第29卷第1期2012年2月实验动物科学
LABORATORYANIMALSCIENCEVol．29No．1February2012
櫴櫴櫴櫴櫴毷研究·论著
櫴毷
櫴毷
基因之一，有研究显示，人类大约一半的肿瘤发生与p53基因异常有关，因此p53基因的相关功能成为当前肿瘤分子生物学研究的热点
［1，2］
导的细胞凋亡通路是人类肿瘤发生过程中最常改变的通路。该通路中p53蛋白发挥细胞周期调控和DNA修复功能，在肿瘤调控机制中发挥着重要的作用
［3，4］
p53基因缺失细胞中进行，虽然具有很好的效果，但是在模拟体内环境方面仍有不足，因此，我们于2007年从美国匹斯堡大学引进p53基因敲除小鼠杂合子，在首都医科大学实验动物部SPF级动物实经基因鉴定成功培育p53基因敲除验室饲养繁殖，
小鼠，为深入研究肿瘤疾病提供了动物模型。
1
1.1
10对p53基因敲除杂合子小鼠（p53+/－）。该小鼠遗传背景为BALB/c小鼠，近交系。1.2
小鼠的饲养和繁殖
按照SPF级动物饲养标准进行饲养，屏障环境
收稿日期：2011－07－28
*
櫴櫴櫴櫴櫴毷
摘要：目的义。
徐
p53基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定
乔录新
1
*
徐萌
1
柴梦音
1
乔欣
2
陈德喜
1
（1.首都医科大学附属北京佑安医院，北京100069）（2.首都医科大学实验动物科学部，北京100069）
为了繁育和鉴定p53基因敲除小鼠，将引进的杂合子小鼠进行饲养繁殖，杂合子用于继续保种。方法
对引进小鼠已成功饲养和繁殖，并得到
正确的饲养、繁殖及基因鉴定方法对于基因敲除小鼠的获得和保种具有重要的意
对其幼鼠剪尾提取基因组DNA，采用PCR方法进行基因型鉴定。结果纯合基因缺失型小鼠。结论
关键词：p53；基因敲除小鼠；PCR331中图分类号：Q95-文献标识码：A
0022-03文章编号：1006－6179（2012）01-
p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的湿度控制在40%～70%，内温度控制在20～25℃，
小鼠饲料、垫料和饮水均经过高温高压灭菌处理，实行自由采食和饮水，垫料一周更换两次。因引进的小鼠数量有限，采用了1只雄鼠和1只雌鼠同居的方式进行繁殖。母鼠孕期为19～21d，哺乳期为18～23d。在幼鼠15日龄左右时打耳号。1.31.3.1
小鼠的基因型鉴定
小鼠尾部基因组DNA的提取：将小鼠尾部
置入1.5mL
。p53蛋白介
。目前对于此方面的体外研究大多在各种
组织小段（长约0.5～1.0cm）
Eppendolf管中，参照北京百泰克生物技术有限公司生产的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书抽提DNA。1.3.21.3.2.1
PCR反应及琼脂糖凝胶电泳基因型鉴定引物设计：P1：CTTGGGTGGAGAGGCTATT
C；P2：AGGTGAGATGACAGGAGATC；P3：ATAGGTCG
材料和方法
实验动物
美国匹斯堡大学医学院CharlesLopez教授惠赠
GCGGTTCAT：ONEXON6；P4：CCCGAGTATCTGGAAGACAG：ONEXON7。1.3.2.2
PCR反应：PCR反应体系：下列反应物构成
30μL的反应体系。上游引物2μL（10μmol/mL），下10×PCRBuffer3μL，游引物2μl（10μmol/mL），
dNTP（20mmol/L）2.4μL，Taqpolymerase（2u/μL）0．2μL，DNA模板（DilutedTemplate）2μL，加H2O补足30μL。采用PCR仪进行循环扩增：预变性，
基金项目：国家自然科学基金面上项目（No．30870853）
萌（1983－），女，实验员。主要研究方向：感染性疾病。
作者简介：乔录新（1985－），女，在读硕士。主要研究方向：感染性疾病。E-mail：qiaolx2006@163．com通信作者：陈德喜。E-mail：Dexi09@yahoo．com
第1期乔录新等：p53基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定
·23·
95℃3min；预扩增，94℃1min，55℃1min，72℃94℃30s；退火，55℃1min，共3个循环；变性，72℃45s，30s；延伸，共27个循环，最后再延伸5min。1.3.2.3
