2008年21卷3期西 南 农 业 学 报
Vol121 No13SouthwestChinaJournalofAgricultural
Sciences
659
文章编号:1001-4829(2008)03-0659-05
番茄根结线虫分离和苗期接种方法研究
张绍松,李成云,周晓罡,丁玉梅,孙茂林
(云南省农业科学院云南省农业生物技术重点实验室,云南昆明 650223)
摘 要:通过5年番茄栽培地的根结线虫发病状况调查,得出蔬菜栽培地的根结线虫发病率为90%～其附着的根系土,利用蔗糖高渗溶液离心法与分离筛法分离,获得病原线虫3茄幼苗,培养56d后,调查结果显示:;对苗期番茄根系具有侵染性,但形成根结时间不同,接种幼虫后10d,16d可见根结雏形,病圃土则需17d;接种J2幼虫后,14.5个,表明接种幼虫是测试植物对根结线虫敏感性的有效虫态。
关键词:番茄;根结线虫;分离;苗期中图分类号:S641.2onthemethodofseparatingroot2knotnematodes
andinoculatingtotomatoseedlings
ZHANGShao2song,LICheng2yun,ZHOUXiao2gang,DINGYu2mei,SUNMao2lin
(YunnanAcademyofAgriculturalSciences,AgriculturalBiotechnologyLaboratoryofYunnanProvince,YunnanKunming650223,China)
Abstract:Afterinvestigating5timestherootsoftomatoplantsincultivatingvegetablelandduring5years,theywereinfected90%-100%byroot2knotnematodes.Therootsandsoilofstickingonthemwerecollected.Nematodesfromtheirwashedsolutionandmudwereextractedbymeansofsugarsolutioncentrifugeandsievewash.Theouveniles,bigfemalesandeggswereobtained.Inoculatedthemseparatelytotomatoseedlings.Theresultsshowedthatthebigfemalescouldnotinfecttomatoroot,therudimentofgallingappearredafter10daysbyinoculatingjuveniles,however,itappearedseparately16daysand17daysafterinoculatedbyeggsorsoilfromcultivatingtomatoland.Andtheaveragenumberofgallsandegg2massesoneachplantrootsystemswasdifferent.Theaveragenumberwas48.1byinoculatedjuveniles,about4.5byinoculatedeggsorthesoil.Theresultsindicatedthatitwaseffectivemethodbyusingofjuvenilestoinoculate.Keywords:tomato;root2knotnematode;separation;seedlingperiod;inoculate
线虫是危害农作物的一类极重要病害,据估测,
[1]
全世界每年造成农作物的损失约1000亿美元。中国若干地区也相继报道了蔬菜种植生产中,线虫
