生物工
程
Vol. 35, No. 02, 2014
金丝小枣枣泥酵素发酵工艺的研究
董
洁1，夏敏敏1，王成忠1，*，孙曙光2，孙久玉1
（1. 山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南250353；
2. 山东省食品发酵工业研究设计院，山东济南250013）
摘
要：以金丝小枣枣泥为主要原料，进行金丝小枣枣泥发酵工艺的研究。采用单因素实验法和正交设计法对酵母菌
和乳酸菌的接种量、发酵培养基碳氮比、发酵温度、时间等工艺条件进行了研究。确定出最佳的工艺参数为：30℃条件
下，发酵培养基中碳氮比为6∶1，接种0.1%酵母菌，保证充分溶氧，发酵12h ，然后在37℃条件下，接种0.5%乳酸菌发酵剂，静置发酵28h ，最后控制温度为6~8℃，静置24h ，进行后酵，使发酵液产香。关键词：金丝小枣枣泥酵素，发酵，超氧化物歧化酶（SOD ）
Study on the fermentation techniques of golen silk jujube paste leaven
DONG Jie 1，XIA Min-min 1，WANG Cheng-zhong 1，*，SUN Shu-guang 2，SUN Jiu-yu 1
Shandong Institute of Light Industry ，Ji ’nan 250353，China ；（1.Department of Food and Biology Engineering ，
2.Shandong Food Fermentation Research &Design Center ，Ji ’nan 250013，China ）Abstract ：In this experiment ，golden silk jujube paste leaven fermentation process was studied by golden silk jujube paste as main materials. The single factor experiment method and the orthogonal design were applied
for research on the yeast and Lactobacillus inoculation quantity ，the ratio of carbon to nitrogen in the fermentation culture medium ，fermentation time and temperature and other process conditions. The optimum processing parameters were as follows ：fermentation temperature 30℃，ratio of carbon to nitrogen was 6to 1in fermentation medium ，0.1%yeast of inoculation quality ，fully dissolved oxygen was guaranteed ，fermented for 12h ，then under the conditions of 37℃，add 0.5%Lactobacillus of inoculation amount ，fermentation time 28h ，finally controlling temperature was 6~8℃for 24h to make fragrance in fermentation broth. Key words ：golen silk paste jujube leaven ；fermentation ；superoxide dismutase （SOD ）
文献标识码：A 文章编号：1002-0306（2014）02-0197-05中图分类号：TS201.1
其资源非常丰富，总量枣在我国有悠久的历史，[1]
占世界资源的90%以上，历来被人们视为滋补佳品，有养血安神、养胃健脾之功效，是一种富含药用[2]汁多核小，和营养价值的果品[3]。金丝小枣皮薄肉厚，
[4]
香甜可口，营养十分丰富。据分析，金丝小枣中富含糖类、维生素、粗纤维、氨基酸、矿物质，还含有生物
[5]
碱、皂甙、黄酮等化学成分。金丝小枣干枣经过复水、打浆去皮去核、提汁后所剩的枣泥通常作为废弃物处理掉，既浪费掉了资源，提高了原料成本，又造成环境污染，如果将其进一步加工成为枣泥酵素，其增值幅度巨大。
酵素，也称为“酶”，是酵母分泌的“代谢产物”，是一种生物催化剂，大多数酵素由蛋白质构成。酵素几乎可以参与所有的身体活动，在酵素的参与下人体能维持正常的机体免疫、新陈代谢、修复组织等生
[6]
理功能。目前，国内对金丝小枣酵素的介绍和认知还几乎是空白。从金丝小枣枣泥中制备的金丝小枣酵素含有丰富的超氧化物歧化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、矿物质以及酚类、维生素、黄酮类等次生代
谢产物，具有体内环境、分解、抗炎、抗菌、净化血液
[7]
等作用。
本文以生产金丝小枣浓缩枣汁过程中产生的枣泥为原料，通过复合酶酶解、浓缩、发酵、喷雾干燥等步骤，制成金丝小枣枣泥酵素成品，变废为宝，提高了金丝小枣的利用率。金丝小枣枣泥酵素作为市场新型的食品及化妆品添加剂能够明显的提高产品品质，因此其应用前景非常广阔。
1
1.1
材料与方法
材料与仪器
金丝小枣枣泥山东鼎力枣业食品集团有限公司；乳酸菌发酵剂、葡萄酒酵母市售。
CR22E 型冷冻离心机日本日立公司；旋转蒸发仪上海申科生物科技有限公司；B-191微型喷雾干燥机瑞士B üchi 公司；血球计数板上海市求精生化试剂仪器有限公司；A001-150型超氧化物歧化酶试剂盒南京建成生物工程研究所。
1.2
1.2.1
实验方法
工艺流程
酵母菌、乳酸菌
↓