电泳鉴定：分别取PCR扩增产物8μL、
10×LoadingBuffer1μL在含30μL/L溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中以120V电泳后于凝胶成像仪中观察拍照。小鼠尾部组织琼脂糖凝胶电泳基因型片断为：（野生型：550bp；纯合子：278bp；杂合子：550bp，278bp）按此基因条带可以鉴别出各个基因型小鼠。
图2
子代小鼠基因型鉴定部分结果
M：2000bp分子量标准；1～4为1～4号小鼠用P1、P2引物
2
2.1
结果
小鼠的繁殖情况
P53杂合子母鼠成功繁殖出子代幼鼠。每只母
1'-4'为1～4号小鼠用引物P3、P4扩增结果．扩增结果，
3讨论
p53是一种多功能蛋白，有“基因卫士”或者“分
鼠妊娠期为19～21d，哺乳期为18～23d，每胎平均成活率＞95%。产4～10只幼鼠，2.2
小鼠的生长情况
幼鼠由母鼠母乳喂养，哺乳期21d左右，产后3周离乳。子代纯合子老鼠的寿命较短，很快长出肿很少能够继续繁殖，大多死于肿瘤或者瘤（见图1），贫血
。
DNA修复和子警察”之称，主要参与细胞周期停滞、细胞凋亡等，其在维持机体基因稳定的各个方面起到重要作用。深入研究p53蛋白在机体内部的作用机制，有助于明确各种肿瘤的发生机制，也有助于肿瘤的治疗。目前国外已有采用p53基因敲除小鼠研
［5～6］
，曾有动物模究p53蛋白在机体中的作用机制
型表明p53途径在肿瘤的化疗和放疗反应方面是一个重要的调节因子
［7］
。但是国内目前大都采用p53
基因缺失的细胞系，从细胞水平分析p53蛋白的功能，由于机体内环境相当复杂仅从细胞水平研究还是有缺陷的。
p53敲除小鼠杂合子引进后，饲养和繁殖一直严格按照SPF级动物饲养标准进行。杂合子小鼠即野生型（p53+/+），杂合子子代有三种表型，
图1
纯合子基因缺失小鼠于右下肢巨大肿瘤
（2cm×2cm，箭头所指）
［8］
（p53+/－），，纯合子（p53－/－）子代经基因鉴
定后继续采用杂合子雌雄配对繁殖保种，纯合子存活周期较短，不能进行正常的繁殖，多数在几个月大溃疡或贫血。小出现不同部位的肿瘤、
通过PCR法鉴定基因型已经非常成熟，且方法可靠应用广泛，我们拟采用PCR鉴定小鼠的基因型，为此设计了两对特异性引物，一对位于原有的功能基因上，一对位于替代基因上。通过两次分别扩增，可以增加鉴定的可靠性。
在饲养繁殖过程中，有时出现母鼠产子率低的这时应考虑替掉较老的母鼠或者互换雄性小情况，
鼠；还有个别母鼠有食子现象，这个可能与受到过惊吓有关。具体原因尚未明确，有待于进一步研究。
2.3小鼠基因型鉴定结果
随机选择出生大约15d的4只小鼠剪取尾部
组织并编号1～4，将1～4号小鼠尾巴提取DNA，分P2（特异性扩增替代p53功能基因）和别用引物P1、
P4（特异性扩增p53功能基因）进行PCR引物P3、
扩增，结果显示1号小鼠只能扩增出p53功能基因2～3号小鼠既含替代基因又片段故为野生型小鼠，
4号只能扩增出替代基因含原有基因为杂合小鼠，
片段故为纯合子p53基因敲除小鼠（图2）
。
·24·
实验动物科学
forp53-deficienthematopoieticprogenitors［J］．
29卷
PLoSBiol，
参考文献
［1］BykovVJ，IssaevaN，ShilovA，etal．Restorationofthetumor
suppressorfunctiontomutantp53byalowmolecularweightcompound［J］．NatMed，2002，8（3）：282～288．
［2］HollsteinM，SidranskyD，VogelsteinB，etal．p53mutationsin
humancancers［J］．Science，1991，253（5015）：49～53．
［3］TokinoT，NakamuraY．Theroleofp532targetgenesinhuman
cancer［J］．Oncology/Hematology，2000，33（1）：1～6．
［4］VogelsteinB，KinzlerKW．P53functionanddysfunction［J］．
Cell，1992，70（8）：523～526．
［5］MarusykA，PorterCC，ZaberezhnyyV，etal．Irradiationselects
2010，8（3）：e1000324．