[2]
病害呈现加重的趋势:徐建华等报道了江苏省大棚蔬菜生产中根结线虫的严重危害与病原种类;
[3]
2001年,刘鸣韬也报道了在河南省温室和大棚蔬菜生产中,因线虫病害造成减产20%～30%,重者达60%～70%;露地蔬菜一般病田的发病率也达
[4]
20%左右,重者达50%以上;与此同时,彭德良
[5]
和林永让等开展了关于防治的研究。根据笔者
收稿日期:2007-09-17 基金项目:云南省科技厅国际合作项目资助(2002GH05)
作者简介:张绍松(1966-),男,白族,云南大理人,副研究员,本科,研究方向为抗病抗虫资源及其利用。
的调查,云南省蔬菜种植中,线虫病害的危害也十分严重,多年栽培蔬菜和复种指数高的局部地区,线虫病害的危害更为突出,整块地在苗定植后却无收获
[6]
的现象时有发生。国外M.Jacquet、Concepcion
[7][8]
Sigüenza和AnaPiedrBuena等也报道了关于根结线虫的危害与防治。由此可见根结线虫在国内外农作物栽培中发生的普遍性和危害的严重性。此外,大多数线虫危害还会在植物根部造成伤口,提高了其它病原侵染作物的几率;部分线虫还成为病毒病的传播媒介,加重危害程度。
由于线虫广泛侵染农作物及其危害的严重性,引起了国内外科技工作者的关注。自1855年Berkeley在英国的感病黄瓜上首次观察到根结,并
660西 南 农 业 学 报 21
卷
发现根结线虫病原后,多数国家和地区在多种植物
上都发现了根结线虫。目前,世界上许多农作物上均发现了根结线虫。迄今,根结线虫已报道的约有80个种,但常见的只有4个种:南方根结线虫(Meloidogyneincognita),爪哇根结线虫(M.javani2
ca),花生根结线虫(M.arenaria)和北方根结线虫
[9]
121℃灭菌1h,自然降温后,装入接种盒中。待种
子萌发长出胚根约1cm,将有胚根的种苗移栽于接种盒中。同时,利用发病严重菜地的病圃土(未经灭菌和不加肥料)装入接种盒中,作为病圃土接种对照。移栽后将接种盒装入塑料筐内,置于光照培养箱中25℃培养。113 番茄根结线虫病害调查、病原采集与分离1.3.1 番茄生产中根结线虫病害的调查 在农户的番茄栽培地寻找采收末期的番茄植株,挖取完整的植株根系,采回后即洗净根系,统计根系上的根结数量。同时,记录采样地的前茬栽培作物。1.3.2 ,,(共,),,保留附着在根系上的少许1.3.3 根结线虫病原分离 采回的病株根系,计数每一病株上的根结数,再放入盆中,加入自来水浸泡过夜,在盆中逐株清洗根系,尽可能将根系上的土洗下。洗净的根系,统计根结数量,继续泡入水中浸泡过夜,收集浸泡液;同法再泡洗3次(d),弃去根系,回收洗液和泥土。洗液和泥土经20目分离筛清洗,去除分离筛上较大颗粒土和植株残渣,放入容器中静置后,轻轻移弃上部液体。残液和泥土经2000r/min离心2min,弃去上清液,加入494g/L蔗糖,混匀后2000r/min离心2min,将上清液用800目的分离筛清洗,收集分离筛上的幼虫和虫卵。取收集物放入60目的分离筛中,用清水反复清洗,收集分离筛上虫体———雌虫;洗液再用100、200和500目的分离筛反复漂洗,收集500目分离筛上的收集物———大部分为虫卵;500目分离筛上的滤过液再经800目的分离筛清洗,收集分离筛上的虫体———2龄幼虫。所分离的虫和虫卵储于4℃的冰箱中备用。1.3.4 分离的病原根结线虫镜检 在分离过程中,利用连接有成像系统的解剖镜检查每步的分离物,经多次清洗过筛后,检测3种虫态的纯度高于99%时,收集虫体或虫卵于试剂瓶,并测定浓度、拍照。114 番茄苗的培养和接种根结线虫
(M.hapla)。在国际根结线虫协作组(IMP)所收集
