抗菌测试方法
抗菌测试前期准备
1.各种溶液的配置
100ml液体培养基溶液：1.8g营养肉汤+100ml去离子水。
100ml固体培养基溶液：1.8g营养肉汤+1.5g琼脂粉+100ml去离子水。 100ml氯化钠溶液：1g氯化钠+100ml去离子水。
2.高压灭菌
为保证灭菌质量，高压灭菌时间适宜控制在20至30分钟之间。
3.乙醇消毒
所有样品包括人手在进入超净工作台前，须用75%的乙醇彻底擦洗一遍。
4.活化菌种
用移液枪头挑取一个典型菌落，至于3ml液体培养基的试管中。 把试管放置于恒温培养箱中，37℃，培养24小时。
三种抗菌测试方法
一．抑菌圈法
取活化过的菌种100μl滴于含有固体培养基的平板中，并用涂布棒涂均匀，涂干（涂至表面没有水分为止）。
取抗菌膜（直径5mm左右），把含有抗菌成分的一面紧紧地压于涂干的平板上。 把平板倒置放于恒温培养箱中，37℃，培养18至24小时。
抑菌圈法示意图。大圆为平板，四个小圆中有三个为抗菌膜，另外一个为不含有抗菌成分作为空白对照的膜。
二．平板计数法
取活化过的菌种30μl滴于含有30ml液体培养基的锥形瓶中，在恒温摇床中培养2.5至3小时（细菌数约至于10个/ml)。
从锥形瓶中取100μl菌液分别均匀涂于含有抗菌膜和空白对照膜上，放置于恒温培养箱中，培养10小时。
取生理盐水10ml把膜上的细菌冲洗下来，用振荡器使其充分均匀分散。
从生理盐水中取100μl用十倍稀释法逐步稀释至细菌数为10到100个/ml（此梯度为最8
小梯度）。
从十倍稀释法稀释过后的细菌数（最小梯度）往上推两个梯度，分别为10个/ml和10个/ml，从此三个梯度中取100μl滴于含有固体培养基的平板中，并用涂布棒涂均匀，涂干（涂至表面没有水分为止）。
把平板倒置放于恒温培养箱中，37℃，培养18至24小时。
没有抗菌剂对照样按以上相同方法进行。
抗菌率计算：
R%=A-B
A⨯100 34
A为对照样的细菌数，B-为加有抗菌剂的细菌数。
三．吸光度法
从活化过的菌种中取一定量的菌液分别滴于含有抗菌剂和不含有抗菌剂的液体培养基的锥形瓶中，使其在600nm波长的吸光度（OD600）在0.1～0.2。
把含有上述培养基的放于恒温震荡培养箱中37℃培养，每隔15分钟测一次OD600。直至不含有抗菌剂的液体培养基（对照样）的OD600数值的增长随时间的延长而趋于平缓为止，实验方可结束。OD600随时间的增加而基本不变或降低的所用的最低抗菌剂浓度即为最低抑菌浓度，即MIC
※ 以下是卫生部消毒技术标准的相关详细方法和步骤
卫生部消毒技术规范（2002年版）
2.1.7 抗（抑）菌试验
2.1.7.1 目的
测定抗（抑）菌产品对细菌和真菌的抗（抑）菌作用。
常使用的方法有抑菌环试验、最小抑制浓度测定试验、滞 留 抑 菌 效 果 测 定 试 验 、洗衣粉抗菌效果测定试验、振荡烧瓶试验、浸渍试验与奎因试验, 可视情况选用。
2.1.7.2 抑菌环试验（抑菌圈试验）
2.1.7.2.1 原理
利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。
2.1.7.2.2 试验器材
(1)金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌 (ATCC 10231) 菌悬液(见 2.1.1.2)及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液。
(2)抑菌剂载体 (5 mm 直径园形新华一号定性滤纸片,经压力蒸汽灭菌处理后，置 120℃ 烤干2h, 保存备用)。
(3)活菌培养计数所需器材(见2.1.1.3)。
(4)微量移液器(5μl～50μl, 可调式)。
(5)游标卡尺。
(6)营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基
2.1.7.2.3 操作程序
(1)抑菌片的制备:对液体抑菌剂, 取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加实际使用浓度抑菌
剂溶液 20μl, 然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内,开盖置温箱(37℃) 中烤干, 或置室温下自然干燥后备用。
溶出性抗（抑）菌产品, 可直接制成直径为 5mm, 厚不超过 4mm圆片(块)，每 4 片(块) 一组。
(2)阴性对照样片的制备:取无菌干燥滤纸片,每片滴加无菌蒸馏水 20μl，干燥后备用。 溶出性抗（抑）菌产品的阴性对照样本, 应取同种材质不含抑菌成份的样品，制成与试验组大小相同的样片(块)。
56 (3)试验菌的接种:用无菌棉拭子蘸取浓度为 5×10cfu/ml～5×10cfu/ml 试验菌悬
液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次, 平板应转动 60°, 最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥 5min。
