#282#
解放军医学杂志2003年3月第28卷第3期M ed J Chin PLA Vol 28No 3M ar 2003
#简 报#
改良明胶酶谱测定明胶酶活性¹
710032 西安 第四军医大学细胞工程研究中心 骞爱荣 商 澎 陈志南
关键词 明胶酶谱; 基质金属蛋白酶; 电泳; 聚丙烯酰胺凝胶中图分类号 R96512
基质金属蛋白酶(M MPs) 是能降解细胞外基质和基底膜成分的酶家族成员之一。这个蛋白家族包括胶原酶、明胶酶、基质素和
膜型基质金属蛋白酶(M T -M MP) 等5大类。MMPs 家族成员目前已鉴定出28种。M MP 的基因表达水平和酶活性的高低与许多生理或病理过程及其恶性程度相关, 如肿瘤转移、血管浸润、骨质疏松、组织纤维化等, 尤其是明胶酶A 和B(MMP -2, 9) 在肿瘤的转移和血管生成方面起重要的作用[2]。
目前, 测定明胶酶活性的方法多用明胶酶谱法(gelatin zymog -raphy) , 即收集待测样本, 处理后在含有明胶-聚丙烯凝胶中进行SDS -PAGE 。但是, 传统的方法样品处理费时、费事。因此, 从方法学的角度, 寻找简便实用的检测MM Ps 活性的方法有重要的意义。本文介绍一种改良的明胶酶谱方法, 较好地解决了实验中遇到的一些难题, 且简单、实用、结果可靠。尤其是在筛选MM Ps 的抑制剂时, 该方法省时, 省实验药物。1 材料与方法
111 常规仪器和试剂 垂直电泳槽和电泳仪(美国Bi o -Rad 公司) , 图像分析系统(上海复日科技有限公司) , 96孔板(瑞典Nunc 公司) , 培养瓶, CO 2培养箱(德国Heraeus 公司) , 超净工作台, 震荡器等。明胶, Tri ton X -100(购自华美生物技术公司) 。
112 酶谱电泳专用梳子和边条 自制专用梳子和边条的厚度112mm, 齿孔宽度为1313mm, 每个梳子有5个孔。
113 试剂配制 1%明胶溶液; 2@电泳载样缓冲液(5%SDS,2%蔗糖, 012%溴酚蓝, 50mmol/L Tris -HCl, pH 618) ; 电泳缓冲液25mmol/L Tris , 250mmol /L 甘氨酸, pH 813, 011%SDS; 聚丙烯酰胺凝胶电泳贮液:¹30%的丙烯酰胺溶液; º110mol/L Tris -HCl (pH618) ; »115mol/L Tri s -HCl (p H818) ; ¼10%SDS; ½10%过硫酸铵; ¾10%T EM ED; 215%Triton X -100溶液; 明胶酶缓冲液50mmol/L Tri s , 10mmol /L CaCl 2, 200mmol/L NaCl, 1L mol /L ZnCl 2(pH 715) ; 染色液011%考马斯亮蓝R -250; 脱色液甲醇B 水B 冰醋酸=45B 45B 10.