的1300个样本中,4种根结线虫占到群体总数的95%,其中前3种根结线虫普遍分布于热带、亚热带和
温带。
研究线虫及其相关学科领域,首先需要分离与培养线虫。然而,受侵染植株根系及其周围的土壤所包含的并非单一种群的线虫。关于线虫形态学方面的研究,只需要少量线虫。但利用线虫进行植物抗性评价等方面的研究,通常需要大量的线虫。此[10～11][12]
养卵与幼虫,。[13][E.P.等和R(schachtii)的胞囊与幼虫和刘维志等也介绍了关于线虫分离的相关方法。国内报道利用虫卵或幼虫接种的文献中对虫卵与幼虫的大量分离方法未进行详细描述。笔者针对番茄根结线虫3种虫态的分离方法进行了探索。
番茄对根结线虫是高度敏感易发病的栽培园艺作物。目前许多研究者在测试作物对根结线虫的敏感性或筛选抗病种质资源时,不同的研究者采用的
[10]
测试方法不同,在病圃中、采集病圃土在室内、收集分离虫卵或幼虫等方法对作物的敏感性或抗性进行接种测试。本文研究和报道了根结线虫的分离及分别以病圃土、虫卵、雌虫或幼虫接种苗期番茄测定敏感性的方法。
[10]
[10～11]
[12,17]
[15]
[16]
1 材料与方法
111 种子与萌发
番茄种子采自农户栽培地中发病严重的翠玉栽培品种。无限生长型,果实为小果型水果番茄。采摘已变红成熟的果实,淘洗种子凉干后即可用于试验。在3套培养皿内垫双层滤纸,灭菌后自然降至室温,取约250粒种子,以1cm左右间距排在平皿中滤纸上,加入灭菌水,置平皿于培养箱中,25℃培养。112 番茄苗的培养
用透明度较高的塑料片膜自制接种盒(2cm×4cm×12cm)。取从元谋县采回的菜园土,按1%的比例混入腐熟的干猪粪(已研磨和8目过筛),经
番茄苗在光照培养箱中以25℃(昼,12h)/16℃(夜,12h)培养。待番茄苗的真叶长出1～2片时(2周),进行接种。选择生长良好的植株,测试的每项内容各30株;含病圃土的接种盒不再接种,空白对照接种盒(灭菌土)加2mL的水。雌虫、幼虫和虫卵按1.3中分离,储于4℃的冰箱中。雌虫和2龄幼虫稀释为800条/mL,虫卵稀释为1500个/mL,
3期 张绍松等:
番茄根结线虫分离和苗期接种方法研究661
表1 元谋县番茄根结线虫病害调查
Table1 Investigatedroot2knotdiseaseoftomatoinYuanmou
调查时间
Investigatedtime2001年11月
Nov.2001
36000
2002年4月
Apr.2002
867991.9185.4
2003年6月
Jun.2003
[1**********]4.0
2004年12月Dec.2004
[1**********]7.5
2005年12月Dec.2005
[1**********]1.0
调查植株数Amountofsurveyedplants感染的植株数Amountofinfectedplants感染率(%)Rateofinfectedplants平均单株根结数Galls/plant
前茬栽培作物Cultivatedcropbeforetomato
水稻Rice黄瓜Cucumber番茄Tomato黄瓜Cucumber番茄Tomato
每株接种2mL的虫或卵液。雌虫和2龄幼虫的接种虫量分别为1600条/株,虫卵接种量为3000个/株。接种完毕后,放回光照培养箱中继续培养,适时浇水,接种后第5天开始,每天取出接种盒,在接种盒表面直接观察接种盒内根系上根结形成状况。115 接种后发病状况调查56d,将接,0.02%的Phloxine染色,在解剖镜检下调查每一株根系形成的根结和卵块团数,拍照。
