＧＡＯＭｅｎｇ－ｘｉａｎｇ，ＹＡＮＧＦｅｎｇ－ｑｉｎ

（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＹａｎｇｔｚｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ４３４０２５）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｗａｘ－ｇｏｕｒｄｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ（ＰＰＯ）ｗａｓｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒａｔ４２０ｎｍｕｓｉｎｇｃａｔｅｃｈｏｌ

ａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ．

Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，

ｐＨａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｎＰＰＯｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄａｎｄｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃ

ｅｑｕａｔｉｏｎｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．

ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｐＨｗｅｒｅ２０℃ａｎｄｐＨ６．０

ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｅｑｕａｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｂｒｏｗｎｉｎｇｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｂｕｉｌｔａｃｃｏｒｄｅｄｗｉｔｈＭｉｃｈａｅｌｉｓ

收稿日期：２００７－０７－０４

作者简介：高梦祥（１９７１—），男，陕西武功人，副教授，博士，主要从事农产品深加工方面的研究工作。

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

酶学性质的研究［Ｊ］．食品工业科技，２００４，（１）：１０８－１１０［７］梁华正，刘富梁，彭玲西，等．京尼平苷为底物测定β－葡萄

糖苷酶活力的方法［Ｊ］．食品科学，２００６，２７（４）：１８２－１８５［８］苏二正，夏涛，宛晓春，等．单宁酶和β－葡萄糖苷酶的共固

定化［Ｊ］．食品与生物技术学报，２００６，２５（１）：４０－４４

［９］张正竹，李英波，苏二正，等．β－葡萄糖苷酶的蚕丝素蛋白

膜固定化及其性质研究［Ｊ］．食品与发酵工业，２００４，３０（６）：６－９

［１０］李平，宛晓春，陶文沂，等．丝素蛋白膜固定β－葡萄糖苷酶

及其改良食品风味的研究［Ｊ］．菌物学报，２００４，２３（１）：７３－７８［１１］池玉杰，潘学仁，康海燕，等．硫磺菌原变种与淡红变种培

养特性的研究［Ｊ］．东北林业大学学报，１９９９，２７（３）：７９－８０［１２］ＳｈｉｏｎｏＹ，ＴａｍｅｓａｄａＹ，ＭｕｒａｖａｙｅｖＹＤ，ｅｔａｌ．Ｎ－Ｐｈｅｎ－

ｅｔｈｙｌｈｅｘａｄｅｃａｎａｍｉｄｅｆｒｏｍｔｈｅｅｄｉｂｌｅｍｕｓｈｒｏｏｍＬａｅ－ｔｉｐｏｒｕｓｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ［Ｊ］．ＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔＲｅｓｅａｒｃｈ，２００５，１９（４）：３６３－３６６

［１３］ＤａｖｏｌｉＰ，ＭｕｃｃｉＡ，ＳｃｈｅｎｅｔｔｉＬ，ｅｔａｌ．Ｌａｅｔｉｐｏｒｉｃａｃｉｄｓ，ａ

ｆａｍｉｌｙｏｆｎｏｎ－ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｐｏｌｙｅｎｅｐｉｇｍｅｎｔｓｆｒｏｍｆｒｕｉｔ－ｂｏｄｉｅｓａｎｄｌｉｑｕｉｄｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆＬａｅｔｉｐｏｒｕｓｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，６６（７）：８１７－８２３

［１４］汪国轮，郭学武，龚建华．硫磺菌原变种液体培养代谢物生

物活性分析［Ｊ］．微生物学报，２００５，４５（５）：７０２－７０６

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食品开发与机械

ｅｑｕａｔｉｏｎｍｏｄｌｅ．ＴｈｅＫｍ，Ｖｍａｘｏｆｋｉｎｅｔｉｃｅｑｕａｔｉｏｎｗｅｒｅ０．０１１８ｍｏｌ／Ｌ，０．０５８６Ｕ／ｍｉｎｕｓｉｎｇｃａｔｅｃｈｏｌａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｆｏｕｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓａｓａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ，ＮａＨＳＯ３，ｃｒｉｔｉｃａｃｉｄａｎｄＥＤＴＡ－２Ｎａｈａｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍａｔｉｃｂｒｏｗｎｉｎｇ．ＴｈｅｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＰＰＯｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｏ２５％，３２％，６２％ａｎｄ５７％．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ－ｏｘｉｄａｓｅ；ｗａｘ－ｇｏｕｒｄ；ｂｒｏｗｎｉｎｇ；ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ

冬瓜是一年生攀缘性草本植物，属于葫芦科，起源于中国和印度，广泛分布于亚洲的热带、亚热带及温带地区。冬瓜易栽培，产量高，耐贮藏，能消暑，清热利水，为夏秋季主要蔬菜之一［１］。冬瓜是果蔬中唯一不含脂肪的食品，其钠盐也较一般蔬菜低得多，含有的矿物质和维生素对需要限制钠盐食物的肾脏病、高血压、浮肿病人大有益处，因其含有丙醇二酸，能控制体内的糖转化为脂肪，从而防止了体内的脂肪堆积，所以对防止人体发胖、减脂健美，具有重要作用［２］。冬瓜加工、果实和果汁的色泽是衡量加工品质好坏的重要指标，由于破碎或切割造成的机械伤导致果实中相关酶和底物充分接触，引起酶促褐变的发生［３］。本试验是通过丙酮法提取冬瓜中的ＰＰＯ，研究其酶学特性并考察几种抑制剂对酶活性的影响，旨在为冬瓜尤其是鲜切和机械损伤后的冬瓜的保鲜技术提供参考依据。１材料与设备１．１材料

供试冬瓜：市售的成熟的新鲜冬瓜；

邻苯二酚、冷冻丙酮、磷酸氢二钾、柠檬酸、抗坏血酸（Ｖｃ）：分析纯试剂；亚硫酸氢钠、ＥＤＴＡ－２Ｎａ：生化试剂。１．２设备

７２２Ｓ可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；ＨＨ－４型恒温水浴锅：金坛市富华电器有限公司；ＰＬ３０３精密电子天平：上海精密科学仪器有限公司；ＢＣＤ－１９８家用电冰箱：吉诺尔电器（集团）公司；九阳料理器：山东九阳小家电有限公司；０１Ｕ７２８９高速冷冻离心机：上海安亭仪器厂。２试验方法

２．１ＰＰＯ的提取与制备［４－６］

将新鲜冬瓜用榨汁机捣碎后，加入４倍体积的冰丙酮在－２０℃冷冻过夜提取，再用用布氏漏斗抽滤，得到的残渣用冰丙酮反复冲洗（直到出现白色粉末）。将所得的丙酮粉于低温下保藏（以上操作均在冰浴上进行）。

取１ｇ丙酮粉加入ｐＨ为５．５的磷酸盐－柠檬酸缓冲液搅拌１０ｍｉｎ，再用冷冻离心机离心２０ｍｉｎ（４０００ｒ／ｍｉｎ），过滤得滤液即为粗酶液（低温下保藏备用）。

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Ｎｏ．２．２００８

２．２冬瓜ＰＰＯ活性的测定

以１．５ｍＬｐＨ５．５的柠檬酸磷酸盐缓冲液和１．５ｍＬ０．１ｍｏｌ／Ｌ邻苯二酚溶液，加入０．１ｍＬ的酶液，混匀后，室温（１０℃）下反应８ｍｉｎ，于４２０ｎｍ处测定产物ＯＤ值，以ＯＤ值的大小表示冬瓜ＰＰＯ活性的大小。一个酶活力单位定义为每分钟引起ＯＤ值增加０．００１所需的酶量。３结果与分析

３．１室温下冬瓜多酚氧化酶的反应动力学

在室温（１０℃）、ｐＨ为５．５条件下测定不同底物（邻苯二酚）浓度时产物吸光度随时间的变化，并分别拟合所得直线斜率，即为反应初速度Ｖｏ，如图１所示。做出反应初速率随邻苯二酚浓度变化的反应动力学曲线，如图２所示。

由图２可以看出，冬瓜ＰＰＯ所催化的酶促褐变反应的反应初速率随底物浓度的变化曲线类似于米氏方程所描述的反应初速率随底物浓度的变化规律，因此对试验结果做相应地处理进行验证。