(4)抑菌剂样片贴放:每次试验贴放1个染菌平板,每个平板贴放4片试验样片, 1 片阴性对照样片, 共 5 片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距 25mm以上, 与平板的周缘相距 15 mm 以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片,使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37℃温箱, 培养16h～18h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径 (包括贴片) 并记录。试验重复3次。
测量抑菌环时, 应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。 测量其直径应以抑菌环外沿为界。
2.1.7.2.4 评价规定
(1)抑菌作用的判断:
抑菌环直径大于 7mm 者, 判为有抑菌作用。
抑菌环直径小于或等于 7mm 者, 判为无抑菌作用。
(2) 3 次重复试验均有抑菌作用结果者, 判为合格。
(3)阴性对照组应无抑菌环产生。否则试验无效。
2.1.7.2.5 注意事项
(1)每次试验均应设置阴性对照, 不可省略。在报告中亦必须将对照组的结果列出。
(2)接种用细菌悬液的浓度应符合要求。浓度过低,接种菌量少,抑菌环常因之增大; 浓度过高, 接种量过多, 抑菌环则可减小。
(3)应保持琼脂浓度的准确性, 否则可影响抑菌环的大小。
(4)培养时间不得超过 18h。培养过久, 部分细菌可恢复生长, 抑菌环变小。
(5)抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌剂滤纸片应在试验当天制 备。
2.1.7.3 最小抑菌浓度测定试验
2.1.7.3.1原理
本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培养基中，然后点种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌物质抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)。
2.1.7.3.2 试验器材
（1）菌株
金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大肠杆菌 8099或ATCC 11229。
（2）MH琼脂 将38gMH琼脂干粉培养基溶干1000ml水中， 加热至沸腾溶解， 然后121℃高压灭菌15min，置45℃～50℃水浴备用， 此培养基将用于对照试验。
（3）0.03mol/L磷酸盐缓冲液pH7.2
（4）加样器（1μl～10μl）
（5）45℃～50℃水浴恒温箱
（6）吸管、试管、平皿
（7）37℃培养箱
2.1.7.3.3 操作步骤
（1）抗（抑）菌溶液的配制：以无菌操作取5ml或5g（固体研磨后）样品，放入45ml灭菌磷酸缓冲液中，充分震荡溶解，配成10%的均匀分散的溶液或悬液。
（2）含抗菌剂培养基配制：将已配成10%的抗（抑）菌溶液或悬液用PBS做对倍系列稀
释成不同浓度的受试液，置45℃～50℃水浴恒温备用。
（3）双倍浓度培养基配制： 将76gMH琼脂干粉培养基溶于1000ml水中。加热至沸腾溶解。然后121℃压力蒸汽灭菌15min，置45℃～50℃水浴备用。此培养基将用于稀释抗（抑）菌溶液或悬液。
（4）含抗（抑）菌液培养基的配制：分别取10ml系列稀释的抗菌液加入平皿内。将在45℃～50℃水浴中的双倍MH琼脂10ml，加进平皿内 ，边加边摇晃平板， 使抗（抑）菌液和培养基充分混匀。
7（5）用加样器取1μl～2μl（含菌量约为10cfu/ml）菌悬液点种于含抗（抑）菌液培养
4基的平皿，接种后所形成的菌液圈直径约5mm～8mm（每个点菌量约为为10cfu）。
（6）以同样方法接种不含抗（抑）菌成分的MH琼脂平板，作为阳性对照。
（7）将接种后的平板放置35℃培养箱中，倒置培养18h～24h，观察结果。
2.1.7.3.4 评判规定
菌落生长被完全抑制的最低抗（抑）菌液浓度为该样品对受试菌的MIC。单一菌落生长可忽略不计。
2.1.7.3.5 注意事项
(1) 接种时，应由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度平板依次接种，最后接种对照平板。
(2)为了保证平板受热均匀，培养时平板堆放不得超过4个。
2.1.11.7 产品杀菌性能、抑菌性能及其稳定性鉴定
(1) 样品采集
为使样品具有良好的代表性,应于同一批号三个运输包装中至少随机抽取20件最小销售包装样品，其中1/4留样，1/4做抑菌或杀菌性能测试，2/4做稳定性测试。
(2) 试验菌与菌液制备
试验菌：
细菌：金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）,大肠杆菌（8099或ATCC 25922）
酵母菌：白色念珠菌(ATCC 10231)
菌液制备：取菌株第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物(18h～24h), 用5 mL 0.03mol/L磷酸盐缓冲液 （以下简称PBS）洗下菌苔,使菌悬浮均匀后用上述PBS稀释至所需浓度.
