ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２００７
文章编号：１００９－０００２（２００７）０２－０３１３－０３
生物技术通讯
３１３
综述
乳腺癌患者循环肿瘤细胞检测的研究进展
曹明刚综述；窦骏审校
东南大学基础医学院病原生物学与免疫学系，江苏南京２１０００９［摘要］
血行播散是乳腺癌转移的重要途径，检测腋窝淋巴结已经不能完全准确判断乳腺癌患者是否存在转移。肿瘤细胞
进入外周血是肿瘤远处转移的前提，对乳腺癌患者循环肿瘤细胞的检测将有助于判断预后，指导治疗，监测治疗效果。简要综述了乳腺癌循环肿瘤细胞及其检测方法的研究进展。［关键词］
乳腺癌；微转移；循环肿瘤细胞
［中图分类号］
Ｒ７３－３７+Ｒ７３７．９［文献标识码］Ａ
ＡｄｖａｎｃｅｉｎｔｈｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＴｕｍｏｕｒＣｅｌｌｓｉｎＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ
ＣＡＯＭｉｎｇ－ｇａｎｇ，ＤＯＵＪｕｎ
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［Ａｂｓｔｒａｃｔ］
Ｈｅｍａｔｏｇｅｎｏｕｓｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｕｔｅｆｏｒｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｘｉｌｌａｒｙｌｙｍｐｈＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ
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［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］
ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ+ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ+ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌ
后的外周血癌胚抗原（ＣＥＡ）ｍＲＮＡ，发现３例术前阴性的患者术后转为阳性。Ｈｕ［５］等发现细针抽吸（ｆｉｎｅｎｅｅｄｌｅａｓｐｉｒａｔｉｏｎ，ＦＮＡ）也可以导致肿瘤细胞播散入外周血。这些自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞被称为ＣＴＣ。
肿瘤细胞进入外周血中的微转移是肿瘤远处转移的前提［６］，大量实验证明ＣＴＣ的出现与乳腺癌患者的临床分期、淋巴结状况以及预后均密切相关。Ｓｔａｔｈｏｐｏｕｌｏｕ［７］等检测了乳腺癌患者外周血的细胞角蛋白（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ，ＣＫ）１９的ｍＲＮＡ，发现在Ⅰ～Ⅱ期患者术前阳性率为３１．２％，而Ⅳ期患者则达到４０．４％，结果表明
乳腺癌已被认为是一种全身性疾病，即早期可发生肿瘤细胞的全身扩散，大约１５％的乳腺癌患者即使术后腋窝淋巴结活检阴性仍有可能出现转移，提示复发与转移是由于已存在的但未被常规临床诊断手段检测到的乳腺癌微转移造成的［１］。远处转移是导致乳腺癌患者死亡的主要因素，提高乳腺癌微转移的检出率，对判断患者预后和合理选择治疗方案、提高患者生存率均有重要意义。因此，对乳腺癌患者循环肿瘤细胞检测的研究已受到特别关注。在此，我们就相关研究进展加以概述。
１循环肿瘤细胞
血行播散是乳腺癌转移的重要途径，肿瘤细胞可以通过血
ＣＴＣ的存在与临床分期相关。Ｔａｕｅｒｔ［８］等检测了１２５份乳腺癌患
者外周血中的ＣＫ阳性细胞，淋巴结Ｎ０期患者阳性率为２５％，
Ｎ１期患者为５４％，ＣＴＣ的出现与淋巴结转移数目有明显的相关
性。Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ［９］等检测了１７７例乳腺癌患者的ＣＴＣ数量，发现
液循环抵达任何组织和器官。临床发现部分乳腺癌患者肿块小、腋窝淋巴结阴性但预后很差，而某些晚期患者却能存活较长时间，这一临床现象用已有的经验和理论很难解释，而血行途径微转移的学说为此提供了理论依据［２］。１８９６年，Ａｓｈｗｏｒｔｈ在１例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并提出了循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌ，ＣＴＣ）的概念［２］。研究发现，随着肿瘤细胞的不断增殖，部分细胞失去相互附着的能力，从肿瘤母体脱离，降解、浸润周围组织，进入到血液或淋巴系统中。转移的肿瘤细胞游出血管外，通过细胞外基质迁移到合适的生长部位，被激活分裂、增殖形成转移灶［３］。某些诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环，Ｍｏｒｉ［４］等检测了１３例乳腺癌患者手术前