米氏方程：Ｖ＝Ｖｍａｘ×［Ｓ］／（Ｋｍ＋［Ｓ］）可转化为１／Ｖ＝Ｋｍ／Ｖｍａｘ×１／［Ｓ］＋１／Ｖｍａｘ

对试验结果进行处理做出１／Ｖ与１／［Ｓ］图，如图３

食品开发与机械食品添加剂

所示。拟合直线决定系数达到０．９８７３，可见冬瓜多酚氧化酶酶促褐变反应动力学符合米氏方程。根据直线斜率和纵轴截距，可求得该反应的米氏常数Ｋｍ＝０．０１１８ｍｏｌ／Ｌ，最大反应速率Ｖｍａｘ＝０．０５８６Ｕ／ｍｉｎ，相应的米氏方程为Ｖ＝０．０５８６×［Ｓ］／（０．０１１８＋［Ｓ］）。Ｋｍ是酶催化反应的一个重要特征常数，Ｋｍ越小，说明底物与酶结合的亲和力越强。

加工中采用高温处理能破坏活钝化酶的活力。温度对冬瓜ＰＰＯ活性的影响如图５所示。

由图５可看出，冬瓜ＰＰＯ的最适温度为２０℃，在１５～４０℃间反应速度较大，高于６０℃酶开始钝化，故可采用热处理的方法对冬瓜进行处理。３．４抑制剂对ＰＰＯ活性的影响３．４．１

不同浓度抗坏血酸对ＰＰＯ活性的抑制

配制

０．０２％～０．１％梯度为０．０２％的抗坏血酸溶液，在各试管中分别加入１．５ｍＬ０．１ｍｏｌ／Ｌ的底物邻苯二酚、１．５ｍＬ缓冲液、抗坏血酸０．５ｍＬ、酶液０．１ｍＬ，对照组为１．５ｍＬ０．１ｍｏｌ／Ｌ的邻苯二酚，室温（１０℃）下恒温８ｍｉｎ后测定其吸光值。结果如图６所示。

图３１／Ｖ－１／［Ｓ］双倒数图

３．２ｐＨ值对冬瓜ＰＰＯ活性的影响

图６抗坏血酸（Ｖｃ）对ＰＰＯ活性的影响

由图６可看出，随着抗坏血酸用量的增加，ＰＰＯ的活性呈下降趋势，在抗坏血酸含量大于０．０６％时，ＰＰＯ活性基本保持不变，此时ＰＰＯ活性仅为对照的２５％。因此用０．０６％的抗坏血酸能有效抑制ＰＰＯ的活性。

图４ｐＨ值对ＰＰＯ活性的影响

３．４．２不同浓度亚硫酸氢钠对ＰＰＯ活性的抑制配

ｐＨ值对冬瓜ＰＰＯ活性的影响如图４所示。从图４可以看出，ＰＰＯ对ｐＨ的变化比较敏感，ｐＨ值小于３．０时ＰＰＯ活性非常弱，这是因为在强酸条件下，酶中的Ｃｕ２＋解离出来，使酶失活；而在ｐＨ６．０酶的活性最高；随着ｐＨ值的增加，酶的活性又逐渐下降，这是因为在碱性条件下，Ｃｕ２＋易转变成不溶性氢氧化铜而与酶脱离使酶失活［７］。本试验中，冬瓜ＰＰＯ的最适ｐＨ值为６．０。

３．３温度对ＰＰＯ活性的影响

用温度调节来控制酶催化反应速度是非常重要的。一方面，在低温下保藏食品能减少酶对软化、不良风味的产生和成熟的影响；另一方面，在食品

制０．０２％～０．１％梯度为０．０２％的亚硫酸氢钠溶液，参照３．４．１操作，测定其吸光值。结果如图７所示。

图７亚硫酸氢钠与ＰＰＯ活性的关系

图７结果表明，在０．０２～０．０８％的用量范围内，随着亚硫酸氢钠在反应体系中浓度的增加，酶活性显著下降，浓度大于０．０８％时，ＰＰＯ活性基本上不再变化，亚硫酸氢钠浓度为０．０８％时，ＰＰＯ的活性仅为对照的３２％。因此，浓度为０．０８％的亚硫酸氢钠能有效抑制ＰＰＯ活性，防止褐变，但在实际应用中要考虑Ｎａ＋超标问题。３．４．３

不同浓度柠檬酸对ＰＰＯ活性的抑制

配制

０．０２％～０．１％梯度为０．０２％的柠檬酸溶液，参照３．４．１操作，测定其吸光值。结果如图８所示。

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食品开发与机械

的亚硫酸氢钠能有效地抑制ＰＰＯ的活性，其活性分别为对照的２５％和３２％。抗坏血酸既作为醌的还原剂，又作为酶分子中铜离子的螯合剂，通过与多酚氧化酶的辅基Ｃｕ２＋离子螯合；它甚至可以被多酚氧化酶直接氧化，起到竞争性抑制剂的作用［７－８］。二氧化硫或亚硫酸盐具有较强的抑制、护色作用也常用来预防果蔬的酶促褐变。它们既可直接作用于酶本身，降低对单酚和二酚类的催化反应活性，又可与