114 样品制备 ¹人成纤维细胞(Fb) 和人肝癌细胞(HHCC) 培养至对数期, 用0125%胰酶消化, 以105/孔的密度接种于96孔板中, 培养24h; º第二天, 弃去培养上清, 用PBS 洗2次后, 加300L l 无血清培养液, 培养24h; »收集无血清培养细胞上清, 低速离心(200g ) 去除细胞碎片后, 4e 备用。
115 明胶酶谱 ¹根据胶板大小配制一定体积的8%分离胶和5%浓缩胶, 分离胶中加入明胶溶液使明胶终浓度为011%,灌胶及电泳操作与普通SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳相同。º凝胶制好后, 取备用的培养上清(80~100L l) , 与1/2体积的样品缓冲液混合均匀, 大约体积为150L l, 需要特定的上样孔, 上样初始, 以8V/cm
, 图1 样品经改良明胶酶谱染色后所显示的透明带
212 动态明胶酶谱 图2是采用该方法在不同时间点采样, 进行的酶谱分析。测定了给予M MPs 抑制性药物5、10、15h 时间点明胶酶的变化。其中1、3、5条带分别为给药组, 2、4、6条带为对照组。从该图可发现给药组各时间点明胶酶的含量均低于对照组各时间点, 且随着时间的延长, 明胶酶的量也在逐渐增加。
[1]
º
泳至溴酚蓝前沿离分离胶前端约2cm 时, 停止电泳(1~2h) ; »取下凝胶, 移入215%Triton X -100溶液中, 在摇床上洗脱2次(45min/次) , 加入明胶酶缓冲液, 在37e 恒温中孵育12~16h 。¼凝胶用染色液染色4h; 在脱色液中脱色1~2h, 至对照出现明显, 清晰的负染酶带, 用蒸馏水漂洗后观察。
116 结果评价 肿瘤细胞和间质细胞无血清培养上清中通常含有72kD 和92kD 两种明胶酶, 即MMP -2和MMP -9。电泳后负染酶带亮度的强弱和面积大小可以半定量地表征明胶酶的活性大小。负染带面积越大、亮度越大, 表明明胶酶的活性越强; 反之则弱。2 结 果
211 改良明胶酶谱染色后所显示的明胶酶条带 图1是未经饱和硫酸铵沉淀、透析及浓缩直接上样结果。上样量为100L l 所获得的结果, 深蓝色背景上显示清晰可见的透明条带, 说明该条带所代表的酶水解活性是明胶特异性的, 该条带是MMP -2。其他染色的蓝色条带为其他非明胶酶类蛋白质。
图2 不同时间点(5、10、15h) 明胶酶的变化
骞爱荣, 在读博士生。主要从事肿瘤细胞生物学和肿瘤药物学。已发表论文5篇, 参与申请专利2项, 其中1项是国际PCT 专利。
¹国家自然科学基金(编号39989002) 和国家高技术研究发展(863) 计划资助课题(编号2001AA215061); º通信作者
解放军医学杂志2003年3月第28卷第3期M ed J Chin PLA Vol 28No 3M ar 2003
#283#
养液, 尤其是药物筛选时大大节约了实验用药物。»梳齿加宽, 上
3 讨 论
明胶-SDS ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将肿瘤细胞或肿瘤细胞和间质细胞共培养后分泌到培养上清中的明胶酶以及和它们的活性形式按分子量大小分开, 并使之浓缩在小的区带内; 经Triton X -100洗脱SDS 而复性的明胶酶能降解其电泳区带周围掺入到凝胶中的明胶, 蛋白降解区不能被考马斯亮蓝染色; 肿瘤细胞分泌的明胶酶越多, 带的亮度和宽度也越大。用这种方法可以方便地检测肿瘤细胞分泌的明胶酶活性和药物对肿瘤细胞分泌的抑制作用。