７．５ｍＬ外周血中ＣＴＣ≥５的患者治疗后缓解期约２．７个月，总生
存期约１０．１个月；而ＣＴＣ＜５的患者治疗后缓解期约７个月，总判断预后。生存期则大于１８个月，提示ＣＴＣ可以预测治疗效果、
由此可见，迅速准确地检测乳腺癌患者的ＣＴＣ，对其诊断、评估预后及治疗方案的选择具有重要价值，有助于降低肿瘤复发率，延长患者生存期。
２００６－０７－３０
江苏省卫生厅资助项目（１６２３０００５７７７）
曹明刚（１９８３－），男，硕士研究生
窦骏，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｎｊｄｏｕｊｕｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
［收稿日期］［基金项目］［作者简介］［通讯作者］
３１４２
ＣＴＣ的检测方法
２．１
免疫细胞化学
乳腺癌为上皮来源性肿瘤，具有上皮源性的细胞生物学特
征，而外周血细胞不表达上皮源性抗原。免疫细胞化学（ｉｍ－
ｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＣＣ）是利用单克隆抗体与特异的肿瘤标志物
结合，并通过酶和底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在。常用的肿瘤标志物有ＣＫ、人表皮生长因子受体（ＨＥＲ２）、上皮膜抗原（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅａｎｔｉｇｅｎ，ＥＭＡ）等。目前，ＩＣＣ仍然是评价ＣＴＣ检测方法的金标准［６］。
但由于直接运用ＩＣＣ检测ＣＴＣ较费时费力，并有可能遗漏一部分肿瘤细胞，故人们设法通过磁性细胞分选技术（ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ＭＡＣＳ）富集肿瘤细胞后再进行ＩＣＣ检测，这种方法上的改进显著地提高了检测效率和检出率。Ｈｕ［１０］等分别运用直接ＩＣＣ和ＭＡＣＳ／ＩＣＣ方法检测了３６例乳腺癌患者外周血的ＣＴＣ，结果显示ＩＣＣ组阳性率为
５．６％，而ＭＡＣＳ／ＩＣＣ组则达到３８．９％，ＭＡＣＳ／ＩＣＣ组Ⅰ到Ⅳ期患
者阳性率分别为０％（０／４）、３３．３％（８／２４）、６０％（３／５）和１００％（３／
３），ＭＡＣＳ／ＩＣＣ法较ＩＣＣ法的检出率有很大提高，差异有显著性
（Ｐ＜０．０５）。Ｗｕｌｆｉｎｇ［１１］等用ＭＡＣＳ－ＩＣＣ法检测４２例乳腺癌患者外周血ＨＥＲ２阳性ＣＴＣ，无明显转移的患者组阳性率为４８．６％，转移患者组为１００％，且ＣＴＣ的出现与患者缓解期及总生存期显著相关。由于肿瘤细胞抗原表达具有异质性，有学者建议ＭＡＣＳ／
ＩＣＣ联合检测多种抗体以提高灵敏度和特异性。ＩＣＣ法的优点是
简便、直观，但肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性、部分淋巴细胞的交叉反应等因素会影响检测的敏感性和特异性。
２．２流式细胞技术
流式细胞技术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）是运用标记荧光物质的
单克隆抗体与肿瘤细胞特异性的标志物结合，使肿瘤细胞染色，然后用流式细胞仪进行测量分析。目前在乳腺癌ＣＴＣ检测的研究中，ＣＫ作为乳腺癌细胞较特异的标志物，其应用最为广泛。
Ｃｒｕｚ［１２］等分别用抗ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ８／ＣＫ１８、ＣＫ２０和ｐａｎ－ＣＫ
等６种荧光标记的单克隆抗体染色乳腺癌患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ），然后进行ＦＣＭ检测，结果显示ＣＫ１８的敏感性最高。
ＦＣＭ可以进行多参数测量，实验表明多参数ＦＣＭ可以显著提高
检测的敏感性。Ｇｒｏｓｓ［１３］将乳腺癌细胞系ＢＴ－２０与正常人ＰＢＭＣ混合，运用４种不同荧光物质结合的一系列ＣＤ、ＣＫ的单克隆抗体染色后进行ＦＣＭ检测，结果显示该方法可以从１０７个ＰＢＭＣ中检出１个肿瘤细胞。运用ＭＡＣＳ技术富集肿瘤细胞后再进行
ＦＣＭ检测也可以提高敏感性，据报道［２］，ＭＡＣＳ－ＦＣＭ可以检测到
１ｍＬ外周血中的１个肿瘤细胞。ＦＣＭ检测快速、准确，可以定量检测乳腺癌病人外周血中肿瘤细胞的含量。但ＦＣＭ不能提供有关乳腺癌细胞形态方面的信息，所以有学者认为ＦＣＭ检测后尚需要运用乳腺癌特异抗体进行ＩＣＣ染色，从形态学上确定肿瘤细胞。Ｒａｃｉｌａ［２］等运用ＭＡＣＳ－ＦＣＭ－ＩＣＣ联合法检测乳腺癌患者
ＣＴＣ，发现ＣＴＣ的数量与临床分期及化疗相关，但这种检测方法
