课 程 论 文
课程名称：高级分子生物学
任课老师：谭晓风（教授）姓 名：
2007年7月8日
木本植物分子生物学的研究进展 (中国林科院林业所,北京100091)
摘要 分子生物学是近40年发展起来的一门新兴边缘科学,最初的发展主要以 微生物为研究对象,木本植物进展相对缓慢。随着研究的深入,以树木为受体的 分子生物学也取得了令人瞩目的成绩,树木转基因、基因表达调控、基因图谱、寻 找数量性状位点、基因组变异和进化等方面的研究相继开展起来。 关键词 分子生物学 基因工程 调控 基因图谱
分子生物学研究是1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构而真正揭开序 幕的。近40多年来,特别是基因工程研究的深入开展,无论是理论上还是实践上,都涌现 出一批突出的成果,其中微生物方面的进展最快,植物分子生物学研究要稍慢一些。
对树木来说,由于其生长周期长,基因组结构比较复杂,遗传操作不易,使得树木分子 生物学研究,与农作物等其它草本植物相比,一直处于比较落后的位置。近几年来,随着分 子生物学研究技术的不断成熟,对基因分子生物学理论和实践认识的不断提高,木本植物 分子生物学也取得了一些长足的进步。主要表现为:从树木基因组中分离和克隆新的有益 操作基因;转基因树木种类不断增多;以树木为受体研究某些外源基因的表达和功能;树 木基因图谱工作也开展起来,并以得到的基因连锁图谱为工具,分离和寻找合适的数量性 状位点
1 树木转基因研究的深入发展
70年代以来,基因重组技术和植物肿瘤发生分子生物学研究相继取得重大突破,使 得植物基因工程迅速发展起来。80年代中后期,由于迫切需要培育出具有抗性的优良树 种,促使树木基因工程也取得了飞速发展。
到目前为止,进行了遗传转化的树种有:杨树、核桃、刺槐、麻栎、桤木、桉树、苹果、李、 猕猴桃、鹅掌楸、胶皮枫香树、火炬松、欧洲赤松、白云杉、挪威云杉、花旗松等20余种。真正获得转基因植株的有杨树、核桃、苹果、李、葡萄。其中作为林木基因工程模式植物的杨树基因工程发展最快。
1987年Fillatli等人利用根癌农杆菌的Ti质粒为载体将NPTII基因导入杨树杂种 NC5339内,并经Southern Blot证明确有外源基因的存在,这是以树木为受体首次转化 获得的转基因植株[15]。次年他们运用同样方法又把抗除草剂草苷膦基因aroA基因转入 杨树杂种体内[16]。1990年王善平等人利用改造的Ti质粒,采用叶盘法转化毛白杨外植 体,结果表明转化苗中含有特异的胭脂碱活性[11],1991年,卜学贤、林忠平等人,分别利用 Ri质粒和Ti质粒进行毛白杨的遗传转化,获得转化植株,经Southern Blot证明呈阳性 反应[12]。以上这些工作的成功,都证明遗传转化技术的可行性。
在此基础上,以树木遗传改良为目的转化外源基因的工作也同时开展起来。目前导入 木本植物的外源基因主要有:来自沙门氏菌的aroA基因和来自吸水链霉菌的bar基因, 两者都能使受体植物获得对除草剂的抗性,来自苏云金杆菌的Bt基因和马铃薯、慈菇、水 稻等的蛋白酶抑制剂基因,它们能赋予或增强受体植物的抗虫性或对机械损伤的保护反 应能力[10,13,16~19]。1988年美国依阿华大学林学系,首先利用从马铃薯中提取的蛋白抑制 剂基因(proteinase inhibitor z)为目的基因,与NPTII基因构成嵌合基因,以根癌农杆菌 的Ti质粒为载体,对杨树杂种无性系NC5339进行了转化,获得了抗卡那霉素的植株[19], 其抗虫效果未见报道。1991年中科院微生物所的田颖川和中国林科院的韩一凡合作,利 用Ti质粒的双元载体系统把苏云金杆菌δ-内毒素基因(Bt基因)转入到欧洲黑杨中,获 得了转基因植株,Southern Blot证明该基因稳定插入到杨树基因组中,虫试测定表明,其 毒杀鳞翅目害虫舞毒蛾和杨尺蠖的能力高达76%~100%[10]。现在又开展了运用多种蛋
白酶抑制剂进行抗虫转基因的工作。另外,还有好几个研究小组正在进行这方面的研究。 加拿大Laval大学的Lise Jouanin正在用从水稻中提出的半胱氨酸型蛋白酶抑制剂进行 转基因试验。
为了提高木本植物纤维产量和质量,比利时Gent大学的Wout Boerjan实验室构建 了反义木质素生物合成关键酶,如0-甲基化转移酶(OMT)和肉桂酸醇脱氢酶(CAD)等 的基因,转入植物体,并获得了转基因植株,结果表明,转基因植株体内木质素合成单体含 量明显变化。加拿大British Columbia大学的Ellis研究小组从杨树中分离出4-香豆素 -辅酶A连接酶(4CL)基因,在反义构建到载体中转化烟草和杨树,研究木质素合成中
该基因的反义效果。在研究中人们认识到类黄酮类物质在树木生根中有很重要的作用,法 国INRA的Lise Jouanin实验室进行了用查尔酮合成酶(CHS)基因转化杨树的工作,获 得了成功[1~2]。
除杨树获得了多种转外源基因的工程植株外,还有核桃、苹果获得了转Bt基因的工 程植株,Southern Blot证明了外源基因整合到受体植物基因组中,其抗虫效果还未见报 道。
2 基因克隆和基因表达调控及其生理反应的研究
木本植物分子生物学基础研究方面的进展明显落后于草本植物。在木本植物中,迄今 已被克隆并阐明了碱基序列的基因总数不超过20个,主要有:与光合有关的基因、与外界 环境胁迫有关的基因、与材质改良有关的基因、外源凝集素基因以及与植物防卫反应有关 的基因。
2.1 与光合作用有关的基因
在木本植物基因表达调控研究中,发现松属等部分裸子植物的一些光合作用相关基 因不受光调控。捕光叶绿素a/b基因(cab)和二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶小亚基基因 (rbcS)是核DNA中与光合有关的两个基因。在被子植物中,这两种基因的表达受光调 控,光照可激活该基因的表达,一旦转入黑暗中,表达立即停止。而在裸子植物的松树中则 不受光调控,黑松、欧洲赤松和花旗松的cab基因和rbcS基因在黑暗中也能同样有高水 平的表达。
有关木本植物叶绿体DNA表达调控的研究进展也比较快。至今已从针叶树中克隆 出了4个叶绿体DNA基因,即:花旗松和黑松的rbcL(二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶大亚 基基因)、山地松的psbA(光系统Ⅱ叶绿素蛋白基因)、chlN(叶绿素合成基因)和chlB(叶 绿素合成基因)。已经知道,被子植物rbcL和psbA基因受光调控,但对黑松叶绿体DNA 的研究发现,其rbcL和psbA基因与核DNA的cab基因一样,不受光调控。chlN和chlB 基因最早在原核生物绿藻和苔藓植物地钱叶绿体DNA中发现的。它们与黑暗状态下的 叶绿素合成有关。1991年,Lidholm等首次从山地松叶绿体DNA中发现并克隆了这两个 基因,其他研究者在云杉和银杏等裸子植物叶绿体DNA中也发现了类似的碱基序列。但 在被子植物叶绿体DNA中,迄今尚未发现类似序列。chlN基因和chlB基因在针叶树中 的发现为阐明裸子植物光合作用基因调控机制提供了一个重要线索。
针叶树叶绿体DNA的遗传方式及结构也有很多特殊点。已研究过的草本植物叶绿 体DNA都是母系遗传。但DNA限制性片断多态性分析和种间杂交结果表明,针叶树叶 绿体DNA是父系遗传的,这一点已在花旗松、松及云杉等树种中得以证明[8]。被子植物 叶绿体DNA长度为135~160kb,通常含有一组反向排列的携带有核糖体RNA基因的 重复序列。在花旗松和火炬松的叶绿体DNA中不存在这一反向重复序列,因此其长度较 短,仅为120kb。
2.2 与外界环境胁迫有关的基因
外界环境胁迫引起植物代谢过程中一系列生理效应,以适应可能给植物带来的不利
影响,包括某些特异基因的激活。但对其作用机制还知之甚少,这一研究领域引起了中外 科学家的浓厚兴趣。还有部分科学家正在从外界环境胁迫特异的cDNA基因文库中克隆 和分离对主要环境胁迫发生反应的基因。美国德克萨斯大学Shujun Chang等人正从火炬 松中获得干旱胁迫诱导表达的部分基因,包括咖啡碱辅酶A合成酶、SAM-合成酶、几丁 质酶、与动物表皮基质类似的蛋白质等的基因,德国Pflanzenpathologie生化研究所Di- eter Ernst正从欧洲赤松中获得紫外线诱导表达基因,包括CAD酶,1,2-二苯乙烯合成 酶,羟甲基戊二酰辅酶A合成酶等基因。在其它一些植物中,也发现部分被环境胁迫诱导 的基因。如几丁质酶基因能被机械损伤、真菌感染和干旱胁迫诱导表达。为了获得更多的 针叶树可利用基因,美国林业遗传研究所的Claire Kinlaw正在利用David Neale建立的 遗传图谱标记从火炬松种子的cDNA克隆中筛选单一识别序列。这些序列为研究针叶树 的基因组结构和进化规律提供了有益的分子生物学工具。在此之前主要进行了一些已知 功能基因的分离,如编码光合蛋白、转移因子、糖酵解、胁迫诱导等的基因。最近的研究又 转向一些组织特异性cDNA克隆的筛选[1,9]。
根据已有的实验研究,美国俄勒冈州立大学的Gary Coleman提出了一个假设,解释 树木如何在秋季储存氮源,在春季光合需氮时释放氮源。他认为,树皮和树叶分别积累 32KD的树皮储存蛋白(BSP)和Win4基因编码的叶部蛋白。在日照时间短或氮素水平高 时,BSP在树皮薄壁组织中积累,Win4基因被抑制,在日照时间长和顶芽旺盛生长季节, BSP含量降低,Win4基因编码蛋白大量积累[1]。 2.3 与材质改良有关的基因
尽管针叶树缺乏有效的遗传转化和再生方法,关于其木质素方面的研究仍在继续。美 国北卡罗来纳州立大学的Ron Sederoff等人开展了从火炬松基因组中分离和克隆编码 木质素合成有关酶基因的研究,包括苯丙氨酸氨解酶(PAL)、肉桂酸乙醇脱氢酶(CAD)、 4-香豆素-辅酶A连接酶(4CL)。
美国的Mackay研究小组正致力于不同树种木质部发生的研究。他们讨论了树木材 质形成基因与动物癌症基因的相互关系。他解释,如果树木材质大量形成就是木质部分化 的最终阶段,那么该阶段的基因控制模式应与动物细胞的终端分化因子具有同源性,如 myb癌基因。确实,他从湿地松木质部特异的cDNA文库中克隆了11个类似myb的同源 异形基因,并发现部分基因在木质部中优先表达,表明它参与了材质发育。有两类myb基 因拷贝数很少,它们与大麦的myb33基因具有很高的同源性。另外,加拿大林业服务中心 的研究人员还报道了黑云杉的myb基因。他们从黑云杉雌球果cDNA文库中分离到类似 玉米C1基因。当用带有玉米Bz2启动子的C1基因转化落叶松和云杉的胚性愈伤组织时 实现了表达。进一步实验用C1基因代替黑云杉的myb同源盒,发现两者功能相同[2,9]。 2.4 其它基因
人们早就发现,昆虫危害或其它机械损伤能诱导马铃薯、番茄等植物体内某些损伤诱 导基因的表达,合成出能干扰昆虫消化功能的胰蛋白酶抑制剂。在木本植物杨树中也发现 了类似的基因调控现象[20]。从杨树中克隆出了损伤激活基因的cDNA,通过对其进行测 序得知其表达产物之一类似于大豆胰蛋白酶抑制剂,另一种表达产物类似于几丁质酶。在 杨树木质部的贮存蛋白中,通过对其cDNA序列的分析,也发现了与几丁质酶同源的氨 基酸序列。
能凝集动物红血球的蛋白质—外源凝集素(lectin)常见于草本植物种子中。在木本植 物的接骨木、刺槐和国槐树皮韧皮部中也发现了外源凝集素的积累[14],其积累量呈现季 节性变化;秋冬季大量形成,春季消失。外源凝集素基因的这种表达调控方式被认为可能 同自然界的光周期有关。吉田等(1992)从刺槐中克隆出了外源凝集素的cDNA,并测定了 其碱基序列。
3 基因图谱定位和寻找数量性状位点
基因图谱研究是近几年来国内外十分活跃的研究课题。利用基因图谱,就可进行目的 基因定位,寻找数量性状位点,分析基因组结构等。然而组建基因图谱第一步得到足够大 量的遗传标记位点。在植物遗传育种中,遗传性状标记也是重要的研究工具。新近发明的 两种以分子生物学为基础的遗传标记即RFLP (Restriction Fragment Length Polymor-
phisms)和RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA),为解释遗传变异的性质和内容、确定植物育种策略及揭示物种演化等方面提供了崭新的研究手段。与形态标记、细胞
学标记和同功酶标记等相比,这两种分子水平的遗传标记都具有方法可靠,不受显隐性关 系、环境条件和发育阶段的影响,揭示的多态性水平高,产生能反映遗传物质种类学特征 的大量多态性,可用于组建高密度的遗传图谱。
运用RFLP和RAPD这两种分子标记可以寻找数量性状位点(Quantitative Trait
Loci,简称QTL)。美国森林遗传研究所的Mitch Sewell阐述了用RFLP的方法构建两个 火炬松家系的连锁图谱,现在Neale和他的合作者正继续在此遗传连锁图谱的基础上开 展材质特性基因的分离工作,并进一步理解针叶树的基因组结构和组织方式。美国华盛顿 大学的Toby Bradshaw运用杨树的RFLP标记寻找其半同胞家系的QTL,取得了很好 的效果。同时,美国北卡罗来纳州立大学的一些研究人员正在用RAPD的图谱方法寻找 桉树属控制开花和生根的QTL位点[2~3]。
另外,一些实验室正在寻找基因组中简单重复序列(Simple Sequence Repeats,
SSRs)或微卫星DNA(Minisatellite DNA)中的长度多态性。美国UNDA林业服务中心 Crag Echt的研究表明,美国五针松的基因组约0.3%是由SSRs组成,在这些简单重复序 列中,二聚体、三聚体和四聚体的重复非常丰富。65%美国五针松的SSRs位点可以和侧 端引物配对扩增出DNA片段,这个高比例说明了SSRs的多态性(>4bp)水平高,并且比 其它针叶树种扩增的DNA片段多,与其工作相比,美国Maine大学的Keith Hutchison
试验的美洲落地松SSRs等位基因多态性水平低。美国林业遗传研究所David Harry运用 PCR的方法,设计并检查了火炬松cDNA克隆的特异序列引物,大约75%的引物扩增出 基因组DNA片段。这个高比例揭示了孟德尔多态性与限制性片段多态性是一致的。 4 检查树木基因组的波动性和进化规律
由于木本植物生活周期长,基因组杂合程度高,因此其遗传变异机制、基因进化规律 和进化时间,一直是木本植物分子生物学研究的重要领域。
Hutchison比较了美洲落叶松基因组中与SSRs相关的编码蛋白质的核苷酸遗传变
异情况。结果表明,蛋白质编码区序列变化较大,这可能是因为在不同环境条件下,不同等 位基因的选择结果。另外,Hutchison和他的合作者还发现,在温暖环境中,位于不同位点 的捕光色素复合体编码蛋白基因的扭曲分离方式。在基因编码区多态性水平高,在SSRs 区多态性水平低,这表明了针叶树具有相对有效的错配修复机制,还可能是由于针叶树具 有表型稳定性。