枣泥→酶解→调配，灭菌→接种→发酵→喷雾干燥→枣
2014年第2期
收稿日期：2013－05－09*通讯联系人
作者简介：董洁（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品资源开发。
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泥酵素。
1.2. 2操作要点
β-葡聚糖1.2.2.1酶解液的制备采用木聚糖酶、
酶和纤维素酶进行酶解[8]。复合酶酶解枣泥的工艺为：枣泥∶水=1∶2，pH 为5.5，温度为55℃，酶解时间为180min ，木聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的加酶量都为500U/g，酶解后枣泥酶解率高达67.78%，可溶性固形物含量达6.59%。
1.2.2.2发酵基质的制备将酶解液用旋转蒸发仪浓缩到可溶性固形物含量为20%，适量补加营养物质：酵母膏0.2%、硫酸铵1.9%、氯化锌0.1%、硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.6%[9]，发酵基质灭菌。
1.2.2.3接种和发酵接种0.1%酵母菌，30℃条件下，保证充分溶氧，发酵12h ，接种0.5%乳酸菌发酵剂，然后在37℃条件下，静置发酵28h ，最后维持温度为6~8℃，静置24h ，进行后酵，使发酵液产香。1.2.2.4喷雾干燥将发酵液可溶性固形物浓缩到25%，通过喷雾干燥得到水分含量小于5%的金丝小枣枣泥酵素粉。喷雾干燥条件：进口温度控制在160℃，出口温度控制在65℃[10]。
1.2.3SOD 的提取取3.0g 湿菌体悬于9mL 50mol/L、pH 为8.3的磷酸缓冲液中，使用超声波破碎细胞，于高速冷冻离心机中以8000r/min离心10min ，弃去沉淀，上清液即为含有SOD 的粗酶液[11]。1.2.4
测定方法
1.2.4.1超氧化物歧化酶（SOD ）的测定超氧化物歧化酶试剂盒法。
1.2.4.2酵母菌的测定方法血球计数板法。1.2.4.3乳酸菌的测定方法GB 4789.35-2010。1.2.4.4酸度的测定方法GB/T12456-2008。
1.2.4.5生物量的测定取一定体积的发酵液于高速冷冻离心机中以8000r/min离心10min ，弃去上清液，测定沉淀的质量。
1.2.4.6还原糖的测定DNS 法。
1.2.4.7水分的测定GB 5009.3-2010。1.2.5酵母菌单独发酵
1.2.5.1发酵温度对酵母菌生长数量及酵母产SOD 影响发酵温度影响微生物的生长情况和代谢产物的生成，因此对发酵液中的酵母含量和菌液中的活性成分SOD 具有很大的影响。在保证菌种发酵液充分溶氧下，酵母接种量为0.1%，分别控制温度为25、27、30、33、35℃进行发酵，发酵时间为18h ，发酵后测定酵母数量和SOD 的活性，确定最适发酵温度。
1.2.5.2酵母菌接种量对酵母菌生长数量及酵母产SOD 影响将发酵温度控制在30℃，在保证发酵液充分溶氧下，分别接种0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%的酵母量进行发酵，发酵时间为18h ，发酵结束后测定其酵母数量和SOD 的活性，确定最适酵母菌接种量。
1.2.5.3发酵时间对酵母菌生长数量及酵母产SOD 影响发酵时间影响着酵母的生长量及SOD 的活性，在保证发酵液充分溶氧下，发酵温度为30℃，将发酵时间设置为6、12、18、24、36h ，发酵结束后测其
Table 1水平123
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酵母数量和SOD 的活性，确定最适发酵时间。
1.2.5.4培养基中不同碳氮比对酵母菌生长个数及SOD 影响在保证发酵液充分溶氧下，接种量为0.1%，发酵温度为28℃，发酵18h ，以枣泥酶解液的葡萄糖为碳源、硫酸铵和酵母膏为氮源配制不同碳氮比（3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1）的培养基，考察不同碳氮比对酵母菌生长数量及酵母菌产SOD 影响。
1.2.5.5正交实验酵母菌发酵受到多个因素的影响[12]，根据单因素实验结果，酵母菌接种量达到0.1%时，随着接种量继续的增大，酵母菌产SOD 活性基本不改变，酵母数量也基本不变。正交实验以发酵温度、发酵时间、培养基碳氮比为三个因素，以酵母数量和SOD 活性为评价指标，确定酵母菌发酵酶解液的最佳工艺条件。选择3因素3水平，设计正交实验，正交实验因素与水平设计见表1。
4
表1L （实验因素水平表93）
4
Factors and Levels of L （93）orthogonal experiment
因素
A 发酵温度（℃）B 发酵时间（h ）C 培养基碳氮比
253035
121824
4∶15∶16∶1
1.2.6乳酸菌单独发酵
1.2.6.1发酵时间对乳酸菌活菌数及可滴定酸度的影响为确定乳酸菌发酵剂在枣泥酶解液发酵基质中的最佳发酵时间，在接种量0.5%、发酵温度37℃的条件下，将发酵时间设置为5、10、15、20、25、30、35、40h ，发酵结束后测定在酶解液发酵基质中的可滴定酸度和乳酸菌活菌数。
1.2.6.2接种量对乳酸活菌数及pH 的影响为确定乳酸菌发酵剂在枣泥酶解液发酵基质中的最佳接种量，在发酵时间为20h 时，发酵温度37℃的条件下，将接种量设置为0.5%、1%、1.5%、2%，发酵结束后测定在酶解液发酵基质中的乳酸菌活菌数和pH 。1.2.7复合发酵在发酵时，由于乳酸菌利用发酵液中的营养成分比较快，会很快消耗掉营养物质[13-14]
再接种乳酸菌。在30℃时，保证发所以先接种酵母，
酵液充分溶氧下，先接种酵母，培养时间分别设定为6、12、18h 后再37℃接种乳酸菌，总发酵时间设定为40h 。测量生物量、酵母数量、乳酸菌活菌数、SOD 活性和还原糖含量，确定最佳接种乳酸菌的时间。