作者在摸索的过程中发现传统的明胶酶谱方法费时费力且过程复杂。在传统的明胶酶谱方法[3]基础上进行了改良。本实验方法与传统的方法比较改良处有:¹缩短了制备样品的时间。经典的样品制备要经过80%饱和硫酸铵沉淀, 透析除盐, 聚乙二醇浓缩, 制备样品需4~5天, 而该方法只需2天, 不经过沉淀、透吸、浓缩等过程, 大大缩短了时间。º96孔板代替了培养瓶。传统培养用培养瓶, 加入5ml 培养液, 该方法用96孔板, 只需加200L l 培
231
样量加大, 胶条也相应加厚。传统的梳子上样量仅为10~30L l, 该方法中的梳子上样量可达150L l, 可以提高5倍上样量。
改良的明胶酶谱法在分析药物对肿瘤细胞明胶酶分泌量和活性的影响、分析明胶酶活性抑制因子的作用以及不同侵袭转移能力的细胞系(株) 之间的基质降解活性的比较研究都有非常重要的作用。本方法是抗肿瘤浸润转移研究中一种新的使用方法。
参 考 文 献
Sternli cht MD, Werb Z. How ma trix metalloproteina ses regula te ce ll behav -i or. Ann Rev Cell Dev Bi ol , 2001, 17:463
Egeblad M, Werb Z. New func ti ons for the matrix metalloprotei nas es in ca n -ce r progres sion. Nature Rev Cancer, 2002, 2:161
Klei ner DE, Stetl er -Ste venson WG. Qua nti tati ve zymography detecti on of picogram quanti tie s of gela ti nses . Analytical Biochemis try, 1994, 218:325
(2002-09-20收稿 2002-12-13修回)
(本文编辑 李恩江)
动态监测小儿急性淋巴细胞白血病脑脊液B -2MG
071000 保定 河北省职工医学院附属医院 魏金铠 刘惠哲 田 艳 李小芳 赵振贤 杨一江¹
关键词 急性淋巴细胞白血病; 脑脊液; B 2-MG 中国图书资料分类号 R7331711 资料与方法
对照组:患惊厥性脑病者18例, 男10例, 女8例, 年龄0125~
10岁, 平均6岁。脑压及脑脊液常规、生化检测正常, 除外颅内出血、中枢神经系统肿瘤、感染、自身免疫系统疾病。实验组:8例, 男7例, 女1例, 年龄2~10岁, 平均418岁, 均系ALL 标危型(按1993年北海会议诊断标准) 。每例于诱导缓解期开始即规律鞘注三联药物(阿糖胞苷、甲氨喋呤、氟美松) , 每周1次, 巩固治疗期1次, 髓外白血病防治、早期强化治疗每疗程1次, 以后隔3个月1次, 每次所采集脑脊液均送常规化验及B -2MG 检测, 常规生化均在正常范围。缓解治疗期每6个月一次大剂量MTX 治疗, 其无病存活达3年者5例, 有病存活达3年者1例, 无病存活2年者2例, 3例于存活2年时检测PCR -T CR D 基因重排, 阴性1例, 阳性2例。
采用中国原子能科学研究院提供的宽范围测定盒进行放射免疫法分析, 严格按照说明书进行, 用中国科学院上海原子核研究所日环仪器厂生产的SW -682放疗免疫C 计数器测沉淀计数, 由在线计算机进行数据处理, 按经典放射免疫B/BO%线性方法自动绘制标准曲线, 并得到脑脊液样品浓度。2 结 果
与对照组比较, 实验组在ALL 诱导缓解期脑脊液B 2-MG 明
¹保定市妇幼保健院
显增高(P
峰(2294113? 1118150) ng/ml, 从诱导期第2周便开始逐渐下降, 至巩固期及髓外预防期, 早期强化期差异已无显著性意义(P >0105) 。