加拿大Laval大学Bousquet和他的合作者调查了种子植物进化过程中的化石标本, 证实了分子时钟的存在,并建立了现代被子植物起源于原始简单家系的理论。美国北卡罗 来纳州立大学的Ross Whetten提出了根据树木冠层发育状况推断木本植物顶芽谱系发 生规律的理论。例如,根据桃树表型,可估计转座遗传因子在体细胞胚中的插入频率,实验 中发现这种插入频率比一年生物种高得多,并且在不同顶端分生组织中变化很大,这种不 同冠层树种顶芽存在,巨大差异的理论,就很容易解释生活史长的树木为什么更能抵抗病 虫害的侵袭。
5 调查树木遗传多样性和群体结构
随着先进实验手段在林木遗传育种工作中的应用,估计树木遗传多样性和计算群体
遗传结构又有了新的突破。这些先进实验工具有指纹图谱、RAPD分析等。加拿大Laval 大学的Natalie Isabel同时运用同功酶和RAPD的方法比较了黑云杉种内和种间的遗传 变异性,实验表明,这两种标记得出的结果基本相似。加拿大Petawawa国家森林研究所 的Linda Deverno用400个RAPD引物检查北美油松基因组的遗传多态性,没有发现多 态性,这个结果也与同功酶得出的结果类似。
分子标记同样在树木群体遗传结构分析中发挥重要作用。美国的Jerry Tuskan等人 用RAPD标记精确分析了黄石国家公园1988年遭火灾后山杨林分群体的遗传变异规 律。分析表明,它们可能起源于同一无性系,并揭示了林分内的遗传多样性,而且多样性水 平与林分年龄一致。当该山杨无性系林分遭火灾后,重新自然繁殖,RAPD分析表明该林 分的种子资源已不是来自同一样本。新的幼苗群体差别显著,它们的遗传距离与地理位置 是一致的。1988年的大火灾又进一步增加了公园中山杨群体的变异性。
加拿大的Ben Sutton报道了他的研究小组利用云杉群落核糖体DNA的RFLP,建
立了在英属哥伦比亚管理区云杉种子迁移路线,并揭示了两个不同云杉种群体对干旱和 寒冷胁迫的耐受性与特异rDNA标记存在相关性。根据该种的rDNA指数,确定其对逆 境的耐受性,为管理者选择最佳幼苗种植地提供科学依据。同时,Sutton还报道了运用 PCR方法扩增叶绿体DNA高度可变区的指纹分析,这种方法是可行的,因为云杉叶绿体 基因组属父系遗传。单个胚胎指纹图谱就可分析种子园中80%的无性系,用于监测和评 估种子园生产力[1~2]。
综观木本植物分子生物学近期的发展情况,可以说是进步神速。一方面是分子生物学 和生物工程技术的飞速发展,特别是植物基因工程领域的日新月异,为木本植物分子生物 学更深入研究提供了许多有效模式;另一方面是该领域实验手段的不断更新,现代化仪器 设备的广泛使用和某些关键技术的突破。但也要清醒的看到制约其发展的一些限速因子。 木本植物分子生物学研究起步晚,技术复杂,研究周期长,很多方面还不成熟。许多有较高 经济价值树种组培技术还不过硬,它们的有效遗传转化系统还没有建立起来。特别是针叶 树种,进展非常缓慢。面对这种现状,目前对于林业生物学工作者来说,是机遇和挑战并 存。庆幸的是,很多研究人员已经注意到这一点,正加紧进行这方面的研究。
植物抗病分子生物学研究进展
摘要 从植物在分子水平上对植物抗病机制、抗病基因克隆及遗传转化三个方面,综述了国 内外在植物抗病分子生物学研究的进展。
关键词 分子生物学 抗病基因 抗病机制 研究进展
植物生长发育过程中,常受到各种病原菌(包括真菌、细菌、病毒等)的侵害。以造纸工业常用的桉树为例,其常见的病原菌达23种,病菌流行时,造成树木枯死、产量下降,在一定程上制约了桉树的发展,并对造纸工业造成影响。常规植物抗病方法主要有杂交育种及药物防治。杂交育种不仅受到亲缘关系的限制,而且花费时间较长;药物防治不仅增加生产成本和造成环境污染,还会由于药物的长期使用,使病菌产生抗药性,增加防治工作的难度。因此,研究病原菌侵染机制及植物防御系统抗病机理,从根本上解决植物染病问题就显得尤为重要。近二十年来,植物抗病分子生物学研究取得了较大进展,主要表现在:在分子水平上对植物抗病机制有了较深入的了解;抗病基因定位、分离手段更加先进;克隆出了一些抗病基因,并进行了遗传转化研究。本文将从三方面对植物抗病分子生物学研究状况作一综述。 1 植物防御体系抗病反应分子生物学研究状况 植物防御体系抗病反应分子生物学研究 是基因工程研究的基础。植物在与病原菌相 互长期进化过程中,通过各种代谢途径,在体
内形成了各种与抗病菌有关的物质,从而形 成植物自己的防御体系。目前国内外对植物 防御系统研究较多的主要有以下几方面。
1.1 宿主植物产生并积累的、对病原菌起拮抗作用的低分子量次生代谢物 这些次生物质主要是细胞壁合成代谢中 间产物,包括:苯丙氨酸代谢途径中的中间 产物,其中许多被称为植物抗毒素
(Phytoalexin),又称植保素,细胞壁的附加
成分,如木质素和木栓质等。它们通过加强细 胞壁的机械强度而起防御作用。
植保素是植物受侵染时产生的一类低分 子量抗病原菌的化合物,其主要产生途径是 苯丙氨酸代谢途径,它们的产生速度与积累 量与植物抗病有很大关系。植保素最先发现 于豌豆中,至今已在17科植物中发现并鉴定 了200多种植保素。研究最多的植保素有:类 萜植保素,如甘薯酮、利希酮、辣椒素等。一般 植物抗性品种中这类物质的含量高于非抗病 品种。类萜植保素的生物合成途径已知是乙 酸-甲羟戊酸途径;另一类植保素是类黄酮
植保素,如碗豆素、菜豆素、大豆素等。它们在 体内的合成途径是通过丙二酰—苯丙烷类途 径来完成。
植保素在植物体内积累有以下特点:(1) 抗性植物与感性植物同样可以积累植保素, 但抗性植物形成植保素类物质的速度较快, 在感病初期即可达到高峰,而感病植株则积 累很慢;(2)植保素只局限于植物受侵染的细 胞周围,并不运输到其它部位,因而可在受侵 染部位形成一道化学屏障,以阻挡病原菌的 进一步入侵;(3)植保素产生的诱导因素无专 一性。许多因素,如病菌侵染,紫外线照射等 均可诱导植保素产生。
与植保素不同的是,木质素含量的增加 则是通过宿主细胞木质化而阻碍病菌入侵, 表现在:木质素增加了细胞壁抗病菌穿透的 能力;木质化限制了病菌向宿主的扩散及宿 主营养物向病菌的扩散;木质素低分子量前 体还可钝化病菌的细胞膜、酶、致病毒素等。
1.2 宿主植物产生的一些水解酶、病原相关蛋白、蛋白酶抑制剂等 近年来,两种细胞水解酶在植物抗病中 的作用引起广泛注意,它们是几丁质酶与1, 3-β-葡聚糖酶。在正常情况下,这二种酶在 植物体内只是低水平的组成型表达,但在病
原菌等诱发因素存在下,抗病力强的植株该 酶的活性可迅速提高,它们作用的底物分别 是几丁质与葡聚糖,这二种物质在植物体内 并不存在,而存在于大多数真菌的细胞壁中, 因而这两种酶的高效表达可通过分解真菌细 胞壁而起到抑菌作用。
病原相关蛋白是植物受病菌侵染时产生 的一组抗菌蛋白,有些病原相关蛋白具有几 丁质酶或葡聚糖酶活性,有些的生物学功能
尚不清楚。已从烟草、欧洲芹菜、水稻、马铃薯 等植物中分离到了一些病原相关蛋白,并且 克隆出了基因。在烟草、马铃薯中得到的携带 病原相关的蛋白基因的转基因植物抗真菌病 原菌,对烟草黑胫病,马铃薯霜霉病表达高水 平抗性。
蛋白酶抑制剂则是又一类抗菌物质,它主要分布于植物贮藏组织中,如马铃薯中所 含的丝氨酸蛋白酶抑制剂,它们主要通过干 扰病原菌代谢而起抑菌作用。 1.3 凝集素
宿主积累的一些特殊的、可与多糖结合 而使细胞凝集的蛋白质类物质即凝集素。至 今从各类植物中分离到的植物凝集素有100 多种,它们在与病原菌相互作用中主要表现 在二个方面:一是寄主植物凝集素对病原菌 识别存在专一性;二是凝集素显示具有外源 抗体同类的作用,以小麦、大豆、花生、水豆为 材料所进行的凝集素体外抑制病菌试验均表 明:用从上述材料中提取的凝集素可抑制多 种病原菌的菌丝生长与孢子萌发。关于凝集 素在抗病中的作用研究还有待进一步深入。 除以上物质外,许多植物在生长及感病 过程中还积累了一些特殊的,作为结构组分 的蛋白质,以富含羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)、 富含甘氨酸糖蛋白(GRP)最具代表性。它们 主要分布于植物表层及一些厚角组织中,在 病害与伤害诱导下可大量产生,已在菜豆、大 豆、黄瓜、马铃薯等多种作物中发现此类现 象。HRGP具有凝集素活性并对病原菌有识 别、免疫作用;GRP则可能是作为植物防御 体系中的一种传递信号分子而起作用。 2 植物抗病基因克隆研究进展 2.1 克隆基因的来源
目前所克隆基因按来源主要有三个方
面,第一类来源于植物自身的抗病基因。几丁
质酶基因、葡聚糖酶基因、病原相关蛋白基 因、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因,这些基 因在大多数植物体内均存在,在自然条件下 仅在抗病品种中高效表达,在非抗病品种中 通常不存在或表达量极低。这些抗病基因的 克隆,并将之与强启动子重组,组成嵌合基
因,有极大增强转化植株抗病的可能性,这在烟草、马铃薯、菜豆、梨等作物中得到证明。木 本植物中已克隆到柑桔几丁质酶基因,并得 到枳壳转化植株;杨树中也克隆到几丁质酶 基因,其转化研究正在进行之中,杨树中还克 隆了一段功能类似于大豆胰蛋白酶抑制剂的 基因,其重组研究也在进行之中。
第二类抗病基因则来源于微生物。研究 工作者利用微生物之间的拮抗作用,找到对 病原菌有拮抗作用的微生物,从中克隆出抗 病基因。例如,一些细菌、放线菌、真菌等均可 产生几丁质酶,分解病原菌细胞壁。尖孢镰刀 菌是许多植物枯萎的致病菌,从克雷伯氏细 菌的一个菌株中分离到了可降解尖孢镰刀菌 的基因,该基因向番茄的转化研究正在进行 之中,如果成功,则可利用该基因向多种作物 的转化来减轻镰刀病的危害。
第三类来源于致病毒素。植物病原菌产 生的病毒素是重要的致病因子,如果植物可 以降解病原菌在侵染过程中产生的毒素,则 植物就能有效地抵抗病菌引起的进一步侵 染,从而提高自身的抗病性。例如从烟草野火 毒素中克隆的ttr基因可降解tabtoxin;从菜 豆晕斑菌毒素中克隆的octase基因可降解菜 豆萎蔫病病原菌所产生的毒素。 2.2 抗菌基因的克隆方法
在抗菌基因筛选方法上,研究工作者也 进行了许多有益尝试,有如下常用的策略方 法。(1)分子克隆战略,这种方法是把抗病品 种基因组按鸟枪法构建基因文库,然后逐次 转化感病品种,筛选出含抗病基因的克隆。该 方法的问题在于植物基因组较大,转化成功 率不高,效率低。(2)根据遗传分析,找出与抗 病基因连锁较近的已知基因为标记物,再用 染色体步行法,找出抗病基因。此法的问题在 于可利用的遗传子数据太少,并且植物染色 体基因组内含大量重复顺序,因此在实际应 用中存在许多困难。(3)以感、抗病品种等基
因为材料,应用RAPD/PCR法可快速地把目的基因定位出来,这是一种较先进的抗病
基因克隆新方法。(4)分离抗病蛋白质,再从 抗病蛋白质中克隆出相应蛋白基因。 在上述策略方法中,以RAPD/PCR法
较为引人注目。它是建立在PCR技术基础之 上,以随机寡聚脱氧核甘酸作为PCR反应引 物,对基因组DNA进行扩增而显示多态性 的DNA图谱的一种遗传技术。通过RAPD 可以找出与靶基因连锁的RAPD标记,进行 定位,并为以该RAPD标记为起点向靶基因 进行滑步,进而分离该基因打下基础。美国康 乃尔大学已利用该方法找到了3个与番茄抗 pot基因连锁的RAPD标记;2个与水稻
Xa21基因连锁的RAPD标记。1995澳大利 亚研究工作者已利用RAPD标记法在Sugar pine上找到了与抗白松锈病连锁的基因。新 西兰等国科研工作者也已于1995年用同样 方法在Loblollypine中定位了fusiformrust disease病的基因。
抗病基因克隆的另一方向是克隆抗病物 质代谢反应过程中的关键酶,通过这些酶基 因的克隆,改建而调节抗病代谢产物,进而提 高植物抗病性。如苯丙氨酸代谢中的一些重 要酶,象苯丙氨酸氨解酶、肉桂酸-4-羟化 酶等酶的基因已被克隆,并以多种植物为材 料,研究了这些基因在转录和翻译水平上的 调节。研究发现在诱导物存在下,抗性植物中 这些基因的转录活性迅速提高,其中木质素 合成关键酶肉桂基乙醇脱氢酶的转录活性比 其它植物抗毒素生物酶合成来的更快。由于 木质素是细胞壁次生加厚的最主要成分,因 而它的含量增加对植物抗逆性有重要作用。 近年来研究还发现,木质素合成过程中的许 多关键酶的基因具有多态性。如PAL、CHS 基因家族中不同成员所编码的多肽可能极其 相近,但其作用方式,调节方式可能很不相 同,这使得植物可以适应多样性、不断变化的 环境条件。
3 抗病分子生物学研究状况
与抗菌相比,抗病分子生物学研究则较 为滞后。由于病毒是严格活体寄生,它们利用 寄主原有的系统在细胞内复制、繁殖,因而对 病毒的抗生物质(如RNA、某些蛋白质、某些 类似于干扰素的蛋白质)常难于离体检测,抗 病因子的检测就显的更为困难。植物抗病毒
机理大致分三类:(1)在病毒侵入早期,病毒
侵染部位周围组织代谢上发生某些变化,如
木质素合成加剧,内源生长调节剂(如生长
素、脱落酸)的增加,过氧化物酶及多酶氧化
酶活性增加,毒性醌类物质的积累等,通过这
些代谢变化以阻止病毒的进一步入侵;(2)许
多植物体内存在抗病毒因子(AVF),它们包
括糖蛋白、RNA、某些低分子量化合物,有的
植物中还发现病毒复制抑制物;(3)某些植物
体内存在一种阻止病毒在细胞间运动的因
子,它们主要存在于烟草、菜豆。
目前只有烟草等少数作物有抗病毒基因
定位的报道。由于抗病毒基因难于定位,研究
者从以下几方面进行抗病毒研究:(1)借取病
毒分子生物学的研究成果,在植物体内导入
病毒的反义RNA,从而阻止病毒复制;(2)导
入病毒外壳蛋白基因,借交叉保护原理,提高
植物抗病性。这在烟草、蕃茄、桃、李、杏等中
已有成功报道;(3)转入病毒卫星RNA基
因,这方面尚未有成功报道。
4 结语
植物抗病分子生物学研究是一门综合性的新兴学科,它在农业、林业上的应用将日趋 广泛,它的研究的深入开展及成果的推广应
用,对于我国抗性育种研究将有极大的推动
作用,不仅可缩短育种周期,更可提高育种效
率,并减少农药的使用,从而带来巨大的社会
与经济效益。还应看到,我国的植物抗病分子
生物学与国外相比还比较落后,即需要各学
科的互相交流及互相促进,又需要与国外同
行广泛进行交流、学习,同时也要求各级领导
给予重视,给予一定的资金扶持。相信在我国
科学研究工作者的共同努力下,我国的植物
抗病分子生物学研究将取得更大进步。
参考文献
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研究中的应用.植物生理学通迅,1995,31(2)137~143.