番茄连作或与黄瓜、甜椒轮作时,发病率均为90%以上,病害发生极为严重。,则未发现病株,。2.2 ,,另含有少许其,大量60目的分离筛上,包括极少量幼虫和卵,经60目多次分离筛漂洗后,获得纯度约99%的雌虫高于6万条;筛洗滤液进一步在100～500目分离筛上多次漂洗,大部分死幼虫、个体大的活虫和虫卵滞留在分离筛上;滤过的漂洗液中含大量的2龄幼虫、少量死幼虫与卵,活幼虫的纯度高于99%,获得活幼虫约100万条;500目分离筛上的分离物需进一步用100目和200目的分离筛多次漂洗,最后在500目分离筛上获得虫卵约350万个。所分离线虫的3种虫态(图3～5)数量可满足试验需要。212 接种虫态与根结形成时间
2 结果与分析
211 根结线虫的分离
2.1.1 番茄栽培地中蔬菜上的根结线虫调查 在
番茄栽培地调查情况见表1和图1～2。结果表明
,
通过直接观察接种盒表面,接种幼虫后10d
有
662西 南 农 业 学 报 21卷
;
接种虫卵和病圃16和17d;而雌
虫出现根结雏形的时间为11d(表2)。213 接种虫态与形成的根结和卵块团数量
利用未经灭菌的病圃土作为接种基质,移栽胚根幼苗后即有植株死亡,至调查根结时(70d),移栽的30株中仅8株存活。调查根结和卵块团数见表2和图6～8。结果表明:接种病圃土与虫卵后,平均单株形成的卵块团数量相近,约4.5个/株,初步表明病圃土中病原主要来自卵的孵化;接种幼虫的植株,平均单株形成的卵块团数量为48.1个/株,平均卵块团数高于根结数;然而,接种雌虫形成的根结和卵块数极少。试验中大部分雌虫体内尚未形成完整的卵粒,
少量大型雌虫则处在虫体卷曲(图4),未出现雏型卵的阶段。这一阶段的虫态,在解剖镜下未观察到虫体运动。同时,具有未成熟卵粒的雌虫在
脱离寄主后,能否完成卵的形成,目前尚未见相关的报道。因此,接种雌虫后产生的根结和卵块,推测为接种雌虫液中残留的极少量幼虫所为。
3 讨 论
311 番茄根结线虫的分离
分离少量番茄根结线虫并不困难,分离雌虫和虫卵也较简单,但分离大量的幼虫,操作上较为繁琐。然而,国际上在开展有关抗线虫资源的抗性评价或对植物与线虫敏感性测试时,更趋向于使用幼虫接种。目前尚不能通过合成培养基直接培养线虫,只有通过病圃采集样品或敏感寄主培养线虫而分离大量的幼虫。笔者曾尝试将虫卵孵化成幼虫,但未成功。本研究从发病的番茄栽培地采集线虫,利用高渗蔗糖溶液法与分离筛法结合分离的线虫,
表2 番茄苗接种线虫后浸染状况
Table2 Infectedstatusafterinoculatednematodesontomatoseedlings
接种物虫态
Inoculated
nematodeform
移栽苗数
Transplantedseedlings
3030303030
接种苗数
Inoculatedseedlings
--303030
根结出现的天数(d)
Daysofappearedgall
-17111610
调查植株数
Surveyedplants308302930
卵块团数
Amountofegg2masses
016156725
根结数
Amount
ofgalls0211675718
卵块团数
Amountofegg2massesandgalls
[1**********]3
单株平均卵块团数
Average04.60.64.548.1
对照Control3病圃土Soil3
3
雌虫Femamles虫卵Eggs幼虫Juveniles
注:3,接种时加自来水2mL/株;33病圃土来自发病严重的番茄栽培地。
Note:3,Added2mltapwaterforeachplantattheinoculatingtime;33Thesoilwasfromcultivatedtomatolandwithheavyroot2knotdisease.
