无菌操作技术（一）—器皿的清洗、包扎、灭菌及培养基的配制
实验目的：
1、掌握实验用器皿的清洗、包扎方法
2、了解常用的灭菌方法—干热灭菌、湿热灭菌、紫外线灭菌及化学灭菌
3、掌握培养基的配制及不同类型灭菌器的使用。
一、实验用器皿的清洗及洗涤液的配制
1、洗涤液的种类及配制
（1）去垢剂溶液（常用洗涤液）。
生化去垢剂（detergent ）
A ．中性去垢剂 又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售有
聚乙二醇类，如PEG200；
多元醇类表面活性剂，如山梨醇、
司班和吐温类：司班-80和吐温-20
B ．阴离子去垢剂 ：
常见的有十二烷基硫酸钠和十二烷基璜酸钠。常用于核酸的提取。
C ．阳离子去垢剂 ：
如洁尔灭、新洁尔灭、消毒净等，消毒灭菌类居多。
D ．天然表面活性剂 ：
又称为生物表面活性剂，如各种树胶（阿拉伯胶、果胶）、明胶、皂甙、卵磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、多糖类（如环糊精）等。
E ．两性表面活性剂：
在碱性水溶液中呈阴离子表面活性剂的性质，起泡性好，去污力也强；在酸性溶液中则呈现阳离子表面活性剂特征，其杀菌性很强。
（2）铬酸洗液：
[又称重铬酸钾（或钠）——浓硫酸洗涤液，简称洗液]广泛用于玻璃仪器的洗涤。其配制方法如下：
①称取5g 重铬酸钾(或钠) 粉末放入250ml 烧杯中，加5ml 水，尽量使其溶解。然后边搅拌，边缓缓注入浓H2SO4l00ml ，待洗液温度冷却至40℃以下，将其转移到具玻塞的细颈干燥的试剂瓶内贮存备用。
②称取10g 重铬酸钾粉末置于500ml 烧杯中，加水20ml ，尽量使其溶解。然后慢慢注入浓H2SO4180ml ，随加随搅拌。冷却后贮于具玻塞的细颈试剂瓶中备用。
（3）浓HCl （工业用）常用于洗去水垢或某些无机盐沉淀。
（4）浓HNO3（常用于洗涤除去金属离子）。
（5）1mol/LKOH溶液。
（6）8mol/L尿素洗涤液（PH1.0）适用于洗涤盛蛋白质溶液及血样的器皿。
（7）10-3mol/LEDTA溶液用于除去塑料容器内壁污染的金属离子。
（8）5%-10%磷酸三钠（Na3PO4·12H2O ）溶液（用于洗涤油污物）。
（9）氢氧化钾（KOH ）的乙醇溶液和含有高锰酸钾的氢氧化钠（NaOH ）溶液，适用于清除容器内壁污垢，但这两种强碱性洗涤液对玻璃仪器的侵蚀性很强，故洗涤时间不宜过长，使用时应小心慎重。
（10）有机溶剂：丙酮、乙醇、乙醚等可用于洗脱油脂、脂溶性染料等污痕。二甲苯可洗脱油漆类污垢。
2．玻璃仪器的清洗
（1）初用玻璃仪器的洗涤
新购置的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用去垢剂（0.5%水溶液）或肥皂水洗刷，再用自来水洗净。然后浸泡1%—2%HCl溶液中过液，次日取出用自来水充分冲洗，最后再用蒸馏水漂洗数次，置烘箱内烘干或倒置晾干备用。
（2）使用过的玻璃仪器的洗涤
①一般玻璃仪器洗涤
自来水冲洗→去垢剂洗涤或浸泡于0.5%去垢剂水溶液中→将器皿内外（特别是内壁）仔细刷洗后 →自来水充分洗净→蒸馏水漂洗数次，烘干或晾干备用。凡洗净的玻璃器皿，其壁上不沾有水珠，否则表示尚未洗净，应按上述方法重新洗涤。量具玻璃仪器不能烘烤，只能晾干或风干
②移液管（吸量管）的洗涤
移液管每次使用后须及时用流水冲洗或浸泡于冷水中，特别是吸取粘滞性较大的液体（全血、血浆、血清等）后应立即用流水充分冲洗，以免物质干涸和堵塞移液管。通常使用过的移液管经自来水冲洗后，可浸泡于0.5%去垢剂溶液中或铬酸洗液中过夜（不少于4h ），然后分别用自来水充分冲洗和蒸馏水漂洗，晾干备用。