植物抗病性的分子生物学研究进展
摘要:本文对植物抗病基因克隆策略及其可能功能、分类以及植物基因工程展望作了概述。
关键词:植物抗病基因;策略;功能;展望
植物在长期的进化过程中,需要不断抵抗病原微生
物(包括细菌、真菌和病毒)的侵害。在这种长期相互影
响的共进化过程中,植物逐渐形成一系列复杂而行之有
效的保护机制来抵御病原微生物的侵染。
迄今,科学家们对植物的抗病机制及其信号传导
植物保护反应和植物系统获得抗性(SAR)的产生等方
面做了大量工作,积累了丰富资料,逐渐揭示了植物在
长期进化过程中所形成的行之有效的保护机制,这里简
要介绍植物抗病性的分子生物学研究进展。
1 概论
植物的抗病反应可以发生在多种水平[1]:一方面植
物本身的某些结构障碍和化学成分具有抗病的功效,如
细胞壁的角质、蜡质、栓质、木质素、特殊的气孔结构及
影响病原物细胞透性的蛋白质和核糖体失活蛋白等
另一方面,植物在受到侵染时可以通过诱导产生的防卫
反应来推销抗病原菌,包括活性氧的释放、防卫基因表
达、过敏反应及系统获得性抗性等等。
关于病原与植物互作关系的遗传模式主要有两种第一是Flor提出的基因对基因假说。根据该假说,病
原的无毒基因(avr)产物或者次生代谢产物(称激发子
celicitior)与植物抗病(R)基因产物(受体)的互作,导致
寄主植物防卫基因的表达。第二是与亲和因子相关的
互作模式。其特点是:病原与互作有关的基因的作用是
导致病理与其寄主共发生亲和性互作。亲和性因子通
过改变寄主的生理特性而使其易受病原侵染,而抗病寄
主植物含有相应的抗病基因,其产物能使亲和性因子失
活而不起作用。
2 植物抗病基因研究进展
2.1 抗病基因克隆策略研究进展
植物的抗病基因(resistancegene)和防卫基因(de-
fensegene)是两个不同的概念。前者是指基因对基因假
说中的寄主植物中与病原无毒基因的迅速表达。后者
则是指前者之外的使植物表现抗病性的基因。
1992年以后抗病基因的克隆取得显著进展,迄今已
克隆了十多个抗病基因。其中应用最广泛而有效的两
种方法是转座子标签法(Transposontagging)和以图谱为基础的定位克隆法(map-basedgenecloing)。虽然高
等植物的基因组十分庞大而给抗病基因的克隆带来很
大障碍,但是随着RFLP、RAPD、AFLP等分子标记技术
的发展和应用,越来越多的抗病基因将被定位和克隆
特别值得注意的是随着模式植物(拟南芥和水稻)等基
因组全序列测定计划的迅速进行和完成及其后的功能
基因组学的开展,将有很多新的抗病基因被克隆和进行
功能研究。
另外,利用已知抗病基因的保守序列设计引物进行
PCR扩增已经在大豆[5]、马铃薯[6]、水稻[7]、大麦[8]、番
茄[9]和玉米[10]中分离到了许多与已知抗病基因同源的
DNA序列(RGA)。但是这些似乎并不赋予寄主抗
性[9、10]。利用RGA作为遗传标记结合后代分离群体有
利于在育种中快速而有效在对抗病基因进行辅助选
择[11]。
植物抗病性的分子生物学研究进展
植物在其生长发育过程中常受到一些病原微生物的侵袭,它们在自然生态系统中长期并存,相互适应,相互选择乃至协同进化,使得植物的抗病性与病原物的致病性之间形成一种动态平衡。但是,自人类开展农业活动之后,经常发生植物病害的大流行。农业上成片单一种植,直接降低了遗传上的多样性,增加了植物在时空上的连续性,为病原物的发展和连年积累提供了方便。此外,精耕细作下的农田小环境也更加有利于病原物的传播和侵染。目前,病害造成的损失一般为农作物产量的10%以上,同时还导致农产品质量下降。因此,病害已成为农业生产上不可忽视的重要问题。
人类克服植物病害的主要途径之一,是利用抗性资源,通过常规育种的方法培育抗病品种。鉴于常规育种途径本身的局限性,植物抗病性的复杂性以及对植物抗病机制认识的匮乏,抗病育种一直是农业生产上的重大难题。近年随着重组DNA技术的发展,植物抗病机制的分子生物学和抗病基因工程的研究有了许多突破,展示了诱人的前景,本文就这些研究进展作一综合论述。
1 植物抗病性的表现
植物对病原物的拮抗,表现为几种不同的途径〔1〕。一方面,植物本身的某些结构障碍和化学成份具有抗病的功效,前者如细胞壁的角质、蜡质、栓质、木质素及特殊的气孔结构等;后者如小分子抗病物质,影响病原物细胞透性的蛋白质和核糖体失活蛋白等。另外,植物在受到病原物侵染时还可通过诱导产生的防卫反应来拮抗,它主要包括活性氧的释放、防卫基因表达,过敏反应(Hyper-sensitive Response)和系统获得抗性(Systematic Acquired Resistance)等。活性氧的释放是寄主对病原早期的抗病反应之一,其作用体现在引起胞壁结构蛋白的氧化交联,激活细胞内一些防卫基因的表达,诱使细胞编程死亡和与过敏反应(HR)有关等方面〔2〕。防卫基因据其表达的产物可分为(1)细胞壁蛋白基因,编码细胞壁中富含羟脯氨酸的糖蛋白,过氧化物酶及硫堇等;(2)次生物质合成基因,编码植保素及木质素生物合成所需的酶;(3)病理相关蛋白基因,编码蛋白酶抑制剂、葡聚糖苷酶、几丁质水解酶等。过敏反应(HR)是植物最常见的抗病表现形式,它几乎总被视作抗病的标志,其特征是寄主植物在病原侵染的部位迅速形成枯斑从而限制病原的扩展〔3〕。过敏反应是一种局部的防卫反应,它可能相继使整个组织或植株都具有抗性,这种抗性称作系统获得抗性(SAR)。
2 植物抗病性的遗传基础
植物的抗病性与其它性状相比有其特殊性,即它不仅决定于植物本身的基因型,还取决于病原 物的基因型,因此,植物与病原物互作的遗传基础即构成了植物抗病的遗传基础。目前,广为接受的描述植物-病原互作关系的遗传模式有两种〔5〕,即与不亲和因子相关的互作模式和与
亲和因子相关的互作模式。
2.1 与不亲和因子相关的互作模式
该模式也称基因对基因学说,最早是Flor通过研究亚麻对亚麻锈菌的小种特异抗性提出的。迄今已被证明至少适合于几十种不同的植物-病原互作系统,包括真菌、细菌、病毒所致病害,以及线虫和寄生种子植物所致的病害〔7〕。其基本内容为:病原与其寄主植物的关系分亲和及不亲和两种类型,亲和与不亲和病原分别含毒性基因(vir)和无毒基因(avr),亲和与不亲和寄主分别含感病基因(r)和抗病基因(R)。当携无毒基因的病原与携抗病基因的寄主互作时,二者才表现不亲和,即寄主表现抗病;其它情况下,二者表现亲和,即寄主感病。寄主与病原间的非亲和性互作关系取决于病原产生的无毒(或非亲和)因子的变异性或寄主对该因子的敏感性,无毒因子通过改变寄主的生理特性而起作用。
2.2 与亲和因子相关的互作模式
该模式是Scheffer等首先提出的,它与上述模式的不同在于:病原与互作有关的基因的作用是 导致病原与其寄主仅发生亲和性互作。亲和性因子通过改变寄主的生理特性而使其易受病原侵染,而抗病寄主植物含有相应的抗病基因,其产物能使亲和性因子失活而不起作用。
2.3 与植物抗病性有关的基因及其功能
由上述内容看出,植物的抗病性既与其本身的基因有关,也与病原物的基因有关。正确认识这 些基因,对于从基因水平上了解植物抗病性是极为重要的。
2.3.1 病原物的致病基因 致病性基因(Pathogenicity genes)是指病原物中与决定对植物致病性有关的基因。致病基因主要包括毒性基因和无毒基因(Avirulent genes),前者决定对植物表现亲和性,即调控病害的发生与发展;后者决定病原菌小种与含相应抗病基因的寄主植物品种表现专化性不亲和。在概念上,毒性(Virulence)与致病性(Pathogenecity)以及无毒性(Avirulence)与无致病性(Nonpathogenecity)不能相混淆。还需指出的是,“无毒基因”这一术语常易引起误解,因而需对其含义正确认识。首先,无毒基因与毒性基因座位并不具有遗传等位关系,因为无毒基因的表达产物与致病表现型没有关系〔6〕。再如,由于无毒基因使得含有它的病原对抗性寄主因不亲和而不能侵染,病原的毒性因而无从谈起,但这并不等于病原对其他植物都没有毒性。因此,有人提出以“不亲和基因”〔5〕或“识别基因”〔6〕来取而代之似乎更为确切。
2.3.2 植物的抗病基因与防卫基因 植物的抗病基因(Resistance genes),不是字义上的具有抗 病功效的基因,而是指基因对基因假说中的寄主植物中与病原无毒基因表现非亲和性互作的基因,除此之外的使植物表现抗病性的基因叫防卫基因(Defense genes)。需要指出,防卫基因及其表达并不象抗病基因那样仅抗病植株所特有,而是感病植株也存在,只是感病植株中的防卫基因相对抗病植株被激活得慢和表达微弱得多而已〔1〕。与抗病基因相对的,是感病基因(Susceptible genes)。事实上,抗、感病基因在原生功能上都一样地是植物正常代谢所必需的基因,只是在病原侵染植物后它们才表现了这种截然对立的次生功能。由于前者已不易被认识,而后者却引人注意,致使它们分别被冠之以抗病基因和感病基因的名称。
3 病原的无毒基因
病原的无毒基因是Flor于1942年首先发现的,之后许多经典的遗传学研究证明,它广泛存在 于寄主植物的病原中,对无毒基因的克隆和更深入的认识只是近10年的事情。Staskawicz等于1984年通过把含无毒基因avrA的大豆丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringaepv.glycinea)小种的Cosmid克隆接合转移到不含avrA的小种中,继之以遗传互补实验,克隆了avrA,这是克隆的第一个无毒基因。随后,许多研究者通过类似的方法从不同的病原(包括细菌、真菌和病毒)中克隆了30多个无毒基因。这不仅有力地支持了基因对基因假说,而且也促进了对其本身的认识。无毒基因克隆后,发现克隆自某一病原的无毒基因可在其他病原中起作用。例如,将克隆自甘蓝黑腐黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris)一个小种的无毒基因avrRxv转化
到不含它的pv.glycinea、pv.phaseoli、pv.vigincola、pv.alfalfae、pv.holcicola和pv.malvacearum等致病变种中时,它们会分别在其对应的原来感病的寄主植物大豆、菜豆、豇豆、苜蓿、玉米和棉花上诱发过敏反应〔7〕。这表明,无毒基因不仅具有决定病原小种特异性(或寄主植物的品种特异性)的作用,而且还有更高水平上的特异性决定作用,即决定病原致病变种(或寄主植物种)的特异性。由此还说明,在不相关的植物中可能蕴含着功能相同的抗病基因。因为,根据基因对基因假说,对含有某一无毒基因的病原表现过敏反应的不同植物,应具有功能相同的抗病基因。无毒基因的序列分析表明,一些具有不同特异决定性的无毒基因之间存有明显的同源性〔7〕。例如,Bonas等发现X.C. pv.vesicatoria的无毒基因avrB3含有一长为102bp的高度保守且重复多次的基元序列(motif),它既在X.campestris的其它致病变种的无毒基因(如X. pv.malvacearum的avrB4、avrB6、avrB7、avrN101和avrB102)中存在〔11〕,在X.citri的avr pthA和X.oryzae的avrXa7和avrXa10中也存在〔12〕。由此推论,植物中对应于这些无毒基因的不同抗病基因可能也是同源保守的,并具有相似的抗病机制。虽然已有许多的无毒基因被克隆和测序,但对其确切产物及功能有较详细了解的却仅限少数几个〔9〕。其一是大豆丁香假单胞杆菌的无毒基因avrD,它编码的蛋白具有酶活性,负责合成了Sy-ringolides,能使含抗病基因Rpg4的大豆产生过敏反应;其二是番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum)无毒基因avr9,它编码一长为28个氨基酸残基的多肽,能使含抗病基因Cf-9的番茄形成过敏反应; 其三是烟草花叶病毒的外壳蛋白基因,它编码的外壳蛋白也能使含抗性基因N的烟草产生过敏反应;最后是Xanthomonas的无毒基因avrB3基因家族,它们编码的蛋白含有14~23个长为34个氨基酸残基的重复,由于某些重复的缺失会引起抗病特异性的改变,因而说明该蛋白是寄主植物的识别对象。由此可见,无毒基因诱使寄主植物形成过敏反应的激发子(Elicitor),或是其编码蛋白本身,或是其酶活性有关的产物。
4 植物的抗病基因
长期以来,人们积累了很多有关抗病基因表现的遗传资料,但迟迟不能实现对它的克隆。近两 年伴随着分子生物学技术的发展,抗病基因的克隆终获成功,对其特性也因此而有了深入的认识。
4.1 抗病基因的克隆
克隆基因的途径概括起来分为两种——正向遗传学途径和反向遗传学途径。前者以欲克隆基 因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型的突变进行;后者则着眼于基因本身,通过其特定的序列或其在基因组中的特定位置进行。由于抗病基因的产物及表达调控特性都尚不清楚,抗病突变体也难以确定或创造等,因此尚不能用根据基因产物蛋白质序列的克隆方法和相减杂交法992期张德水等:植物抗病性的分子生物学研究进展
等来克隆抗病基因。随着近年植物转化与再生以及抗病筛选等技术的日趋完善,用抗病个体的DNA片段转化感病个体,然后筛选抗病转化体来分离抗病基因这一名为“鸟枪克隆法”的途径似乎很有希望,但迄今尚无成功的报道。
