ZeissLSM710激光扫描共聚焦显微镜的使用和管理

第31卷第8期2012年8月

实验室研究与探索

RESEARCH AND EXPLORATION IN LABORATORY

Vol．31No．8Aug．2012

Zeiss LSM710激光扫描共聚焦显微镜的使用和管理

段

妍，关苑君，蓝秀健，张选红，吴珏珩

（中山大学中山医学院，广东广州510080）

摘

LSCM ) 的配要:介绍了Zeiss LSM 710激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy ，

样品制备要求，图像采集的参数设置原则，日常维护和共享管理等方面。针对LSM 710置和技术参数，

的主要功能列举了生物医学领域的一些应用实例，如多通道荧光图像采集和自动叠加、荧光共定位分

Z 轴扫描和三维重建，析、光谱扫描等。LSCM 避免了非焦平面杂散光的干扰，其分辨率比普通光学显微镜大大提高，能够进行光学切片和三维重建等，在生物医学领域应用十分广泛。中山医学院的Zeiss LSM 710实行开放共享使用，使用率高，已成为学院和各附属医院相关领域常规科研仪器之一。关键词:激光共聚焦显微镜; Zeiss LSM 710; 使用和管理中图分类号：Q 334文献标志码：A 文章编号：1006－7167（2012）08－0228－03

Use and Management of Laser Scanning Confocal

Microscopy Zeiss LSM 710

DUAN Yan ，GUAN Yuan-jun ，LAN Xiu-jian ，ZHANG Xuan-hong ，WU Jue-heng （Zhongshan School of Medicine ，Sun Yat-Sen University ，Guangzhou 510080，China ）

Abstract ：This paper introduced the components and technical parameters ，sample preparation requirements ，parameter setting principles of image acquisition ，daily maintenance and sharing management of Zeiss LSM 710confocal microscope．It then exemplified some biomedical applications according to the main functions of LSM 710，such as multichannel fluorescence image acquisition and automatic overlay ，fluorescence analysis of co-localization ，the Z-stack scanning and 3d reconstruction ，spectral scanning ，and so on．The results show that the LSCM avoided the stray light interference．Its resolution is much higher than ordinary optical microscope ，and it can capture point images and undertake optical slice and 3D reconstruction ，etc．

Key words ：laser scanning confocal microscopy ；Zeiss LSM 710；use and management

0引言

发射光均被探测针孔阻挡，因此Confocal 是对标本的在焦平面实现点照明、点扫描，最终成像为点成像。通Y 方向的连续扫描，Confocal 控制软过扫描振镜在X 、

