摘 要 从已测定凝集素含量的56个菜豆品种中筛选具有代表性的菜豆品种，分离纯化菜豆植物凝集素，MTS法分析其对人乳腺癌细胞（MCF7、231）及肝癌细胞（HEPG2）生长的影响。结果显示菜豆植物凝集素能抑制这三种肿瘤细胞的增殖，且抑制作用呈明显剂量-效应关系。说明菜豆植物凝集素具有一定的体外抗肿瘤活性，可进一步筛选高凝集素含量菜豆品种作为分离纯化凝集素的原料，为抗肿瘤药物的研究奠定实验基础。 关键词 菜豆植物凝集素 MTS分析 抗肿瘤 中图分类号：Q946 文献标识码：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2016.09.079 Analysis on Inhibition of Tumor Cell Proliferation Induced by Kidney Bean Lectin JIN Wenyan，WEI Siyu， LI Jianan Department of Biotechnology， School of Life Science， Jianghan University， Wuhan， Hubei 430056） Abstract The kidney bean lectin was purified by methods of homogenization， centrifugation， ultrafiltration and ammonium sulfate precipitation. Two human breast cancer cell line （MCF7， 231） and one liver cancer cell line （HEPG2） were cultured in vitro and treated with kidney bean lectin. MTS assay was used for detecting the inhibition of tumor cell proliferation.The results showed that there was a significant difference in the inhibition ratio of proliferation after treated by kidney bean lectin. The result also indicated that the inhibition was dose dependent. This study will provide a theoretical basis and technical methods for the genetic improvement of kidney bean quality and utilization. Key words kidney bean lectin； MTS assay； anti-tumor 凝集素是一种可从植物、无脊椎动物和高等动物中提取的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故称其为凝集素。有报道指出，某些凝集素在动物体内对各类肿瘤均有抑制作用；另有报道，从刀豆种子中提取的一种新型凝集素具有潜在的抗肝癌作用。多种研究表明存在于植物中的凝集素具有抑制肿瘤细胞增殖活性。 在前期研究中，我们已经对56个品种的菜豆植物凝集素进行活性浓度测定，并成功分离纯化到菜豆植物凝集素，本研究拟通过MTS法检测已分离的菜豆植物凝集素对三种肿瘤细胞生长的影响，判断其是否具有抑制肿瘤细胞生长的作用，为菜豆植物凝集素的应用奠定基础。 1 材料与方法 1.1 细胞株 人乳腺癌细胞（MCF7），人肝癌细胞（HEPG2），人乳腺癌细胞株（231）。 1.2 试剂 菜豆植物凝集素（1mg/ml），RPMI-1640培养基，胎牛血清，青、链霉素（1%），RPMI-1640完全培养液（RPMI-1640+10%胎牛血清+1%青、链霉素）。 1.3 方法 1.3.1 肿瘤细胞培养 三种贴壁细胞使用RPMI-1640完全培养液，于37.0��C、5%CO2培养箱中培养。细胞贴壁生长，取对数生长期细胞用于实验。 1.3.2 MTS法检测活细胞数 将用以上方法培养获得的细胞以2.0x104个/ml密度接种于96孔培养板中，每孔0.1ml，于37.0��C、5%CO2培养箱中培养24h后，加入浓度分别为1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml、0.00001mg/ml的菜豆凝集素0.1ml。每个浓度设3个重复，并设空白对照。继续培养24h后，加入MTS试剂，放回培养箱3～4h，在波长490nm处测得各孔吸光值，计算细胞生长抑制率=（空白对照组A490-实验组A490）/空白对照组A490*100%。 1.4 统计学分析 利用EXCEL软件，将吸光值与其相应的菜豆凝集素浓度制成统计图进行分析。 