转座子作为插入诱变剂,已广泛用于基因的鉴定和分离。在植物中,玉米的AC/DS、Spm和 Mu因子,金鱼草的Tam因子已成功地用于分离基因。由于AC和Spm转座子家族在其它植物中也具有转座功能,因此这一基因示踪系统可有效地用于其它植物。近年T-DNA作为插入诱变剂也受到了重视。将转座子或T-DNA插入到欲分离基因的内部或附近,基因发生突变而被标识,然后用插入DNA片段作探针即可从被标识的突变体基因文库中克隆基因,这一方法称之为转座子示踪(Transposon tagging)。通过该法克隆了玉米抗叶斑病菌基因Hml〔13〕,之后又相继克隆了烟草抗花叶病毒基因N〔14〕,番茄抗叶霉病基因Cf9〔15〕和亚麻抗叶锈基因L6〔16〕。显然,该法是目前克隆抗病基因的一种有效方法。
基于作图的克隆法,是近年发展的另一有效方法,即首先鉴定与目的基因连锁的分子标记,进而借助于染色体“步移”或“登陆”等方法来克隆目的基因。随着高密度遗传图谱和物理
图谱的构建,基于作图的基因克隆已成为可能,尤其是在基因组较小的植物如拟南芥菜、水稻和番茄中。例如,番茄抗丁香假单胞杆菌基因Pto、拟南芥抗丁香假单胞杆菌基因RPS2和水稻抗白叶枯病基因Xa21〔19〕等三个抗病基因都是籍此克隆的。
此外,植物的比较遗传作图法、高信息量的分子标记技术以及NIL和BSA分析法等都可有效地用以鉴定与目标基因紧密连锁的分子标记〔20〕,这将使得基于作图的克隆方法在克隆抗病基因及其它基因方面发挥更大的作用。
4.2 抗病基因的特性
抗病基因的克隆成功,也随之带来了对其特性更加深入的认识。玉米抗圆斑病基因Hm1,是迄 今所克隆的抗病基因中唯一符合与亲和因子有关的互作关系的,它编码依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的HC-毒素还原酶,该酶能使病原真菌产生的致病因子HC-毒素失活〔5,13〕。已克隆的其他抗病基因,均符合非亲和性互作关系,据其结构特点可分两种类型。一种是番茄Pto基因,其编码序列是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶,不含跨膜性区域,但氮端有一潜在的十四酰化位点〔17〕。另一种类型包括RPS2、N、Cf9、L6和Xa21等5个基因,它们不仅植物的来源不同,分别是拟南芥、烟草、番茄、亚麻和水稻,而且其拮抗的病原物类型也不同,包括细菌、真菌和病毒,但是它们的编码序列都具有相似的结构特征。最为明显的是,其编码蛋白都含有不同数目的富含亮氨酸的重复(LRRs),该重复单位广泛见于许多生物的多肽链中,并与介导蛋白质间的互作有关〔21〕。对这些基因的蛋白序列作进一步比较发现,它们可分为三亚类。一类包括RPS2、N和L6 3个基因,其间具有相对更高的同源性,而且都含有核苷酸结合位点〔14,16,18〕。具体到每个基因,都有其特殊之处。如拟南芥菜RPS2为细菌病原P.syringaepv.tomato和meculicola的抗性基因,它的氨基端有一短的疏水区,其氨基酸序列的碳端多带正电荷,这似乎是一信号锚定域,与此毗邻的还有一亮氨酸拉链,中部是一膜整合域;烟草N基因为TMV抗性基因,其蛋白氨基端的150个氨基酸残基与哺乳动物白芥素受体(IL-1R)及果蝇Toll蛋白的胞质域具有同源性;亚麻L6基因为真菌病原菌Melampsora lini的抗性基因,其蛋白的氨基端与烟草N基因相似,但有一信号肽。初步的突变及序列分析表明:RPS2和N蛋白不具信号先导肽。番茄Cf9基因抗真菌病原菌C.fulvum,由于其组成及结构的特点有别于上述3个基因,可被视作第二亚类〔15〕。它没有核苷酸结合位点,但有跨膜糖蛋白的特征——具有信号肽;成熟蛋白的氨基端有在胞外蛋白及类似受体激酶蛋白中位置保守的半胱氨酸,含一个由37个氨基酸组成的疏水跨膜域,且其侧翼为带电荷的锚定域(其胞内侧和胞外侧分别带正负电荷);与植物其他几种胞外LRRs蛋白一样,在许多的LRRs单位里有保守的甘氨酸残基。新近克隆的Xa21基因属于第三亚类,它在许多方面与Cf9基因有相似之处,但Cf9缺乏胞质内的丝/苏氨酸蛋白激酶功能域,而Xa21却同时集此胞内催化域和LRRs功能域于一身〔19〕。
5 植物抗病的分子机制
随着分子生物学技术的飞速发展及其在植物病理学中的广泛应用,尤其是抗病基因的成功克 隆与分析,植物抗病的分子机制这一复杂问题已渐露端倪。
5.1 与病原物亲和因子有关的植物抗病性机制
在该领域中,目前最清楚的是玉米对由Cochliobolus carbonum所引起的叶斑和穗霉病的抗性 机制〔5〕。玉米的抗病基因包括HM1和HM2,HM1使全生育期的整个植株都表现抗病,呈完全显性;HM2的抗病表现为部分显性,植株幼苗时感病,近成熟时才表现出抗性。HM1基因的编码产物为HC-毒素还原酶,该酶使病原Tox2基因座上的基因所控制合成的亲和性因子Hc-毒素失活,从而表现抗性。
另一种可能的抗性机制,是通过修饰甚至缺失亲和性因子的作用受体,使得植物对亲和因子失 去敏感性而表现抗性,目前对该机制的具体了解还不多。
5.2 与病原物非亲和因子有关的植物抗病性机制
反映寄主植物和病原间与非亲和因子有关的互作机制的一个广为接受的模式为:植物抗病基 因编码感触病原信号的受体分子(Receptor),而病原无毒基因的直接或间接产物即是信号分子 ——激发子(Elicitor),两者互作激活与抗病有关的信号传导级联网络,最终使植物表达一系列的防卫反应〔9〕。近年抗病基因研究的突破性进展,为该模式提供了更进一步的证据。
5.2.1 抗病基因产物与信号识别 抗病基因的克隆及序列分析所揭示的其编码蛋白的组成、拓朴学和亚细胞定位等特征,为揭开抗病基因的作用特点提供了线索。
番茄Pto基因的编码蛋白是位于胞内的丝/苏氨酸型蛋白激酶,这已被功能活性实验所证 明〔22〕。该蛋白酶虽然不含胞外或跨膜决定域,但其潜存的十四酰化位点使它连在细胞膜的内侧,因而可与跨膜或锚定在膜上并且被病原激发子活化的类似受体蛋白互作,激活最终产生抗性反应的磷酸化级联信号传导网络。分别来自烟草、亚麻和拟南芥的N、L6和Rps2 3个抗病基因具有很高的序列同源性,因而其抗病作用机制可能是相似的。N和L6基因的编码蛋白,在氮端都与哺乳动物IL-1R蛋白和果蝇Toll蛋白的胞质域相似。在哺乳动物及果蝇的免疫系统中,这两种蛋白的胞质域都会在病原信号的作用下,引起与Rel有关的转录因子的激活和从胞质到细胞核的移位,进而激活防卫基因的转录和表达。所以,抗病基因N和L6的编码蛋白可能都像IL-1R及Toll蛋白的胞质域那样,行使受体功能,触发信号传导途径,激活类似于Rel/KB的转录因子并相继使植物表达防卫反应。所不同的是N蛋白为胞质内定位,而L6蛋白则可通过先导信号肽附在膜上。关于RPS2基因,据其序列所作的拓扑学和亚细胞定位分析、离体翻译/移位实验分析以及它与N基因间的比较分析等表明,它的作用机制可能与N基因类似〔18〕。虽然Rps2基因的编码蛋白的氮端与IL-1R及Toll蛋白的胞质域并不相 似,但其亮氨酸拉链可使之形成类似Toll蛋白异二聚体式的结构。
抗病基因Cf9的编码蛋白是一种胞外糖蛋白,其结构与RLPKS的膜结合受体域相似。它的作用机制可能是其LRRs域直接与无毒基因avr9的产物结合,然后其胞质域激活某种类似于Pto蛋白的蛋白激酶或仅是与其它含LRRs的膜结合蛋白互作,最后激活抗病反应的信号传导网络。1012期张德水等:植物抗病性的分子生物学研究进展
抗病基因Xa21的编码蛋白最具特色,它与动物的酪氨酸受体激酶非常类似。其抗病作用机制 为:含LRRs的糖基化胞外域识别并结合病原无毒基因的激发子,由此激活胞质侧的激酶功能域,从而引发防卫反应〔19〕。
综上所述,符合非亲和性互作关系的6个抗病基因,它们虽然各具特点,但作用机制却非常相似,在抗病反应中都起着信号识别与传导的作用。这些抗病基因大都编码含LRRs的蛋白质,该种蛋白在病原激发子的作用下发生由LRRs介导的相互间的以及与其它含LRRs蛋白间的互作,产生二聚体或部分二聚体〔23〕。由此产生的信号通过蛋白激酶而继发传导,最终激活抗病防卫反应。这种相似性与基因对基因假说广泛适用于不同的寄主植物——病原互作系统的事实是相吻合的。
5.2.2 植物防卫反应的信号传递过程 根据基因对基因学说和上述的分析,抗病基因产物是avr基因产物的受体。两者间的互作是植物抗病反应的起始,防卫反应的激活是靶细胞或组织特异于病原信号的最终反应,其间有一信号传导过程,该过程一直是抗病研究的热点和难点之
一。抗病植物在受到非亲和病原侵染时,往往表达多种防卫反应,一般先是释放活性氧,相继激活防卫基因的表达,最后发生过敏反应和系统获得抗性。但是,不同的防卫反应之间有时并无必然的联系。例如,在有些情况下过敏反应发生了,而防卫基因却未表达,反之亦然。另外,即使是同一类防卫反应,在不同情况下其信号传导过程也有差异,例如不同防卫基因的表达有时间或空间上的差异。尽管如此,许多研究表明植物防卫反应的信号传导过程有着某些共性〔1〕。首先,蛋白激酶和磷酯酶引起的蛋白磷酸化是各种防卫反应表达的信号传导中的重要环节。另外,钙离子的变化、电解质渗透和G蛋白等也常出现在许多防卫反应的信号传导途径中,最近的一些研究还发现,水杨乙酸(SA)是激活某些防卫反应的重要信号分子,其作用是它作为
配体与过氧化氢酶结合,从而抑制该酶的活性,使细胞内的H2O2含量增加,由此诱导防卫反应 6 控制植物病害的基因工程策略
对植物病害的控制,主要通过有性杂交将抗源植物中的抗性基因转移到栽培品种来实现,这往 往需要6~8年,远不及病原小种的分化速度快,加之目前栽培品种的遗传基础日趋狭窄,因而生产上仍有病害大发生的隐患。分子生物学及基因工程技术的长足发展,尤其是近年来在抗病基因研究上的重大突破,为分子标记辅助抗病育种和基因工程抗病育种提供了诱人的前景。 基因工程抗病育种的途径之一,是利用克隆的抗病基因,通过基因工程的手段转化受体品种, 选择培养转基因的抗病品种,这已在不少植物上取得了成功。另外,还可依据群体遗传学原理,将对应于同一种病原的多个不同抗病基因转化到同一品种的不同个体中,产生仅在抗病基因座位上有差异的近等基因系混合群体,由此可实现该品种对病害的持久抗性。而且,这一途径克服了当使用混合品种群体时因其在株高和熟期等性状上不一致所带来的不利影响。
植物的防卫基因如今已有许多被克隆,对其序列、结构及表达等也有了较深入的认识,对它们 在抗病中的利用,也是采用与上述抗病基因完全相似的途径。此外,通过修饰改变防卫基因或调控其表达的时空性等,还可进一步提高其抗病的效能。
在上述的基因工程策略中,抗病基因是在诱导植物产生HR乃至SAR的信号传导网络的起始 步骤起作用,而防卫基因仅对某些种类的病原起有限程度的抗性作用。相反,HR或SAR往往是信号传导网络的终结,它们可拮抗各种病原,无特异性,且抗性能力也较强。因此,对直接产生HR或SAR的信号传导途径中的基因进行操作,是抗病基因工程更为理想的策略。研究发现,抗病基因或一些与抗病基因互作的基因的突变体,可产生类似于HR或SAR的表现型〔25,26〕,因此这些突变基。因可被用于植物对病害的防御。但这些基因的表达是组成性的,因而会造成植物的浪费和其一定程度的损伤。鉴此,可寻找受病原诱导表达的启动子并将avr基因置于它的调控之下,然后将其转化到含相应抗病基因的植物中,从而可使植物只在受病原侵染时产生HR或SAR。
课 程 论 文
课程名称：高级分子生物学
任课老师：谭晓风（教授）姓 名：
2007年7月8日
木本植物分子生物学的研究进展 (中国林科院林业所,北京100091)
摘要 分子生物学是近40年发展起来的一门新兴边缘科学,最初的发展主要以 微生物为研究对象,木本植物进展相对缓慢。随着研究的深入,以树木为受体的 分子生物学也取得了令人瞩目的成绩,树木转基因、基因表达调控、基因图谱、寻 找数量性状位点、基因组变异和进化等方面的研究相继开展起来。 关键词 分子生物学 基因工程 调控 基因图谱
分子生物学研究是1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构而真正揭开序 幕的。近40多年来,特别是基因工程研究的深入开展,无论是理论上还是实践上,都涌现 出一批突出的成果,其中微生物方面的进展最快,植物分子生物学研究要稍慢一些。
对树木来说,由于其生长周期长,基因组结构比较复杂,遗传操作不易,使得树木分子 生物学研究,与农作物等其它草本植物相比,一直处于比较落后的位置。近几年来,随着分 子生物学研究技术的不断成熟,对基因分子生物学理论和实践认识的不断提高,木本植物 分子生物学也取得了一些长足的进步。主要表现为:从树木基因组中分离和克隆新的有益 操作基因;转基因树木种类不断增多;以树木为受体研究某些外源基因的表达和功能;树 木基因图谱工作也开展起来,并以得到的基因连锁图谱为工具,分离和寻找合适的数量性 状位点
1 树木转基因研究的深入发展
70年代以来,基因重组技术和植物肿瘤发生分子生物学研究相继取得重大突破,使 得植物基因工程迅速发展起来。80年代中后期,由于迫切需要培育出具有抗性的优良树 种,促使树木基因工程也取得了飞速发展。
到目前为止,进行了遗传转化的树种有:杨树、核桃、刺槐、麻栎、桤木、桉树、苹果、李、 猕猴桃、鹅掌楸、胶皮枫香树、火炬松、欧洲赤松、白云杉、挪威云杉、花旗松等20余种。真正获得转基因植株的有杨树、核桃、苹果、李、葡萄。其中作为林木基因工程模式植物的杨树基因工程发展最快。
1987年Fillatli等人利用根癌农杆菌的Ti质粒为载体将NPTII基因导入杨树杂种 NC5339内,并经Southern Blot证明确有外源基因的存在,这是以树木为受体首次转化 获得的转基因植株[15]。次年他们运用同样方法又把抗除草剂草苷膦基因aroA基因转入 杨树杂种体内[16]。1990年王善平等人利用改造的Ti质粒,采用叶盘法转化毛白杨外植 体,结果表明转化苗中含有特异的胭脂碱活性[11],1991年,卜学贤、林忠平等人,分别利用 Ri质粒和Ti质粒进行毛白杨的遗传转化,获得转化植株,经Southern Blot证明呈阳性 反应[12]。以上这些工作的成功,都证明遗传转化技术的可行性。