［6］TomasevicG，RaghupathiR，ScherbelU，etal．Deletionofthe
p53tumorsuppressorgeneimprovesneuromotorfunctionbutdoesnotattenuateregionalneuronalcelllossfollowingexperimentalbraintraumainmice［J］．JNeurosciRes，2010，88（15）：3414～3423．
［7］KempCJ，SunS，GurleyKE．p53inductionandapoptosisin
responsetoradio-andchemotherapyinvivoistumor-type-dependent［J］．CancerRes，2001，61（1）：327～332．
［8］施新猷．现代医学实验动物学［M］．北京：人民军医出版社，
2000：171．
BreedingReproducingandIdentifyingforp53GeneKnockoutMice
QIAOLu-xin1，XUMeng1，CHAIMeng-yin1，QIAOXin2，CHENDe-xi1
（1.DepartmentofInfectiousDiseasesofCapitalMedicalUniversityAffiliatedBeijingYouanHospital，Beijing100069，China）
（2.DepartmentofLaboratoryAnimalScienceofCapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China）
Abstract：ObjectiveTobreedandidentifyp53geneknockoutmice，HeterozygotemicewerebredandGenomeDNAextractedfromthemice’stailsweresubjectedtoPCRtestforgenotypeHeterozygouswereusedtoacquirebabymiceforProtectionspecies．Conclusion
The
reproduced．Methodsidentification．Results
breedingandreproducingweresuccessfulandHomozygousgenotypemicewereacquired．Appropriatemethodsoffeeding，breedingandidentifyingareimportantforobtaininggeneknockoutmiceandprotectingspecies．Keywords：p53；geneknockoutmice；PCR
檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶櫴櫴櫴櫴毷
动态·信息櫴毷
櫴毷
可显著提高其对胰岛素的敏感性。这项研究为糖尿病治疗和药物研发提供了新途径。
美国加州大学圣迭戈分校的研究人员在美国《细胞》杂志网站上报告说，他们培育了体内脂肪细胞缺少核受体辅助抑制因子的小鼠，然后用促使小鼠肥胖并易患上糖尿病的食物喂养。
研究人员发现，这类小鼠对血糖升高的耐受性有显著提高，其肝脏、肌肉和脂肪对胰岛素的敏感性得到改善，体内的系统性炎症也有所减少。
胰岛素抵抗与慢性系统性炎症是Ⅱ型糖尿病的重要特征。胰岛素抵抗是指机体对胰岛素的敏感性降低，其利用胰岛素促进葡萄糖代谢的能力下降。
研究人员表示，核受体辅助抑制因子似乎能促进一种调节脂肪酸存储和血糖代谢的常见蛋白质PPAR-γPPAR－γ蛋白质就能保持活性，磷酸化，进而使这种蛋白质失去活性。去除小鼠的核受体辅助抑制因子后，因这意味着核受体辅助抑制因子可能是较好的Ⅱ型糖尿病药物靶点。而可以继续改善血糖代谢。研究人员说，
（张树庸供稿）
櫴櫴櫴櫴毷
美发现提高小鼠胰岛素敏感性新法
新华社华盛顿2011年11月14日电，美国研究人员日前报告说，去除实验鼠体内的一种关键调控蛋白，
第29卷第1期2012年2月实验动物科学
LABORATORYANIMALSCIENCEVol．29No．1February2012
櫴櫴櫴櫴櫴毷研究·论著
櫴毷
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基因之一，有研究显示，人类大约一半的肿瘤发生与p53基因异常有关，因此p53基因的相关功能成为当前肿瘤分子生物学研究的热点