3期 张绍松等:
番茄根结线虫分离和苗期接种方法研究663
可以满足接种测定的需要。分离所获得线虫数量,
只是植株根系线虫群体的一部分。此外,获得的线虫也不是单一的种群,为栽培地植株根系以优势种群为主的复合物,推测主要为南方根结线虫。赵洪[18]
海等研究了利用同功酶对根结线虫进行分类,目前笔者也正利用分子生物学技术和同功酶研究技术鉴别分离物中所含有的根结线虫的种群。312 测试植物对根结线虫敏感性的适宜接种虫态
本研究结果显示,在苗期接种同一番茄品种的条件下,病圃土容易造成测试植株的死亡,如果在室外病圃中测试,推测所测试植株的死亡率还会更高,而且形成的根结与卵块团数量不多,从而影响测试结果。分离虫卵方法虽然简易,但利用虫卵接种后形成的根结与卵块团仅有幼虫法接种的1/10,所获得的试验结果难以区分不同品系植株对线虫的敏感性。利用活体2龄幼虫接种,显增高,,提高测试结果的可靠性,究,,雌虫,将大量活。荷兰Frans认为(私人通讯),2龄幼虫中约有20%～30%侵染寄主并产生根结和卵块团(一般为雌虫)。笔者曾使用Frans提供的甜菜胞囊线虫和北方根结
[19～21]
线虫的2龄幼虫分别接种过十字花科植物与番茄,在敏感的对照植株上所产生的胞囊或根结与卵块团都在100以上。可见,形成根结和卵块团数量与所使用的虫态密切相关。但获得龄期基本一致的大量2龄幼虫比较困难,理想的途径是通过虫卵孵化出龄期基本一致的2龄幼虫。313 植物苗期接种根结线虫的相关条件
影响苗期接种根结线虫的因素主要包括:①接种物,如上述的虫态。②培养的植物苗生长的基质。笔者曾选用河砂配以矿质营养进行接种北方根结线虫,效果良好(尚未发表)。③温度。每一种根结线虫的侵染循环与温度密切相关。在线虫可生长繁殖的温度范围内,温度升高,侵染循环将缩短。种类不同的线虫,适宜生长繁殖的温度也不同,过高温度,会导致有些种类的线虫死亡;另一方面,所测试植物的抗性也与温度有关,如已报道秘鲁番茄中的抗根结线虫基因Mi21在
[22]
32℃接种培养条件下,抗性丧失。④光照。光照影响植物的生长,也影响根结线虫侵染所测试植物的生长。⑤水分。水分既影响植物生长,也影响线虫生长与侵染。⑥接种的植物种类。不同植物需要不同的上述条件。实际接种过程中,还需考虑可能影响接种效果的其它条件,总之,探索适宜的接种条件,有利于获得客观可靠的试验结果。
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(责任编辑 谢晓慧)
2008年21卷3期西 南 农 业 学 报
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文章编号:1001-4829(2008)03-0659-05
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摘 要:通过5年番茄栽培地的根结线虫发病状况调查,得出蔬菜栽培地的根结线虫发病率为90%～其附着的根系土,利用蔗糖高渗溶液离心法与分离筛法分离,获得病原线虫3茄幼苗,培养56d后,调查结果显示:;对苗期番茄根系具有侵染性,但形成根结时间不同,接种幼虫后10d,16d可见根结雏形,病圃土则需17d;接种J2幼虫后,14.5个,表明接种幼虫是测试植物对根结线虫敏感性的有效虫态。
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由于线虫广泛侵染农作物及其危害的严重性,引起了国内外科技工作者的关注。自1855年Berkeley在英国的感病黄瓜上首次观察到根结,并
660西 南 农 业 学 报 21
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发现根结线虫病原后,多数国家和地区在多种植物
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[9]
121℃灭菌1h,自然降温后,装入接种盒中。待种
