高效液相色谱法测定蚕丝蛋白水解液中多肽分子量的分布
摘要： 利用高效液相色谱法对硫酸水解的蚕丝蛋白水溶液中多肽组份分子量的分布进行分析。应用Agilent 1100 型高效液相色谱( 美国Agilent 公司) 系统，使用C 18反相色谱柱，对流动相、洗脱方式、洗脱时间、色谱条件进行探索，使用甲醇、KH 2PO 4为流动相、0.6ml/ min 流速、10min 洗脱时间，得到很好的分离效果。该方法简便快速且灵敏度高，结果的准确性好，为丝素肽的研究提供了更有效的方法。
关键词：蚕丝蛋白 肽 分子量分布 高效液相色谱
中图分类号：Q51 文献标识码：A
Key words：silk protein peptide determination of molecular HPLC
丝素蛋白具有良好的生物相容性，无毒，无刺激性，极小的炎症反应性。同时，丝素蛋白具有一定的可生物降解性，其降解产物本身不仅对组织无毒副作用，还对如皮肤、牙周组织等有营养与修复的作用。丝素肽是丝素蛋白的水解产物，极易被人体吸收，消化率较丝素蛋白大大提高，且具有降低血液胆固醇含量、促进酒精代谢、降低血压、促进胰岛素分泌及预防老年性痴呆症等生理功能。因此，丝素肽不仅具有食用价值，而且具有药用价值，作为功能食品因子开发具有广阔的应用前景。本文旨在为进一步扩大丝素肽在食品、化妆品、医药等领域的应用提供理论依据。
用反相色谱法分离多肽和蛋白质的原理是基于蛋白质的疏水性，在不同介质条件下，使不同的蛋白质得以分离，具有快速、高效的特点，在分离和制备多肽及蛋白质上有独特的优越性，尤其在生物工程产品质控方面广泛应用。近些年来具有重要生物活性的新肽不断被发现，原有的肽类也不断被发现具有新的生物功能，这些肽类在各种生理活动中都起着重要作用。高效液相色谱(HPLC) 已广泛用来分离分析和制备多肽蛋白等生物样品，尤其是反相高效液相色谱已成为许多研究肽类的实验室的主要分离分析手段。
1 实验材料
1.1 仪器与药品 Agilent 1100 型高效液相色谱( 美国Agilent 公司) 系统，手动进样系统；
真空透膜脱气；高稳定性二元泵；二极管阵列及示差检测器; 柱温箱：低于环境10℃~80℃，±0.15℃。甲醇为色谱纯，KH 2PO 4为分析纯。
1.2 色谱条件 色谱柱为C 18；流动相为甲醇：KH 2PO 4=50:50，柱温为30℃；检测波长为
254nm ；流速为0.6ml/min。
1.3 溶液的配制 0.005mol/l的KH 2PO 4的配制，准确称取0.68045g KH2PO 4，然后用适量的双
蒸水溶解，用1000ml 容量瓶定容至刻度线；160ug/ml的标准谷胱甘肽溶液的配制：准确称取0.0160g 的还原性谷胱甘肽，用适量双蒸水溶解，然后用100ml 容量瓶定容至刻度线，既得浓度为160ug/ml的标准谷胱甘肽溶液；160ug/ml的酪蛋白磷酸肽溶液的配制，准确称取0.0160g 的酪蛋白磷酸肽，用适量双蒸水溶解，然后用100ml 容量瓶定容至刻度线，既得浓度为160ug/ml的标准酪蛋白磷酸肽溶液；
2、方法与结果
2.1 样品溶液的制备 样品：将用硫酸水解，以及沉淀、脱色等步骤处理过的蚕丝蛋白溶液用双蒸水稀释，配制成样品溶液。
2、液相色谱条件的选择
2.1 流动相及波长的选择
多肽或蛋白质的液相色谱通常使用的流动相为含酸性或中性介质的甲醇-水或乙腈-水，或用甲醇与缓冲盐溶液做流动相。在测定蛋白质或多肽时如果出峰效果不理想的话，可以再流动相中加入少量的三氟乙酸可改善出峰效果。分别以甲醇-水，乙腈-水，甲醇- KH2PO 4为流动相，并设定各个流动相的不同洗脱条件进行全波长扫描，设定柱温为30℃，进样量10ul 。根据其出图的效果，得到流动相为甲醇：KH 2PO 4=50:50，波长为254nm 时出图的效果最好，