图８柠檬酸与ＰＰＯ活性的关系

第一步反应生成的醌类物质发生不可逆的结合形成无色物质［９］；同时，亚硫酸钠有漂白和抑制微生物生长的作用。一般只要有游离的二氧化硫存在就能起作用，虽然二氧化硫和亚硫酸盐是高效酶促褐变的抑制剂，但是亚硫酸盐用于生食或鲜售的果蔬时不具有公认安全性，已经被限制使用，故要考虑ＳＯ２在食品中的残留问题［１０￣１１］。在实际生产中较为理想的抑制剂是抗坏血酸，它既具有较好的抑制效果，又

配

是食品中固有的营养成分，且安全性高。但是抗坏血酸本身易于被氧化，所以要使其能保持一定的抑制效果就要保持其含量的稳定；同时其不能与亚硫酸盐混合使用，否则会降低抗坏血酸及亚硫酸盐的抑制效果［１０］。

参考文献：

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研究与开发，２００４，２５（１）：１０４－１０５

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学，２００６，８（１０）：３２－３６

［４］孙蕾，王太明，乔勇进，等．果实褐变机理及研究进展［Ｊ］．经

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［Ｊ］．植物学通报，２００５，２２（２）：２１５－２２２

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研究进展［Ｊ］．西北林学报，２００５，２０（３）：１５６－１５９

［９］沈金玉，黄家音，李晓莉．果蔬酶促褐变机理及其抑制方

法研究进展［Ｊ］．食品研究与开发，２００５，２５（６）：１５０－１５５［１０］赵东海，王云，张建平．果疏酶促褐变及控制方法的研究

［Ｊ］．长江蔬菜，２００５，（７）：３２－３４

［１１］袁海娜．冬瓜贮藏过程中ＰＰＯ、ＰＯＤ和ＣＡＴ活性及同工

酶研究［Ｊ］．食品研究与开发，２００５，２６（１）：６１－６３

由图８可知，随着柠檬酸用量的增加，ＰＰＯ活性有所下降，但不是很明显，０．０６％的柠檬酸的ＰＰＯ的活性为对照的６２％，影响很小。柠檬酸抑制作用的机理主要有两个因素：首先，柠檬酸的螯合作用使得ＰＰＯ活性降低；此外，柠檬酸的酸性对反应体系的ｐＨ也有调节作用，使反应体系的ｐＨ值远离ＰＰＯ最适ｐＨ值而降低ＰＰＯ活性［８￣９］。３．４．４

不同浓度ＥＤＴＡ－２Ｎａ对ＰＰＯ活性的抑制制０．０２％～０．１％梯度为０．０２％的ＥＤＴＡ－２Ｎａ溶液，参照３．４．１操作，测定其吸光值。结果如图９所示。

图９ＥＤＴＡ－２Ｎａ与ＰＰＯ活性的关系

由图９可看出，０．０６％的ＥＤＴＡ－２Ｎａ对ＰＰＯ活性的抑制达到了最大，此时ＰＰＯ活性为对照的５７％。ＥＤＴＡ－２Ｎａ和柠檬酸的抑制效果差不多，对ＰＰＯ活性影响不是很大，其作用机理主要是作为金属螯合剂和多酚氧化酶中的Ｃｕ２＋作用，从而抑制了多酚氧化酶活性［９］。４结论与讨论

冬瓜多酚氧化酶催化的酶促褐变反应动力学曲线符合米氏方程所描述的动力学曲线，米氏常数Ｋｍ和Ｖｍａｘ分别为０．０１１８ｍｏｌ／Ｌ及０．０５８６Ｕ／ｍｉｎ。冬瓜多酚氧化酶的最适ｐＨ值为６．０，值为５．０～７．０范围内酶活力较大，在其他值下均表现出不同程度的抑制。温度小于６０℃对冬瓜多酚氧化酶的影响不是很大，曲线变化不明显，其最适的温度为２０℃。

抑制剂的加入对ＰＰＯ活性均有一定程度的抑制，抑制酶的效果的强弱顺序为抗坏血酸＞亚硫酸氢钠＞ＥＤＴＡ－２Ｎａ＞柠檬酸。０．０６％的抗坏血酸和０．０８％

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