在此基础上,以树木遗传改良为目的转化外源基因的工作也同时开展起来。目前导入 木本植物的外源基因主要有:来自沙门氏菌的aroA基因和来自吸水链霉菌的bar基因, 两者都能使受体植物获得对除草剂的抗性,来自苏云金杆菌的Bt基因和马铃薯、慈菇、水 稻等的蛋白酶抑制剂基因,它们能赋予或增强受体植物的抗虫性或对机械损伤的保护反 应能力[10,13,16~19]。1988年美国依阿华大学林学系,首先利用从马铃薯中提取的蛋白抑制 剂基因(proteinase inhibitor z)为目的基因,与NPTII基因构成嵌合基因,以根癌农杆菌 的Ti质粒为载体,对杨树杂种无性系NC5339进行了转化,获得了抗卡那霉素的植株[19], 其抗虫效果未见报道。1991年中科院微生物所的田颖川和中国林科院的韩一凡合作,利 用Ti质粒的双元载体系统把苏云金杆菌δ-内毒素基因(Bt基因)转入到欧洲黑杨中,获 得了转基因植株,Southern Blot证明该基因稳定插入到杨树基因组中,虫试测定表明,其 毒杀鳞翅目害虫舞毒蛾和杨尺蠖的能力高达76%~100%[10]。现在又开展了运用多种蛋
白酶抑制剂进行抗虫转基因的工作。另外,还有好几个研究小组正在进行这方面的研究。 加拿大Laval大学的Lise Jouanin正在用从水稻中提出的半胱氨酸型蛋白酶抑制剂进行 转基因试验。
为了提高木本植物纤维产量和质量,比利时Gent大学的Wout Boerjan实验室构建 了反义木质素生物合成关键酶,如0-甲基化转移酶(OMT)和肉桂酸醇脱氢酶(CAD)等 的基因,转入植物体,并获得了转基因植株,结果表明,转基因植株体内木质素合成单体含 量明显变化。加拿大British Columbia大学的Ellis研究小组从杨树中分离出4-香豆素 -辅酶A连接酶(4CL)基因,在反义构建到载体中转化烟草和杨树,研究木质素合成中
该基因的反义效果。在研究中人们认识到类黄酮类物质在树木生根中有很重要的作用,法 国INRA的Lise Jouanin实验室进行了用查尔酮合成酶(CHS)基因转化杨树的工作,获 得了成功[1~2]。
除杨树获得了多种转外源基因的工程植株外,还有核桃、苹果获得了转Bt基因的工 程植株,Southern Blot证明了外源基因整合到受体植物基因组中,其抗虫效果还未见报 道。
2 基因克隆和基因表达调控及其生理反应的研究
木本植物分子生物学基础研究方面的进展明显落后于草本植物。在木本植物中,迄今 已被克隆并阐明了碱基序列的基因总数不超过20个,主要有:与光合有关的基因、与外界 环境胁迫有关的基因、与材质改良有关的基因、外源凝集素基因以及与植物防卫反应有关 的基因。
2.1 与光合作用有关的基因
在木本植物基因表达调控研究中,发现松属等部分裸子植物的一些光合作用相关基 因不受光调控。捕光叶绿素a/b基因(cab)和二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶小亚基基因 (rbcS)是核DNA中与光合有关的两个基因。在被子植物中,这两种基因的表达受光调 控,光照可激活该基因的表达,一旦转入黑暗中,表达立即停止。而在裸子植物的松树中则 不受光调控,黑松、欧洲赤松和花旗松的cab基因和rbcS基因在黑暗中也能同样有高水 平的表达。
有关木本植物叶绿体DNA表达调控的研究进展也比较快。至今已从针叶树中克隆 出了4个叶绿体DNA基因,即:花旗松和黑松的rbcL(二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶大亚 基基因)、山地松的psbA(光系统Ⅱ叶绿素蛋白基因)、chlN(叶绿素合成基因)和chlB(叶 绿素合成基因)。已经知道,被子植物rbcL和psbA基因受光调控,但对黑松叶绿体DNA 的研究发现,其rbcL和psbA基因与核DNA的cab基因一样,不受光调控。chlN和chlB 基因最早在原核生物绿藻和苔藓植物地钱叶绿体DNA中发现的。它们与黑暗状态下的 叶绿素合成有关。1991年,Lidholm等首次从山地松叶绿体DNA中发现并克隆了这两个 基因,其他研究者在云杉和银杏等裸子植物叶绿体DNA中也发现了类似的碱基序列。但 在被子植物叶绿体DNA中,迄今尚未发现类似序列。chlN基因和chlB基因在针叶树中 的发现为阐明裸子植物光合作用基因调控机制提供了一个重要线索。
针叶树叶绿体DNA的遗传方式及结构也有很多特殊点。已研究过的草本植物叶绿 体DNA都是母系遗传。但DNA限制性片断多态性分析和种间杂交结果表明,针叶树叶 绿体DNA是父系遗传的,这一点已在花旗松、松及云杉等树种中得以证明[8]。被子植物 叶绿体DNA长度为135~160kb,通常含有一组反向排列的携带有核糖体RNA基因的 重复序列。在花旗松和火炬松的叶绿体DNA中不存在这一反向重复序列,因此其长度较 短,仅为120kb。
2.2 与外界环境胁迫有关的基因
外界环境胁迫引起植物代谢过程中一系列生理效应,以适应可能给植物带来的不利
影响,包括某些特异基因的激活。但对其作用机制还知之甚少,这一研究领域引起了中外 科学家的浓厚兴趣。还有部分科学家正在从外界环境胁迫特异的cDNA基因文库中克隆 和分离对主要环境胁迫发生反应的基因。美国德克萨斯大学Shujun Chang等人正从火炬 松中获得干旱胁迫诱导表达的部分基因,包括咖啡碱辅酶A合成酶、SAM-合成酶、几丁 质酶、与动物表皮基质类似的蛋白质等的基因,德国Pflanzenpathologie生化研究所Di- eter Ernst正从欧洲赤松中获得紫外线诱导表达基因,包括CAD酶,1,2-二苯乙烯合成 酶,羟甲基戊二酰辅酶A合成酶等基因。在其它一些植物中,也发现部分被环境胁迫诱导 的基因。如几丁质酶基因能被机械损伤、真菌感染和干旱胁迫诱导表达。为了获得更多的 针叶树可利用基因,美国林业遗传研究所的Claire Kinlaw正在利用David Neale建立的 遗传图谱标记从火炬松种子的cDNA克隆中筛选单一识别序列。这些序列为研究针叶树 的基因组结构和进化规律提供了有益的分子生物学工具。在此之前主要进行了一些已知 功能基因的分离,如编码光合蛋白、转移因子、糖酵解、胁迫诱导等的基因。最近的研究又 转向一些组织特异性cDNA克隆的筛选[1,9]。
根据已有的实验研究,美国俄勒冈州立大学的Gary Coleman提出了一个假设,解释 树木如何在秋季储存氮源,在春季光合需氮时释放氮源。他认为,树皮和树叶分别积累 32KD的树皮储存蛋白(BSP)和Win4基因编码的叶部蛋白。在日照时间短或氮素水平高 时,BSP在树皮薄壁组织中积累,Win4基因被抑制,在日照时间长和顶芽旺盛生长季节, BSP含量降低,Win4基因编码蛋白大量积累[1]。 2.3 与材质改良有关的基因
尽管针叶树缺乏有效的遗传转化和再生方法,关于其木质素方面的研究仍在继续。美 国北卡罗来纳州立大学的Ron Sederoff等人开展了从火炬松基因组中分离和克隆编码 木质素合成有关酶基因的研究,包括苯丙氨酸氨解酶(PAL)、肉桂酸乙醇脱氢酶(CAD)、 4-香豆素-辅酶A连接酶(4CL)。
美国的Mackay研究小组正致力于不同树种木质部发生的研究。他们讨论了树木材 质形成基因与动物癌症基因的相互关系。他解释,如果树木材质大量形成就是木质部分化 的最终阶段,那么该阶段的基因控制模式应与动物细胞的终端分化因子具有同源性,如 myb癌基因。确实,他从湿地松木质部特异的cDNA文库中克隆了11个类似myb的同源 异形基因,并发现部分基因在木质部中优先表达,表明它参与了材质发育。有两类myb基 因拷贝数很少,它们与大麦的myb33基因具有很高的同源性。另外,加拿大林业服务中心 的研究人员还报道了黑云杉的myb基因。他们从黑云杉雌球果cDNA文库中分离到类似 玉米C1基因。当用带有玉米Bz2启动子的C1基因转化落叶松和云杉的胚性愈伤组织时 实现了表达。进一步实验用C1基因代替黑云杉的myb同源盒,发现两者功能相同[2,9]。 2.4 其它基因
人们早就发现,昆虫危害或其它机械损伤能诱导马铃薯、番茄等植物体内某些损伤诱 导基因的表达,合成出能干扰昆虫消化功能的胰蛋白酶抑制剂。在木本植物杨树中也发现 了类似的基因调控现象[20]。从杨树中克隆出了损伤激活基因的cDNA,通过对其进行测 序得知其表达产物之一类似于大豆胰蛋白酶抑制剂,另一种表达产物类似于几丁质酶。在 杨树木质部的贮存蛋白中,通过对其cDNA序列的分析,也发现了与几丁质酶同源的氨 基酸序列。
能凝集动物红血球的蛋白质—外源凝集素(lectin)常见于草本植物种子中。在木本植 物的接骨木、刺槐和国槐树皮韧皮部中也发现了外源凝集素的积累[14],其积累量呈现季 节性变化;秋冬季大量形成,春季消失。外源凝集素基因的这种表达调控方式被认为可能 同自然界的光周期有关。吉田等(1992)从刺槐中克隆出了外源凝集素的cDNA,并测定了 其碱基序列。
3 基因图谱定位和寻找数量性状位点
基因图谱研究是近几年来国内外十分活跃的研究课题。利用基因图谱,就可进行目的 基因定位,寻找数量性状位点,分析基因组结构等。然而组建基因图谱第一步得到足够大 量的遗传标记位点。在植物遗传育种中,遗传性状标记也是重要的研究工具。新近发明的 两种以分子生物学为基础的遗传标记即RFLP (Restriction Fragment Length Polymor-
phisms)和RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA),为解释遗传变异的性质和内容、确定植物育种策略及揭示物种演化等方面提供了崭新的研究手段。与形态标记、细胞
学标记和同功酶标记等相比,这两种分子水平的遗传标记都具有方法可靠,不受显隐性关 系、环境条件和发育阶段的影响,揭示的多态性水平高,产生能反映遗传物质种类学特征 的大量多态性,可用于组建高密度的遗传图谱。
运用RFLP和RAPD这两种分子标记可以寻找数量性状位点(Quantitative Trait
Loci,简称QTL)。美国森林遗传研究所的Mitch Sewell阐述了用RFLP的方法构建两个 火炬松家系的连锁图谱,现在Neale和他的合作者正继续在此遗传连锁图谱的基础上开 展材质特性基因的分离工作,并进一步理解针叶树的基因组结构和组织方式。美国华盛顿 大学的Toby Bradshaw运用杨树的RFLP标记寻找其半同胞家系的QTL,取得了很好 的效果。同时,美国北卡罗来纳州立大学的一些研究人员正在用RAPD的图谱方法寻找 桉树属控制开花和生根的QTL位点[2~3]。
另外,一些实验室正在寻找基因组中简单重复序列(Simple Sequence Repeats,
SSRs)或微卫星DNA(Minisatellite DNA)中的长度多态性。美国UNDA林业服务中心 Crag Echt的研究表明,美国五针松的基因组约0.3%是由SSRs组成,在这些简单重复序 列中,二聚体、三聚体和四聚体的重复非常丰富。65%美国五针松的SSRs位点可以和侧 端引物配对扩增出DNA片段,这个高比例说明了SSRs的多态性(>4bp)水平高,并且比 其它针叶树种扩增的DNA片段多,与其工作相比,美国Maine大学的Keith Hutchison
试验的美洲落地松SSRs等位基因多态性水平低。美国林业遗传研究所David Harry运用 PCR的方法,设计并检查了火炬松cDNA克隆的特异序列引物,大约75%的引物扩增出 基因组DNA片段。这个高比例揭示了孟德尔多态性与限制性片段多态性是一致的。 4 检查树木基因组的波动性和进化规律
由于木本植物生活周期长,基因组杂合程度高,因此其遗传变异机制、基因进化规律 和进化时间,一直是木本植物分子生物学研究的重要领域。
Hutchison比较了美洲落叶松基因组中与SSRs相关的编码蛋白质的核苷酸遗传变
异情况。结果表明,蛋白质编码区序列变化较大,这可能是因为在不同环境条件下,不同等 位基因的选择结果。另外,Hutchison和他的合作者还发现,在温暖环境中,位于不同位点 的捕光色素复合体编码蛋白基因的扭曲分离方式。在基因编码区多态性水平高,在SSRs 区多态性水平低,这表明了针叶树具有相对有效的错配修复机制,还可能是由于针叶树具 有表型稳定性。
加拿大Laval大学Bousquet和他的合作者调查了种子植物进化过程中的化石标本, 证实了分子时钟的存在,并建立了现代被子植物起源于原始简单家系的理论。美国北卡罗 来纳州立大学的Ross Whetten提出了根据树木冠层发育状况推断木本植物顶芽谱系发 生规律的理论。例如,根据桃树表型,可估计转座遗传因子在体细胞胚中的插入频率,实验 中发现这种插入频率比一年生物种高得多,并且在不同顶端分生组织中变化很大,这种不 同冠层树种顶芽存在,巨大差异的理论,就很容易解释生活史长的树木为什么更能抵抗病 虫害的侵袭。
5 调查树木遗传多样性和群体结构
随着先进实验手段在林木遗传育种工作中的应用,估计树木遗传多样性和计算群体
遗传结构又有了新的突破。这些先进实验工具有指纹图谱、RAPD分析等。加拿大Laval 大学的Natalie Isabel同时运用同功酶和RAPD的方法比较了黑云杉种内和种间的遗传 变异性,实验表明,这两种标记得出的结果基本相似。加拿大Petawawa国家森林研究所 的Linda Deverno用400个RAPD引物检查北美油松基因组的遗传多态性,没有发现多 态性,这个结果也与同功酶得出的结果类似。