2
2.1
结果与分析
酵母菌单独发酵
发酵温度的确定
从图1可以得出，发酵温度
2.1.1
为25℃时发酵慢，随着温度升高，发酵加快，但当发酵温度超过30℃时，发酵液里的酵母数量和SOD 的活性随之降低，所以发酵温度控制在30℃，酵母的数量和SOD 的活性较高，故实验发酵温度确定为30℃。2.1.2酵母菌接种量的确定从图2可以得出，不同接种量对酵母发酵的影响在0.05%和0.1%之间的变化较明显，接种量为0.1%时酵母数量和SOD 活性分
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酵母菌数量2.00250SOD 活性1.95245
1.902401.852351.802301.752251.702201.652151.602101.552051.50200
[***********]33343536
温度（℃）
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0.1%，氯化锌0.1%、硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.3%。
S O D 活性（U /g ）
酵母菌数量（×108C F U /m L ）
表2碳氮比对酵母菌生物量和SOD 活性影响
Table 2Effect of ratio of carbon to nitrogen on yeast biomass
and SOD activity C ∶N 3∶14∶15∶16∶17∶18∶1
生物量（g ）酵母数量（×108CFU/mL）SOD 活性（U/g）4.785.025.465.495.335.31
1.461.541.982.001.791.39
194.19200.23210.34252.12230.14225.67
Fig.1
酵母菌数量（×108C F U /m L ）
2.01.91.81.71.61.5
图1温度对酵母菌发酵的影响
Effect of temperature on yeast fermentation
260
S O D 活性（U /g ）255250245
酵母菌数量
SOD 活性
注：生物量包括酵母菌湿菌体和杂质。
2.2酵母菌最佳发酵条件的确定
240235230
0.05
0.100.150.200.25
酵母菌接种量（%）
0.30
Fig.2
图2酵母菌接种量对酵母菌发酵的影响
Effect of inoculation quality yeast on yeast fermentation
对正交表（表3）进行极差分析，对酵母数量而言，极差反映出影响酵母生长数量的因素排列顺序为C ＞A ＞B ，即培养基中碳氮比对酵母生长量有很大的影响，是关键控制因素，其次为发酵温度，最佳配方为C 3A 2B 2。对SOD 活性而言，极差反映出影响酵母产SOD 的活性的因素排列顺序为C ＞A ＞B ，并且最佳配方也为C 3A 2B 2。因此，确定最佳配方为C 3A 2B 2，
发酵时间为18h ，培养基碳氮比即发酵温度为30℃，
为6∶1。
别达到最大值1.98×108CFU/mL和250.03U/g，当接种量超过0.1%时，酵母菌数量和SOD 活性基本不变，故酵母菌最适接种量确定为0.1%。
2.1.3发酵时间的确定从图3可以得出，随着发酵时间的增加，发酵液中酵母菌个数不断增加，在18h 之后增长缓慢，在18h 时SOD 活性为250.04U/g。根据图3，可以将最佳发酵时间设定为18~24h。
酵母菌数量（×108C F U /m L ）
2.01.81.61.41.21.00
5
10
15202530
发酵时间（h ）
35
酵母菌数量
SOD 活性
2.3乳酸菌单独发酵
2.3.1发酵时间的确定结果表明（图4），在枣泥酶解液发酵基质中接种乳酸菌后，随着发酵时间的增加，乳酸菌活菌数和可滴定酸度不断增大，在20h 乳酸活菌数为8.5×108CFU/mL，此时乳酸菌活菌数达到最大值，20h 后乳酸菌活菌数逐渐降低。故发酵时间以20h 为宜。
0.500.450.400.350.300.250.200.150.100.05
乳酸菌活菌数（×108C F U /m L ）9876
可滴定酸度
乳酸菌活菌数
250
S O D 活性（U /g ）[**************]
40
可滴定酸度（%）
54321
010
2030
发酵时间（h ）
40
图3发酵时间对酵母发酵的影响
Fig.3Effect of fermentation time yeast on yeast fermentation 2.1.4酵母菌发酵培养基中碳氮比的确定由表2可以得出，在碳氮比为6∶1时，SOD 活性达到最大值；生物量和酵母数量也达到最大值，确定该酵母适宜的碳氮比为6∶1。根据发酵时间对酵母菌生长数量及SOD 影响（图3）的实验结果，在第24h 时，酵母菌数量和SOD 活性基本不变，所以在24h 时判定发酵结束，酵母菌几乎不生长，此时酵母利用50%的葡萄糖，在保证碳氮比为6∶1，根据各个培养基含碳和氮的含量计算，最佳培养基的配方为：硫酸铵0.95%，酵母膏
图4
乳酸菌发酵剂发酵过程中产酸及乳酸菌活菌数的变化
Fig.4Changes of producing acid and viable count of
lactobacillus in the fermentation process of
lactic acid bacteria starte
2.3.2接种量的确定结果表明（图5），在枣泥酶解液发酵基质中接种乳酸菌发酵剂后，当接种量超过0.5%，接种量为1%、1.5%和2%的发酵基质中的乳酸菌活菌数和pH 的变化梯度并不明显，而接种量为0.5%的发酵基质中乳酸活菌数的变化与空白和接种量在0.1%相比较明显，考虑到生产成本的因素，最佳接种量选择0.5%。