价格昂贵而且操作起来费时费力，难以作为常规检测方法应用于临床。
２．３聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）检测外周
血中肿瘤细胞的原理是基于游离ＤＮＡ的存在。上世纪５０年代人们就发现外周血中存在游离ＤＮＡ，它们可能是由于ＣＴＣ的裂
生物技术通讯
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解、肿瘤细胞的凋亡、坏死或自发性释放等原因进入外周血循环的。进一步研究发现，恶性肿瘤患者游离ＤＮＡ水平明显升高，且肿瘤患者血浆ＤＮＡ的基因型改变与其原发肿瘤细胞一致，在血清中可以检测到原发肿瘤细胞中所有基因谱的改变。ＰＣＲ检测就是特异性扩增出外周血循环中因癌基因、抑癌基因突变或染色体异常而特异性改变的ＤＮＡ片段，以及游离的肿瘤细胞ＤＮＡ片段，从而判断肿瘤细胞的存在。用于乳腺癌ＣＴＣ检测的标志主要有游离ＤＮＡ的含量、启动子高度甲基化、微卫星不稳定、杂合性缺失，以及特异的ＤＮＡ点突变等［１４］。Ｄｉ［１５］等分别检测了乳腺癌患者和正常对照的外周血游离ＤＮＡ含量，并运用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测ｐ５３基因的突变情况，发现乳腺癌患者外周血游离ＤＮＡ水平显著升高，游离ＤＮＡ的ｐ５３基因突变与临床分期、
肿瘤大小及淋巴结转移等密切相关，肿瘤原发灶与外周血中均检出ｐ５３基因突变的患者预后较差。研究者认为ｐ５３基因的突变可作为一种预后指标，提示乳腺癌早期复发和远处转移。但游离ＤＮＡ的检测也有一些不尽如人意的地方，由于ＤＮＡ能在组织中稳定存在，所以游离ＤＮＡ并不能提示外周血中有ＣＴＣ，Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂａｃｈ［１６］等发现游离ＤＮＡ与ＣＴＣ的出现没有相关性。另外，检测游离
ＤＮＡ前还需要先对每个患者的原位肿瘤进行分析，以确定其特
异的染色体异常或ＤＮＡ突变的标志，再进行外周血游离ＤＮＡ检测，故该方法不够简便。
２．４逆转录聚合酶链式反应
逆转录聚合酶链式反应（ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＰＣＲ，ＲＴ－
ＰＣＲ）检测ＣＴＣ是基于组织或肿瘤特异性ｍＲＮＡ的表达或某些
基因改变后ＲＮＡ水平的异常，这些ｍＲＮＡ标志不表达于正常外周血细胞，所以在乳腺癌患者外周血中检测到特异ｍＲＮＡ可以间接提示ＣＴＣ的存在。
从已有资料分析，大量研究仍集中在细胞内ＲＮＡ的检测，但近年来研究显示血浆／血清中的游离ＲＮＡ同样可以提示ＣＴＣ的存在。由于外周血中含有ＲＮＡ酶，游离ＲＮＡ极易被降解，所以与游离ＤＮＡ相比，游离ＲＮＡ与ＣＴＣ的出现更具有相关性。Ｓｉｌｖａ［１７］等分别检测了乳腺癌患者外周血ＣＴＣ和血浆中ＣＫ１９与人乳腺珠蛋白（ｈｕｍａｎｍａｍｍｏｇｌｏｂｉｎ，ｈＭＡＭ）的
ｍＲＮＡ，发现１０例能检测到ＣＴＣ的患者中有９例血浆ＣＫ１９、ｈＭＡＭｍＲＮＡ呈阳性。
ＲＴ－ＰＣＲ具有高效率、
高灵敏度、高特异性的优点且操作简便，是目前检测ＣＴＣ的最有效的方法，但寻找一个特异、灵敏的乳腺癌标志物仍然是关键。目前乳腺癌ＣＴＣ主要检测的肿瘤标志物为：①某些基因的改变，如ｐ５３、ｒａｓ的点突变等；②组织特异性标志物ｍＲＮＡ，如ＣＫ１９、ＣＫ２０、ｈＭＡＭ等；③肿瘤特异性标志物ｍＲＮＡ，如ＣＥＡ、多型上皮黏蛋白的核心抗原（ＭＵＣ１）等。其中，ＣＫ１９、ＣＫ２０和ｈＭＡＭ是目前文献报道中应用最多的标志物。ＣＫ１９一直是乳腺癌ＣＴＣ检测中最为常用的标志，但最近的研究显示其不仅表达于乳腺上皮细胞，在其他上皮细胞中也有表达，甚至在健康志愿者的外周血中也有表达。Ｂａｅ［１８］等分别检测了３０例乳腺癌患者和６例健康志愿者的外周血ＣＫ１９、ＣＫ２０
ｍＲＮＡ，结果显示ＣＫ１９在所有样本中均有表达，而ＣＫ２０则显示
了高度的特异性，在健康志愿者中未检测到表达。尽管如此，Ｓｉｌ－
ｖａ
［１９］
等指出ＣＫ２０也不是一个可靠的ｍＲＮＡ标志，他们发现
ＣＫ２０在乳腺癌细胞中的表达水平极低，其灵敏度仅达１０－３。近年来，ｈＭＡＭ以其良好的灵敏度和特异性受到了研究者的青睐。
ｈＭＡＭ是子宫珠蛋白家族成员，其表达仅限于成人乳腺组织和
曹明刚等：乳腺癌患者循环肿瘤细胞检测的研究进展
一些乳腺癌细胞株，在人类乳腺癌中高表达。Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ［２０］等比较了ｈＭＡＭ、ＥＧＦ－Ｒ、ＣＫ１９等３种ｍＲＮＡ标志，发现ｈＭＡＭ是惟一不表达于正常对照组的标志，且只有ｈＭＡＭ与淋巴结状况、转移等临床参数相关，研究者认为其是目前最为出众的乳腺癌
ＣＴＣ检测标志。但Ｂａｌｌｅｓｔｒｅｒｏ［２１］等报道ｈＭＡＭ在其他肿瘤细胞系
中也有表达，其临床应用价值也存在争论。总之，研究者们尚未找到一个令人信赖的乳腺癌细胞特异性的标志物。