［1，2］
导的细胞凋亡通路是人类肿瘤发生过程中最常改变的通路。该通路中p53蛋白发挥细胞周期调控和DNA修复功能，在肿瘤调控机制中发挥着重要的作用
［3，4］
p53基因缺失细胞中进行，虽然具有很好的效果，但是在模拟体内环境方面仍有不足，因此，我们于2007年从美国匹斯堡大学引进p53基因敲除小鼠杂合子，在首都医科大学实验动物部SPF级动物实经基因鉴定成功培育p53基因敲除验室饲养繁殖，
小鼠，为深入研究肿瘤疾病提供了动物模型。
1
1.1
10对p53基因敲除杂合子小鼠（p53+/－）。该小鼠遗传背景为BALB/c小鼠，近交系。1.2
小鼠的饲养和繁殖
按照SPF级动物饲养标准进行饲养，屏障环境
收稿日期：2011－07－28
*
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摘要：目的义。
徐
p53基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定
乔录新
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徐萌
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柴梦音
1
乔欣
2
陈德喜
1
（1.首都医科大学附属北京佑安医院，北京100069）（2.首都医科大学实验动物科学部，北京100069）
为了繁育和鉴定p53基因敲除小鼠，将引进的杂合子小鼠进行饲养繁殖，杂合子用于继续保种。方法
对引进小鼠已成功饲养和繁殖，并得到
正确的饲养、繁殖及基因鉴定方法对于基因敲除小鼠的获得和保种具有重要的意
对其幼鼠剪尾提取基因组DNA，采用PCR方法进行基因型鉴定。结果纯合基因缺失型小鼠。结论
关键词：p53；基因敲除小鼠；PCR331中图分类号：Q95-文献标识码：A
0022-03文章编号：1006－6179（2012）01-
p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的湿度控制在40%～70%，内温度控制在20～25℃，
小鼠饲料、垫料和饮水均经过高温高压灭菌处理，实行自由采食和饮水，垫料一周更换两次。因引进的小鼠数量有限，采用了1只雄鼠和1只雌鼠同居的方式进行繁殖。母鼠孕期为19～21d，哺乳期为18～23d。在幼鼠15日龄左右时打耳号。1.31.3.1
小鼠的基因型鉴定
小鼠尾部基因组DNA的提取：将小鼠尾部
置入1.5mL
。p53蛋白介
。目前对于此方面的体外研究大多在各种
组织小段（长约0.5～1.0cm）
Eppendolf管中，参照北京百泰克生物技术有限公司生产的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书抽提DNA。1.3.21.3.2.1
PCR反应及琼脂糖凝胶电泳基因型鉴定引物设计：P1：CTTGGGTGGAGAGGCTATT
C；P2：AGGTGAGATGACAGGAGATC；P3：ATAGGTCG
材料和方法
实验动物
美国匹斯堡大学医学院CharlesLopez教授惠赠
GCGGTTCAT：ONEXON6；P4：CCCGAGTATCTGGAAGACAG：ONEXON7。1.3.2.2
PCR反应：PCR反应体系：下列反应物构成
30μL的反应体系。上游引物2μL（10μmol/mL），下10×PCRBuffer3μL，游引物2μl（10μmol/mL），
dNTP（20mmol/L）2.4μL，Taqpolymerase（2u/μL）0．2μL，DNA模板（DilutedTemplate）2μL，加H2O补足30μL。采用PCR仪进行循环扩增：预变性，
基金项目：国家自然科学基金面上项目（No．30870853）
萌（1983－），女，实验员。主要研究方向：感染性疾病。
作者简介：乔录新（1985－），女，在读硕士。主要研究方向：感染性疾病。E-mail：qiaolx2006@163．com通信作者：陈德喜。E-mail：Dexi09@yahoo．com
第1期乔录新等：p53基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定