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4
正交实验结果表3L （93）4
Table 3Results of L （93）orthogonal experiment
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实验号123456789K 1K 2K 3K 1′K 2′K 3′R R ′影响因素顺序最优组合
A 1112223335.485.695.41729.27744.49733.520.2815.22
B 1231231235.485.645.46729.24743.68734.360.1814.44C>A>BC 3A 2B 2
C 1232313125.265.595.73712.99748.97751.090.4738.10
酵母菌数量（×108CFU/mL）
1.731.851.901.932.011.751.821.781.81
SOD 活性（U/g）
231.63248.25249.39250.36254.45239.68247.25240.98245.29
Table 4
（h ）接种时间
61218
10可滴定酸度（%）
86420
0.0
0.5
表4接种乳酸菌的时间对发酵液各指标的影响
Effect of lactobacillus inoculation time on the index of fermentation broth 酵母菌数量（×108CFU/mL）
1.251.881.98
乳酸菌活菌数（CFU/mL）
8.32×1088.00×1086.23×108
SOD 活性（U/g）
200245249
还原糖含量（%）
4.384.255.01
生物量（g ）5.685.996.01
2.5
43
乳酸菌活菌数pH
金丝小枣枣泥酵素产品质量标准
21
色泽：浅棕黄色、色泽均匀；气味：枣香味，有发酵香气；酸度：酸甜适口、持久不刺激；组织形态：松散无结块；水分（百分含量）≤5%；超氧化物歧化酶（SOD ）≥（485±5）U/g；乳酸菌活菌数≥（5.6±0.5）×108CFU/g。
p H
3结论
1.0接种量（%）
1.52.0
图5接种量对乳酸菌发酵液pH 和活菌数的影响
Fig.5Effect of inoculation quality on lactobacillus fermentation
broth pH and viable bacteria counts
2.4复合发酵
结果见表4，当培养酵母菌6h 后再接种乳酸菌，发酵液中乳酸菌活菌含量最高，但是酵母数量和SOD 活性比较低；当培养酵母菌12h 后再接种乳酸菌时，发酵液中乳酸菌活菌含量、SOD 活性和酵母数量比较高；当培养酵母菌18h 后再接种乳酸菌时，虽然酵母数量和SOD 活性最高，但是发酵液中乳酸菌活菌数比较低，综合各个因素，乳酸菌最佳接种时间确定为培养酵母菌12h 后。
本项目以生产金丝小枣浓缩枣汁过程中废弃的枣泥为原料，采用酵母菌和乳酸菌进行了复合发酵。通过实验研究得到一条金丝小枣枣泥发酵产酶的工艺，确定了复合发酵的过程中的工艺参数：30℃条件下，酵母菌发酵12h ，然后在37℃条件下，乳酸菌发酵28h ，低温后酵24h 。今后的研究中还可以利用不同类别的酵母菌和乳酸菌以及其他种类的菌种进行发酵，例如红曲霉、黑曲霉等，产生其他酶类。根据本研究，还可以将其他枣类浓缩枣汁过程中废弃的枣泥制备枣泥酵素，得到资源的充分利用。
参考文献
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（下转第205页）
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Y ：C S 得率（%）
2420.7517.514.25111∶7
1.40
Vol. 35, No. 02, 2014
3结论
1.301∶6
1.252∶11B ：酶添加量（g/L）料液比（g/mL）C ：1∶51.20
2∶131.35
图7酶添加量、料液比及其交互作用对CS 的响应曲面
Fig.7Influence of enzyme addition, ratio of raw material to NaOH and their interactions on the response surface of
the CS yield rate
采用超声波辅助碱-酶法提以鸡胸软骨为原料，
取CS 。通过可见光谱扫描确定CS 的最大波长为526nm 。通过单因素实验确定CS 的最佳提取工艺条件：即超声时间30min ，碱浓度3%，酶添加量1.3g/L，料液比1∶6（g/mL）为最优条件。通过响应曲面法优化CS 的提取工艺条件：即碱浓度4%，酶添加量1.4g/L，料液比1000∶5923（g/mL）的数据结果显著，其条件下CS 的得率为23.94%。采用可见光谱检测将样品与标准品进行对照，确定提取物为CS 。
参考文献
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2.3验证实验结果分析
经过验证采用响应曲面法优化后的工艺提取CS ，
实验得知工艺条件：碱浓度为4%、酶添加量为1.4g/L、料液比为1000∶5923（g/mL），CS 得率为23.94%。
2.4CS 的定性实验结果与分析
2.0001.625A b s
1.2500.8750.500
400.00
样品标品
526. 00
450.00
500.00波长（nm ）
550.00600.00
Fig.8
图8CS 标准品和样品吸收光谱
Absorption spectrum of the CS standards and samples
由图8可见，CS 样品和CS 标准品均在波长526nm 处有较稳定的吸收峰，且样品与标品的出峰位置及峰形一致，可确定提取物中含有CS 。
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第200页）