ALL 鞘注前后脑脊液B -2M G 与对照组间差异无显著性意义(P >0105) 。实验组脑脊液B -M G 经治疗在鞘注前早期强化及2鞘注后巩固期开始与对照组差异无显著性意义(P >0105) , 巩固期与髓外预防期鞘注后比鞘注前明显下降(P
对小儿ALL 在诱导缓解、巩固治疗、髓外白血病防治及维持强化缓解治疗各阶段分次动态监测脑脊液中B -2MG 表明, 治疗前已有亚临床状态的ALL 患儿中枢浸润, 并在全身及鞘注化疗后增高, 但连续观察随全身及鞘注化疗缓慢下降。总体脑脊液B -M G 2
鞘注前后与对照组差异无显著性意义(P >0105) 。在ALL 巩固期始(即鞘注第6次) 与对照组差异无显著性意义(P >0105) 。这与反复鞘注及全身化疗使白血病病情程度被控制在更低水平, 白血病细胞等有核细胞繁殖呈抑制状态有关, 可能有利于病人的长期生存。
(2002-09-15收稿)
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解放军医学杂志2003年3月第28卷第3期M ed J Chin PLA Vol 28No 3M ar 2003
#简 报#
改良明胶酶谱测定明胶酶活性¹
710032 西安 第四军医大学细胞工程研究中心 骞爱荣 商 澎 陈志南
关键词 明胶酶谱; 基质金属蛋白酶; 电泳; 聚丙烯酰胺凝胶中图分类号 R96512
基质金属蛋白酶(M MPs) 是能降解细胞外基质和基底膜成分的酶家族成员之一。这个蛋白家族包括胶原酶、明胶酶、基质素和
膜型基质金属蛋白酶(M T -M MP) 等5大类。MMPs 家族成员目前已鉴定出28种。M MP 的基因表达水平和酶活性的高低与许多生理或病理过程及其恶性程度相关, 如肿瘤转移、血管浸润、骨质疏松、组织纤维化等, 尤其是明胶酶A 和B(MMP -2, 9) 在肿瘤的转移和血管生成方面起重要的作用[2]。
目前, 测定明胶酶活性的方法多用明胶酶谱法(gelatin zymog -raphy) , 即收集待测样本, 处理后在含有明胶-聚丙烯凝胶中进行SDS -PAGE 。但是, 传统的方法样品处理费时、费事。因此, 从方法学的角度, 寻找简便实用的检测MM Ps 活性的方法有重要的意义。本文介绍一种改良的明胶酶谱方法, 较好地解决了实验中遇到的一些难题, 且简单、实用、结果可靠。尤其是在筛选MM Ps 的抑制剂时, 该方法省时, 省实验药物。1 材料与方法
111 常规仪器和试剂 垂直电泳槽和电泳仪(美国Bi o -Rad 公司) , 图像分析系统(上海复日科技有限公司) , 96孔板(瑞典Nunc 公司) , 培养瓶, CO 2培养箱(德国Heraeus 公司) , 超净工作台, 震荡器等。明胶, Tri ton X -100(购自华美生物技术公司) 。
112 酶谱电泳专用梳子和边条 自制专用梳子和边条的厚度112mm, 齿孔宽度为1313mm, 每个梳子有5个孔。
113 试剂配制 1%明胶溶液; 2@电泳载样缓冲液(5%SDS,2%蔗糖, 012%溴酚蓝, 50mmol/L Tris -HCl, pH 618) ; 电泳缓冲液25mmol/L Tris , 250mmol /L 甘氨酸, pH 813, 011%SDS; 聚丙烯酰胺凝胶电泳贮液:¹30%的丙烯酰胺溶液; º110mol/L Tris -HCl (pH618) ; »115mol/L Tri s -HCl (p H818) ; ¼10%SDS; ½10%过硫酸铵; ¾10%T EM ED; 215%Triton X -100溶液; 明胶酶缓冲液50mmol/L Tri s , 10mmol /L CaCl 2, 200mmol/L NaCl, 1L mol /L ZnCl 2(pH 715) ; 染色液011%考马斯亮蓝R -250; 脱色液甲醇B 水B 冰醋酸=45B 45B 10.