人们在ＲＴ－ＰＣＲ的基础上又增加了套式ＲＴ－ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ）、
竞争ＲＴ－ＰＣＲ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＲＴ－ＰＣＲ）、实时定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ－ＰＣＲ）等新技术，这些新技术的使
用更加提高了ＲＴ－ＰＣＲ的灵敏度、特异性。由于肿瘤细胞的异质性，个体间肿瘤标志的表达有差异，Ｇｉｌｂｅｙ［３］
等认为多标志联合检测将大大提高检出率，近期大量的报道也证实了这一点。也有学者运用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹、ＥＬＩＳＡ、ＭＡＣＳ等技术与ＲＴ－ＰＣＲ联合检测乳腺癌ＣＴＣ，同样也取得了令人满意的结果。但ＲＴ－ＰＣＲ技术也有其不足，如无法进行形态学观察、
无法对外周血肿瘤细胞定量等，而取样时上皮细胞污染、肿瘤标志物在外周血的非正常表达及假基因干扰等原因导致的假阳性结果，则是影响其临床应用的最大障碍。
３小结与展望
大量实验已经证实ＣＴＣ检测将有助于乳腺癌早期诊断、复
发转移监控、判断患者预后、指导术后辅助治疗等。与淋巴结、骨髓相比，外周血标本易获得、
创伤性小、可反复采集，是临床上常规检测较为理想的标本来源。但ＣＴＣ的临床应用也存在一些问题。首先，目前尚未发现乳腺癌特异标志物，现在运用的检测标志尚存在某些缺陷，目前还难以在临床运用，寻找特异敏感的检测标志对于其临床应用至关重要；其二，乳腺癌血行转移的机制尚未完全阐明，ＣＴＣ的释放可能是间歇性的，循环中的肿瘤细胞常常成群，单点时间的采样可能产生一定的偏倚，若连续多次采样或加大样本量可能会提高检出率和准确性；其三，乳腺癌患者的大部分ＣＴＣ在血循环中很快会凋亡，所以检测到ＣＴＣ可能并不意味着会形成转移灶［２２］，只有一小部分表型为ＣＤ４４＋／ＣＤ２４－的肿瘤细胞可以在动物模型中形成肿瘤，因此检测乳腺癌患者的外周血中ＣＤ４４＋／ＣＤ２４－ＣＴＣ可能更具有临床应用价值［２３］。
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ｐｏｓｓｉｂｌｅｒｅｌｅｖａｎｃｅｔｏｔｈｅａｓｓａｙｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ
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ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２００７
文章编号：１００９－０００２（２００７）０２－０３１３－０３
生物技术通讯
３１３
综述
乳腺癌患者循环肿瘤细胞检测的研究进展
曹明刚综述；窦骏审校
东南大学基础医学院病原生物学与免疫学系，江苏南京２１０００９［摘要］
血行播散是乳腺癌转移的重要途径，检测腋窝淋巴结已经不能完全准确判断乳腺癌患者是否存在转移。肿瘤细胞
进入外周血是肿瘤远处转移的前提，对乳腺癌患者循环肿瘤细胞的检测将有助于判断预后，指导治疗，监测治疗效果。简要综述了乳腺癌循环肿瘤细胞及其检测方法的研究进展。［关键词］
乳腺癌；微转移；循环肿瘤细胞
［中图分类号］
Ｒ７３－３７+Ｒ７３７．９［文献标识码］Ａ
ＡｄｖａｎｃｅｉｎｔｈｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＴｕｍｏｕｒＣｅｌｌｓｉｎＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ
ＣＡＯＭｉｎｇ－ｇａｎｇ，ＤＯＵＪｕｎ
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｏｕｔｈｅａｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９，Ｃｈｉｎａ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］
Ｈｅｍａｔｏｇｅｎｏｕｓｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｕｔｅｆｏｒｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｘｉｌｌａｒｙｌｙｍｐｈＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ
ｎｏｄｅｓａｌｏｎｅｉｓｎｏｔｅｎｏｕｇｈｔｏａｃｃｕｒａｔｅｌｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｗｈｅｔｈｅｒｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｄｅｖｅｌｏｐｃａｒｃｉｎｏｍａｔｏｕｓｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｅｎｔｒｙｉｎｔｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｓｔｈｅｃｒｉｔｉｃａｌｓｔｅｐｆｏｒｃａｎｃｅｒｄｉｓｔａｎｔｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．
ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｍａｙｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｊｕｄｇｉｎｇｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，ｇｕｉｄｉｎｇｔｏｔｒｅａｔｍｅｎｔｓａｎｄｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｔｈｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗｗｉｌｌｂｅｍａｉｎｌｙｃｏｎｃｅｒｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓａｓｗｅｌｌａｓｒｅｌｅｖａｎｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］
ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ+ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ+ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌ
后的外周血癌胚抗原（ＣＥＡ）ｍＲＮＡ，发现３例术前阴性的患者术后转为阳性。Ｈｕ［５］等发现细针抽吸（ｆｉｎｅｎｅｅｄｌｅａｓｐｉｒａｔｉｏｎ，ＦＮＡ）也可以导致肿瘤细胞播散入外周血。这些自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞被称为ＣＴＣ。
肿瘤细胞进入外周血中的微转移是肿瘤远处转移的前提［６］，大量实验证明ＣＴＣ的出现与乳腺癌患者的临床分期、淋巴结状况以及预后均密切相关。Ｓｔａｔｈｏｐｏｕｌｏｕ［７］等检测了乳腺癌患者外周血的细胞角蛋白（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ，ＣＫ）１９的ｍＲＮＡ，发现在Ⅰ～Ⅱ期患者术前阳性率为３１．２％，而Ⅳ期患者则达到４０．４％，结果表明
乳腺癌已被认为是一种全身性疾病，即早期可发生肿瘤细胞的全身扩散，大约１５％的乳腺癌患者即使术后腋窝淋巴结活检阴性仍有可能出现转移，提示复发与转移是由于已存在的但未被常规临床诊断手段检测到的乳腺癌微转移造成的［１］。远处转移是导致乳腺癌患者死亡的主要因素，提高乳腺癌微转移的检出率，对判断患者预后和合理选择治疗方案、提高患者生存率均有重要意义。因此，对乳腺癌患者循环肿瘤细胞检测的研究已受到特别关注。在此，我们就相关研究进展加以概述。
１循环肿瘤细胞
血行播散是乳腺癌转移的重要途径，肿瘤细胞可以通过血
ＣＴＣ的存在与临床分期相关。Ｔａｕｅｒｔ［８］等检测了１２５份乳腺癌患
者外周血中的ＣＫ阳性细胞，淋巴结Ｎ０期患者阳性率为２５％，
Ｎ１期患者为５４％，ＣＴＣ的出现与淋巴结转移数目有明显的相关
性。Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ［９］等检测了１７７例乳腺癌患者的ＣＴＣ数量，发现
液循环抵达任何组织和器官。临床发现部分乳腺癌患者肿块小、腋窝淋巴结阴性但预后很差，而某些晚期患者却能存活较长时间，这一临床现象用已有的经验和理论很难解释，而血行途径微转移的学说为此提供了理论依据［２］。１８９６年，Ａｓｈｗｏｒｔｈ在１例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并提出了循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌ，ＣＴＣ）的概念［２］。研究发现，随着肿瘤细胞的不断增殖，部分细胞失去相互附着的能力，从肿瘤母体脱离，降解、浸润周围组织，进入到血液或淋巴系统中。转移的肿瘤细胞游出血管外，通过细胞外基质迁移到合适的生长部位，被激活分裂、增殖形成转移灶［３］。某些诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环，Ｍｏｒｉ［４］等检测了１３例乳腺癌患者手术前
７．５ｍＬ外周血中ＣＴＣ≥５的患者治疗后缓解期约２．７个月，总生