③玻璃比色皿和石英比色皿的清洗
比色皿使用后应立即用蒸馏水充分冲洗，倒置在清洁处晾干备用。所有比色皿均可用0.5%去垢剂溶液洗涤，必须用脱脂棉小心地清洗，然后用大量蒸馏水充分漂洗干净，倒置晾干。但不能用氢氧化钾的乙醇溶液及其他强碱洗涤液清洗比色皿，因这样导致比色皿的严重腐蚀。
3．塑料器皿的洗涤
新购买的塑料器皿：
自来水清洗后→8mol ·L-1尿素溶液（PH1.0）洗涤，→蒸馏水漂洗→1mol/LKOH溶液洗涤→蒸馏水漂洗→10-3mol/LEDTA溶液洗涤，以除去污染的金属离子→双蒸馏水充分漂洗，倒置晾干备用。使用后塑料器皿:
0.5%去垢剂溶液洗涤→自来水充分冲洗和蒸馏水漂洗晾干后即可使用。如果必要也可按碱→尿素→EDTA 洗涤顺序处理，以除去器皿上的污染物。
二、常用灭菌方法：
干热灭菌：在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭菌的技术。一般有火焰灭菌法和干热空气灭菌法
火焰灭菌：指用火焰直接烧灼的灭菌方法。该方法灭菌迅速、可靠、简便，适合于耐火焰材料（如金属、玻璃及瓷器等）物品与用具的灭菌，不适合药品的灭菌。
干热灭菌：
该法适用于耐高温的玻璃和金属制品以及不允许湿热气体穿透的油脂（如油性软膏机制、注射用油等）和耐高温的粉末化学药品的灭菌，不适合橡胶、塑料及大部分药品的灭菌。 135-140℃灭菌3-5h ；160-170 ℃灭菌2-4h ；180-200 ℃灭菌0.5-1h 。
细菌的繁殖体在干燥状态下，80℃～100℃ 1小时可被杀死；芽胞需要加热至160℃～170℃ 2小时才杀灭
湿热灭菌：
湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的灭菌方法。湿热灭菌法可分为：煮沸灭菌法、巴氏消毒法、高压蒸汽灭菌法、流通蒸汽灭菌法、和间歇蒸汽灭菌法。
103.4千帕蒸汽压温度达121.3℃，维持15-20分钟。
紫外线灭菌：是指用紫外线（能量）照射杀灭微生物的方法，紫外线不仅能使核酸蛋白变性，而且能使空气中氧气产生微量臭氧，从而达到共同杀菌作用。用于紫外线灭菌的波长一般为200~300nm，灭菌里最强的为254nm 。该方法属于表面灭菌。该法适于照射物体表面灭菌、无菌室空气及蒸馏水的灭菌；不适用于药液的灭菌及固体物料的深部灭菌。由于紫外线是以直线传播，可被不同的表面反射或吸收，穿透力微弱，普通玻璃可吸收紫外线，因此装于容器中的药物不能用紫外线来灭菌。
化学灭菌：用化学药品直接作用于微生物而将其杀死的方法。
1. 气体灭菌法： 采用气态杀菌剂（如臭氧、环氧乙烷、甲醛、丙二醇、甘油和过氧乙酸蒸汽等）进行灭菌的方法。该法特别适合环境消毒以及不耐加热灭菌的医用器具、设备和设施的消毒。临床供应商常用到的环氧乙烷低温灭菌器、过氧化氢等离子体灭菌器、低温蒸汽甲醛灭菌器都是这中方法。亦可用于粉末注射剂，但不适合于对产品质量有损害的场合。
2. 液体灭菌法： 采用杀菌剂容易如进行消毒的方法。该法常作为其他灭菌法的辅助措施，适合于皮肤、无菌器具和设备的消毒。常采用的消毒液有75%乙醇、1%聚维酮碘溶液、0.1%~0.2%苯扎溴铵（新洁尔灭）、2%左右的酚或煤酚皂溶液等。
三、玻璃器皿的包扎
棉塞制作
锥形瓶包扎
移液管包扎
培养皿包扎
四、培养基的配制
普通培养基（牛肉膏蛋白胨）培养细菌
马丁氏培养基（培养真菌）
高氏1号培养基（培养放线菌）