2 结果 形态观察结果显示，人乳腺癌细胞（MCF7），人肝癌细胞（HEPG2），人乳腺癌细胞株（231）呈现相同生长趋势：（1）正常培养时，传代培养后3～4h可贴壁，并呈现长椭圆形；8-9h后，细胞紧密贴壁，形状不一，呈拉扯状多边形贴合生长；24h后，细胞活跃生长，大量增殖。（2）加入了不同浓度的菜豆植物凝集素培养24h后，三种细胞生长状况缓慢且贴壁完全不明显，部分细胞变圆，甚至出现小细胞团。 MTS结果显示（图1）三种肿瘤细胞的生长均受菜豆植物凝集素抑制，且随着凝集素浓度的依次增加（0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1mg/ml），抑制率依次增加，幅度变大（图2、图3、图4），说明菜豆植物凝集素对这三种肿瘤细胞的抑制效应具有显著量效依赖关系。 3 讨论 植物凝集素是一类糖结合特异性非免疫性蛋白质的总称，其本身具有多个催化性的糖结合结构域，通过专一性识别并结合细胞表面结构上的各种糖结构，引起细胞内部一系列反应，从而抑制细胞增殖，甚至让细胞死亡。各类研究显示植物凝集素对不同细胞系都具有体外凝血活性、抗增殖活性，对机体具有抗肿瘤，免疫激活以及抗菌抗病毒等生物活性。本研究结果亦显示菜豆凝集素对三种肿瘤细胞的增殖有抑制作用。植物凝集素抑制细胞增殖的作用方式大致归于两大类：自噬与细胞凋亡途径。自噬，指的是细胞本身的溶酶体将细胞膜内的物质降解，在细胞内基本细胞器被降解之后会导致细胞死亡。植物凝集素结合至细胞膜表面糖蛋白或多糖上，进而进入细胞内并大量附着于重要细胞器上，使其通透性改变，激活了自噬，溶酶体降解掉重要细胞器后，导致细胞死亡。细胞凋亡途径中，caspase依赖途径是较为普遍的一种类型。这种途径中，最为关键的物质是caspase-3，因其底物为多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）和caspase以来的DNA酶抑制因子（ICAD）。而ICAD作为底物会被降解成含CAD的其他组分，CAD会导致DNA发生典型片段化，使细胞死亡。植物凝集素在进入细胞之后，会通过形成其他物质或改变膜电位等方式来激活caspase系列物质，最终激活caspase-3，导致细胞死亡。本研究中菜豆植物凝集素抑制肿瘤细胞增殖的作用机制还有待进一步研究。 *通讯作者：李佳楠 参考文献 [1] 刘东亮，吕慧，李婷婷，等.植物凝集素诱导肿瘤细胞凋亡和自噬的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志，2012.28（6）：669-671. [2] 薛晓鸥，张少娟，谢伟，等.大豆胰蛋白酶抑制剂对子宫内膜癌细胞增殖影响的实验研究[J].北京医学，2008.30（4）：252-253. [3] 康庄，冯倩，曹厚利，等.菠菜种子胰蛋白酶抑制剂对K-562细胞增殖的抑制及促凋亡作用研究[J].天然产物研究与开发，2009.21：684-686. [4] Huan-Yao Lei， Chih-Peng. Lectin of Concanavalin A as an anti-hepatoma therapeutic agent[J].Journal of Biomedical Science 2009.19（1）：10-16. [5] Hao Peng， Hui Lv， Ying Wang， Yan-hong Liu， et al. Clematis montana lectin， a novel mannose-binding lectin from traditional Chinese medicine with antiviral and apoptosis-inducing activities[J]. Peptides，2009.30（10）：1805�C1815. [6] LevineB， Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease [J].Cell，2008.132（1）：27-42. [7] Lei HY， Chang CP. Induction of autophagy by concanavalin A and its application in anti-tumor therapy [J].Autophagy，2007.3（4）：402-404. [8] Zhang ZT， Peng H， Li CY， et al. Polygonatum cyrtonema lectin induces murine fibrosarcoma L929 cell apoptosis via a caspasedependent pathway as compared to ophiopogon japonicus lectin[J].Phytomedicine，2010.18（1）：25-31.