(3) 杀菌性能测试方法
该试验取样部位，根据被试产品生产者的说明而确定。
1) 中和剂鉴定试验：
进行杀菌性能测试必须通过以下中和剂鉴定试验。
① 试验分组
第1组： 染菌样片 + 5 ml PBS
第2组： 染菌样片 + 5 ml中和剂
第3组：染菌对照片 + 5 ml中和剂
第4组：样片 + 5 ml中和剂 + 染菌对照片
第5组：染菌对照片 + 5 ml PBS
第6组：稀释液 + 中和剂 + 培养基 → 培养
作为试验材料阴性对照。
② 评价规定
第1组无试验菌,或仅有极少数试验菌菌落生长；第2组有较第1组为多, 但较第3、4、5组为少的试验菌落生长, 并符合要求；第3,4,5组有相似量试验菌生长, 并在1×104 cfu/片～9×10cfu/片之间, 其组间菌落数误差率应不超过15 % ；第6组无菌生长；连续3次试验取得合格评价。 4
2）杀菌试验
①操作步骤
将试验菌24h斜面培养物用 PBS洗下，制成菌悬液（要求的浓度为：用100μl滴于对
44照样片上，回收菌数为1×10 cfu/片）～9×10cfu/片）。
取被试样片（2.0cm×3.0cm）和对照样片（与试样同质材料，同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理）各4片，分成4组置于4个灭菌平皿内。
取上述菌悬液，分别在每个被试样片和对照样片上滴加100μl，均匀涂布，开始计时，作用2 min、5 min、10 min、20 min, 用无菌镊分别将样片投入含5 mL相应中和剂的试管内，充分混匀,作适当稀释，然后取其中2-3个稀释度，分别吸取0.5 ml，置于两个平皿，用凉至40ºC～45ºC的营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15 ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35ºC±2ºC培养48 h（细菌）或72 h（酵母菌），作活菌菌落计数。
试验重复3次, 按下式计算杀菌率:
X3 = (A-B) / A × 100%
式中：
X3 ：杀菌率，% ；
A：对照样品平均菌落数；
B：被试样品平均菌落数。
②评价标准
杀菌率≥90%，产品有杀菌作用。
（4）溶出性抗（抑）菌产品抑菌性能测试方法 （类似于平板计数法）
1）操作步骤
将试验菌24h斜面培养物用 PBS洗下，制成菌悬液（要求的浓度为：用100μl滴于对照样片上或5ml样液内，回收菌数为1×104cfu/片～9×104cfu/片或ml）。
取被试样片（2.0cm×3.0cm）或样液（5 ml）和对照样片或样液（与试样同质材料，同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理）各4片（置于灭菌平皿内）或4管。
取上述菌悬液，分别在每个被试样片或样液和对照样片或样液上或内滴加100μl，均匀涂布/混合，开始计时，作用2 min、5 min、10 min、20min,用无菌镊分别将样片或样液（0.5 ml）投入含5mL PBS的试管内，充分混匀,作适当稀释，然后取其中2-3个稀释度，分别吸取0.5 ml，置于两个平皿，用凉至40ºC～45ºC的营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15 ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35ºC±2ºC培养48h（细菌）或72 h（酵母菌），作活菌菌落计数。
试验重复3次, 按下式计算抑菌率:
X4 = (A-B) / A × 100%
式中：
X4：抑菌率，% ；
A：对照样品平均菌落数；
B：被试样品平均菌落数。
2）评价标准
抑菌率≥50%～90%，产品有抑菌作用，抑菌率≥90%，产品有较强抑菌作用。
（5）非溶出性抗（抑）菌产品抑菌性能测试方法
1）操作步骤
称取被试样片（剪成1.0cm×1.0cm大小）0.75 g，放入一个250 ml的三角烧瓶中,分别加入70 ml PBS和5 ml 菌悬液, 使菌悬液在PBS中的浓度为1×104 cfu/ml～9×104cfu/ml。 将三角烧瓶固定于振荡摇床上,以300 r/min 振摇1 h。
取0.5 ml振摇后的样液,或用PBS做适当稀释后的样液, 以琼脂倾注法接种平皿, 进行菌落计数。
同时设对照样片组和不加样片组. 对照样片组的对照样片与被试样片同样大小但不含抗菌成分,其它操作程序均与被试样片组相同.不加样片组分别取5ml菌悬液和70 ml PBS加入一个250 ml三角烧瓶中,混匀,分别于0时间和振荡1h后, 各取0.5 ml菌悬液与PBS的混合液做适当稀释,然后进行菌落计数。
试验重复3次, 按下式计算抑菌率:
X5 = (A-B) / A × 100%
式中：
X5：抑菌率，% ；
A：被试样品振荡前平均菌落数；
B：被试样品振荡前平均菌落数。
2）评价标准
不加样片组的菌落数在1×10cfu/ml～9×10cfu/ml之间, 且样本振荡前后平均菌落数差值在10 %以内, 试验有效；被试样片组抑菌率与对照样片组抑菌率的差值 > 26 %,产品具有抗菌作用。
（6）稳定性测试方法
1）测试条件
①自然留样：将原包装样品置室温下至少1年，每半年进行抑菌或杀菌性能测试。 ②加速试验：将原包装样品置54ºC～56ºC恒温箱内14天或37ºC～40ºC恒温箱内3个月，保持相对湿度 ≥75 %, 放置前后分别进行抑菌或杀菌性能测试。
2）评价标准
①产品经自然留样，其杀菌率或抑菌率达到规定的标准值，产品的杀菌或抑菌作用在室温下的保持时间即为自然留样时间。
②产品经54ºC加速试验，其杀菌率或抑菌率达到规定的标准值，产品的杀菌或抑菌作用在室温下至少保持一年。