子萌发长出胚根约1cm,将有胚根的种苗移栽于接种盒中。同时,利用发病严重菜地的病圃土(未经灭菌和不加肥料)装入接种盒中,作为病圃土接种对照。移栽后将接种盒装入塑料筐内,置于光照培养箱中25℃培养。113 番茄根结线虫病害调查、病原采集与分离1.3.1 番茄生产中根结线虫病害的调查 在农户的番茄栽培地寻找采收末期的番茄植株,挖取完整的植株根系,采回后即洗净根系,统计根系上的根结数量。同时,记录采样地的前茬栽培作物。1.3.2 ,,(共,),,保留附着在根系上的少许1.3.3 根结线虫病原分离 采回的病株根系,计数每一病株上的根结数,再放入盆中,加入自来水浸泡过夜,在盆中逐株清洗根系,尽可能将根系上的土洗下。洗净的根系,统计根结数量,继续泡入水中浸泡过夜,收集浸泡液;同法再泡洗3次(d),弃去根系,回收洗液和泥土。洗液和泥土经20目分离筛清洗,去除分离筛上较大颗粒土和植株残渣,放入容器中静置后,轻轻移弃上部液体。残液和泥土经2000r/min离心2min,弃去上清液,加入494g/L蔗糖,混匀后2000r/min离心2min,将上清液用800目的分离筛清洗,收集分离筛上的幼虫和虫卵。取收集物放入60目的分离筛中,用清水反复清洗,收集分离筛上虫体———雌虫;洗液再用100、200和500目的分离筛反复漂洗,收集500目分离筛上的收集物———大部分为虫卵;500目分离筛上的滤过液再经800目的分离筛清洗,收集分离筛上的虫体———2龄幼虫。所分离的虫和虫卵储于4℃的冰箱中备用。1.3.4 分离的病原根结线虫镜检 在分离过程中,利用连接有成像系统的解剖镜检查每步的分离物,经多次清洗过筛后,检测3种虫态的纯度高于99%时,收集虫体或虫卵于试剂瓶,并测定浓度、拍照。114 番茄苗的培养和接种根结线虫
(M.hapla)。在国际根结线虫协作组(IMP)所收集
的1300个样本中,4种根结线虫占到群体总数的95%,其中前3种根结线虫普遍分布于热带、亚热带和
温带。
研究线虫及其相关学科领域,首先需要分离与培养线虫。然而,受侵染植株根系及其周围的土壤所包含的并非单一种群的线虫。关于线虫形态学方面的研究,只需要少量线虫。但利用线虫进行植物抗性评价等方面的研究,通常需要大量的线虫。此[10～11][12]
养卵与幼虫,。[13][E.P.等和R(schachtii)的胞囊与幼虫和刘维志等也介绍了关于线虫分离的相关方法。国内报道利用虫卵或幼虫接种的文献中对虫卵与幼虫的大量分离方法未进行详细描述。笔者针对番茄根结线虫3种虫态的分离方法进行了探索。
番茄对根结线虫是高度敏感易发病的栽培园艺作物。目前许多研究者在测试作物对根结线虫的敏感性或筛选抗病种质资源时,不同的研究者采用的
[10]
测试方法不同,在病圃中、采集病圃土在室内、收集分离虫卵或幼虫等方法对作物的敏感性或抗性进行接种测试。本文研究和报道了根结线虫的分离及分别以病圃土、虫卵、雌虫或幼虫接种苗期番茄测定敏感性的方法。
[10]
[10～11]
[12,17]
[15]
[16]
1 材料与方法
111 种子与萌发
番茄种子采自农户栽培地中发病严重的翠玉栽培品种。无限生长型,果实为小果型水果番茄。采摘已变红成熟的果实,淘洗种子凉干后即可用于试验。在3套培养皿内垫双层滤纸,灭菌后自然降至室温,取约250粒种子,以1cm左右间距排在平皿中滤纸上,加入灭菌水,置平皿于培养箱中,25℃培养。112 番茄苗的培养
用透明度较高的塑料片膜自制接种盒(2cm×4cm×12cm)。取从元谋县采回的菜园土,按1%的比例混入腐熟的干猪粪(已研磨和8目过筛),经
番茄苗在光照培养箱中以25℃(昼,12h)/16℃(夜,12h)培养。待番茄苗的真叶长出1～2片时(2周),进行接种。选择生长良好的植株,测试的每项内容各30株;含病圃土的接种盒不再接种,空白对照接种盒(灭菌土)加2mL的水。雌虫、幼虫和虫卵按1.3中分离,储于4℃的冰箱中。雌虫和2龄幼虫稀释为800条/mL,虫卵稀释为1500个/mL,
3期 张绍松等:
番茄根结线虫分离和苗期接种方法研究661
表1 元谋县番茄根结线虫病害调查
Table1 Investigatedroot2knotdiseaseoftomatoinYuanmou
调查时间
Investigatedtime2001年11月
Nov.2001
36000
2002年4月
Apr.2002
867991.9185.4
2003年6月
Jun.2003
[1**********]4.0
2004年12月Dec.2004
[1**********]7.5
2005年12月Dec.2005
[1**********]1.0
调查植株数Amountofsurveyedplants感染的植株数Amountofinfectedplants感染率(%)Rateofinfectedplants平均单株根结数Galls/plant