114 样品制备 ¹人成纤维细胞(Fb) 和人肝癌细胞(HHCC) 培养至对数期, 用0125%胰酶消化, 以105/孔的密度接种于96孔板中, 培养24h; º第二天, 弃去培养上清, 用PBS 洗2次后, 加300L l 无血清培养液, 培养24h; »收集无血清培养细胞上清, 低速离心(200g ) 去除细胞碎片后, 4e 备用。
115 明胶酶谱 ¹根据胶板大小配制一定体积的8%分离胶和5%浓缩胶, 分离胶中加入明胶溶液使明胶终浓度为011%,灌胶及电泳操作与普通SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳相同。º凝胶制好后, 取备用的培养上清(80~100L l) , 与1/2体积的样品缓冲液混合均匀, 大约体积为150L l, 需要特定的上样孔, 上样初始, 以8V/cm
, 图1 样品经改良明胶酶谱染色后所显示的透明带
212 动态明胶酶谱 图2是采用该方法在不同时间点采样, 进行的酶谱分析。测定了给予M MPs 抑制性药物5、10、15h 时间点明胶酶的变化。其中1、3、5条带分别为给药组, 2、4、6条带为对照组。从该图可发现给药组各时间点明胶酶的含量均低于对照组各时间点, 且随着时间的延长, 明胶酶的量也在逐渐增加。
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º
泳至溴酚蓝前沿离分离胶前端约2cm 时, 停止电泳(1~2h) ; »取下凝胶, 移入215%Triton X -100溶液中, 在摇床上洗脱2次(45min/次) , 加入明胶酶缓冲液, 在37e 恒温中孵育12~16h 。¼凝胶用染色液染色4h; 在脱色液中脱色1~2h, 至对照出现明显, 清晰的负染酶带, 用蒸馏水漂洗后观察。
116 结果评价 肿瘤细胞和间质细胞无血清培养上清中通常含有72kD 和92kD 两种明胶酶, 即MMP -2和MMP -9。电泳后负染酶带亮度的强弱和面积大小可以半定量地表征明胶酶的活性大小。负染带面积越大、亮度越大, 表明明胶酶的活性越强; 反之则弱。2 结 果
211 改良明胶酶谱染色后所显示的明胶酶条带 图1是未经饱和硫酸铵沉淀、透析及浓缩直接上样结果。上样量为100L l 所获得的结果, 深蓝色背景上显示清晰可见的透明条带, 说明该条带所代表的酶水解活性是明胶特异性的, 该条带是MMP -2。其他染色的蓝色条带为其他非明胶酶类蛋白质。
图2 不同时间点(5、10、15h) 明胶酶的变化
骞爱荣, 在读博士生。主要从事肿瘤细胞生物学和肿瘤药物学。已发表论文5篇, 参与申请专利2项, 其中1项是国际PCT 专利。
¹国家自然科学基金(编号39989002) 和国家高技术研究发展(863) 计划资助课题(编号2001AA215061); º通信作者
解放军医学杂志2003年3月第28卷第3期M ed J Chin PLA Vol 28No 3M ar 2003
#283#
养液, 尤其是药物筛选时大大节约了实验用药物。»梳齿加宽, 上
3 讨 论
明胶-SDS ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将肿瘤细胞或肿瘤细胞和间质细胞共培养后分泌到培养上清中的明胶酶以及和它们的活性形式按分子量大小分开, 并使之浓缩在小的区带内; 经Triton X -100洗脱SDS 而复性的明胶酶能降解其电泳区带周围掺入到凝胶中的明胶, 蛋白降解区不能被考马斯亮蓝染色; 肿瘤细胞分泌的明胶酶越多, 带的亮度和宽度也越大。用这种方法可以方便地检测肿瘤细胞分泌的明胶酶活性和药物对肿瘤细胞分泌的抑制作用。
作者在摸索的过程中发现传统的明胶酶谱方法费时费力且过程复杂。在传统的明胶酶谱方法[3]基础上进行了改良。本实验方法与传统的方法比较改良处有:¹缩短了制备样品的时间。经典的样品制备要经过80%饱和硫酸铵沉淀, 透析除盐, 聚乙二醇浓缩, 制备样品需4~5天, 而该方法只需2天, 不经过沉淀、透吸、浓缩等过程, 大大缩短了时间。º96孔板代替了培养瓶。传统培养用培养瓶, 加入5ml 培养液, 该方法用96孔板, 只需加200L l 培
231
