液相色谱操作规程-U3000（全自动）
一、操作前准备：
1.1流动相的配制：
1.1.1根据所供试品的性质、相关的文献资料、工作经验等按比例配制流动相。
1.1.2根据流动相的性质确定采用有机膜（0.45um ）还是水相膜(0.45um)对流动相进行过滤。
1.1.3将过滤后的流动相进行超声脱气10~15分钟。
1.2对照品供试品处理：
1.2.1称取或量取适量的对照品或供试品，用适当的溶剂（最好采用流动相或流动相的主成分）进行充分溶解（也可借助超声波进行超声溶解），使其浓度为0.1~1mg/mL（根据检测结果再适当调节溶液的浓度）。
1.2.2根据对照品或供试品的性质确定采用有机针头滤膜（0.45um ）还是水相针头滤膜(0.45um)进行过滤。
1.3色谱柱的选择：根据样品的性质选择适当的色谱柱。
二、开机：
2.1打开电源，打开仪器接线板电源开关；
2.2打开电脑显示器电源，打开电脑主机电源，启动电脑；
2.3依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源；等待各个部件自检完成
2.4双击屏幕右下角“服务管理器”快捷图标, 出现对话界面后点击“启动仪器控制器”启动, 等显示“本地仪器控制器 运行空闲”, 关闭界面。
2.5双击在桌面上的Chromeleon 7图标（工作站主程序）。
2.6在左下方点击仪器，则在右边会自动显示该仪器控制面板
2.7 旋开泵上的排液阀(两圈以上) ；设置A 通道为100%，点击“冲洗”，然后再出现的对话框中点击“忽略并执行”；（默认冲洗5分钟）；然后用同样的方法分别“冲洗”流路中其他通道气泡；排完气泡后关闭排液阀；
2.8设置流动相的比例及流速后，点击“马达”。此时泵自动会以设置的流速进行运行。
2.9在控制面板“自动进样器”控制框中，分别执行“灌注注射器”，“清洗缓冲环”，“清洗针外壁”, 执行“到进样位置”；（操作过程中注意注射器有没有气泡。如有先机器排气，如果不行手动拆除排气泡。）
3.0 在控制面板“柱温箱”控制框中，设置准备分析样品所使用的柱温箱温度。
3.1打开氘灯（待系统压力稳定后约10min 后再开灯）：在控制面板“Detector ”控制框中，选中“紫外灯”选框，及“可见灯”选框（如果波长在可见范围）。
3.2 在控制面板“UV ”控制框中，设置波长，采集频率（10~20HZ）；点击“监视基线”，选中通道1并确定。
3.3在控制面板“FLD ”控制框中，设置激发波长及发射波长，灵敏度适当（1~7）；采集频率（10~20HZ）；点击“监视基线（一般30min ）”，选中通道Emission_1并确定。(若不需要荧光分析，可忽略此步骤)
三、样品分析：
3.1建立仪器方法：
3.1.1点数据键，选中仪器方法，点创建，选中仪器方法（HPLC ），出现对话框，点击下一步，在运行时间栏中填写样品所需要运行的时间，选择所需的通道（若没有要选的通道，点击取消选择所有通道），点击下一步，进入pump （泵）设置，点击常规设置，填写溶剂名称（例如A ：乙腈 B：水 放置流动相根据情况而定 ），设置压力限值（下限50 上限350）点击旁边的流速梯度，进入梯度设置，删除平衡阶段，设置流速为（1.0ml/min），按要求填写流动相比例；点击下一步，进入sampler （采样器）设置，将进样冲洗改为AfterDraw(其他设置不用改变) ，点击下一步，进入ColumnOven （柱温）设置，一般无要求通常设置为：温度30C ；下限5.0；上限110.0；平衡时间0.5min ；就绪温度差1.0C ；点击下一步，进入UV （紫外）设置，设置按要求所需的紫外波长（通道1），峰宽0.05；点击下一步；进入FLD 设置（荧光检测器），若不用蒸发光则不需开FLD ；点击下一步，出现对话框，将所需要做的样品名称填写上，点击完成后，再点击左上角保存，即可。全部设置完成后，点击仪器，出现主界面，点击Pump ，将流动相比例改成之前设置的比例，再点击UV ，将紫外波长改为要求的波长。
注：如需要进行梯度洗脱，则每个时间段的流动相比例不一样，进入泵设置的流速梯度，删除平衡阶段，按要求和时间段填写流动相比例，（每次按要求的时间再延长十分钟且流动相比例与最初0分钟的保持一致）。如果之前有创建，可以直接调用之前的。
3.2建立序列：