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2014年第2期
生物工
程
Vol. 35, No. 02, 2014
金丝小枣枣泥酵素发酵工艺的研究
董
洁1，夏敏敏1，王成忠1，*，孙曙光2，孙久玉1
（1. 山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南250353；
2. 山东省食品发酵工业研究设计院，山东济南250013）
摘
要：以金丝小枣枣泥为主要原料，进行金丝小枣枣泥发酵工艺的研究。采用单因素实验法和正交设计法对酵母菌
和乳酸菌的接种量、发酵培养基碳氮比、发酵温度、时间等工艺条件进行了研究。确定出最佳的工艺参数为：30℃条件
下，发酵培养基中碳氮比为6∶1，接种0.1%酵母菌，保证充分溶氧，发酵12h ，然后在37℃条件下，接种0.5%乳酸菌发酵剂，静置发酵28h ，最后控制温度为6~8℃，静置24h ，进行后酵，使发酵液产香。关键词：金丝小枣枣泥酵素，发酵，超氧化物歧化酶（SOD ）
Study on the fermentation techniques of golen silk jujube paste leaven
DONG Jie 1，XIA Min-min 1，WANG Cheng-zhong 1，*，SUN Shu-guang 2，SUN Jiu-yu 1
Shandong Institute of Light Industry ，Ji ’nan 250353，China ；（1.Department of Food and Biology Engineering ，
2.Shandong Food Fermentation Research &Design Center ，Ji ’nan 250013，China ）Abstract ：In this experiment ，golden silk jujube paste leaven fermentation process was studied by golden silk jujube paste as main materials. The single factor experiment method and the orthogonal design were applied
for research on the yeast and Lactobacillus inoculation quantity ，the ratio of carbon to nitrogen in the fermentation culture medium ，fermentation time and temperature and other process conditions. The optimum processing parameters were as follows ：fermentation temperature 30℃，ratio of carbon to nitrogen was 6to 1in fermentation medium ，0.1%yeast of inoculation quality ，fully dissolved oxygen was guaranteed ，fermented for 12h ，then under the conditions of 37℃，add 0.5%Lactobacillus of inoculation amount ，fermentation time 28h ，finally controlling temperature was 6~8℃for 24h to make fragrance in fermentation broth. Key words ：golen silk paste jujube leaven ；fermentation ；superoxide dismutase （SOD ）
文献标识码：A 文章编号：1002-0306（2014）02-0197-05中图分类号：TS201.1
其资源非常丰富，总量枣在我国有悠久的历史，[1]
占世界资源的90%以上，历来被人们视为滋补佳品，有养血安神、养胃健脾之功效，是一种富含药用[2]汁多核小，和营养价值的果品[3]。金丝小枣皮薄肉厚，
[4]
香甜可口，营养十分丰富。据分析，金丝小枣中富含糖类、维生素、粗纤维、氨基酸、矿物质，还含有生物
[5]
碱、皂甙、黄酮等化学成分。金丝小枣干枣经过复水、打浆去皮去核、提汁后所剩的枣泥通常作为废弃物处理掉，既浪费掉了资源，提高了原料成本，又造成环境污染，如果将其进一步加工成为枣泥酵素，其增值幅度巨大。
酵素，也称为“酶”，是酵母分泌的“代谢产物”，是一种生物催化剂，大多数酵素由蛋白质构成。酵素几乎可以参与所有的身体活动，在酵素的参与下人体能维持正常的机体免疫、新陈代谢、修复组织等生
[6]
理功能。目前，国内对金丝小枣酵素的介绍和认知还几乎是空白。从金丝小枣枣泥中制备的金丝小枣酵素含有丰富的超氧化物歧化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、矿物质以及酚类、维生素、黄酮类等次生代
谢产物，具有体内环境、分解、抗炎、抗菌、净化血液
[7]
等作用。
本文以生产金丝小枣浓缩枣汁过程中产生的枣泥为原料，通过复合酶酶解、浓缩、发酵、喷雾干燥等步骤，制成金丝小枣枣泥酵素成品，变废为宝，提高了金丝小枣的利用率。金丝小枣枣泥酵素作为市场新型的食品及化妆品添加剂能够明显的提高产品品质，因此其应用前景非常广阔。
1
1.1
材料与方法
材料与仪器
金丝小枣枣泥山东鼎力枣业食品集团有限公司；乳酸菌发酵剂、葡萄酒酵母市售。
CR22E 型冷冻离心机日本日立公司；旋转蒸发仪上海申科生物科技有限公司；B-191微型喷雾干燥机瑞士B üchi 公司；血球计数板上海市求精生化试剂仪器有限公司；A001-150型超氧化物歧化酶试剂盒南京建成生物工程研究所。