样量加大, 胶条也相应加厚。传统的梳子上样量仅为10~30L l, 该方法中的梳子上样量可达150L l, 可以提高5倍上样量。
改良的明胶酶谱法在分析药物对肿瘤细胞明胶酶分泌量和活性的影响、分析明胶酶活性抑制因子的作用以及不同侵袭转移能力的细胞系(株) 之间的基质降解活性的比较研究都有非常重要的作用。本方法是抗肿瘤浸润转移研究中一种新的使用方法。
参 考 文 献
Sternli cht MD, Werb Z. How ma trix metalloproteina ses regula te ce ll behav -i or. Ann Rev Cell Dev Bi ol , 2001, 17:463
Egeblad M, Werb Z. New func ti ons for the matrix metalloprotei nas es in ca n -ce r progres sion. Nature Rev Cancer, 2002, 2:161
Klei ner DE, Stetl er -Ste venson WG. Qua nti tati ve zymography detecti on of picogram quanti tie s of gela ti nses . Analytical Biochemis try, 1994, 218:325
(2002-09-20收稿 2002-12-13修回)
(本文编辑 李恩江)
动态监测小儿急性淋巴细胞白血病脑脊液B -2MG
071000 保定 河北省职工医学院附属医院 魏金铠 刘惠哲 田 艳 李小芳 赵振贤 杨一江¹
关键词 急性淋巴细胞白血病; 脑脊液; B 2-MG 中国图书资料分类号 R7331711 资料与方法
对照组:患惊厥性脑病者18例, 男10例, 女8例, 年龄0125~
10岁, 平均6岁。脑压及脑脊液常规、生化检测正常, 除外颅内出血、中枢神经系统肿瘤、感染、自身免疫系统疾病。实验组:8例, 男7例, 女1例, 年龄2~10岁, 平均418岁, 均系ALL 标危型(按1993年北海会议诊断标准) 。每例于诱导缓解期开始即规律鞘注三联药物(阿糖胞苷、甲氨喋呤、氟美松) , 每周1次, 巩固治疗期1次, 髓外白血病防治、早期强化治疗每疗程1次, 以后隔3个月1次, 每次所采集脑脊液均送常规化验及B -2MG 检测, 常规生化均在正常范围。缓解治疗期每6个月一次大剂量MTX 治疗, 其无病存活达3年者5例, 有病存活达3年者1例, 无病存活2年者2例, 3例于存活2年时检测PCR -T CR D 基因重排, 阴性1例, 阳性2例。
采用中国原子能科学研究院提供的宽范围测定盒进行放射免疫法分析, 严格按照说明书进行, 用中国科学院上海原子核研究所日环仪器厂生产的SW -682放疗免疫C 计数器测沉淀计数, 由在线计算机进行数据处理, 按经典放射免疫B/BO%线性方法自动绘制标准曲线, 并得到脑脊液样品浓度。2 结 果
与对照组比较, 实验组在ALL 诱导缓解期脑脊液B 2-MG 明
¹保定市妇幼保健院
显增高(P
峰(2294113? 1118150) ng/ml, 从诱导期第2周便开始逐渐下降, 至巩固期及髓外预防期, 早期强化期差异已无显著性意义(P >0105) 。
ALL 鞘注前后脑脊液B -2M G 与对照组间差异无显著性意义(P >0105) 。实验组脑脊液B -M G 经治疗在鞘注前早期强化及2鞘注后巩固期开始与对照组差异无显著性意义(P >0105) , 巩固期与髓外预防期鞘注后比鞘注前明显下降(P
对小儿ALL 在诱导缓解、巩固治疗、髓外白血病防治及维持强化缓解治疗各阶段分次动态监测脑脊液中B -2MG 表明, 治疗前已有亚临床状态的ALL 患儿中枢浸润, 并在全身及鞘注化疗后增高, 但连续观察随全身及鞘注化疗缓慢下降。总体脑脊液B -M G 2
鞘注前后与对照组差异无显著性意义(P >0105) 。在ALL 巩固期始(即鞘注第6次) 与对照组差异无显著性意义(P >0105) 。这与反复鞘注及全身化疗使白血病病情程度被控制在更低水平, 白血病细胞等有核细胞繁殖呈抑制状态有关, 可能有利于病人的长期生存。
(2002-09-15收稿)