3.2.1点击数据键，点序列，创建一个样品文件夹，再点击序列，点创建，点击序列，点击HPLC ，点下一步，出现对话框，填写进样名称（样品名）、样品数、进样次数、开始位置、进样量；点击下一步，出现对话框，在浏览中选择所需要的仪器方法（上一步创建仪器方法），点击下一步，点完成，在对象名称栏中填写样品名称，点保存，出现序列，在名称栏中填写所做的样品名称（注明批号），类型栏中填写校准标准品（对照品）或未知（样品），级别栏默认数值，位置栏填写样品瓶的位置；进样量按要求填写所需的进样量，点击保存。
3.3待基线稳定后(一般30min) ，点击“监视基线”，点击确定，关闭查看基线。
3.4 将对照品及样品按序列中的位置逐个放在样品盘中；
3.5点击左下方“数据”，并选中要分析的序列，然后点击“开始”启动样品表进行分析（如果序列里有完成的样品，则会变成继续，点继续；如果该序列还在队列中则会显示删除，点击删除后在点击继续）；
3.6样品全部检测结束后，如果不再分析样品应立即关掉氘灯，延长氘灯使用的寿命。
四、数据处理
4.1 方法一：在序列里选择所需要处理的数据双击，点击处理键，出现对话框，选中积分区域，点下一步直到完成。
4.2 方法二：双击图谱在数据处理界面点击校准和数据处理方法，进入界面，在色谱图下方点击“检测”，运行cobra 向导执行检测参数的优化， 选中要积分的峰，依次进行积分区域、基线噪声（可选择较平滑的一段）、平滑度、最小峰面积通道和进样类型进行选择直至完成。
4.3 打印图谱：点击报告设计器，点总结即可看到所建序列里所有数据；点击旁边的积分，点击页面布局，点页面预览，点击打印，即可。
4.4 打印样品报告。
五、关机：
5.1样品全部检测结束后，如果不再分析样品应立即关掉氘灯，延长氘灯使用的寿命，冲洗色谱柱（如果使用了缓冲盐，首先使用10%甲醇水溶液冲洗色谱柱
30分钟，然后使用纯甲醇冲洗色谱柱30分钟或用设定的智能关机系统自动冲洗，具体操作步骤：点击仪器，点击一起方法，找到仪器方法中C-10%甲醇-D 复制粘贴到序列，添加一个序列，将类型栏改为空白，仪器方法设为C-10%甲醇-D ）。
5.2关闭泵马达，断开连接，关闭工作站。
5.3双击屏幕右下角“服务管理器”快捷图标, 出现对话界面后点击“停止仪器控制器”, 等显示“本地仪器控制器 已停止”, 可以关闭界面。
5.4关闭检测器、柱温箱、自动进样器、泵的电源。
5.5关闭计算机。关闭电源。
六、注意事项：
6.1溶剂泵的使用注意事项：
（1） 使用时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转会磨损柱
塞、缸体和密封环，最终产生漏夜。
（2） 防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质微粒都会磨损
柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体
颗粒。流动相过滤，可采用滤膜（0.2um 或0.45um ）等滤过。
（3） 输液泵的工作压力不能超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变
形，产生漏夜。
（4） 流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果
有大量的气泡，
泵就无法正常工作。
（5） 溶剂泵长期不用时，用甲醇以1.0ml/min冲洗各个通道。
（6） 泵的清洗液要勤换。
（7） 每次开启泵之前要排除管道中是气泡。
（8） 流动相由无机盐溶液转换有机溶剂前要用90%去离子水清洗管路。
（9） 转换不同流动相时注意两者是否容易混合或者发生反应。
（10）长期不用或运输前要到空清洗液瓶。
6.2色谱柱的使用注意事项：
（1） 免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色
谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也
会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，进样阀的转动不能过缓。
（2） 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产厂家指明该柱可以反冲时，才可
以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
（3） 选择使用适宜的流动相（尤其是pH ），以避免固定相被破坏。有时可