存期约１０．１个月；而ＣＴＣ＜５的患者治疗后缓解期约７个月，总判断预后。生存期则大于１８个月，提示ＣＴＣ可以预测治疗效果、
由此可见，迅速准确地检测乳腺癌患者的ＣＴＣ，对其诊断、评估预后及治疗方案的选择具有重要价值，有助于降低肿瘤复发率，延长患者生存期。
２００６－０７－３０
江苏省卫生厅资助项目（１６２３０００５７７７）
曹明刚（１９８３－），男，硕士研究生
窦骏，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｎｊｄｏｕｊｕｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
［收稿日期］［基金项目］［作者简介］［通讯作者］
３１４２
ＣＴＣ的检测方法
２．１
免疫细胞化学
乳腺癌为上皮来源性肿瘤，具有上皮源性的细胞生物学特
征，而外周血细胞不表达上皮源性抗原。免疫细胞化学（ｉｍ－
ｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＣＣ）是利用单克隆抗体与特异的肿瘤标志物
结合，并通过酶和底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在。常用的肿瘤标志物有ＣＫ、人表皮生长因子受体（ＨＥＲ２）、上皮膜抗原（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅａｎｔｉｇｅｎ，ＥＭＡ）等。目前，ＩＣＣ仍然是评价ＣＴＣ检测方法的金标准［６］。
但由于直接运用ＩＣＣ检测ＣＴＣ较费时费力，并有可能遗漏一部分肿瘤细胞，故人们设法通过磁性细胞分选技术（ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ＭＡＣＳ）富集肿瘤细胞后再进行ＩＣＣ检测，这种方法上的改进显著地提高了检测效率和检出率。Ｈｕ［１０］等分别运用直接ＩＣＣ和ＭＡＣＳ／ＩＣＣ方法检测了３６例乳腺癌患者外周血的ＣＴＣ，结果显示ＩＣＣ组阳性率为
５．６％，而ＭＡＣＳ／ＩＣＣ组则达到３８．９％，ＭＡＣＳ／ＩＣＣ组Ⅰ到Ⅳ期患
者阳性率分别为０％（０／４）、３３．３％（８／２４）、６０％（３／５）和１００％（３／
３），ＭＡＣＳ／ＩＣＣ法较ＩＣＣ法的检出率有很大提高，差异有显著性
（Ｐ＜０．０５）。Ｗｕｌｆｉｎｇ［１１］等用ＭＡＣＳ－ＩＣＣ法检测４２例乳腺癌患者外周血ＨＥＲ２阳性ＣＴＣ，无明显转移的患者组阳性率为４８．６％，转移患者组为１００％，且ＣＴＣ的出现与患者缓解期及总生存期显著相关。由于肿瘤细胞抗原表达具有异质性，有学者建议ＭＡＣＳ／
ＩＣＣ联合检测多种抗体以提高灵敏度和特异性。ＩＣＣ法的优点是
简便、直观，但肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性、部分淋巴细胞的交叉反应等因素会影响检测的敏感性和特异性。
２．２流式细胞技术
流式细胞技术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）是运用标记荧光物质的
单克隆抗体与肿瘤细胞特异性的标志物结合，使肿瘤细胞染色，然后用流式细胞仪进行测量分析。目前在乳腺癌ＣＴＣ检测的研究中，ＣＫ作为乳腺癌细胞较特异的标志物，其应用最为广泛。
Ｃｒｕｚ［１２］等分别用抗ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ８／ＣＫ１８、ＣＫ２０和ｐａｎ－ＣＫ
等６种荧光标记的单克隆抗体染色乳腺癌患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ），然后进行ＦＣＭ检测，结果显示ＣＫ１８的敏感性最高。
ＦＣＭ可以进行多参数测量，实验表明多参数ＦＣＭ可以显著提高
检测的敏感性。Ｇｒｏｓｓ［１３］将乳腺癌细胞系ＢＴ－２０与正常人ＰＢＭＣ混合，运用４种不同荧光物质结合的一系列ＣＤ、ＣＫ的单克隆抗体染色后进行ＦＣＭ检测，结果显示该方法可以从１０７个ＰＢＭＣ中检出１个肿瘤细胞。运用ＭＡＣＳ技术富集肿瘤细胞后再进行
ＦＣＭ检测也可以提高敏感性，据报道［２］，ＭＡＣＳ－ＦＣＭ可以检测到
１ｍＬ外周血中的１个肿瘤细胞。ＦＣＭ检测快速、准确，可以定量检测乳腺癌病人外周血中肿瘤细胞的含量。但ＦＣＭ不能提供有关乳腺癌细胞形态方面的信息，所以有学者认为ＦＣＭ检测后尚需要运用乳腺癌特异抗体进行ＩＣＣ染色，从形态学上确定肿瘤细胞。Ｒａｃｉｌａ［２］等运用ＭＡＣＳ－ＦＣＭ－ＩＣＣ联合法检测乳腺癌患者
ＣＴＣ，发现ＣＴＣ的数量与临床分期及化疗相关，但这种检测方法
价格昂贵而且操作起来费时费力，难以作为常规检测方法应用于临床。
２．３聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）检测外周
血中肿瘤细胞的原理是基于游离ＤＮＡ的存在。上世纪５０年代人们就发现外周血中存在游离ＤＮＡ，它们可能是由于ＣＴＣ的裂