分子标记同样在树木群体遗传结构分析中发挥重要作用。美国的Jerry Tuskan等人 用RAPD标记精确分析了黄石国家公园1988年遭火灾后山杨林分群体的遗传变异规 律。分析表明,它们可能起源于同一无性系,并揭示了林分内的遗传多样性,而且多样性水 平与林分年龄一致。当该山杨无性系林分遭火灾后,重新自然繁殖,RAPD分析表明该林 分的种子资源已不是来自同一样本。新的幼苗群体差别显著,它们的遗传距离与地理位置 是一致的。1988年的大火灾又进一步增加了公园中山杨群体的变异性。
加拿大的Ben Sutton报道了他的研究小组利用云杉群落核糖体DNA的RFLP,建
立了在英属哥伦比亚管理区云杉种子迁移路线,并揭示了两个不同云杉种群体对干旱和 寒冷胁迫的耐受性与特异rDNA标记存在相关性。根据该种的rDNA指数,确定其对逆 境的耐受性,为管理者选择最佳幼苗种植地提供科学依据。同时,Sutton还报道了运用 PCR方法扩增叶绿体DNA高度可变区的指纹分析,这种方法是可行的,因为云杉叶绿体 基因组属父系遗传。单个胚胎指纹图谱就可分析种子园中80%的无性系,用于监测和评 估种子园生产力[1~2]。
综观木本植物分子生物学近期的发展情况,可以说是进步神速。一方面是分子生物学 和生物工程技术的飞速发展,特别是植物基因工程领域的日新月异,为木本植物分子生物 学更深入研究提供了许多有效模式;另一方面是该领域实验手段的不断更新,现代化仪器 设备的广泛使用和某些关键技术的突破。但也要清醒的看到制约其发展的一些限速因子。 木本植物分子生物学研究起步晚,技术复杂,研究周期长,很多方面还不成熟。许多有较高 经济价值树种组培技术还不过硬,它们的有效遗传转化系统还没有建立起来。特别是针叶 树种,进展非常缓慢。面对这种现状,目前对于林业生物学工作者来说,是机遇和挑战并 存。庆幸的是,很多研究人员已经注意到这一点,正加紧进行这方面的研究。
植物抗病分子生物学研究进展
摘要 从植物在分子水平上对植物抗病机制、抗病基因克隆及遗传转化三个方面,综述了国 内外在植物抗病分子生物学研究的进展。
关键词 分子生物学 抗病基因 抗病机制 研究进展
植物生长发育过程中,常受到各种病原菌(包括真菌、细菌、病毒等)的侵害。以造纸工业常用的桉树为例,其常见的病原菌达23种,病菌流行时,造成树木枯死、产量下降,在一定程上制约了桉树的发展,并对造纸工业造成影响。常规植物抗病方法主要有杂交育种及药物防治。杂交育种不仅受到亲缘关系的限制,而且花费时间较长;药物防治不仅增加生产成本和造成环境污染,还会由于药物的长期使用,使病菌产生抗药性,增加防治工作的难度。因此,研究病原菌侵染机制及植物防御系统抗病机理,从根本上解决植物染病问题就显得尤为重要。近二十年来,植物抗病分子生物学研究取得了较大进展,主要表现在:在分子水平上对植物抗病机制有了较深入的了解;抗病基因定位、分离手段更加先进;克隆出了一些抗病基因,并进行了遗传转化研究。本文将从三方面对植物抗病分子生物学研究状况作一综述。 1 植物防御体系抗病反应分子生物学研究状况 植物防御体系抗病反应分子生物学研究 是基因工程研究的基础。植物在与病原菌相 互长期进化过程中,通过各种代谢途径,在体
内形成了各种与抗病菌有关的物质,从而形 成植物自己的防御体系。目前国内外对植物 防御系统研究较多的主要有以下几方面。
1.1 宿主植物产生并积累的、对病原菌起拮抗作用的低分子量次生代谢物 这些次生物质主要是细胞壁合成代谢中 间产物,包括:苯丙氨酸代谢途径中的中间 产物,其中许多被称为植物抗毒素
(Phytoalexin),又称植保素,细胞壁的附加
成分,如木质素和木栓质等。它们通过加强细 胞壁的机械强度而起防御作用。
植保素是植物受侵染时产生的一类低分 子量抗病原菌的化合物,其主要产生途径是 苯丙氨酸代谢途径,它们的产生速度与积累 量与植物抗病有很大关系。植保素最先发现 于豌豆中,至今已在17科植物中发现并鉴定 了200多种植保素。研究最多的植保素有:类 萜植保素,如甘薯酮、利希酮、辣椒素等。一般 植物抗性品种中这类物质的含量高于非抗病 品种。类萜植保素的生物合成途径已知是乙 酸-甲羟戊酸途径;另一类植保素是类黄酮
植保素,如碗豆素、菜豆素、大豆素等。它们在 体内的合成途径是通过丙二酰—苯丙烷类途 径来完成。
植保素在植物体内积累有以下特点:(1) 抗性植物与感性植物同样可以积累植保素, 但抗性植物形成植保素类物质的速度较快, 在感病初期即可达到高峰,而感病植株则积 累很慢;(2)植保素只局限于植物受侵染的细 胞周围,并不运输到其它部位,因而可在受侵 染部位形成一道化学屏障,以阻挡病原菌的 进一步入侵;(3)植保素产生的诱导因素无专 一性。许多因素,如病菌侵染,紫外线照射等 均可诱导植保素产生。
与植保素不同的是,木质素含量的增加 则是通过宿主细胞木质化而阻碍病菌入侵, 表现在:木质素增加了细胞壁抗病菌穿透的 能力;木质化限制了病菌向宿主的扩散及宿 主营养物向病菌的扩散;木质素低分子量前 体还可钝化病菌的细胞膜、酶、致病毒素等。
1.2 宿主植物产生的一些水解酶、病原相关蛋白、蛋白酶抑制剂等 近年来,两种细胞水解酶在植物抗病中 的作用引起广泛注意,它们是几丁质酶与1, 3-β-葡聚糖酶。在正常情况下,这二种酶在 植物体内只是低水平的组成型表达,但在病
原菌等诱发因素存在下,抗病力强的植株该 酶的活性可迅速提高,它们作用的底物分别 是几丁质与葡聚糖,这二种物质在植物体内 并不存在,而存在于大多数真菌的细胞壁中, 因而这两种酶的高效表达可通过分解真菌细 胞壁而起到抑菌作用。
病原相关蛋白是植物受病菌侵染时产生 的一组抗菌蛋白,有些病原相关蛋白具有几 丁质酶或葡聚糖酶活性,有些的生物学功能
尚不清楚。已从烟草、欧洲芹菜、水稻、马铃薯 等植物中分离到了一些病原相关蛋白,并且 克隆出了基因。在烟草、马铃薯中得到的携带 病原相关的蛋白基因的转基因植物抗真菌病 原菌,对烟草黑胫病,马铃薯霜霉病表达高水 平抗性。
蛋白酶抑制剂则是又一类抗菌物质,它主要分布于植物贮藏组织中,如马铃薯中所 含的丝氨酸蛋白酶抑制剂,它们主要通过干 扰病原菌代谢而起抑菌作用。 1.3 凝集素
宿主积累的一些特殊的、可与多糖结合 而使细胞凝集的蛋白质类物质即凝集素。至 今从各类植物中分离到的植物凝集素有100 多种,它们在与病原菌相互作用中主要表现 在二个方面:一是寄主植物凝集素对病原菌 识别存在专一性;二是凝集素显示具有外源 抗体同类的作用,以小麦、大豆、花生、水豆为 材料所进行的凝集素体外抑制病菌试验均表 明:用从上述材料中提取的凝集素可抑制多 种病原菌的菌丝生长与孢子萌发。关于凝集 素在抗病中的作用研究还有待进一步深入。 除以上物质外,许多植物在生长及感病 过程中还积累了一些特殊的,作为结构组分 的蛋白质,以富含羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)、 富含甘氨酸糖蛋白(GRP)最具代表性。它们 主要分布于植物表层及一些厚角组织中,在 病害与伤害诱导下可大量产生,已在菜豆、大 豆、黄瓜、马铃薯等多种作物中发现此类现 象。HRGP具有凝集素活性并对病原菌有识 别、免疫作用;GRP则可能是作为植物防御 体系中的一种传递信号分子而起作用。 2 植物抗病基因克隆研究进展 2.1 克隆基因的来源
目前所克隆基因按来源主要有三个方
面,第一类来源于植物自身的抗病基因。几丁
质酶基因、葡聚糖酶基因、病原相关蛋白基 因、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因,这些基 因在大多数植物体内均存在,在自然条件下 仅在抗病品种中高效表达,在非抗病品种中 通常不存在或表达量极低。这些抗病基因的 克隆,并将之与强启动子重组,组成嵌合基
因,有极大增强转化植株抗病的可能性,这在烟草、马铃薯、菜豆、梨等作物中得到证明。木 本植物中已克隆到柑桔几丁质酶基因,并得 到枳壳转化植株;杨树中也克隆到几丁质酶 基因,其转化研究正在进行之中,杨树中还克 隆了一段功能类似于大豆胰蛋白酶抑制剂的 基因,其重组研究也在进行之中。
第二类抗病基因则来源于微生物。研究 工作者利用微生物之间的拮抗作用,找到对 病原菌有拮抗作用的微生物,从中克隆出抗 病基因。例如,一些细菌、放线菌、真菌等均可 产生几丁质酶,分解病原菌细胞壁。尖孢镰刀 菌是许多植物枯萎的致病菌,从克雷伯氏细 菌的一个菌株中分离到了可降解尖孢镰刀菌 的基因,该基因向番茄的转化研究正在进行 之中,如果成功,则可利用该基因向多种作物 的转化来减轻镰刀病的危害。
第三类来源于致病毒素。植物病原菌产 生的病毒素是重要的致病因子,如果植物可 以降解病原菌在侵染过程中产生的毒素,则 植物就能有效地抵抗病菌引起的进一步侵 染,从而提高自身的抗病性。例如从烟草野火 毒素中克隆的ttr基因可降解tabtoxin;从菜 豆晕斑菌毒素中克隆的octase基因可降解菜 豆萎蔫病病原菌所产生的毒素。 2.2 抗菌基因的克隆方法
在抗菌基因筛选方法上,研究工作者也 进行了许多有益尝试,有如下常用的策略方 法。(1)分子克隆战略,这种方法是把抗病品 种基因组按鸟枪法构建基因文库,然后逐次 转化感病品种,筛选出含抗病基因的克隆。该 方法的问题在于植物基因组较大,转化成功 率不高,效率低。(2)根据遗传分析,找出与抗 病基因连锁较近的已知基因为标记物,再用 染色体步行法,找出抗病基因。此法的问题在 于可利用的遗传子数据太少,并且植物染色 体基因组内含大量重复顺序,因此在实际应 用中存在许多困难。(3)以感、抗病品种等基
因为材料,应用RAPD/PCR法可快速地把目的基因定位出来,这是一种较先进的抗病
基因克隆新方法。(4)分离抗病蛋白质,再从 抗病蛋白质中克隆出相应蛋白基因。 在上述策略方法中,以RAPD/PCR法
较为引人注目。它是建立在PCR技术基础之 上,以随机寡聚脱氧核甘酸作为PCR反应引 物,对基因组DNA进行扩增而显示多态性 的DNA图谱的一种遗传技术。通过RAPD 可以找出与靶基因连锁的RAPD标记,进行 定位,并为以该RAPD标记为起点向靶基因 进行滑步,进而分离该基因打下基础。美国康 乃尔大学已利用该方法找到了3个与番茄抗 pot基因连锁的RAPD标记;2个与水稻
Xa21基因连锁的RAPD标记。1995澳大利 亚研究工作者已利用RAPD标记法在Sugar pine上找到了与抗白松锈病连锁的基因。新 西兰等国科研工作者也已于1995年用同样 方法在Loblollypine中定位了fusiformrust disease病的基因。
抗病基因克隆的另一方向是克隆抗病物 质代谢反应过程中的关键酶,通过这些酶基 因的克隆,改建而调节抗病代谢产物,进而提 高植物抗病性。如苯丙氨酸代谢中的一些重 要酶,象苯丙氨酸氨解酶、肉桂酸-4-羟化 酶等酶的基因已被克隆,并以多种植物为材 料,研究了这些基因在转录和翻译水平上的 调节。研究发现在诱导物存在下,抗性植物中 这些基因的转录活性迅速提高,其中木质素 合成关键酶肉桂基乙醇脱氢酶的转录活性比 其它植物抗毒素生物酶合成来的更快。由于 木质素是细胞壁次生加厚的最主要成分,因 而它的含量增加对植物抗逆性有重要作用。 近年来研究还发现,木质素合成过程中的许 多关键酶的基因具有多态性。如PAL、CHS 基因家族中不同成员所编码的多肽可能极其 相近,但其作用方式,调节方式可能很不相 同,这使得植物可以适应多样性、不断变化的 环境条件。
3 抗病分子生物学研究状况
与抗菌相比,抗病分子生物学研究则较 为滞后。由于病毒是严格活体寄生,它们利用 寄主原有的系统在细胞内复制、繁殖,因而对 病毒的抗生物质(如RNA、某些蛋白质、某些 类似于干扰素的蛋白质)常难于离体检测,抗 病因子的检测就显的更为困难。植物抗病毒
机理大致分三类:(1)在病毒侵入早期,病毒
侵染部位周围组织代谢上发生某些变化,如
木质素合成加剧,内源生长调节剂(如生长
素、脱落酸)的增加,过氧化物酶及多酶氧化
酶活性增加,毒性醌类物质的积累等,通过这
些代谢变化以阻止病毒的进一步入侵;(2)许
多植物体内存在抗病毒因子(AVF),它们包
括糖蛋白、RNA、某些低分子量化合物,有的
植物中还发现病毒复制抑制物;(3)某些植物
体内存在一种阻止病毒在细胞间运动的因
子,它们主要存在于烟草、菜豆。
目前只有烟草等少数作物有抗病毒基因
定位的报道。由于抗病毒基因难于定位,研究
者从以下几方面进行抗病毒研究:(1)借取病
毒分子生物学的研究成果,在植物体内导入
病毒的反义RNA,从而阻止病毒复制;(2)导
入病毒外壳蛋白基因,借交叉保护原理,提高
植物抗病性。这在烟草、蕃茄、桃、李、杏等中
已有成功报道;(3)转入病毒卫星RNA基
因,这方面尚未有成功报道。
4 结语
植物抗病分子生物学研究是一门综合性的新兴学科,它在农业、林业上的应用将日趋 广泛,它的研究的深入开展及成果的推广应
用,对于我国抗性育种研究将有极大的推动
作用,不仅可缩短育种周期,更可提高育种效
率,并减少农药的使用,从而带来巨大的社会
与经济效益。还应看到,我国的植物抗病分子
生物学与国外相比还比较落后,即需要各学
科的互相交流及互相促进,又需要与国外同
行广泛进行交流、学习,同时也要求各级领导
给予重视,给予一定的资金扶持。相信在我国
科学研究工作者的共同努力下,我国的植物
抗病分子生物学研究将取得更大进步。
参考文献
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研究中的应用.植物生理学通迅,1995,31(2)137~143.