件将扫描的像素点组成共聚焦图像，通过电动载物台可获得样品不同层面的光切沿Z 轴方向的连续扫描，图像。

Confocal 抑制了样品杂散光的干扰，图像的清晰度和分辨率大大提高，并可以实现对较厚样品的光学切片和三维重组，在生物医学领域的应用越来越普遍。

Confocal 以激光为照明光源，经过照明针孔对样品实现点照明，该点所发射的荧光信号通过探测针孔

被照射点以外的发射光和非焦平面的被探测器检测，

收稿日期：2012－04－18

基金项目：广东省科技计划项目（2011B040300023，2011B010200025）；中山大学实验教学研究（改革）项目

作者简介：段

妍（1981－），女，湖南益阳人，硕士，实验师，主要从

事科研仪器设备与实验室管理。

Tel．：020-87332824；E-mail ：duanyan@mail．sysu．edu．cn

通信作者：吴珏珩（1972－），女，广东广州人，博士，科研仪器管理中心主任，主要从事科研仪器设备与实验室建设管理。

Tel．：020-87332824；E-mail ：wujh@mail．sysu．edu．cn

1Zeiss LSM 710的组成和技术参数

（1）激光器。红激光He-Ne 激光器，633nm ；绿激

Ne 激光器，543nm ；蓝激光Ar 多线激光器，458/光He-

488/514nm ；近紫外diode 固体激光器，405nm 。（2）扫描头。荧光扫描检测器4个，DIC 通道1

个，荧光检测器范围400 800nm ；光谱型荧光检测通道34个，能够进行可见光范围一次性全光谱扫描。

（3）荧光显微镜。Zeiss 研究级电动倒置显微镜Observer Z1，低倍物镜10ˑ 、

20ˑ 具有相差功能；高倍物镜40ˑ 、

63ˑ 油镜，100ˑ 油镜具有DIC 功能。（4）活细胞恒温培养系统。可放置6孔板、24孔板、玻片、

35mm 和60mm 培养皿。（5）操作和分析软件。Zen 2009。

激光共聚焦显微镜样品制备要求

2．1

染料的选择

激光共聚焦显微镜配备4个激光器，

405nm 激光器可观察DAPI 、

Hoechst 和Alexa-405系列染料；氩离子激光器可观察GFP 、CFP 和YFP 等荧光蛋白，及

FITC 、Alexa-488等染料；543nm 激光器可观察RFP 等荧光蛋白，及Rhodamine 、Alexa-546、Cy3等染料；633nm 激光器可观察Alexa-647和Cy5等染料。进行多重

标记时，要尽量避免染料之间的窜色，还要考虑各种抗体的来源，使用不同种属来源的抗体进行染色，并优先选择稳定性和抗淬灭性强的染料，离子荧光染料尽量选择K m 值大的染料，对细胞内的离子浓度缓冲作用

小［1］。

2．2共聚焦观察样品的要求

细胞爬片和组织切片应根据样品种类和实验需求

选择不同的固定方法［2］

，选择的盖玻片厚度应小于

0．17mm ，最好使用共聚焦专用的盖玻片［3，4］，封片剂

推荐使用抗荧光淬灭的固体封片剂，这样使用油镜进行观察时不会发生样品移位的现象，也常用50%的甘油进行封片。活细胞，较厚的组织切片或不规则的组

织块需使用共聚焦专用的培养皿进行样品观察［5］

。

Zeiss LSM 710图像采集基本参数设置

3．1

光路设置

选取荧光探针的种类或直接选择激光管类型以确

定入射光波长（发射光的光谱采集范围也可根据需要进行手动调节）；确定扫描方法，

Fastest 为最快速扫描，即多条激光谱线同时扫描。Best signal 为最佳信号扫描，

即多条激光谱线顺序扫描。Best compromise 为兼顾速度与信号的折中式扫描。3．2

采集图像参数设置选择合适的分辨率，扫描速度（Speed ）一般设置在6 8之间以获得最佳信号，为了提高信噪比，可将采图平均数（Averaging ）设为2 4以扣除噪点。通过扫描区域（Scan Area ）的调节可对感兴趣区域进行缩放，选择或任意角度旋转。

3．3

荧光检测通道的精细调节

（1）针孔的调节。针孔的大小决定了共聚焦光学

切片的厚度，该值越大，切片越厚，采集到的信号越强，但轴向分辨率会降低。理论上，在保证图像质量的前提下，该值越接近于1AU （Airy Unit ）越好，1AU 所代表的光切厚度受物镜影响，物镜数值孔径越高，光切越薄，分辨率越高；

（2）激光管电压的调节。激光管电压越高，激光强度越高，则信号越强，但标本更容易被漂白或淬灭。原则上，在保证图像质量的前提下，激光强度越低越好。随着激光管使用寿命的增加，激光的亮度会有所下降；

（3）光电倍增管增益的调节。增大则信号和噪音都增强，减小则信号和噪音均减小。原则上，在保证图像质量的前提下，

Gain 值越小越好；（4）数码降噪和数码增益的调节。可进一步增强信号扣除背景噪音。原则上，

Digital Offset 值越接近于0越好，Gain 值越接近于1．0 1．2越好；设置以上参数时应避免出现曝光过度和曝光不足

的情况，以免影响图像质量和后续的数据分析［6］

。3．4

LSM 710透射光DIC 图像的采集

使用LSM 710的透射光PMT （T-PMT ）可获得以激光为光源的透射光图片。方法是在Light Path 中勾选“T-PMT ”，并选择激光光源，由于激光是偏振光，所

以聚光镜中不用再选择起偏镜，调节物镜上的DIC 插片，适当缩小聚光镜上的孔径光栏以获得最佳的DIC 成像效果。但共聚焦采集的DIC 图像为非共焦图像，在透射光通道无法对样品进行光学切片。

LSM 710主要功能及在生物医学领域应用

4．1

多通道荧光、

DIC 图片采集和数据分析激光共聚焦显微镜因使用共轭光路使非焦平面的

光线被抑制，以及使用单色激光和点扫描技术，成像分辨率可以达到0．18μm ，可以清晰地呈现细胞的微细结构和细胞器，并获得荧光和DIC 叠加的图片，为荧光信号的定位和定量提供直观的图像（见图1）