生物技术通讯
ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２００７
解、肿瘤细胞的凋亡、坏死或自发性释放等原因进入外周血循环的。进一步研究发现，恶性肿瘤患者游离ＤＮＡ水平明显升高，且肿瘤患者血浆ＤＮＡ的基因型改变与其原发肿瘤细胞一致，在血清中可以检测到原发肿瘤细胞中所有基因谱的改变。ＰＣＲ检测就是特异性扩增出外周血循环中因癌基因、抑癌基因突变或染色体异常而特异性改变的ＤＮＡ片段，以及游离的肿瘤细胞ＤＮＡ片段，从而判断肿瘤细胞的存在。用于乳腺癌ＣＴＣ检测的标志主要有游离ＤＮＡ的含量、启动子高度甲基化、微卫星不稳定、杂合性缺失，以及特异的ＤＮＡ点突变等［１４］。Ｄｉ［１５］等分别检测了乳腺癌患者和正常对照的外周血游离ＤＮＡ含量，并运用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测ｐ５３基因的突变情况，发现乳腺癌患者外周血游离ＤＮＡ水平显著升高，游离ＤＮＡ的ｐ５３基因突变与临床分期、
肿瘤大小及淋巴结转移等密切相关，肿瘤原发灶与外周血中均检出ｐ５３基因突变的患者预后较差。研究者认为ｐ５３基因的突变可作为一种预后指标，提示乳腺癌早期复发和远处转移。但游离ＤＮＡ的检测也有一些不尽如人意的地方，由于ＤＮＡ能在组织中稳定存在，所以游离ＤＮＡ并不能提示外周血中有ＣＴＣ，Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂａｃｈ［１６］等发现游离ＤＮＡ与ＣＴＣ的出现没有相关性。另外，检测游离
ＤＮＡ前还需要先对每个患者的原位肿瘤进行分析，以确定其特
异的染色体异常或ＤＮＡ突变的标志，再进行外周血游离ＤＮＡ检测，故该方法不够简便。
２．４逆转录聚合酶链式反应
逆转录聚合酶链式反应（ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＰＣＲ，ＲＴ－
ＰＣＲ）检测ＣＴＣ是基于组织或肿瘤特异性ｍＲＮＡ的表达或某些
基因改变后ＲＮＡ水平的异常，这些ｍＲＮＡ标志不表达于正常外周血细胞，所以在乳腺癌患者外周血中检测到特异ｍＲＮＡ可以间接提示ＣＴＣ的存在。
从已有资料分析，大量研究仍集中在细胞内ＲＮＡ的检测，但近年来研究显示血浆／血清中的游离ＲＮＡ同样可以提示ＣＴＣ的存在。由于外周血中含有ＲＮＡ酶，游离ＲＮＡ极易被降解，所以与游离ＤＮＡ相比，游离ＲＮＡ与ＣＴＣ的出现更具有相关性。Ｓｉｌｖａ［１７］等分别检测了乳腺癌患者外周血ＣＴＣ和血浆中ＣＫ１９与人乳腺珠蛋白（ｈｕｍａｎｍａｍｍｏｇｌｏｂｉｎ，ｈＭＡＭ）的
ｍＲＮＡ，发现１０例能检测到ＣＴＣ的患者中有９例血浆ＣＫ１９、ｈＭＡＭｍＲＮＡ呈阳性。
ＲＴ－ＰＣＲ具有高效率、
高灵敏度、高特异性的优点且操作简便，是目前检测ＣＴＣ的最有效的方法，但寻找一个特异、灵敏的乳腺癌标志物仍然是关键。目前乳腺癌ＣＴＣ主要检测的肿瘤标志物为：①某些基因的改变，如ｐ５３、ｒａｓ的点突变等；②组织特异性标志物ｍＲＮＡ，如ＣＫ１９、ＣＫ２０、ｈＭＡＭ等；③肿瘤特异性标志物ｍＲＮＡ，如ＣＥＡ、多型上皮黏蛋白的核心抗原（ＭＵＣ１）等。其中，ＣＫ１９、ＣＫ２０和ｈＭＡＭ是目前文献报道中应用最多的标志物。ＣＫ１９一直是乳腺癌ＣＴＣ检测中最为常用的标志，但最近的研究显示其不仅表达于乳腺上皮细胞，在其他上皮细胞中也有表达，甚至在健康志愿者的外周血中也有表达。Ｂａｅ［１８］等分别检测了３０例乳腺癌患者和６例健康志愿者的外周血ＣＫ１９、ＣＫ２０
ｍＲＮＡ，结果显示ＣＫ１９在所有样本中均有表达，而ＣＫ２０则显示
了高度的特异性，在健康志愿者中未检测到表达。尽管如此，Ｓｉｌ－
ｖａ
［１９］
等指出ＣＫ２０也不是一个可靠的ｍＲＮＡ标志，他们发现
ＣＫ２０在乳腺癌细胞中的表达水平极低，其灵敏度仅达１０－３。近年来，ｈＭＡＭ以其良好的灵敏度和特异性受到了研究者的青睐。
ｈＭＡＭ是子宫珠蛋白家族成员，其表达仅限于成人乳腺组织和
曹明刚等：乳腺癌患者循环肿瘤细胞检测的研究进展
一些乳腺癌细胞株，在人类乳腺癌中高表达。Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ［２０］等比较了ｈＭＡＭ、ＥＧＦ－Ｒ、ＣＫ１９等３种ｍＲＮＡ标志，发现ｈＭＡＭ是惟一不表达于正常对照组的标志，且只有ｈＭＡＭ与淋巴结状况、转移等临床参数相关，研究者认为其是目前最为出众的乳腺癌
ＣＴＣ检测标志。但Ｂａｌｌｅｓｔｒｅｒｏ［２１］等报道ｈＭＡＭ在其他肿瘤细胞系
中也有表达，其临床应用价值也存在争论。总之，研究者们尚未找到一个令人信赖的乳腺癌细胞特异性的标志物。
人们在ＲＴ－ＰＣＲ的基础上又增加了套式ＲＴ－ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ）、
竞争ＲＴ－ＰＣＲ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＲＴ－ＰＣＲ）、实时定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ－ＰＣＲ）等新技术，这些新技术的使