前茬栽培作物Cultivatedcropbeforetomato
水稻Rice黄瓜Cucumber番茄Tomato黄瓜Cucumber番茄Tomato
每株接种2mL的虫或卵液。雌虫和2龄幼虫的接种虫量分别为1600条/株,虫卵接种量为3000个/株。接种完毕后,放回光照培养箱中继续培养,适时浇水,接种后第5天开始,每天取出接种盒,在接种盒表面直接观察接种盒内根系上根结形成状况。115 接种后发病状况调查56d,将接,0.02%的Phloxine染色,在解剖镜检下调查每一株根系形成的根结和卵块团数,拍照。
番茄连作或与黄瓜、甜椒轮作时,发病率均为90%以上,病害发生极为严重。,则未发现病株,。2.2 ,,另含有少许其,大量60目的分离筛上,包括极少量幼虫和卵,经60目多次分离筛漂洗后,获得纯度约99%的雌虫高于6万条;筛洗滤液进一步在100～500目分离筛上多次漂洗,大部分死幼虫、个体大的活虫和虫卵滞留在分离筛上;滤过的漂洗液中含大量的2龄幼虫、少量死幼虫与卵,活幼虫的纯度高于99%,获得活幼虫约100万条;500目分离筛上的分离物需进一步用100目和200目的分离筛多次漂洗,最后在500目分离筛上获得虫卵约350万个。所分离线虫的3种虫态(图3～5)数量可满足试验需要。212 接种虫态与根结形成时间
2 结果与分析
211 根结线虫的分离
2.1.1 番茄栽培地中蔬菜上的根结线虫调查 在
番茄栽培地调查情况见表1和图1～2。结果表明
,
通过直接观察接种盒表面,接种幼虫后10d
有
662西 南 农 业 学 报 21卷
;
接种虫卵和病圃16和17d;而雌
虫出现根结雏形的时间为11d(表2)。213 接种虫态与形成的根结和卵块团数量
利用未经灭菌的病圃土作为接种基质,移栽胚根幼苗后即有植株死亡,至调查根结时(70d),移栽的30株中仅8株存活。调查根结和卵块团数见表2和图6～8。结果表明:接种病圃土与虫卵后,平均单株形成的卵块团数量相近,约4.5个/株,初步表明病圃土中病原主要来自卵的孵化;接种幼虫的植株,平均单株形成的卵块团数量为48.1个/株,平均卵块团数高于根结数;然而,接种雌虫形成的根结和卵块数极少。试验中大部分雌虫体内尚未形成完整的卵粒,
少量大型雌虫则处在虫体卷曲(图4),未出现雏型卵的阶段。这一阶段的虫态,在解剖镜下未观察到虫体运动。同时,具有未成熟卵粒的雌虫在
脱离寄主后,能否完成卵的形成,目前尚未见相关的报道。因此,接种雌虫后产生的根结和卵块,推测为接种雌虫液中残留的极少量幼虫所为。
3 讨 论
311 番茄根结线虫的分离
分离少量番茄根结线虫并不困难,分离雌虫和虫卵也较简单,但分离大量的幼虫,操作上较为繁琐。然而,国际上在开展有关抗线虫资源的抗性评价或对植物与线虫敏感性测试时,更趋向于使用幼虫接种。目前尚不能通过合成培养基直接培养线虫,只有通过病圃采集样品或敏感寄主培养线虫而分离大量的幼虫。笔者曾尝试将虫卵孵化成幼虫,但未成功。本研究从发病的番茄栽培地采集线虫,利用高渗蔗糖溶液法与分离筛法结合分离的线虫,
表2 番茄苗接种线虫后浸染状况
Table2 Infectedstatusafterinoculatednematodesontomatoseedlings
接种物虫态
Inoculated
nematodeform
移栽苗数
Transplantedseedlings
3030303030
接种苗数
Inoculatedseedlings
--303030
根结出现的天数(d)
Daysofappearedgall
-17111610
调查植株数
Surveyedplants308302930
卵块团数
Amountofegg2masses
016156725
根结数
Amount
ofgalls0211675718
卵块团数
Amountofegg2massesandgalls
[1**********]3
单株平均卵块团数
Average04.60.64.548.1
对照Control3病圃土Soil3
3
雌虫Femamles虫卵Eggs幼虫Juveniles
注:3,接种时加自来水2mL/株;33病圃土来自发病严重的番茄栽培地。
Note:3,Added2mltapwaterforeachplantattheinoculatingtime;33Thesoilwasfromcultivatedtomatolandwithheavyroot2knotdisease.