③产品经37ºC加速试验，其杀菌率或抑菌率达到规定的标准值，产品的杀菌或抑菌作用在室温下至少保持二年。
2.1.7.6 振荡烧瓶试验
2.1.7.6.1 原理 44
在液体中通过快速长时间振荡, 增加微生物与抗（抑）菌产品内抑菌剂的接触以显示其抑菌作用。试验根据抑菌率大小判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于对非溶出性抗（抑）菌织物的鉴定。
2.1.7.6.2 试验器材
(1)金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌 (ATCC 10231) 菌悬液的制备方法见2.1.1.2.3。根据抑菌剂特定用途也可用其他菌悬液。
(2)磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH值7.2～7.4)
(3)振荡摇床 (300r/min)
(4)三角烧瓶
(5)营养琼脂培养基、胰 蛋 白 胨大 豆琼 脂培 养 基（TSA）与沙堡琼脂培养基
2.1.7.6.3 操作程序
（1）将抗菌物品剪切成10mm×10mm样片,称取0.75g分装包好。
（2）将0.75g样片放入250ml的三角烧瓶中,分别加入70ml PBS和5ml菌悬液, 使菌悬
44液在PBS中的浓度为1×10 cfu/ml～5×10 cfu/ml。
（3）将三角烧瓶固定于振荡摇床上, 在作用温度为20℃～25℃的条件下，以300r/min振摇2min。吸取1.0 ml用PBS作适当稀释只至10-2，作为试验组震荡前样液。
（4）将0.75g样片放入上述含有70 ml PBS和5ml菌悬液的三角烧瓶中，然后将三角烧瓶固定于振荡摇床上，在作用温度为20℃～25℃的条件下，以300r/min振摇取0.5ml振摇1h。吸取1.0 ml样液，或用PBS作适当稀释后作为试验组振荡后样液。
（5）分别吸取振荡前和振荡后样液各1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样液接种两个平皿，按照2.1.1.3规定的方法进行活菌培养计数。
（6）试验同时设阴性对照样片和不加样片组。对照样片组以不含抗菌剂的材质、大小相同的样片代替抗菌样片外, 其它操作程序均与试验组相同。 不加样片组分别取5ml菌悬液 和70ml PBS加入250ml三角烧瓶中,混匀,分别于振荡前和振荡后1h， 各取1.0ml菌悬液与PBS的混合液做适当稀释。 按2.1.1.2.3法进行活菌培养计数。
（7）试验重复3次,按下式计算抑菌率
抑菌率=样本振荡前平均菌落数-样本振荡后平均菌落数
样本振荡前平均菌落数⨯100%
2.1.7.6.4 评价规定
(1)不加样片组活菌计数在1×104cfu/ml～5×104cfu/ml, 且样本振荡前后平均菌落数差值在 10% 以内, 试验有效。
(2)试验样片抑菌率与对照样片抑菌率的差值 > 26%, 即可认定该样片具有抗菌作用。
2.1.7.6.5 注意事项
(1) 振荡前须将振荡摇床上的三角烧瓶固定牢, 以免碰破。
(2) 试验中，在实验误差允许的范围内，如果试验组和对照组出现振荡后菌落数高于振
荡前菌落数的情况，其抑菌率可按“0”计算。
2.1.7.7 浸渍试验
2.1.7.7.1原理
将试样和对照织物分别放于三角瓶中，用含有肉汤培养基的试验菌悬液接种于试样和对照织物上，经培养后，分别将培养前后试样上的细菌洗下，测定细菌的数量，可计算出试样上细菌减少的百分率。该方法适用于溶出性抗菌织物的检测。
2.1.7.7.2试验器材
(1)试验菌株 金黄色葡萄球菌ATCC 6538
(2)试样 将抗菌织物剪成直径为5cm的圆形样片
(3)肉汤培养基
(4)胰蛋白胨大豆琼脂培养基
(5)0.03mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.2
(6)恒温水浴箱
(7)37℃培养箱
2.1.7.7.3试样和菌悬液的制备
（1）试样的制备：
距布边10cm以上，离布端1m以上，剪直径为5cm的圆形试样若干，（需用试样数量要根据纤维类别及织物织法而定，以能吸收1ml 菌液且三角瓶中不留残液为度）。另剪取对照织物若干，取3份试样和2份对照织物分别装于三角瓶中，该好瓶口，121℃ 15min灭菌备用。
(2) 菌悬液的制备
用接种环将保存的菌种以划线法接种到营养琼脂平皿上，在37℃培养箱中培养24h ，取平皿上典型的菌落移种到肉汤培养基的三角瓶中，在37℃条件下培养24h ，用肉汤进行系列稀释，使菌悬液的含量为1×105cfu/ml～5×105cfu/ml。
2.1.7.7.4试验步骤
(1) 分别取1ml菌悬液加在三个准备好的三角瓶内的织物上，确保其均匀分布，且三角瓶中不留多余液，封好瓶口，以防蒸发。
(2) 分别在一个盛有试样和对照织物的三角瓶中加入100ml缓冲液，剧烈摇晃1min洗涤细菌，取1ml做10倍系列稀释，选适当稀释度以倾注法接种平皿，作为“0”接触时间样品和对照织物上的细菌数。
(3) 将另一个装有接种试样的三角瓶在37℃培养箱中培养20h±2h，然后加入100ml缓冲液，剧烈摇晃1min洗涤细菌，取1ml做10倍系列稀释，选适当稀释度以倾注法接种平皿，作为试验组。
(4)阴性对照 试样不接种菌悬液，在“0”接触时间加入100ml缓冲液，剧烈摇晃1min取样，接种平皿。
(5)阳性对照 另取1个装有对照织物的三角烧瓶，接种1ml菌悬液后,在37℃培养箱中培养20h±2h，然后加入100ml缓冲液，剧烈摇晃1min洗涤细菌，取1ml做10倍系列稀释，选适当稀释度以倾注法接种平皿。
(6)将阴性和阳性对照样本与试验组样本一并放入37℃培养箱中，培养48h，计数菌落数。