1.2
1.2.1
实验方法
工艺流程
酵母菌、乳酸菌
↓
枣泥→酶解→调配，灭菌→接种→发酵→喷雾干燥→枣
2014年第2期
收稿日期：2013－05－09*通讯联系人
作者简介：董洁（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品资源开发。
Science and Technology of Food Industry
泥酵素。
1.2. 2操作要点
β-葡聚糖1.2.2.1酶解液的制备采用木聚糖酶、
酶和纤维素酶进行酶解[8]。复合酶酶解枣泥的工艺为：枣泥∶水=1∶2，pH 为5.5，温度为55℃，酶解时间为180min ，木聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的加酶量都为500U/g，酶解后枣泥酶解率高达67.78%，可溶性固形物含量达6.59%。
1.2.2.2发酵基质的制备将酶解液用旋转蒸发仪浓缩到可溶性固形物含量为20%，适量补加营养物质：酵母膏0.2%、硫酸铵1.9%、氯化锌0.1%、硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.6%[9]，发酵基质灭菌。
1.2.2.3接种和发酵接种0.1%酵母菌，30℃条件下，保证充分溶氧，发酵12h ，接种0.5%乳酸菌发酵剂，然后在37℃条件下，静置发酵28h ，最后维持温度为6~8℃，静置24h ，进行后酵，使发酵液产香。1.2.2.4喷雾干燥将发酵液可溶性固形物浓缩到25%，通过喷雾干燥得到水分含量小于5%的金丝小枣枣泥酵素粉。喷雾干燥条件：进口温度控制在160℃，出口温度控制在65℃[10]。
1.2.3SOD 的提取取3.0g 湿菌体悬于9mL 50mol/L、pH 为8.3的磷酸缓冲液中，使用超声波破碎细胞，于高速冷冻离心机中以8000r/min离心10min ，弃去沉淀，上清液即为含有SOD 的粗酶液[11]。1.2.4
测定方法
1.2.4.1超氧化物歧化酶（SOD ）的测定超氧化物歧化酶试剂盒法。
1.2.4.2酵母菌的测定方法血球计数板法。1.2.4.3乳酸菌的测定方法GB 4789.35-2010。1.2.4.4酸度的测定方法GB/T12456-2008。
1.2.4.5生物量的测定取一定体积的发酵液于高速冷冻离心机中以8000r/min离心10min ，弃去上清液，测定沉淀的质量。
1.2.4.6还原糖的测定DNS 法。
1.2.4.7水分的测定GB 5009.3-2010。1.2.5酵母菌单独发酵
1.2.5.1发酵温度对酵母菌生长数量及酵母产SOD 影响发酵温度影响微生物的生长情况和代谢产物的生成，因此对发酵液中的酵母含量和菌液中的活性成分SOD 具有很大的影响。在保证菌种发酵液充分溶氧下，酵母接种量为0.1%，分别控制温度为25、27、30、33、35℃进行发酵，发酵时间为18h ，发酵后测定酵母数量和SOD 的活性，确定最适发酵温度。
1.2.5.2酵母菌接种量对酵母菌生长数量及酵母产SOD 影响将发酵温度控制在30℃，在保证发酵液充分溶氧下，分别接种0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%的酵母量进行发酵，发酵时间为18h ，发酵结束后测定其酵母数量和SOD 的活性，确定最适酵母菌接种量。
1.2.5.3发酵时间对酵母菌生长数量及酵母产SOD 影响发酵时间影响着酵母的生长量及SOD 的活性，在保证发酵液充分溶氧下，发酵温度为30℃，将发酵时间设置为6、12、18、24、36h ，发酵结束后测其
Table 1水平123
生物工
程
酵母数量和SOD 的活性，确定最适发酵时间。
1.2.5.4培养基中不同碳氮比对酵母菌生长个数及SOD 影响在保证发酵液充分溶氧下，接种量为0.1%，发酵温度为28℃，发酵18h ，以枣泥酶解液的葡萄糖为碳源、硫酸铵和酵母膏为氮源配制不同碳氮比（3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1）的培养基，考察不同碳氮比对酵母菌生长数量及酵母菌产SOD 影响。
1.2.5.5正交实验酵母菌发酵受到多个因素的影响[12]，根据单因素实验结果，酵母菌接种量达到0.1%时，随着接种量继续的增大，酵母菌产SOD 活性基本不改变，酵母数量也基本不变。正交实验以发酵温度、发酵时间、培养基碳氮比为三个因素，以酵母数量和SOD 活性为评价指标，确定酵母菌发酵酶解液的最佳工艺条件。选择3因素3水平，设计正交实验，正交实验因素与水平设计见表1。
4
表1L （实验因素水平表93）
4
Factors and Levels of L （93）orthogonal experiment
因素
A 发酵温度（℃）B 发酵时间（h ）C 培养基碳氮比
253035
121824
4∶15∶16∶1
1.2.6乳酸菌单独发酵
1.2.6.1发酵时间对乳酸菌活菌数及可滴定酸度的影响为确定乳酸菌发酵剂在枣泥酶解液发酵基质中的最佳发酵时间，在接种量0.5%、发酵温度37℃的条件下，将发酵时间设置为5、10、15、20、25、30、35、40h ，发酵结束后测定在酶解液发酵基质中的可滴定酸度和乳酸菌活菌数。
1.2.6.2接种量对乳酸活菌数及pH 的影响为确定乳酸菌发酵剂在枣泥酶解液发酵基质中的最佳接种量，在发酵时间为20h 时，发酵温度37℃的条件下，将接种量设置为0.5%、1%、1.5%、2%，发酵结束后测定在酶解液发酵基质中的乳酸菌活菌数和pH 。1.2.7复合发酵在发酵时，由于乳酸菌利用发酵液中的营养成分比较快，会很快消耗掉营养物质[13-14]
再接种乳酸菌。在30℃时，保证发所以先接种酵母，
酵液充分溶氧下，先接种酵母，培养时间分别设定为6、12、18h 后再37℃接种乳酸菌，总发酵时间设定为40h 。测量生物量、酵母数量、乳酸菌活菌数、SOD 活性和还原糖含量，确定最佳接种乳酸菌的时间。