。

图1荧光与透射光通道叠加

荧光信号采集后经PMT 转化为电信号，用Zen 2009可对荧光信号进行定位（见图2）和相对定量测定，得到的数据可直接保存成Excel 表格。荧光强度

因此通过与特异性荧光标记蛋白的表达量呈正相关，荧光强度测定可以研究细胞在不同药物环境和培养时

间下特异性蛋白的表达差异

。

图2双色荧光共定位分析

4．2Z 轴扫描和三维重建

对样品进行连续分层扫描，可对较厚的样品进行

stack ，三维重建（见图3）。在Zen 2009中勾选Z -调节pinhole 的大小确定section 的厚度，设定Z 轴方向上采集的第一张和最后一张确定扫描区域，设置Z 轴步

进，当步进值为section 厚度50%时可获得较高的轴向最分辨率。LSM710的Z 轴步进马达可精确到10nm ，佳轴向分辨率为0．4μm ，可用于观测样品空间结构和进行空间定位

。

获得特异性的光样品进行可见光一次性全光谱扫描，

谱特征曲线（见图4）。利用这一功能可很好地解决标本自发荧光的干扰，及多色荧光的串扰问题，也可通过光谱曲线来验证特异性荧光染料的表达

。

图4光谱扫描和光谱特征曲线

LSM 在生物医学领域应用十分广泛，常用的有观如细胞骨架、细胞器定位定量、细察细胞精细结构，

［8］

胞膜电位、细胞间通讯、细胞膜流动性、细胞凋亡，对细胞内钙离子进行定性，定量和动态分析DNA 、RNA 含量分析等等［11-12］。

［9-10］

［7］

图3Z 轴扫描和三维重建

，

4．3时间序列扫描

时间序列扫描可实现对活细胞的实时动态观测，

记录细胞内特定成分的变化并得到动力学曲线。提高扫描速度，采用双向扫描，牺牲分辨率或采用线扫描（xt ），LSM 710在512ˑ 512的分辨率下最快扫描速度达到5帧/s，可用于观察细胞内离子浓度的快速变化。当然在对样品快速扫描时成像效果将受到一定影响。4．4

自动拼接功能勾选Tile Scan ，输入水平和垂直方向采图数，显微

5．1

激光共聚焦显微镜的维护和管理

日常维护注意事项

（1）严格遵守仪器的开、关机流程，特别注意氩离

子激光器需充分冷却后才可以关闭。使用时严格按照操作规程，避免因操作不当造成的仪器损坏。（2）每次使用完毕后，应保持仪器清洁。载物台、物镜、目镜等容易污染的光学部件应经常用擦镜纸蘸取清洁液液进行擦拭（清洁液使用无水乙醇和无水乙醚的混合液，混合比例：无水乙醇30%、无水乙醚70%）。

（下转第239页）

镜可自动采集这些图片并将其自动拼接，可用于拍摄

脑片等较大组织的整体结构。4．5

全光谱扫描，光谱解拆分，荧光解串色

LSM 710配置了34个光谱型荧光检测通道，可对

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（3）根据使用的染料开启相应的激光器，以延长激光管寿命，氩离子激光器不使用时不开启。（4）图像和数据资料应使用刻录光驱刻录，严禁在共聚焦电脑上使用U 盘。

（5）设立专门的仪器室，室内配备空调和除湿器，环境温度应保持在（22ʃ 2）ħ ，湿度40% 60%。5．2

激光共聚焦显微镜的共享管理

中山医学院启用基于RFID 的仪器共享管理系

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包括激光共聚焦显微镜在内的公共仪器均面向统，

兄弟院校、附属医院和其他科研单位实行全面开放共享。学院配备了专职实验技术人员进行共聚焦显微镜的日常管理、使用者培训和功能开发等工作，使用者经

［14-15］

。目前这台过实名制注册，网上预约来使用仪器

设备已为58个院内外课题组的430多位科研人员提

［13］

供服务，年使用机时1500h 左右，处于满负荷运转状态。激光共聚焦显微镜已逐步成为生物医学各领域的常规研究手段之一。参考文献（References ）：

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