3期 张绍松等:
番茄根结线虫分离和苗期接种方法研究663
可以满足接种测定的需要。分离所获得线虫数量,
只是植株根系线虫群体的一部分。此外,获得的线虫也不是单一的种群,为栽培地植株根系以优势种群为主的复合物,推测主要为南方根结线虫。赵洪[18]
海等研究了利用同功酶对根结线虫进行分类,目前笔者也正利用分子生物学技术和同功酶研究技术鉴别分离物中所含有的根结线虫的种群。312 测试植物对根结线虫敏感性的适宜接种虫态
本研究结果显示,在苗期接种同一番茄品种的条件下,病圃土容易造成测试植株的死亡,如果在室外病圃中测试,推测所测试植株的死亡率还会更高,而且形成的根结与卵块团数量不多,从而影响测试结果。分离虫卵方法虽然简易,但利用虫卵接种后形成的根结与卵块团仅有幼虫法接种的1/10,所获得的试验结果难以区分不同品系植株对线虫的敏感性。利用活体2龄幼虫接种,显增高,,提高测试结果的可靠性,究,,雌虫,将大量活。荷兰Frans认为(私人通讯),2龄幼虫中约有20%～30%侵染寄主并产生根结和卵块团(一般为雌虫)。笔者曾使用Frans提供的甜菜胞囊线虫和北方根结
[19～21]
线虫的2龄幼虫分别接种过十字花科植物与番茄,在敏感的对照植株上所产生的胞囊或根结与卵块团都在100以上。可见,形成根结和卵块团数量与所使用的虫态密切相关。但获得龄期基本一致的大量2龄幼虫比较困难,理想的途径是通过虫卵孵化出龄期基本一致的2龄幼虫。313 植物苗期接种根结线虫的相关条件
影响苗期接种根结线虫的因素主要包括:①接种物,如上述的虫态。②培养的植物苗生长的基质。笔者曾选用河砂配以矿质营养进行接种北方根结线虫,效果良好(尚未发表)。③温度。每一种根结线虫的侵染循环与温度密切相关。在线虫可生长繁殖的温度范围内,温度升高,侵染循环将缩短。种类不同的线虫,适宜生长繁殖的温度也不同,过高温度,会导致有些种类的线虫死亡;另一方面,所测试植物的抗性也与温度有关,如已报道秘鲁番茄中的抗根结线虫基因Mi21在
[22]
32℃接种培养条件下,抗性丧失。④光照。光照影响植物的生长,也影响根结线虫侵染所测试植物的生长。⑤水分。水分既影响植物生长,也影响线虫生长与侵染。⑥接种的植物种类。不同植物需要不同的上述条件。实际接种过程中,还需考虑可能影响接种效果的其它条件,总之,探索适宜的接种条件,有利于获得客观可靠的试验结果。
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(责任编辑 谢晓慧)