2
2.1
结果与分析
酵母菌单独发酵
发酵温度的确定
从图1可以得出，发酵温度
2.1.1
为25℃时发酵慢，随着温度升高，发酵加快，但当发酵温度超过30℃时，发酵液里的酵母数量和SOD 的活性随之降低，所以发酵温度控制在30℃，酵母的数量和SOD 的活性较高，故实验发酵温度确定为30℃。2.1.2酵母菌接种量的确定从图2可以得出，不同接种量对酵母发酵的影响在0.05%和0.1%之间的变化较明显，接种量为0.1%时酵母数量和SOD 活性分
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酵母菌数量2.00250SOD 活性1.95245
1.902401.852351.802301.752251.702201.652151.602101.552051.50200
[***********]33343536
温度（℃）
Vol. 35, No. 02, 2014
0.1%，氯化锌0.1%、硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.3%。
S O D 活性（U /g ）
酵母菌数量（×108C F U /m L ）
表2碳氮比对酵母菌生物量和SOD 活性影响
Table 2Effect of ratio of carbon to nitrogen on yeast biomass
and SOD activity C ∶N 3∶14∶15∶16∶17∶18∶1
生物量（g ）酵母数量（×108CFU/mL）SOD 活性（U/g）4.785.025.465.495.335.31
1.461.541.982.001.791.39
194.19200.23210.34252.12230.14225.67
Fig.1
酵母菌数量（×108C F U /m L ）
2.01.91.81.71.61.5
图1温度对酵母菌发酵的影响
Effect of temperature on yeast fermentation
260
S O D 活性（U /g ）255250245
酵母菌数量
SOD 活性
注：生物量包括酵母菌湿菌体和杂质。
2.2酵母菌最佳发酵条件的确定
240235230
0.05
0.100.150.200.25
酵母菌接种量（%）
0.30
Fig.2
图2酵母菌接种量对酵母菌发酵的影响
Effect of inoculation quality yeast on yeast fermentation
对正交表（表3）进行极差分析，对酵母数量而言，极差反映出影响酵母生长数量的因素排列顺序为C ＞A ＞B ，即培养基中碳氮比对酵母生长量有很大的影响，是关键控制因素，其次为发酵温度，最佳配方为C 3A 2B 2。对SOD 活性而言，极差反映出影响酵母产SOD 的活性的因素排列顺序为C ＞A ＞B ，并且最佳配方也为C 3A 2B 2。因此，确定最佳配方为C 3A 2B 2，
发酵时间为18h ，培养基碳氮比即发酵温度为30℃，
为6∶1。
别达到最大值1.98×108CFU/mL和250.03U/g，当接种量超过0.1%时，酵母菌数量和SOD 活性基本不变，故酵母菌最适接种量确定为0.1%。
2.1.3发酵时间的确定从图3可以得出，随着发酵时间的增加，发酵液中酵母菌个数不断增加，在18h 之后增长缓慢，在18h 时SOD 活性为250.04U/g。根据图3，可以将最佳发酵时间设定为18~24h。
酵母菌数量（×108C F U /m L ）
2.01.81.61.41.21.00
5
10
15202530
发酵时间（h ）
35
酵母菌数量
SOD 活性
2.3乳酸菌单独发酵
2.3.1发酵时间的确定结果表明（图4），在枣泥酶解液发酵基质中接种乳酸菌后，随着发酵时间的增加，乳酸菌活菌数和可滴定酸度不断增大，在20h 乳酸活菌数为8.5×108CFU/mL，此时乳酸菌活菌数达到最大值，20h 后乳酸菌活菌数逐渐降低。故发酵时间以20h 为宜。
0.500.450.400.350.300.250.200.150.100.05
乳酸菌活菌数（×108C F U /m L ）9876
可滴定酸度
乳酸菌活菌数
250
S O D 活性（U /g ）[**************]
40
可滴定酸度（%）
54321
010
2030
发酵时间（h ）
40
图3发酵时间对酵母发酵的影响
Fig.3Effect of fermentation time yeast on yeast fermentation 2.1.4酵母菌发酵培养基中碳氮比的确定由表2可以得出，在碳氮比为6∶1时，SOD 活性达到最大值；生物量和酵母数量也达到最大值，确定该酵母适宜的碳氮比为6∶1。根据发酵时间对酵母菌生长数量及SOD 影响（图3）的实验结果，在第24h 时，酵母菌数量和SOD 活性基本不变，所以在24h 时判定发酵结束，酵母菌几乎不生长，此时酵母利用50%的葡萄糖，在保证碳氮比为6∶1，根据各个培养基含碳和氮的含量计算，最佳培养基的配方为：硫酸铵0.95%，酵母膏
图4
乳酸菌发酵剂发酵过程中产酸及乳酸菌活菌数的变化
Fig.4Changes of producing acid and viable count of
lactobacillus in the fermentation process of
lactic acid bacteria starte
2.3.2接种量的确定结果表明（图5），在枣泥酶解液发酵基质中接种乳酸菌发酵剂后，当接种量超过0.5%，接种量为1%、1.5%和2%的发酵基质中的乳酸菌活菌数和pH 的变化梯度并不明显，而接种量为0.5%的发酵基质中乳酸活菌数的变化与空白和接种量在0.1%相比较明显，考虑到生产成本的因素，最佳接种量选择0.5%。
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4