植物抗病性的分子生物学研究进展
摘要:本文对植物抗病基因克隆策略及其可能功能、分类以及植物基因工程展望作了概述。
关键词:植物抗病基因;策略;功能;展望
植物在长期的进化过程中,需要不断抵抗病原微生
物(包括细菌、真菌和病毒)的侵害。在这种长期相互影
响的共进化过程中,植物逐渐形成一系列复杂而行之有
效的保护机制来抵御病原微生物的侵染。
迄今,科学家们对植物的抗病机制及其信号传导
植物保护反应和植物系统获得抗性(SAR)的产生等方
面做了大量工作,积累了丰富资料,逐渐揭示了植物在
长期进化过程中所形成的行之有效的保护机制,这里简
要介绍植物抗病性的分子生物学研究进展。
1 概论
植物的抗病反应可以发生在多种水平[1]:一方面植
物本身的某些结构障碍和化学成分具有抗病的功效,如
细胞壁的角质、蜡质、栓质、木质素、特殊的气孔结构及
影响病原物细胞透性的蛋白质和核糖体失活蛋白等
另一方面,植物在受到侵染时可以通过诱导产生的防卫
反应来推销抗病原菌,包括活性氧的释放、防卫基因表
达、过敏反应及系统获得性抗性等等。
关于病原与植物互作关系的遗传模式主要有两种第一是Flor提出的基因对基因假说。根据该假说,病
原的无毒基因(avr)产物或者次生代谢产物(称激发子
celicitior)与植物抗病(R)基因产物(受体)的互作,导致
寄主植物防卫基因的表达。第二是与亲和因子相关的
互作模式。其特点是:病原与互作有关的基因的作用是
导致病理与其寄主共发生亲和性互作。亲和性因子通
过改变寄主的生理特性而使其易受病原侵染,而抗病寄
主植物含有相应的抗病基因,其产物能使亲和性因子失
活而不起作用。
2 植物抗病基因研究进展
2.1 抗病基因克隆策略研究进展
植物的抗病基因(resistancegene)和防卫基因(de-
fensegene)是两个不同的概念。前者是指基因对基因假
说中的寄主植物中与病原无毒基因的迅速表达。后者
则是指前者之外的使植物表现抗病性的基因。
1992年以后抗病基因的克隆取得显著进展,迄今已
克隆了十多个抗病基因。其中应用最广泛而有效的两
种方法是转座子标签法(Transposontagging)和以图谱为基础的定位克隆法(map-basedgenecloing)。虽然高
等植物的基因组十分庞大而给抗病基因的克隆带来很
大障碍,但是随着RFLP、RAPD、AFLP等分子标记技术
的发展和应用,越来越多的抗病基因将被定位和克隆
特别值得注意的是随着模式植物(拟南芥和水稻)等基
因组全序列测定计划的迅速进行和完成及其后的功能
基因组学的开展,将有很多新的抗病基因被克隆和进行
功能研究。
另外,利用已知抗病基因的保守序列设计引物进行
PCR扩增已经在大豆[5]、马铃薯[6]、水稻[7]、大麦[8]、番
茄[9]和玉米[10]中分离到了许多与已知抗病基因同源的
DNA序列(RGA)。但是这些似乎并不赋予寄主抗
性[9、10]。利用RGA作为遗传标记结合后代分离群体有
利于在育种中快速而有效在对抗病基因进行辅助选
择[11]。
植物抗病性的分子生物学研究进展
植物在其生长发育过程中常受到一些病原微生物的侵袭,它们在自然生态系统中长期并存,相互适应,相互选择乃至协同进化,使得植物的抗病性与病原物的致病性之间形成一种动态平衡。但是,自人类开展农业活动之后,经常发生植物病害的大流行。农业上成片单一种植,直接降低了遗传上的多样性,增加了植物在时空上的连续性,为病原物的发展和连年积累提供了方便。此外,精耕细作下的农田小环境也更加有利于病原物的传播和侵染。目前,病害造成的损失一般为农作物产量的10%以上,同时还导致农产品质量下降。因此,病害已成为农业生产上不可忽视的重要问题。
人类克服植物病害的主要途径之一,是利用抗性资源,通过常规育种的方法培育抗病品种。鉴于常规育种途径本身的局限性,植物抗病性的复杂性以及对植物抗病机制认识的匮乏,抗病育种一直是农业生产上的重大难题。近年随着重组DNA技术的发展,植物抗病机制的分子生物学和抗病基因工程的研究有了许多突破,展示了诱人的前景,本文就这些研究进展作一综合论述。
1 植物抗病性的表现
植物对病原物的拮抗,表现为几种不同的途径〔1〕。一方面,植物本身的某些结构障碍和化学成份具有抗病的功效,前者如细胞壁的角质、蜡质、栓质、木质素及特殊的气孔结构等;后者如小分子抗病物质,影响病原物细胞透性的蛋白质和核糖体失活蛋白等。另外,植物在受到病原物侵染时还可通过诱导产生的防卫反应来拮抗,它主要包括活性氧的释放、防卫基因表达,过敏反应(Hyper-sensitive Response)和系统获得抗性(Systematic Acquired Resistance)等。活性氧的释放是寄主对病原早期的抗病反应之一,其作用体现在引起胞壁结构蛋白的氧化交联,激活细胞内一些防卫基因的表达,诱使细胞编程死亡和与过敏反应(HR)有关等方面〔2〕。防卫基因据其表达的产物可分为(1)细胞壁蛋白基因,编码细胞壁中富含羟脯氨酸的糖蛋白,过氧化物酶及硫堇等;(2)次生物质合成基因,编码植保素及木质素生物合成所需的酶;(3)病理相关蛋白基因,编码蛋白酶抑制剂、葡聚糖苷酶、几丁质水解酶等。过敏反应(HR)是植物最常见的抗病表现形式,它几乎总被视作抗病的标志,其特征是寄主植物在病原侵染的部位迅速形成枯斑从而限制病原的扩展〔3〕。过敏反应是一种局部的防卫反应,它可能相继使整个组织或植株都具有抗性,这种抗性称作系统获得抗性(SAR)。
2 植物抗病性的遗传基础
植物的抗病性与其它性状相比有其特殊性,即它不仅决定于植物本身的基因型,还取决于病原 物的基因型,因此,植物与病原物互作的遗传基础即构成了植物抗病的遗传基础。目前,广为接受的描述植物-病原互作关系的遗传模式有两种〔5〕,即与不亲和因子相关的互作模式和与
亲和因子相关的互作模式。
2.1 与不亲和因子相关的互作模式
该模式也称基因对基因学说,最早是Flor通过研究亚麻对亚麻锈菌的小种特异抗性提出的。迄今已被证明至少适合于几十种不同的植物-病原互作系统,包括真菌、细菌、病毒所致病害,以及线虫和寄生种子植物所致的病害〔7〕。其基本内容为:病原与其寄主植物的关系分亲和及不亲和两种类型,亲和与不亲和病原分别含毒性基因(vir)和无毒基因(avr),亲和与不亲和寄主分别含感病基因(r)和抗病基因(R)。当携无毒基因的病原与携抗病基因的寄主互作时,二者才表现不亲和,即寄主表现抗病;其它情况下,二者表现亲和,即寄主感病。寄主与病原间的非亲和性互作关系取决于病原产生的无毒(或非亲和)因子的变异性或寄主对该因子的敏感性,无毒因子通过改变寄主的生理特性而起作用。
2.2 与亲和因子相关的互作模式
该模式是Scheffer等首先提出的,它与上述模式的不同在于:病原与互作有关的基因的作用是 导致病原与其寄主仅发生亲和性互作。亲和性因子通过改变寄主的生理特性而使其易受病原侵染,而抗病寄主植物含有相应的抗病基因,其产物能使亲和性因子失活而不起作用。
2.3 与植物抗病性有关的基因及其功能
由上述内容看出,植物的抗病性既与其本身的基因有关,也与病原物的基因有关。正确认识这 些基因,对于从基因水平上了解植物抗病性是极为重要的。
2.3.1 病原物的致病基因 致病性基因(Pathogenicity genes)是指病原物中与决定对植物致病性有关的基因。致病基因主要包括毒性基因和无毒基因(Avirulent genes),前者决定对植物表现亲和性,即调控病害的发生与发展;后者决定病原菌小种与含相应抗病基因的寄主植物品种表现专化性不亲和。在概念上,毒性(Virulence)与致病性(Pathogenecity)以及无毒性(Avirulence)与无致病性(Nonpathogenecity)不能相混淆。还需指出的是,“无毒基因”这一术语常易引起误解,因而需对其含义正确认识。首先,无毒基因与毒性基因座位并不具有遗传等位关系,因为无毒基因的表达产物与致病表现型没有关系〔6〕。再如,由于无毒基因使得含有它的病原对抗性寄主因不亲和而不能侵染,病原的毒性因而无从谈起,但这并不等于病原对其他植物都没有毒性。因此,有人提出以“不亲和基因”〔5〕或“识别基因”〔6〕来取而代之似乎更为确切。
2.3.2 植物的抗病基因与防卫基因 植物的抗病基因(Resistance genes),不是字义上的具有抗 病功效的基因,而是指基因对基因假说中的寄主植物中与病原无毒基因表现非亲和性互作的基因,除此之外的使植物表现抗病性的基因叫防卫基因(Defense genes)。需要指出,防卫基因及其表达并不象抗病基因那样仅抗病植株所特有,而是感病植株也存在,只是感病植株中的防卫基因相对抗病植株被激活得慢和表达微弱得多而已〔1〕。与抗病基因相对的,是感病基因(Susceptible genes)。事实上,抗、感病基因在原生功能上都一样地是植物正常代谢所必需的基因,只是在病原侵染植物后它们才表现了这种截然对立的次生功能。由于前者已不易被认识,而后者却引人注意,致使它们分别被冠之以抗病基因和感病基因的名称。
3 病原的无毒基因
病原的无毒基因是Flor于1942年首先发现的,之后许多经典的遗传学研究证明,它广泛存在 于寄主植物的病原中,对无毒基因的克隆和更深入的认识只是近10年的事情。Staskawicz等于1984年通过把含无毒基因avrA的大豆丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringaepv.glycinea)小种的Cosmid克隆接合转移到不含avrA的小种中,继之以遗传互补实验,克隆了avrA,这是克隆的第一个无毒基因。随后,许多研究者通过类似的方法从不同的病原(包括细菌、真菌和病毒)中克隆了30多个无毒基因。这不仅有力地支持了基因对基因假说,而且也促进了对其本身的认识。无毒基因克隆后,发现克隆自某一病原的无毒基因可在其他病原中起作用。例如,将克隆自甘蓝黑腐黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris)一个小种的无毒基因avrRxv转化
到不含它的pv.glycinea、pv.phaseoli、pv.vigincola、pv.alfalfae、pv.holcicola和pv.malvacearum等致病变种中时,它们会分别在其对应的原来感病的寄主植物大豆、菜豆、豇豆、苜蓿、玉米和棉花上诱发过敏反应〔7〕。这表明,无毒基因不仅具有决定病原小种特异性(或寄主植物的品种特异性)的作用,而且还有更高水平上的特异性决定作用,即决定病原致病变种(或寄主植物种)的特异性。由此还说明,在不相关的植物中可能蕴含着功能相同的抗病基因。因为,根据基因对基因假说,对含有某一无毒基因的病原表现过敏反应的不同植物,应具有功能相同的抗病基因。无毒基因的序列分析表明,一些具有不同特异决定性的无毒基因之间存有明显的同源性〔7〕。例如,Bonas等发现X.C. pv.vesicatoria的无毒基因avrB3含有一长为102bp的高度保守且重复多次的基元序列(motif),它既在X.campestris的其它致病变种的无毒基因(如X. pv.malvacearum的avrB4、avrB6、avrB7、avrN101和avrB102)中存在〔11〕,在X.citri的avr pthA和X.oryzae的avrXa7和avrXa10中也存在〔12〕。由此推论,植物中对应于这些无毒基因的不同抗病基因可能也是同源保守的,并具有相似的抗病机制。虽然已有许多的无毒基因被克隆和测序,但对其确切产物及功能有较详细了解的却仅限少数几个〔9〕。其一是大豆丁香假单胞杆菌的无毒基因avrD,它编码的蛋白具有酶活性,负责合成了Sy-ringolides,能使含抗病基因Rpg4的大豆产生过敏反应;其二是番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum)无毒基因avr9,它编码一长为28个氨基酸残基的多肽,能使含抗病基因Cf-9的番茄形成过敏反应; 其三是烟草花叶病毒的外壳蛋白基因,它编码的外壳蛋白也能使含抗性基因N的烟草产生过敏反应;最后是Xanthomonas的无毒基因avrB3基因家族,它们编码的蛋白含有14~23个长为34个氨基酸残基的重复,由于某些重复的缺失会引起抗病特异性的改变,因而说明该蛋白是寄主植物的识别对象。由此可见,无毒基因诱使寄主植物形成过敏反应的激发子(Elicitor),或是其编码蛋白本身,或是其酶活性有关的产物。