(7)试验重复3次。
(8)结果计算
B或C或(B＋C)/2-A
抑菌率（%）×100
B或C或(B＋C)/2
A-试验组试样上的细菌数；
B-“0”接触时间试样上的细菌数；
C-“0”接触时间对照织物上的细菌数；
如果“B”和“C”差别较大时，取较大值；如果“B”和“C”差别不大时，取平均值。
2.1.7.7.5评判规定
(1) “0”接触时间对照织物上的平均菌落数应在1×103cfu/ml～5×103cfu/ml。
(2) 阴性对照应无菌生长，阳性对照菌数比0接触时间的菌数明显增加。
(3) 各次试验的抑菌率均≥50%, 即可认定该样片具有抗菌作用。
2.1.7.7.6 注意事项
(1) 对织物进行染菌操作时，应确保其均匀分布，且三角瓶中不沾染或存留多余菌液。
(2) 三角瓶内的织物染菌后，应将瓶口封好，以防液体蒸发，造成细菌死亡。
抗菌测试方法
抗菌测试前期准备
1.各种溶液的配置
100ml液体培养基溶液：1.8g营养肉汤+100ml去离子水。
100ml固体培养基溶液：1.8g营养肉汤+1.5g琼脂粉+100ml去离子水。 100ml氯化钠溶液：1g氯化钠+100ml去离子水。
2.高压灭菌
为保证灭菌质量，高压灭菌时间适宜控制在20至30分钟之间。
3.乙醇消毒
所有样品包括人手在进入超净工作台前，须用75%的乙醇彻底擦洗一遍。
4.活化菌种
用移液枪头挑取一个典型菌落，至于3ml液体培养基的试管中。 把试管放置于恒温培养箱中，37℃，培养24小时。
三种抗菌测试方法
一．抑菌圈法
取活化过的菌种100μl滴于含有固体培养基的平板中，并用涂布棒涂均匀，涂干（涂至表面没有水分为止）。
取抗菌膜（直径5mm左右），把含有抗菌成分的一面紧紧地压于涂干的平板上。 把平板倒置放于恒温培养箱中，37℃，培养18至24小时。
抑菌圈法示意图。大圆为平板，四个小圆中有三个为抗菌膜，另外一个为不含有抗菌成分作为空白对照的膜。
二．平板计数法
取活化过的菌种30μl滴于含有30ml液体培养基的锥形瓶中，在恒温摇床中培养2.5至3小时（细菌数约至于10个/ml)。
从锥形瓶中取100μl菌液分别均匀涂于含有抗菌膜和空白对照膜上，放置于恒温培养箱中，培养10小时。
取生理盐水10ml把膜上的细菌冲洗下来，用振荡器使其充分均匀分散。
从生理盐水中取100μl用十倍稀释法逐步稀释至细菌数为10到100个/ml（此梯度为最8
小梯度）。
从十倍稀释法稀释过后的细菌数（最小梯度）往上推两个梯度，分别为10个/ml和10个/ml，从此三个梯度中取100μl滴于含有固体培养基的平板中，并用涂布棒涂均匀，涂干（涂至表面没有水分为止）。
把平板倒置放于恒温培养箱中，37℃，培养18至24小时。
没有抗菌剂对照样按以上相同方法进行。
抗菌率计算：
R%=A-B
A⨯100 34
A为对照样的细菌数，B-为加有抗菌剂的细菌数。
三．吸光度法
从活化过的菌种中取一定量的菌液分别滴于含有抗菌剂和不含有抗菌剂的液体培养基的锥形瓶中，使其在600nm波长的吸光度（OD600）在0.1～0.2。
把含有上述培养基的放于恒温震荡培养箱中37℃培养，每隔15分钟测一次OD600。直至不含有抗菌剂的液体培养基（对照样）的OD600数值的增长随时间的延长而趋于平缓为止，实验方可结束。OD600随时间的增加而基本不变或降低的所用的最低抗菌剂浓度即为最低抑菌浓度，即MIC
※ 以下是卫生部消毒技术标准的相关详细方法和步骤
卫生部消毒技术规范（2002年版）
2.1.7 抗（抑）菌试验
2.1.7.1 目的
测定抗（抑）菌产品对细菌和真菌的抗（抑）菌作用。
常使用的方法有抑菌环试验、最小抑制浓度测定试验、滞 留 抑 菌 效 果 测 定 试 验 、洗衣粉抗菌效果测定试验、振荡烧瓶试验、浸渍试验与奎因试验, 可视情况选用。
2.1.7.2 抑菌环试验（抑菌圈试验）
2.1.7.2.1 原理
利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。
2.1.7.2.2 试验器材
(1)金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌 (ATCC 10231) 菌悬液(见 2.1.1.2)及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液。
(2)抑菌剂载体 (5 mm 直径园形新华一号定性滤纸片,经压力蒸汽灭菌处理后，置 120℃ 烤干2h, 保存备用)。
(3)活菌培养计数所需器材(见2.1.1.3)。
(4)微量移液器(5μl～50μl, 可调式)。
(5)游标卡尺。
(6)营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基
2.1.7.2.3 操作程序
(1)抑菌片的制备:对液体抑菌剂, 取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加实际使用浓度抑菌
剂溶液 20μl, 然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内,开盖置温箱(37℃) 中烤干, 或置室温下自然干燥后备用。
溶出性抗（抑）菌产品, 可直接制成直径为 5mm, 厚不超过 4mm圆片(块)，每 4 片(块) 一组。
(2)阴性对照样片的制备:取无菌干燥滤纸片,每片滴加无菌蒸馏水 20μl，干燥后备用。 溶出性抗（抑）菌产品的阴性对照样本, 应取同种材质不含抑菌成份的样品，制成与试验组大小相同的样片(块)。
56 (3)试验菌的接种:用无菌棉拭子蘸取浓度为 5×10cfu/ml～5×10cfu/ml 试验菌悬