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95℃3min；预扩增，94℃1min，55℃1min，72℃94℃30s；退火，55℃1min，共3个循环；变性，72℃45s，30s；延伸，共27个循环，最后再延伸5min。1.3.2.3
电泳鉴定：分别取PCR扩增产物8μL、
10×LoadingBuffer1μL在含30μL/L溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中以120V电泳后于凝胶成像仪中观察拍照。小鼠尾部组织琼脂糖凝胶电泳基因型片断为：（野生型：550bp；纯合子：278bp；杂合子：550bp，278bp）按此基因条带可以鉴别出各个基因型小鼠。
图2
子代小鼠基因型鉴定部分结果
M：2000bp分子量标准；1～4为1～4号小鼠用P1、P2引物
2
2.1
结果
小鼠的繁殖情况
P53杂合子母鼠成功繁殖出子代幼鼠。每只母
1'-4'为1～4号小鼠用引物P3、P4扩增结果．扩增结果，
3讨论
p53是一种多功能蛋白，有“基因卫士”或者“分
鼠妊娠期为19～21d，哺乳期为18～23d，每胎平均成活率＞95%。产4～10只幼鼠，2.2
小鼠的生长情况
幼鼠由母鼠母乳喂养，哺乳期21d左右，产后3周离乳。子代纯合子老鼠的寿命较短，很快长出肿很少能够继续繁殖，大多死于肿瘤或者瘤（见图1），贫血
。
DNA修复和子警察”之称，主要参与细胞周期停滞、细胞凋亡等，其在维持机体基因稳定的各个方面起到重要作用。深入研究p53蛋白在机体内部的作用机制，有助于明确各种肿瘤的发生机制，也有助于肿瘤的治疗。目前国外已有采用p53基因敲除小鼠研
［5～6］
，曾有动物模究p53蛋白在机体中的作用机制
型表明p53途径在肿瘤的化疗和放疗反应方面是一个重要的调节因子
［7］
。但是国内目前大都采用p53
基因缺失的细胞系，从细胞水平分析p53蛋白的功能，由于机体内环境相当复杂仅从细胞水平研究还是有缺陷的。
p53敲除小鼠杂合子引进后，饲养和繁殖一直严格按照SPF级动物饲养标准进行。杂合子小鼠即野生型（p53+/+），杂合子子代有三种表型，
图1
纯合子基因缺失小鼠于右下肢巨大肿瘤
（2cm×2cm，箭头所指）
［8］
（p53+/－），，纯合子（p53－/－）子代经基因鉴
定后继续采用杂合子雌雄配对繁殖保种，纯合子存活周期较短，不能进行正常的繁殖，多数在几个月大溃疡或贫血。小出现不同部位的肿瘤、
通过PCR法鉴定基因型已经非常成熟，且方法可靠应用广泛，我们拟采用PCR鉴定小鼠的基因型，为此设计了两对特异性引物，一对位于原有的功能基因上，一对位于替代基因上。通过两次分别扩增，可以增加鉴定的可靠性。
在饲养繁殖过程中，有时出现母鼠产子率低的这时应考虑替掉较老的母鼠或者互换雄性小情况，
鼠；还有个别母鼠有食子现象，这个可能与受到过惊吓有关。具体原因尚未明确，有待于进一步研究。
2.3小鼠基因型鉴定结果
随机选择出生大约15d的4只小鼠剪取尾部
组织并编号1～4，将1～4号小鼠尾巴提取DNA，分P2（特异性扩增替代p53功能基因）和别用引物P1、
P4（特异性扩增p53功能基因）进行PCR引物P3、
扩增，结果显示1号小鼠只能扩增出p53功能基因2～3号小鼠既含替代基因又片段故为野生型小鼠，
4号只能扩增出替代基因含原有基因为杂合小鼠，
片段故为纯合子p53基因敲除小鼠（图2）
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实验动物科学
forp53-deficienthematopoieticprogenitors［J］．
29卷
PLoSBiol，
参考文献
［1］BykovVJ，IssaevaN，ShilovA，etal．Restorationofthetumor
suppressorfunctiontomutantp53byalowmolecularweightcompound［J］．NatMed，2002，8（3）：282～288．
［2］HollsteinM，SidranskyD，VogelsteinB，etal．p53mutationsin
humancancers［J］．Science，1991，253（5015）：49～53．
［3］TokinoT，NakamuraY．Theroleofp532targetgenesinhuman
cancer［J］．Oncology/Hematology，2000，33（1）：1～6．
［4］VogelsteinB，KinzlerKW．P53functionanddysfunction［J］．