无菌操作技术（一）—器皿的清洗、包扎、灭菌及培养基的配制
实验目的：
1、掌握实验用器皿的清洗、包扎方法
2、了解常用的灭菌方法—干热灭菌、湿热灭菌、紫外线灭菌及化学灭菌
3、掌握培养基的配制及不同类型灭菌器的使用。
一、实验用器皿的清洗及洗涤液的配制
1、洗涤液的种类及配制
（1）去垢剂溶液（常用洗涤液）。
生化去垢剂（detergent ）
A ．中性去垢剂 又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售有
聚乙二醇类，如PEG200；
多元醇类表面活性剂，如山梨醇、
司班和吐温类：司班-80和吐温-20
B ．阴离子去垢剂 ：
常见的有十二烷基硫酸钠和十二烷基璜酸钠。常用于核酸的提取。
C ．阳离子去垢剂 ：
如洁尔灭、新洁尔灭、消毒净等，消毒灭菌类居多。
D ．天然表面活性剂 ：
又称为生物表面活性剂，如各种树胶（阿拉伯胶、果胶）、明胶、皂甙、卵磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、多糖类（如环糊精）等。
E ．两性表面活性剂：
在碱性水溶液中呈阴离子表面活性剂的性质，起泡性好，去污力也强；在酸性溶液中则呈现阳离子表面活性剂特征，其杀菌性很强。
（2）铬酸洗液：
[又称重铬酸钾（或钠）——浓硫酸洗涤液，简称洗液]广泛用于玻璃仪器的洗涤。其配制方法如下：
①称取5g 重铬酸钾(或钠) 粉末放入250ml 烧杯中，加5ml 水，尽量使其溶解。然后边搅拌，边缓缓注入浓H2SO4l00ml ，待洗液温度冷却至40℃以下，将其转移到具玻塞的细颈干燥的试剂瓶内贮存备用。
②称取10g 重铬酸钾粉末置于500ml 烧杯中，加水20ml ，尽量使其溶解。然后慢慢注入浓H2SO4180ml ，随加随搅拌。冷却后贮于具玻塞的细颈试剂瓶中备用。
（3）浓HCl （工业用）常用于洗去水垢或某些无机盐沉淀。
（4）浓HNO3（常用于洗涤除去金属离子）。
（5）1mol/LKOH溶液。
（6）8mol/L尿素洗涤液（PH1.0）适用于洗涤盛蛋白质溶液及血样的器皿。
（7）10-3mol/LEDTA溶液用于除去塑料容器内壁污染的金属离子。
（8）5%-10%磷酸三钠（Na3PO4·12H2O ）溶液（用于洗涤油污物）。
（9）氢氧化钾（KOH ）的乙醇溶液和含有高锰酸钾的氢氧化钠（NaOH ）溶液，适用于清除容器内壁污垢，但这两种强碱性洗涤液对玻璃仪器的侵蚀性很强，故洗涤时间不宜过长，使用时应小心慎重。
（10）有机溶剂：丙酮、乙醇、乙醚等可用于洗脱油脂、脂溶性染料等污痕。二甲苯可洗脱油漆类污垢。
2．玻璃仪器的清洗
（1）初用玻璃仪器的洗涤
新购置的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用去垢剂（0.5%水溶液）或肥皂水洗刷，再用自来水洗净。然后浸泡1%—2%HCl溶液中过液，次日取出用自来水充分冲洗，最后再用蒸馏水漂洗数次，置烘箱内烘干或倒置晾干备用。
（2）使用过的玻璃仪器的洗涤
①一般玻璃仪器洗涤
自来水冲洗→去垢剂洗涤或浸泡于0.5%去垢剂水溶液中→将器皿内外（特别是内壁）仔细刷洗后 →自来水充分洗净→蒸馏水漂洗数次，烘干或晾干备用。凡洗净的玻璃器皿，其壁上不沾有水珠，否则表示尚未洗净，应按上述方法重新洗涤。量具玻璃仪器不能烘烤，只能晾干或风干
②移液管（吸量管）的洗涤