用更加提高了ＲＴ－ＰＣＲ的灵敏度、特异性。由于肿瘤细胞的异质性，个体间肿瘤标志的表达有差异，Ｇｉｌｂｅｙ［３］
等认为多标志联合检测将大大提高检出率，近期大量的报道也证实了这一点。也有学者运用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹、ＥＬＩＳＡ、ＭＡＣＳ等技术与ＲＴ－ＰＣＲ联合检测乳腺癌ＣＴＣ，同样也取得了令人满意的结果。但ＲＴ－ＰＣＲ技术也有其不足，如无法进行形态学观察、
无法对外周血肿瘤细胞定量等，而取样时上皮细胞污染、肿瘤标志物在外周血的非正常表达及假基因干扰等原因导致的假阳性结果，则是影响其临床应用的最大障碍。
３小结与展望
大量实验已经证实ＣＴＣ检测将有助于乳腺癌早期诊断、复
发转移监控、判断患者预后、指导术后辅助治疗等。与淋巴结、骨髓相比，外周血标本易获得、
创伤性小、可反复采集，是临床上常规检测较为理想的标本来源。但ＣＴＣ的临床应用也存在一些问题。首先，目前尚未发现乳腺癌特异标志物，现在运用的检测标志尚存在某些缺陷，目前还难以在临床运用，寻找特异敏感的检测标志对于其临床应用至关重要；其二，乳腺癌血行转移的机制尚未完全阐明，ＣＴＣ的释放可能是间歇性的，循环中的肿瘤细胞常常成群，单点时间的采样可能产生一定的偏倚，若连续多次采样或加大样本量可能会提高检出率和准确性；其三，乳腺癌患者的大部分ＣＴＣ在血循环中很快会凋亡，所以检测到ＣＴＣ可能并不意味着会形成转移灶［２２］，只有一小部分表型为ＣＤ４４＋／ＣＤ２４－的肿瘤细胞可以在动物模型中形成肿瘤，因此检测乳腺癌患者的外周血中ＣＤ４４＋／ＣＤ２４－ＣＴＣ可能更具有临床应用价值［２３］。
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ｌｉａｂｌｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｆｏｒｏｃｃｕｌｔｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］．ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓＴｒｅａｔ，２００１，６６（１）：５９［２０］ＧｒｕｎｅｗａｌｄＫ，ＨａｕｎＭ，ＵｒｂａｎｅｋＭ，ｅｔａｌ．Ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎｇｅｎｅｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ：
ａｓｕｐｅｒｉｏｒｍａｒｋｅｒｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ
ｂｌｏｏｄｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｔｏｅｐｉｄｅｒｍａｌ－ｇｒｏｗｔｈ－ｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｄｃｙ－ｔｏｋｅｒａｔｉｎ－１９［Ｊ］．ＬａｂＩｎｖｅｓｔ，２０００，８０（７）：１０７１
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ｔｏｋｉｎｅｓｏｎｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎａｎｄｍａｓｐｉｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｎｏｒｍａｌｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ：
ｐｏｓｓｉｂｌｅｒｅｌｅｖａｎｃｅｔｏｔｈｅａｓｓａｙｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ
ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ，２００５，９２（１０）：１９４８［２２］ＭｅｈｅｓＧ，ＷｉｔｔＡ，ＫｕｂｉｓｔａＥ，ｅｔａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ
ａｒｅｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙａｐｏｐｔｏｔｉｃ［Ｊ］．ＡｍＪＰａｔｈｏｌ，２００１，１５９（１）：１７
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ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００３，１００（７）：３９８３