Cell，1992，70（8）：523～526．
［5］MarusykA，PorterCC，ZaberezhnyyV，etal．Irradiationselects
2010，8（3）：e1000324．
［6］TomasevicG，RaghupathiR，ScherbelU，etal．Deletionofthe
p53tumorsuppressorgeneimprovesneuromotorfunctionbutdoesnotattenuateregionalneuronalcelllossfollowingexperimentalbraintraumainmice［J］．JNeurosciRes，2010，88（15）：3414～3423．
［7］KempCJ，SunS，GurleyKE．p53inductionandapoptosisin
responsetoradio-andchemotherapyinvivoistumor-type-dependent［J］．CancerRes，2001，61（1）：327～332．
［8］施新猷．现代医学实验动物学［M］．北京：人民军医出版社，
2000：171．
BreedingReproducingandIdentifyingforp53GeneKnockoutMice
QIAOLu-xin1，XUMeng1，CHAIMeng-yin1，QIAOXin2，CHENDe-xi1
（1.DepartmentofInfectiousDiseasesofCapitalMedicalUniversityAffiliatedBeijingYouanHospital，Beijing100069，China）
（2.DepartmentofLaboratoryAnimalScienceofCapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China）
Abstract：ObjectiveTobreedandidentifyp53geneknockoutmice，HeterozygotemicewerebredandGenomeDNAextractedfromthemice’stailsweresubjectedtoPCRtestforgenotypeHeterozygouswereusedtoacquirebabymiceforProtectionspecies．Conclusion
The
reproduced．Methodsidentification．Results
breedingandreproducingweresuccessfulandHomozygousgenotypemicewereacquired．Appropriatemethodsoffeeding，breedingandidentifyingareimportantforobtaininggeneknockoutmiceandprotectingspecies．Keywords：p53；geneknockoutmice；PCR
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可显著提高其对胰岛素的敏感性。这项研究为糖尿病治疗和药物研发提供了新途径。
美国加州大学圣迭戈分校的研究人员在美国《细胞》杂志网站上报告说，他们培育了体内脂肪细胞缺少核受体辅助抑制因子的小鼠，然后用促使小鼠肥胖并易患上糖尿病的食物喂养。
研究人员发现，这类小鼠对血糖升高的耐受性有显著提高，其肝脏、肌肉和脂肪对胰岛素的敏感性得到改善，体内的系统性炎症也有所减少。
胰岛素抵抗与慢性系统性炎症是Ⅱ型糖尿病的重要特征。胰岛素抵抗是指机体对胰岛素的敏感性降低，其利用胰岛素促进葡萄糖代谢的能力下降。
研究人员表示，核受体辅助抑制因子似乎能促进一种调节脂肪酸存储和血糖代谢的常见蛋白质PPAR-γPPAR－γ蛋白质就能保持活性，磷酸化，进而使这种蛋白质失去活性。去除小鼠的核受体辅助抑制因子后，因这意味着核受体辅助抑制因子可能是较好的Ⅱ型糖尿病药物靶点。而可以继续改善血糖代谢。研究人员说，
（张树庸供稿）
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美发现提高小鼠胰岛素敏感性新法
新华社华盛顿2011年11月14日电，美国研究人员日前报告说，去除实验鼠体内的一种关键调控蛋白，