摘 要 从已测定凝集素含量的56个菜豆品种中筛选具有代表性的菜豆品种，分离纯化菜豆植物凝集素，MTS法分析其对人乳腺癌细胞（MCF7、231）及肝癌细胞（HEPG2）生长的影响。结果显示菜豆植物凝集素能抑制这三种肿瘤细胞的增殖，且抑制作用呈明显剂量-效应关系。说明菜豆植物凝集素具有一定的体外抗肿瘤活性，可进一步筛选高凝集素含量菜豆品种作为分离纯化凝集素的原料，为抗肿瘤药物的研究奠定实验基础。 关键词 菜豆植物凝集素 MTS分析 抗肿瘤 中图分类号：Q946 文献标识码：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2016.09.079 Analysis on Inhibition of Tumor Cell Proliferation Induced by Kidney Bean Lectin JIN Wenyan，WEI Siyu， LI Jianan Department of Biotechnology， School of Life Science， Jianghan University， Wuhan， Hubei 430056） Abstract The kidney bean lectin was purified by methods of homogenization， centrifugation， ultrafiltration and ammonium sulfate precipitation. Two human breast cancer cell line （MCF7， 231） and one liver cancer cell line （HEPG2） were cultured in vitro and treated with kidney bean lectin. MTS assay was used for detecting the inhibition of tumor cell proliferation.The results showed that there was a significant difference in the inhibition ratio of proliferation after treated by kidney bean lectin. The result also indicated that the inhibition was dose dependent. This study will provide a theoretical basis and technical methods for the genetic improvement of kidney bean quality and utilization. Key words kidney bean lectin； MTS assay； anti-tumor 凝集素是一种可从植物、无脊椎动物和高等动物中提取的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故称其为凝集素。有报道指出，某些凝集素在动物体内对各类肿瘤均有抑制作用；另有报道，从刀豆种子中提取的一种新型凝集素具有潜在的抗肝癌作用。多种研究表明存在于植物中的凝集素具有抑制肿瘤细胞增殖活性。 在前期研究中，我们已经对56个品种的菜豆植物凝集素进行活性浓度测定，并成功分离纯化到菜豆植物凝集素，本研究拟通过MTS法检测已分离的菜豆植物凝集素对三种肿瘤细胞生长的影响，判断其是否具有抑制肿瘤细胞生长的作用，为菜豆植物凝集素的应用奠定基础。 1 材料与方法 1.1 细胞株 人乳腺癌细胞（MCF7），人肝癌细胞（HEPG2），人乳腺癌细胞株（231）。 1.2 试剂 菜豆植物凝集素（1mg/ml），RPMI-1640培养基，胎牛血清，青、链霉素（1%），RPMI-1640完全培养液（RPMI-1640+10%胎牛血清+1%青、链霉素）。 1.3 方法 1.3.1 肿瘤细胞培养 三种贴壁细胞使用RPMI-1640完全培养液，于37.0��C、5%CO2培养箱中培养。细胞贴壁生长，取对数生长期细胞用于实验。 1.3.2 MTS法检测活细胞数 将用以上方法培养获得的细胞以2.0x104个/ml密度接种于96孔培养板中，每孔0.1ml，于37.0��C、5%CO2培养箱中培养24h后，加入浓度分别为1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml、0.00001mg/ml的菜豆凝集素0.1ml。每个浓度设3个重复，并设空白对照。继续培养24h后，加入MTS试剂，放回培养箱3～4h，在波长490nm处测得各孔吸光值，计算细胞生长抑制率=（空白对照组A490-实验组A490）/空白对照组A490*100%。 1.4 统计学分析 利用EXCEL软件，将吸光值与其相应的菜豆凝集素浓度制成统计图进行分析。 