液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次, 平板应转动 60°, 最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥 5min。
(4)抑菌剂样片贴放:每次试验贴放1个染菌平板,每个平板贴放4片试验样片, 1 片阴性对照样片, 共 5 片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距 25mm以上, 与平板的周缘相距 15 mm 以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片,使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37℃温箱, 培养16h～18h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径 (包括贴片) 并记录。试验重复3次。
测量抑菌环时, 应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。 测量其直径应以抑菌环外沿为界。
2.1.7.2.4 评价规定
(1)抑菌作用的判断:
抑菌环直径大于 7mm 者, 判为有抑菌作用。
抑菌环直径小于或等于 7mm 者, 判为无抑菌作用。
(2) 3 次重复试验均有抑菌作用结果者, 判为合格。
(3)阴性对照组应无抑菌环产生。否则试验无效。
2.1.7.2.5 注意事项
(1)每次试验均应设置阴性对照, 不可省略。在报告中亦必须将对照组的结果列出。
(2)接种用细菌悬液的浓度应符合要求。浓度过低,接种菌量少,抑菌环常因之增大; 浓度过高, 接种量过多, 抑菌环则可减小。
(3)应保持琼脂浓度的准确性, 否则可影响抑菌环的大小。
(4)培养时间不得超过 18h。培养过久, 部分细菌可恢复生长, 抑菌环变小。
(5)抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌剂滤纸片应在试验当天制 备。
2.1.7.3 最小抑菌浓度测定试验
2.1.7.3.1原理
本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培养基中，然后点种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌物质抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)。
2.1.7.3.2 试验器材
（1）菌株
金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大肠杆菌 8099或ATCC 11229。
（2）MH琼脂 将38gMH琼脂干粉培养基溶干1000ml水中， 加热至沸腾溶解， 然后121℃高压灭菌15min，置45℃～50℃水浴备用， 此培养基将用于对照试验。
（3）0.03mol/L磷酸盐缓冲液pH7.2
（4）加样器（1μl～10μl）
（5）45℃～50℃水浴恒温箱
（6）吸管、试管、平皿
（7）37℃培养箱
2.1.7.3.3 操作步骤
（1）抗（抑）菌溶液的配制：以无菌操作取5ml或5g（固体研磨后）样品，放入45ml灭菌磷酸缓冲液中，充分震荡溶解，配成10%的均匀分散的溶液或悬液。
（2）含抗菌剂培养基配制：将已配成10%的抗（抑）菌溶液或悬液用PBS做对倍系列稀
释成不同浓度的受试液，置45℃～50℃水浴恒温备用。
（3）双倍浓度培养基配制： 将76gMH琼脂干粉培养基溶于1000ml水中。加热至沸腾溶解。然后121℃压力蒸汽灭菌15min，置45℃～50℃水浴备用。此培养基将用于稀释抗（抑）菌溶液或悬液。
（4）含抗（抑）菌液培养基的配制：分别取10ml系列稀释的抗菌液加入平皿内。将在45℃～50℃水浴中的双倍MH琼脂10ml，加进平皿内 ，边加边摇晃平板， 使抗（抑）菌液和培养基充分混匀。
7（5）用加样器取1μl～2μl（含菌量约为10cfu/ml）菌悬液点种于含抗（抑）菌液培养
4基的平皿，接种后所形成的菌液圈直径约5mm～8mm（每个点菌量约为为10cfu）。
（6）以同样方法接种不含抗（抑）菌成分的MH琼脂平板，作为阳性对照。
（7）将接种后的平板放置35℃培养箱中，倒置培养18h～24h，观察结果。
2.1.7.3.4 评判规定
菌落生长被完全抑制的最低抗（抑）菌液浓度为该样品对受试菌的MIC。单一菌落生长可忽略不计。
2.1.7.3.5 注意事项
(1) 接种时，应由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度平板依次接种，最后接种对照平板。
(2)为了保证平板受热均匀，培养时平板堆放不得超过4个。
2.1.11.7 产品杀菌性能、抑菌性能及其稳定性鉴定
(1) 样品采集
为使样品具有良好的代表性,应于同一批号三个运输包装中至少随机抽取20件最小销售包装样品，其中1/4留样，1/4做抑菌或杀菌性能测试，2/4做稳定性测试。
(2) 试验菌与菌液制备
试验菌：
细菌：金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）,大肠杆菌（8099或ATCC 25922）
酵母菌：白色念珠菌(ATCC 10231)
菌液制备：取菌株第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物(18h～24h), 用5 mL 0.03mol/L磷酸盐缓冲液 （以下简称PBS）洗下菌苔,使菌悬浮均匀后用上述PBS稀释至所需浓度.