移液管每次使用后须及时用流水冲洗或浸泡于冷水中，特别是吸取粘滞性较大的液体（全血、血浆、血清等）后应立即用流水充分冲洗，以免物质干涸和堵塞移液管。通常使用过的移液管经自来水冲洗后，可浸泡于0.5%去垢剂溶液中或铬酸洗液中过夜（不少于4h ），然后分别用自来水充分冲洗和蒸馏水漂洗，晾干备用。
③玻璃比色皿和石英比色皿的清洗
比色皿使用后应立即用蒸馏水充分冲洗，倒置在清洁处晾干备用。所有比色皿均可用0.5%去垢剂溶液洗涤，必须用脱脂棉小心地清洗，然后用大量蒸馏水充分漂洗干净，倒置晾干。但不能用氢氧化钾的乙醇溶液及其他强碱洗涤液清洗比色皿，因这样导致比色皿的严重腐蚀。
3．塑料器皿的洗涤
新购买的塑料器皿：
自来水清洗后→8mol ·L-1尿素溶液（PH1.0）洗涤，→蒸馏水漂洗→1mol/LKOH溶液洗涤→蒸馏水漂洗→10-3mol/LEDTA溶液洗涤，以除去污染的金属离子→双蒸馏水充分漂洗，倒置晾干备用。使用后塑料器皿:
0.5%去垢剂溶液洗涤→自来水充分冲洗和蒸馏水漂洗晾干后即可使用。如果必要也可按碱→尿素→EDTA 洗涤顺序处理，以除去器皿上的污染物。
二、常用灭菌方法：
干热灭菌：在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭菌的技术。一般有火焰灭菌法和干热空气灭菌法
火焰灭菌：指用火焰直接烧灼的灭菌方法。该方法灭菌迅速、可靠、简便，适合于耐火焰材料（如金属、玻璃及瓷器等）物品与用具的灭菌，不适合药品的灭菌。
干热灭菌：
该法适用于耐高温的玻璃和金属制品以及不允许湿热气体穿透的油脂（如油性软膏机制、注射用油等）和耐高温的粉末化学药品的灭菌，不适合橡胶、塑料及大部分药品的灭菌。 135-140℃灭菌3-5h ；160-170 ℃灭菌2-4h ；180-200 ℃灭菌0.5-1h 。
细菌的繁殖体在干燥状态下，80℃～100℃ 1小时可被杀死；芽胞需要加热至160℃～170℃ 2小时才杀灭
湿热灭菌：
湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的灭菌方法。湿热灭菌法可分为：煮沸灭菌法、巴氏消毒法、高压蒸汽灭菌法、流通蒸汽灭菌法、和间歇蒸汽灭菌法。
103.4千帕蒸汽压温度达121.3℃，维持15-20分钟。
紫外线灭菌：是指用紫外线（能量）照射杀灭微生物的方法，紫外线不仅能使核酸蛋白变性，而且能使空气中氧气产生微量臭氧，从而达到共同杀菌作用。用于紫外线灭菌的波长一般为200~300nm，灭菌里最强的为254nm 。该方法属于表面灭菌。该法适于照射物体表面灭菌、无菌室空气及蒸馏水的灭菌；不适用于药液的灭菌及固体物料的深部灭菌。由于紫外线是以直线传播，可被不同的表面反射或吸收，穿透力微弱，普通玻璃可吸收紫外线，因此装于容器中的药物不能用紫外线来灭菌。
化学灭菌：用化学药品直接作用于微生物而将其杀死的方法。
1. 气体灭菌法： 采用气态杀菌剂（如臭氧、环氧乙烷、甲醛、丙二醇、甘油和过氧乙酸蒸汽等）进行灭菌的方法。该法特别适合环境消毒以及不耐加热灭菌的医用器具、设备和设施的消毒。临床供应商常用到的环氧乙烷低温灭菌器、过氧化氢等离子体灭菌器、低温蒸汽甲醛灭菌器都是这中方法。亦可用于粉末注射剂，但不适合于对产品质量有损害的场合。
2. 液体灭菌法： 采用杀菌剂容易如进行消毒的方法。该法常作为其他灭菌法的辅助措施，适合于皮肤、无菌器具和设备的消毒。常采用的消毒液有75%乙醇、1%聚维酮碘溶液、0.1%~0.2%苯扎溴铵（新洁尔灭）、2%左右的酚或煤酚皂溶液等。
三、玻璃器皿的包扎
棉塞制作
锥形瓶包扎
移液管包扎
培养皿包扎
四、培养基的配制
普通培养基（牛肉膏蛋白胨）培养细菌
马丁氏培养基（培养真菌）
高氏1号培养基（培养放线菌）