在相同的流动相条件下，波长为230nm 时出的色谱图也比较好，但是其谱图的稳定性没有254nm 的好。故本实验选择的是流动相为甲醇∶KH2PO4=50:50，波长为254nm 的色谱条件。以甲醇-KH 2PO 4为流动相时在不同的洗脱条件下得到的色谱图如下所示的图1，2，3，
4
图1 甲醇∶KH 2PO 4=30∶70 图2 甲醇∶KH 2PO 4=40∶
60
图3 甲醇∶KH 2PO 4=50:50 图4 甲醇∶KH 2PO 4=50:50
2.2 柱温的选择
在波长为254nm ，流动相为甲醇∶KH 2PO 4=50:50条件下，分别设定柱温为25℃、30℃、35℃、40℃测得液相色谱的图谱变化不大，即柱温对本实验的影响较小，可不作为重要因素考虑，但是相比之下，30℃条件下出的谱图要比其他温度下的要好一点，故而本实验选用30℃的柱温。
2.3 流速的选择
在波长为254nm ，流动相为甲醇∶KH 2PO 4=50:50，柱温为30℃条件下，分别设定流速为
2.2 谷胱甘肽标准曲线的制作 将配制好的160ug/ml的标准还原性谷胱甘肽溶液，用双蒸水 稀释成5个不同浓度梯度的标准液，进样量为10ul ，分别测定峰面积（A ），然后对照进样浓度（C ）做回归曲线，A 为因变量，C 为自变量，得到的回归方程为：
2.3 标准品色谱图的制作 还原性谷胱甘肽，分子量为307Da ，氧化性谷胱甘肽分子量为612 Da ，杆菌肽分子量为1421.6 Da，胰岛素，分子量为5808 Da
高效液相色谱法测定蚕丝蛋白水解液中多肽分子量的分布
摘要： 利用高效液相色谱法对硫酸水解的蚕丝蛋白水溶液中多肽组份分子量的分布进行分析。应用Agilent 1100 型高效液相色谱( 美国Agilent 公司) 系统，使用C 18反相色谱柱，对流动相、洗脱方式、洗脱时间、色谱条件进行探索，使用甲醇、KH 2PO 4为流动相、0.6ml/ min 流速、10min 洗脱时间，得到很好的分离效果。该方法简便快速且灵敏度高，结果的准确性好，为丝素肽的研究提供了更有效的方法。
关键词：蚕丝蛋白 肽 分子量分布 高效液相色谱
中图分类号：Q51 文献标识码：A
Key words：silk protein peptide determination of molecular HPLC
丝素蛋白具有良好的生物相容性，无毒，无刺激性，极小的炎症反应性。同时，丝素蛋白具有一定的可生物降解性，其降解产物本身不仅对组织无毒副作用，还对如皮肤、牙周组织等有营养与修复的作用。丝素肽是丝素蛋白的水解产物，极易被人体吸收，消化率较丝素蛋白大大提高，且具有降低血液胆固醇含量、促进酒精代谢、降低血压、促进胰岛素分泌及预防老年性痴呆症等生理功能。因此，丝素肽不仅具有食用价值，而且具有药用价值，作为功能食品因子开发具有广阔的应用前景。本文旨在为进一步扩大丝素肽在食品、化妆品、医药等领域的应用提供理论依据。
用反相色谱法分离多肽和蛋白质的原理是基于蛋白质的疏水性，在不同介质条件下，使不同的蛋白质得以分离，具有快速、高效的特点，在分离和制备多肽及蛋白质上有独特的优越性，尤其在生物工程产品质控方面广泛应用。近些年来具有重要生物活性的新肽不断被发现，原有的肽类也不断被发现具有新的生物功能，这些肽类在各种生理活动中都起着重要作用。高效液相色谱(HPLC) 已广泛用来分离分析和制备多肽蛋白等生物样品，尤其是反相高效液相色谱已成为许多研究肽类的实验室的主要分离分析手段。