(3) 杀菌性能测试方法
该试验取样部位，根据被试产品生产者的说明而确定。
1) 中和剂鉴定试验：
进行杀菌性能测试必须通过以下中和剂鉴定试验。
① 试验分组
第1组： 染菌样片 + 5 ml PBS
第2组： 染菌样片 + 5 ml中和剂
第3组：染菌对照片 + 5 ml中和剂
第4组：样片 + 5 ml中和剂 + 染菌对照片
第5组：染菌对照片 + 5 ml PBS
第6组：稀释液 + 中和剂 + 培养基 → 培养
作为试验材料阴性对照。
② 评价规定
第1组无试验菌,或仅有极少数试验菌菌落生长；第2组有较第1组为多, 但较第3、4、5组为少的试验菌落生长, 并符合要求；第3,4,5组有相似量试验菌生长, 并在1×104 cfu/片～9×10cfu/片之间, 其组间菌落数误差率应不超过15 % ；第6组无菌生长；连续3次试验取得合格评价。 4
2）杀菌试验
①操作步骤
将试验菌24h斜面培养物用 PBS洗下，制成菌悬液（要求的浓度为：用100μl滴于对
44照样片上，回收菌数为1×10 cfu/片）～9×10cfu/片）。
取被试样片（2.0cm×3.0cm）和对照样片（与试样同质材料，同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理）各4片，分成4组置于4个灭菌平皿内。
取上述菌悬液，分别在每个被试样片和对照样片上滴加100μl，均匀涂布，开始计时，作用2 min、5 min、10 min、20 min, 用无菌镊分别将样片投入含5 mL相应中和剂的试管内，充分混匀,作适当稀释，然后取其中2-3个稀释度，分别吸取0.5 ml，置于两个平皿，用凉至40ºC～45ºC的营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15 ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35ºC±2ºC培养48 h（细菌）或72 h（酵母菌），作活菌菌落计数。
试验重复3次, 按下式计算杀菌率:
X3 = (A-B) / A × 100%
式中：
X3 ：杀菌率，% ；
A：对照样品平均菌落数；
B：被试样品平均菌落数。
②评价标准
杀菌率≥90%，产品有杀菌作用。
（4）溶出性抗（抑）菌产品抑菌性能测试方法 （类似于平板计数法）
1）操作步骤
将试验菌24h斜面培养物用 PBS洗下，制成菌悬液（要求的浓度为：用100μl滴于对照样片上或5ml样液内，回收菌数为1×104cfu/片～9×104cfu/片或ml）。
取被试样片（2.0cm×3.0cm）或样液（5 ml）和对照样片或样液（与试样同质材料，同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理）各4片（置于灭菌平皿内）或4管。
取上述菌悬液，分别在每个被试样片或样液和对照样片或样液上或内滴加100μl，均匀涂布/混合，开始计时，作用2 min、5 min、10 min、20min,用无菌镊分别将样片或样液（0.5 ml）投入含5mL PBS的试管内，充分混匀,作适当稀释，然后取其中2-3个稀释度，分别吸取0.5 ml，置于两个平皿，用凉至40ºC～45ºC的营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15 ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35ºC±2ºC培养48h（细菌）或72 h（酵母菌），作活菌菌落计数。
试验重复3次, 按下式计算抑菌率:
X4 = (A-B) / A × 100%
式中：
X4：抑菌率，% ；
A：对照样品平均菌落数；
B：被试样品平均菌落数。
2）评价标准
抑菌率≥50%～90%，产品有抑菌作用，抑菌率≥90%，产品有较强抑菌作用。
（5）非溶出性抗（抑）菌产品抑菌性能测试方法
1）操作步骤
称取被试样片（剪成1.0cm×1.0cm大小）0.75 g，放入一个250 ml的三角烧瓶中,分别加入70 ml PBS和5 ml 菌悬液, 使菌悬液在PBS中的浓度为1×104 cfu/ml～9×104cfu/ml。 将三角烧瓶固定于振荡摇床上,以300 r/min 振摇1 h。
取0.5 ml振摇后的样液,或用PBS做适当稀释后的样液, 以琼脂倾注法接种平皿, 进行菌落计数。
同时设对照样片组和不加样片组. 对照样片组的对照样片与被试样片同样大小但不含抗菌成分,其它操作程序均与被试样片组相同.不加样片组分别取5ml菌悬液和70 ml PBS加入一个250 ml三角烧瓶中,混匀,分别于0时间和振荡1h后, 各取0.5 ml菌悬液与PBS的混合液做适当稀释,然后进行菌落计数。
试验重复3次, 按下式计算抑菌率:
X5 = (A-B) / A × 100%
式中：
X5：抑菌率，% ；
A：被试样品振荡前平均菌落数；
B：被试样品振荡前平均菌落数。
2）评价标准
不加样片组的菌落数在1×10cfu/ml～9×10cfu/ml之间, 且样本振荡前后平均菌落数差值在10 %以内, 试验有效；被试样片组抑菌率与对照样片组抑菌率的差值 > 26 %,产品具有抗菌作用。
（6）稳定性测试方法
1）测试条件
①自然留样：将原包装样品置室温下至少1年，每半年进行抑菌或杀菌性能测试。 ②加速试验：将原包装样品置54ºC～56ºC恒温箱内14天或37ºC～40ºC恒温箱内3个月，保持相对湿度 ≥75 %, 放置前后分别进行抑菌或杀菌性能测试。
2）评价标准
①产品经自然留样，其杀菌率或抑菌率达到规定的标准值，产品的杀菌或抑菌作用在室温下的保持时间即为自然留样时间。
②产品经54ºC加速试验，其杀菌率或抑菌率达到规定的标准值，产品的杀菌或抑菌作用在室温下至少保持一年。
③产品经37ºC加速试验，其杀菌率或抑菌率达到规定的标准值，产品的杀菌或抑菌作用在室温下至少保持二年。
2.1.7.6 振荡烧瓶试验
2.1.7.6.1 原理 44
在液体中通过快速长时间振荡, 增加微生物与抗（抑）菌产品内抑菌剂的接触以显示其抑菌作用。试验根据抑菌率大小判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于对非溶出性抗（抑）菌织物的鉴定。