2 结果 形态观察结果显示，人乳腺癌细胞（MCF7），人肝癌细胞（HEPG2），人乳腺癌细胞株（231）呈现相同生长趋势：（1）正常培养时，传代培养后3～4h可贴壁，并呈现长椭圆形；8-9h后，细胞紧密贴壁，形状不一，呈拉扯状多边形贴合生长；24h后，细胞活跃生长，大量增殖。（2）加入了不同浓度的菜豆植物凝集素培养24h后，三种细胞生长状况缓慢且贴壁完全不明显，部分细胞变圆，甚至出现小细胞团。 MTS结果显示（图1）三种肿瘤细胞的生长均受菜豆植物凝集素抑制，且随着凝集素浓度的依次增加（0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1mg/ml），抑制率依次增加，幅度变大（图2、图3、图4），说明菜豆植物凝集素对这三种肿瘤细胞的抑制效应具有显著量效依赖关系。 3 讨论 植物凝集素是一类糖结合特异性非免疫性蛋白质的总称，其本身具有多个催化性的糖结合结构域，通过专一性识别并结合细胞表面结构上的各种糖结构，引起细胞内部一系列反应，从而抑制细胞增殖，甚至让细胞死亡。各类研究显示植物凝集素对不同细胞系都具有体外凝血活性、抗增殖活性，对机体具有抗肿瘤，免疫激活以及抗菌抗病毒等生物活性。本研究结果亦显示菜豆凝集素对三种肿瘤细胞的增殖有抑制作用。植物凝集素抑制细胞增殖的作用方式大致归于两大类：自噬与细胞凋亡途径。自噬，指的是细胞本身的溶酶体将细胞膜内的物质降解，在细胞内基本细胞器被降解之后会导致细胞死亡。植物凝集素结合至细胞膜表面糖蛋白或多糖上，进而进入细胞内并大量附着于重要细胞器上，使其通透性改变，激活了自噬，溶酶体降解掉重要细胞器后，导致细胞死亡。细胞凋亡途径中，caspase依赖途径是较为普遍的一种类型。这种途径中，最为关键的物质是caspase-3，因其底物为多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）和caspase以来的DNA酶抑制因子（ICAD）。而ICAD作为底物会被降解成含CAD的其他组分，CAD会导致DNA发生典型片段化，使细胞死亡。植物凝集素在进入细胞之后，会通过形成其他物质或改变膜电位等方式来激活caspase系列物质，最终激活caspase-3，导致细胞死亡。本研究中菜豆植物凝集素抑制肿瘤细胞增殖的作用机制还有待进一步研究。 *通讯作者：李佳楠 参考文献 [1] 刘东亮，吕慧，李婷婷，等.植物凝集素诱导肿瘤细胞凋亡和自噬的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志，2012.28（6）：669-671. [2] 薛晓鸥，张少娟，谢伟，等.大豆胰蛋白酶抑制剂对子宫内膜癌细胞增殖影响的实验研究[J].北京医学，2008.30（4）：252-253. [3] 康庄，冯倩，曹厚利，等.菠菜种子胰蛋白酶抑制剂对K-562细胞增殖的抑制及促凋亡作用研究[J].天然产物研究与开发，2009.21：684-686. [4] Huan-Yao Lei， Chih-Peng. Lectin of Concanavalin A as an anti-hepatoma therapeutic agent[J].Journal of Biomedical Science 2009.19（1）：10-16. [5] Hao Peng， Hui Lv， Ying Wang， Yan-hong Liu， et al. Clematis montana lectin， a novel mannose-binding lectin from traditional Chinese medicine with antiviral and apoptosis-inducing activities[J]. Peptides，2009.30（10）：1805�C1815. [6] LevineB， Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease [J].Cell，2008.132（1）：27-42. [7] Lei HY， Chang CP. Induction of autophagy by concanavalin A and its application in anti-tumor therapy [J].Autophagy，2007.3（4）：402-404. [8] Zhang ZT， Peng H， Li CY， et al. Polygonatum cyrtonema lectin induces murine fibrosarcoma L929 cell apoptosis via a caspasedependent pathway as compared to ophiopogon japonicus lectin[J].Phytomedicine，2010.18（1）：25-31.