正交实验结果表3L （93）4
Table 3Results of L （93）orthogonal experiment
生物工
程
实验号123456789K 1K 2K 3K 1′K 2′K 3′R R ′影响因素顺序最优组合
A 1112223335.485.695.41729.27744.49733.520.2815.22
B 1231231235.485.645.46729.24743.68734.360.1814.44C>A>BC 3A 2B 2
C 1232313125.265.595.73712.99748.97751.090.4738.10
酵母菌数量（×108CFU/mL）
1.731.851.901.932.011.751.821.781.81
SOD 活性（U/g）
231.63248.25249.39250.36254.45239.68247.25240.98245.29
Table 4
（h ）接种时间
61218
10可滴定酸度（%）
86420
0.0
0.5
表4接种乳酸菌的时间对发酵液各指标的影响
Effect of lactobacillus inoculation time on the index of fermentation broth 酵母菌数量（×108CFU/mL）
1.251.881.98
乳酸菌活菌数（CFU/mL）
8.32×1088.00×1086.23×108
SOD 活性（U/g）
200245249
还原糖含量（%）
4.384.255.01
生物量（g ）5.685.996.01
2.5
43
乳酸菌活菌数pH
金丝小枣枣泥酵素产品质量标准
21
色泽：浅棕黄色、色泽均匀；气味：枣香味，有发酵香气；酸度：酸甜适口、持久不刺激；组织形态：松散无结块；水分（百分含量）≤5%；超氧化物歧化酶（SOD ）≥（485±5）U/g；乳酸菌活菌数≥（5.6±0.5）×108CFU/g。
p H
3结论
1.0接种量（%）
1.52.0
图5接种量对乳酸菌发酵液pH 和活菌数的影响
Fig.5Effect of inoculation quality on lactobacillus fermentation
broth pH and viable bacteria counts
2.4复合发酵
结果见表4，当培养酵母菌6h 后再接种乳酸菌，发酵液中乳酸菌活菌含量最高，但是酵母数量和SOD 活性比较低；当培养酵母菌12h 后再接种乳酸菌时，发酵液中乳酸菌活菌含量、SOD 活性和酵母数量比较高；当培养酵母菌18h 后再接种乳酸菌时，虽然酵母数量和SOD 活性最高，但是发酵液中乳酸菌活菌数比较低，综合各个因素，乳酸菌最佳接种时间确定为培养酵母菌12h 后。
本项目以生产金丝小枣浓缩枣汁过程中废弃的枣泥为原料，采用酵母菌和乳酸菌进行了复合发酵。通过实验研究得到一条金丝小枣枣泥发酵产酶的工艺，确定了复合发酵的过程中的工艺参数：30℃条件下，酵母菌发酵12h ，然后在37℃条件下，乳酸菌发酵28h ，低温后酵24h 。今后的研究中还可以利用不同类别的酵母菌和乳酸菌以及其他种类的菌种进行发酵，例如红曲霉、黑曲霉等，产生其他酶类。根据本研究，还可以将其他枣类浓缩枣汁过程中废弃的枣泥制备枣泥酵素，得到资源的充分利用。
参考文献
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（下转第205页）
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程
Y ：C S 得率（%）
2420.7517.514.25111∶7
1.40
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3结论
1.301∶6
1.252∶11B ：酶添加量（g/L）料液比（g/mL）C ：1∶51.20
2∶131.35
图7酶添加量、料液比及其交互作用对CS 的响应曲面
Fig.7Influence of enzyme addition, ratio of raw material to NaOH and their interactions on the response surface of
the CS yield rate
采用超声波辅助碱-酶法提以鸡胸软骨为原料，
取CS 。通过可见光谱扫描确定CS 的最大波长为526nm 。通过单因素实验确定CS 的最佳提取工艺条件：即超声时间30min ，碱浓度3%，酶添加量1.3g/L，料液比1∶6（g/mL）为最优条件。通过响应曲面法优化CS 的提取工艺条件：即碱浓度4%，酶添加量1.4g/L，料液比1000∶5923（g/mL）的数据结果显著，其条件下CS 的得率为23.94%。采用可见光谱检测将样品与标准品进行对照，确定提取物为CS 。
参考文献
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2.3验证实验结果分析
经过验证采用响应曲面法优化后的工艺提取CS ，
实验得知工艺条件：碱浓度为4%、酶添加量为1.4g/L、料液比为1000∶5923（g/mL），CS 得率为23.94%。
2.4CS 的定性实验结果与分析
2.0001.625A b s
1.2500.8750.500
400.00
样品标品
526. 00
450.00
500.00波长（nm ）
550.00600.00
Fig.8
图8CS 标准品和样品吸收光谱
Absorption spectrum of the CS standards and samples
由图8可见，CS 样品和CS 标准品均在波长526nm 处有较稳定的吸收峰，且样品与标品的出峰位置及峰形一致，可确定提取物中含有CS 。
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2014年第2期