2.1.7.6.2 试验器材
(1)金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌 (ATCC 10231) 菌悬液的制备方法见2.1.1.2.3。根据抑菌剂特定用途也可用其他菌悬液。
(2)磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH值7.2～7.4)
(3)振荡摇床 (300r/min)
(4)三角烧瓶
(5)营养琼脂培养基、胰 蛋 白 胨大 豆琼 脂培 养 基（TSA）与沙堡琼脂培养基
2.1.7.6.3 操作程序
（1）将抗菌物品剪切成10mm×10mm样片,称取0.75g分装包好。
（2）将0.75g样片放入250ml的三角烧瓶中,分别加入70ml PBS和5ml菌悬液, 使菌悬
44液在PBS中的浓度为1×10 cfu/ml～5×10 cfu/ml。
（3）将三角烧瓶固定于振荡摇床上, 在作用温度为20℃～25℃的条件下，以300r/min振摇2min。吸取1.0 ml用PBS作适当稀释只至10-2，作为试验组震荡前样液。
（4）将0.75g样片放入上述含有70 ml PBS和5ml菌悬液的三角烧瓶中，然后将三角烧瓶固定于振荡摇床上，在作用温度为20℃～25℃的条件下，以300r/min振摇取0.5ml振摇1h。吸取1.0 ml样液，或用PBS作适当稀释后作为试验组振荡后样液。
（5）分别吸取振荡前和振荡后样液各1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样液接种两个平皿，按照2.1.1.3规定的方法进行活菌培养计数。
（6）试验同时设阴性对照样片和不加样片组。对照样片组以不含抗菌剂的材质、大小相同的样片代替抗菌样片外, 其它操作程序均与试验组相同。 不加样片组分别取5ml菌悬液 和70ml PBS加入250ml三角烧瓶中,混匀,分别于振荡前和振荡后1h， 各取1.0ml菌悬液与PBS的混合液做适当稀释。 按2.1.1.2.3法进行活菌培养计数。
（7）试验重复3次,按下式计算抑菌率
抑菌率=样本振荡前平均菌落数-样本振荡后平均菌落数
样本振荡前平均菌落数⨯100%
2.1.7.6.4 评价规定
(1)不加样片组活菌计数在1×104cfu/ml～5×104cfu/ml, 且样本振荡前后平均菌落数差值在 10% 以内, 试验有效。
(2)试验样片抑菌率与对照样片抑菌率的差值 > 26%, 即可认定该样片具有抗菌作用。
2.1.7.6.5 注意事项
(1) 振荡前须将振荡摇床上的三角烧瓶固定牢, 以免碰破。
(2) 试验中，在实验误差允许的范围内，如果试验组和对照组出现振荡后菌落数高于振
荡前菌落数的情况，其抑菌率可按“0”计算。
2.1.7.7 浸渍试验
2.1.7.7.1原理
将试样和对照织物分别放于三角瓶中，用含有肉汤培养基的试验菌悬液接种于试样和对照织物上，经培养后，分别将培养前后试样上的细菌洗下，测定细菌的数量，可计算出试样上细菌减少的百分率。该方法适用于溶出性抗菌织物的检测。
2.1.7.7.2试验器材
(1)试验菌株 金黄色葡萄球菌ATCC 6538
(2)试样 将抗菌织物剪成直径为5cm的圆形样片
(3)肉汤培养基
(4)胰蛋白胨大豆琼脂培养基
(5)0.03mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.2
(6)恒温水浴箱
(7)37℃培养箱
2.1.7.7.3试样和菌悬液的制备
（1）试样的制备：
距布边10cm以上，离布端1m以上，剪直径为5cm的圆形试样若干，（需用试样数量要根据纤维类别及织物织法而定，以能吸收1ml 菌液且三角瓶中不留残液为度）。另剪取对照织物若干，取3份试样和2份对照织物分别装于三角瓶中，该好瓶口，121℃ 15min灭菌备用。
(2) 菌悬液的制备
用接种环将保存的菌种以划线法接种到营养琼脂平皿上，在37℃培养箱中培养24h ，取平皿上典型的菌落移种到肉汤培养基的三角瓶中，在37℃条件下培养24h ，用肉汤进行系列稀释，使菌悬液的含量为1×105cfu/ml～5×105cfu/ml。
2.1.7.7.4试验步骤
(1) 分别取1ml菌悬液加在三个准备好的三角瓶内的织物上，确保其均匀分布，且三角瓶中不留多余液，封好瓶口，以防蒸发。
(2) 分别在一个盛有试样和对照织物的三角瓶中加入100ml缓冲液，剧烈摇晃1min洗涤细菌，取1ml做10倍系列稀释，选适当稀释度以倾注法接种平皿，作为“0”接触时间样品和对照织物上的细菌数。
(3) 将另一个装有接种试样的三角瓶在37℃培养箱中培养20h±2h，然后加入100ml缓冲液，剧烈摇晃1min洗涤细菌，取1ml做10倍系列稀释，选适当稀释度以倾注法接种平皿，作为试验组。
(4)阴性对照 试样不接种菌悬液，在“0”接触时间加入100ml缓冲液，剧烈摇晃1min取样，接种平皿。
(5)阳性对照 另取1个装有对照织物的三角烧瓶，接种1ml菌悬液后,在37℃培养箱中培养20h±2h，然后加入100ml缓冲液，剧烈摇晃1min洗涤细菌，取1ml做10倍系列稀释，选适当稀释度以倾注法接种平皿。
(6)将阴性和阳性对照样本与试验组样本一并放入37℃培养箱中，培养48h，计数菌落数。
(7)试验重复3次。
(8)结果计算
B或C或(B＋C)/2-A
抑菌率（%）×100
B或C或(B＋C)/2
A-试验组试样上的细菌数；
B-“0”接触时间试样上的细菌数；
C-“0”接触时间对照织物上的细菌数；
如果“B”和“C”差别较大时，取较大值；如果“B”和“C”差别不大时，取平均值。
2.1.7.7.5评判规定
(1) “0”接触时间对照织物上的平均菌落数应在1×103cfu/ml～5×103cfu/ml。
(2) 阴性对照应无菌生长，阳性对照菌数比0接触时间的菌数明显增加。
(3) 各次试验的抑菌率均≥50%, 即可认定该样片具有抗菌作用。
2.1.7.7.6 注意事项
(1) 对织物进行染菌操作时，应确保其均匀分布，且三角瓶中不沾染或存留多余菌液。
(2) 三角瓶内的织物染菌后，应将瓶口封好，以防液体蒸发，造成细菌死亡。