1 实验材料
1.1 仪器与药品 Agilent 1100 型高效液相色谱( 美国Agilent 公司) 系统，手动进样系统；
真空透膜脱气；高稳定性二元泵；二极管阵列及示差检测器; 柱温箱：低于环境10℃~80℃，±0.15℃。甲醇为色谱纯，KH 2PO 4为分析纯。
1.2 色谱条件 色谱柱为C 18；流动相为甲醇：KH 2PO 4=50:50，柱温为30℃；检测波长为
254nm ；流速为0.6ml/min。
1.3 溶液的配制 0.005mol/l的KH 2PO 4的配制，准确称取0.68045g KH2PO 4，然后用适量的双
蒸水溶解，用1000ml 容量瓶定容至刻度线；160ug/ml的标准谷胱甘肽溶液的配制：准确称取0.0160g 的还原性谷胱甘肽，用适量双蒸水溶解，然后用100ml 容量瓶定容至刻度线，既得浓度为160ug/ml的标准谷胱甘肽溶液；160ug/ml的酪蛋白磷酸肽溶液的配制，准确称取0.0160g 的酪蛋白磷酸肽，用适量双蒸水溶解，然后用100ml 容量瓶定容至刻度线，既得浓度为160ug/ml的标准酪蛋白磷酸肽溶液；
2、方法与结果
2.1 样品溶液的制备 样品：将用硫酸水解，以及沉淀、脱色等步骤处理过的蚕丝蛋白溶液用双蒸水稀释，配制成样品溶液。
2、液相色谱条件的选择
2.1 流动相及波长的选择
多肽或蛋白质的液相色谱通常使用的流动相为含酸性或中性介质的甲醇-水或乙腈-水，或用甲醇与缓冲盐溶液做流动相。在测定蛋白质或多肽时如果出峰效果不理想的话，可以再流动相中加入少量的三氟乙酸可改善出峰效果。分别以甲醇-水，乙腈-水，甲醇- KH2PO 4为流动相，并设定各个流动相的不同洗脱条件进行全波长扫描，设定柱温为30℃，进样量10ul 。根据其出图的效果，得到流动相为甲醇：KH 2PO 4=50:50，波长为254nm 时出图的效果最好，
在相同的流动相条件下，波长为230nm 时出的色谱图也比较好，但是其谱图的稳定性没有254nm 的好。故本实验选择的是流动相为甲醇∶KH2PO4=50:50，波长为254nm 的色谱条件。以甲醇-KH 2PO 4为流动相时在不同的洗脱条件下得到的色谱图如下所示的图1，2，3，
4
图1 甲醇∶KH 2PO 4=30∶70 图2 甲醇∶KH 2PO 4=40∶
60
图3 甲醇∶KH 2PO 4=50:50 图4 甲醇∶KH 2PO 4=50:50
2.2 柱温的选择
在波长为254nm ，流动相为甲醇∶KH 2PO 4=50:50条件下，分别设定柱温为25℃、30℃、35℃、40℃测得液相色谱的图谱变化不大，即柱温对本实验的影响较小，可不作为重要因素考虑，但是相比之下，30℃条件下出的谱图要比其他温度下的要好一点，故而本实验选用30℃的柱温。
2.3 流速的选择
在波长为254nm ，流动相为甲醇∶KH 2PO 4=50:50，柱温为30℃条件下，分别设定流速为
2.2 谷胱甘肽标准曲线的制作 将配制好的160ug/ml的标准还原性谷胱甘肽溶液，用双蒸水 稀释成5个不同浓度梯度的标准液，进样量为10ul ，分别测定峰面积（A ），然后对照进样浓度（C ）做回归曲线，A 为因变量，C 为自变量，得到的回归方程为：
2.3 标准品色谱图的制作 还原性谷胱甘肽，分子量为307Da ，氧化性谷胱甘肽分子量为612 Da ，杆菌肽分子量为1421.6 Da，胰岛素，分子量为5808 Da