4 植物的抗病基因
长期以来,人们积累了很多有关抗病基因表现的遗传资料,但迟迟不能实现对它的克隆。近两 年伴随着分子生物学技术的发展,抗病基因的克隆终获成功,对其特性也因此而有了深入的认识。
4.1 抗病基因的克隆
克隆基因的途径概括起来分为两种——正向遗传学途径和反向遗传学途径。前者以欲克隆基 因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型的突变进行;后者则着眼于基因本身,通过其特定的序列或其在基因组中的特定位置进行。由于抗病基因的产物及表达调控特性都尚不清楚,抗病突变体也难以确定或创造等,因此尚不能用根据基因产物蛋白质序列的克隆方法和相减杂交法992期张德水等:植物抗病性的分子生物学研究进展
等来克隆抗病基因。随着近年植物转化与再生以及抗病筛选等技术的日趋完善,用抗病个体的DNA片段转化感病个体,然后筛选抗病转化体来分离抗病基因这一名为“鸟枪克隆法”的途径似乎很有希望,但迄今尚无成功的报道。
转座子作为插入诱变剂,已广泛用于基因的鉴定和分离。在植物中,玉米的AC/DS、Spm和 Mu因子,金鱼草的Tam因子已成功地用于分离基因。由于AC和Spm转座子家族在其它植物中也具有转座功能,因此这一基因示踪系统可有效地用于其它植物。近年T-DNA作为插入诱变剂也受到了重视。将转座子或T-DNA插入到欲分离基因的内部或附近,基因发生突变而被标识,然后用插入DNA片段作探针即可从被标识的突变体基因文库中克隆基因,这一方法称之为转座子示踪(Transposon tagging)。通过该法克隆了玉米抗叶斑病菌基因Hml〔13〕,之后又相继克隆了烟草抗花叶病毒基因N〔14〕,番茄抗叶霉病基因Cf9〔15〕和亚麻抗叶锈基因L6〔16〕。显然,该法是目前克隆抗病基因的一种有效方法。
基于作图的克隆法,是近年发展的另一有效方法,即首先鉴定与目的基因连锁的分子标记,进而借助于染色体“步移”或“登陆”等方法来克隆目的基因。随着高密度遗传图谱和物理
图谱的构建,基于作图的基因克隆已成为可能,尤其是在基因组较小的植物如拟南芥菜、水稻和番茄中。例如,番茄抗丁香假单胞杆菌基因Pto、拟南芥抗丁香假单胞杆菌基因RPS2和水稻抗白叶枯病基因Xa21〔19〕等三个抗病基因都是籍此克隆的。
此外,植物的比较遗传作图法、高信息量的分子标记技术以及NIL和BSA分析法等都可有效地用以鉴定与目标基因紧密连锁的分子标记〔20〕,这将使得基于作图的克隆方法在克隆抗病基因及其它基因方面发挥更大的作用。
4.2 抗病基因的特性
抗病基因的克隆成功,也随之带来了对其特性更加深入的认识。玉米抗圆斑病基因Hm1,是迄 今所克隆的抗病基因中唯一符合与亲和因子有关的互作关系的,它编码依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的HC-毒素还原酶,该酶能使病原真菌产生的致病因子HC-毒素失活〔5,13〕。已克隆的其他抗病基因,均符合非亲和性互作关系,据其结构特点可分两种类型。一种是番茄Pto基因,其编码序列是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶,不含跨膜性区域,但氮端有一潜在的十四酰化位点〔17〕。另一种类型包括RPS2、N、Cf9、L6和Xa21等5个基因,它们不仅植物的来源不同,分别是拟南芥、烟草、番茄、亚麻和水稻,而且其拮抗的病原物类型也不同,包括细菌、真菌和病毒,但是它们的编码序列都具有相似的结构特征。最为明显的是,其编码蛋白都含有不同数目的富含亮氨酸的重复(LRRs),该重复单位广泛见于许多生物的多肽链中,并与介导蛋白质间的互作有关〔21〕。对这些基因的蛋白序列作进一步比较发现,它们可分为三亚类。一类包括RPS2、N和L6 3个基因,其间具有相对更高的同源性,而且都含有核苷酸结合位点〔14,16,18〕。具体到每个基因,都有其特殊之处。如拟南芥菜RPS2为细菌病原P.syringaepv.tomato和meculicola的抗性基因,它的氨基端有一短的疏水区,其氨基酸序列的碳端多带正电荷,这似乎是一信号锚定域,与此毗邻的还有一亮氨酸拉链,中部是一膜整合域;烟草N基因为TMV抗性基因,其蛋白氨基端的150个氨基酸残基与哺乳动物白芥素受体(IL-1R)及果蝇Toll蛋白的胞质域具有同源性;亚麻L6基因为真菌病原菌Melampsora lini的抗性基因,其蛋白的氨基端与烟草N基因相似,但有一信号肽。初步的突变及序列分析表明:RPS2和N蛋白不具信号先导肽。番茄Cf9基因抗真菌病原菌C.fulvum,由于其组成及结构的特点有别于上述3个基因,可被视作第二亚类〔15〕。它没有核苷酸结合位点,但有跨膜糖蛋白的特征——具有信号肽;成熟蛋白的氨基端有在胞外蛋白及类似受体激酶蛋白中位置保守的半胱氨酸,含一个由37个氨基酸组成的疏水跨膜域,且其侧翼为带电荷的锚定域(其胞内侧和胞外侧分别带正负电荷);与植物其他几种胞外LRRs蛋白一样,在许多的LRRs单位里有保守的甘氨酸残基。新近克隆的Xa21基因属于第三亚类,它在许多方面与Cf9基因有相似之处,但Cf9缺乏胞质内的丝/苏氨酸蛋白激酶功能域,而Xa21却同时集此胞内催化域和LRRs功能域于一身〔19〕。
5 植物抗病的分子机制
随着分子生物学技术的飞速发展及其在植物病理学中的广泛应用,尤其是抗病基因的成功克 隆与分析,植物抗病的分子机制这一复杂问题已渐露端倪。
5.1 与病原物亲和因子有关的植物抗病性机制
在该领域中,目前最清楚的是玉米对由Cochliobolus carbonum所引起的叶斑和穗霉病的抗性 机制〔5〕。玉米的抗病基因包括HM1和HM2,HM1使全生育期的整个植株都表现抗病,呈完全显性;HM2的抗病表现为部分显性,植株幼苗时感病,近成熟时才表现出抗性。HM1基因的编码产物为HC-毒素还原酶,该酶使病原Tox2基因座上的基因所控制合成的亲和性因子Hc-毒素失活,从而表现抗性。
另一种可能的抗性机制,是通过修饰甚至缺失亲和性因子的作用受体,使得植物对亲和因子失 去敏感性而表现抗性,目前对该机制的具体了解还不多。
5.2 与病原物非亲和因子有关的植物抗病性机制
反映寄主植物和病原间与非亲和因子有关的互作机制的一个广为接受的模式为:植物抗病基 因编码感触病原信号的受体分子(Receptor),而病原无毒基因的直接或间接产物即是信号分子 ——激发子(Elicitor),两者互作激活与抗病有关的信号传导级联网络,最终使植物表达一系列的防卫反应〔9〕。近年抗病基因研究的突破性进展,为该模式提供了更进一步的证据。
5.2.1 抗病基因产物与信号识别 抗病基因的克隆及序列分析所揭示的其编码蛋白的组成、拓朴学和亚细胞定位等特征,为揭开抗病基因的作用特点提供了线索。
番茄Pto基因的编码蛋白是位于胞内的丝/苏氨酸型蛋白激酶,这已被功能活性实验所证 明〔22〕。该蛋白酶虽然不含胞外或跨膜决定域,但其潜存的十四酰化位点使它连在细胞膜的内侧,因而可与跨膜或锚定在膜上并且被病原激发子活化的类似受体蛋白互作,激活最终产生抗性反应的磷酸化级联信号传导网络。分别来自烟草、亚麻和拟南芥的N、L6和Rps2 3个抗病基因具有很高的序列同源性,因而其抗病作用机制可能是相似的。N和L6基因的编码蛋白,在氮端都与哺乳动物IL-1R蛋白和果蝇Toll蛋白的胞质域相似。在哺乳动物及果蝇的免疫系统中,这两种蛋白的胞质域都会在病原信号的作用下,引起与Rel有关的转录因子的激活和从胞质到细胞核的移位,进而激活防卫基因的转录和表达。所以,抗病基因N和L6的编码蛋白可能都像IL-1R及Toll蛋白的胞质域那样,行使受体功能,触发信号传导途径,激活类似于Rel/KB的转录因子并相继使植物表达防卫反应。所不同的是N蛋白为胞质内定位,而L6蛋白则可通过先导信号肽附在膜上。关于RPS2基因,据其序列所作的拓扑学和亚细胞定位分析、离体翻译/移位实验分析以及它与N基因间的比较分析等表明,它的作用机制可能与N基因类似〔18〕。虽然Rps2基因的编码蛋白的氮端与IL-1R及Toll蛋白的胞质域并不相 似,但其亮氨酸拉链可使之形成类似Toll蛋白异二聚体式的结构。
抗病基因Cf9的编码蛋白是一种胞外糖蛋白,其结构与RLPKS的膜结合受体域相似。它的作用机制可能是其LRRs域直接与无毒基因avr9的产物结合,然后其胞质域激活某种类似于Pto蛋白的蛋白激酶或仅是与其它含LRRs的膜结合蛋白互作,最后激活抗病反应的信号传导网络。1012期张德水等:植物抗病性的分子生物学研究进展
抗病基因Xa21的编码蛋白最具特色,它与动物的酪氨酸受体激酶非常类似。其抗病作用机制 为:含LRRs的糖基化胞外域识别并结合病原无毒基因的激发子,由此激活胞质侧的激酶功能域,从而引发防卫反应〔19〕。
综上所述,符合非亲和性互作关系的6个抗病基因,它们虽然各具特点,但作用机制却非常相似,在抗病反应中都起着信号识别与传导的作用。这些抗病基因大都编码含LRRs的蛋白质,该种蛋白在病原激发子的作用下发生由LRRs介导的相互间的以及与其它含LRRs蛋白间的互作,产生二聚体或部分二聚体〔23〕。由此产生的信号通过蛋白激酶而继发传导,最终激活抗病防卫反应。这种相似性与基因对基因假说广泛适用于不同的寄主植物——病原互作系统的事实是相吻合的。
5.2.2 植物防卫反应的信号传递过程 根据基因对基因学说和上述的分析,抗病基因产物是avr基因产物的受体。两者间的互作是植物抗病反应的起始,防卫反应的激活是靶细胞或组织特异于病原信号的最终反应,其间有一信号传导过程,该过程一直是抗病研究的热点和难点之
一。抗病植物在受到非亲和病原侵染时,往往表达多种防卫反应,一般先是释放活性氧,相继激活防卫基因的表达,最后发生过敏反应和系统获得抗性。但是,不同的防卫反应之间有时并无必然的联系。例如,在有些情况下过敏反应发生了,而防卫基因却未表达,反之亦然。另外,即使是同一类防卫反应,在不同情况下其信号传导过程也有差异,例如不同防卫基因的表达有时间或空间上的差异。尽管如此,许多研究表明植物防卫反应的信号传导过程有着某些共性〔1〕。首先,蛋白激酶和磷酯酶引起的蛋白磷酸化是各种防卫反应表达的信号传导中的重要环节。另外,钙离子的变化、电解质渗透和G蛋白等也常出现在许多防卫反应的信号传导途径中,最近的一些研究还发现,水杨乙酸(SA)是激活某些防卫反应的重要信号分子,其作用是它作为
配体与过氧化氢酶结合,从而抑制该酶的活性,使细胞内的H2O2含量增加,由此诱导防卫反应 6 控制植物病害的基因工程策略
对植物病害的控制,主要通过有性杂交将抗源植物中的抗性基因转移到栽培品种来实现,这往 往需要6~8年,远不及病原小种的分化速度快,加之目前栽培品种的遗传基础日趋狭窄,因而生产上仍有病害大发生的隐患。分子生物学及基因工程技术的长足发展,尤其是近年来在抗病基因研究上的重大突破,为分子标记辅助抗病育种和基因工程抗病育种提供了诱人的前景。 基因工程抗病育种的途径之一,是利用克隆的抗病基因,通过基因工程的手段转化受体品种, 选择培养转基因的抗病品种,这已在不少植物上取得了成功。另外,还可依据群体遗传学原理,将对应于同一种病原的多个不同抗病基因转化到同一品种的不同个体中,产生仅在抗病基因座位上有差异的近等基因系混合群体,由此可实现该品种对病害的持久抗性。而且,这一途径克服了当使用混合品种群体时因其在株高和熟期等性状上不一致所带来的不利影响。
植物的防卫基因如今已有许多被克隆,对其序列、结构及表达等也有了较深入的认识,对它们 在抗病中的利用,也是采用与上述抗病基因完全相似的途径。此外,通过修饰改变防卫基因或调控其表达的时空性等,还可进一步提高其抗病的效能。
在上述的基因工程策略中,抗病基因是在诱导植物产生HR乃至SAR的信号传导网络的起始 步骤起作用,而防卫基因仅对某些种类的病原起有限程度的抗性作用。相反,HR或SAR往往是信号传导网络的终结,它们可拮抗各种病原,无特异性,且抗性能力也较强。因此,对直接产生HR或SAR的信号传导途径中的基因进行操作,是抗病基因工程更为理想的策略。研究发现,抗病基因或一些与抗病基因互作的基因的突变体,可产生类似于HR或SAR的表现型〔25,26〕,因此这些突变基。因可被用于植物对病害的防御。但这些基因的表达是组成性的,因而会造成植物的浪费和其一定程度的损伤。鉴此,可寻找受病原诱导表达的启动子并将avr基因置于它的调控之下,然后将其转化到含相应抗病基因的植物中,从而可使植物只在受病原侵染时产生HR或SAR。