以在进样器前连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析之前被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被破坏。
（4） 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进
行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是有相似固定相的短柱，也有用浸透限制固定相短柱。保护柱可以经常更换。
（5） 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥
发干燥。绝对禁止将缓冲液留在柱内静置过夜或更长时间。
6.3检测器的使用注意事项：
（1） 长时间检测池中无流动相流动时，关闭检测器氘灯。
（2） 不要将物品或其他仪器档住检测器的散热孔。
（3） 检测器安装的位置应没有震动，温度变化不大，避免阳光直射。
（4） 在关灯命令发出后，再次开灯须等待5分钟以上的时间。否则灯会因
为过热而损坏。
液相色谱操作规程-U3000（全自动）
一、操作前准备：
1.1流动相的配制：
1.1.1根据所供试品的性质、相关的文献资料、工作经验等按比例配制流动相。
1.1.2根据流动相的性质确定采用有机膜（0.45um ）还是水相膜(0.45um)对流动相进行过滤。
1.1.3将过滤后的流动相进行超声脱气10~15分钟。
1.2对照品供试品处理：
1.2.1称取或量取适量的对照品或供试品，用适当的溶剂（最好采用流动相或流动相的主成分）进行充分溶解（也可借助超声波进行超声溶解），使其浓度为0.1~1mg/mL（根据检测结果再适当调节溶液的浓度）。
1.2.2根据对照品或供试品的性质确定采用有机针头滤膜（0.45um ）还是水相针头滤膜(0.45um)进行过滤。
1.3色谱柱的选择：根据样品的性质选择适当的色谱柱。
二、开机：
2.1打开电源，打开仪器接线板电源开关；
2.2打开电脑显示器电源，打开电脑主机电源，启动电脑；
2.3依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源；等待各个部件自检完成
2.4双击屏幕右下角“服务管理器”快捷图标, 出现对话界面后点击“启动仪器控制器”启动, 等显示“本地仪器控制器 运行空闲”, 关闭界面。
2.5双击在桌面上的Chromeleon 7图标（工作站主程序）。
2.6在左下方点击仪器，则在右边会自动显示该仪器控制面板
2.7 旋开泵上的排液阀(两圈以上) ；设置A 通道为100%，点击“冲洗”，然后再出现的对话框中点击“忽略并执行”；（默认冲洗5分钟）；然后用同样的方法分别“冲洗”流路中其他通道气泡；排完气泡后关闭排液阀；
2.8设置流动相的比例及流速后，点击“马达”。此时泵自动会以设置的流速进行运行。
2.9在控制面板“自动进样器”控制框中，分别执行“灌注注射器”，“清洗缓冲环”，“清洗针外壁”, 执行“到进样位置”；（操作过程中注意注射器有没有气泡。如有先机器排气，如果不行手动拆除排气泡。）
3.0 在控制面板“柱温箱”控制框中，设置准备分析样品所使用的柱温箱温度。
3.1打开氘灯（待系统压力稳定后约10min 后再开灯）：在控制面板“Detector ”控制框中，选中“紫外灯”选框，及“可见灯”选框（如果波长在可见范围）。
3.2 在控制面板“UV ”控制框中，设置波长，采集频率（10~20HZ）；点击“监视基线”，选中通道1并确定。
3.3在控制面板“FLD ”控制框中，设置激发波长及发射波长，灵敏度适当（1~7）；采集频率（10~20HZ）；点击“监视基线（一般30min ）”，选中通道Emission_1并确定。(若不需要荧光分析，可忽略此步骤)
三、样品分析：
3.1建立仪器方法：
3.1.1点数据键，选中仪器方法，点创建，选中仪器方法（HPLC ），出现对话框，点击下一步，在运行时间栏中填写样品所需要运行的时间，选择所需的通道（若没有要选的通道，点击取消选择所有通道），点击下一步，进入pump （泵）设置，点击常规设置，填写溶剂名称（例如A ：乙腈 B：水 放置流动相根据情况而定 ），设置压力限值（下限50 上限350）点击旁边的流速梯度，进入梯度设置，删除平衡阶段，设置流速为（1.0ml/min），按要求填写流动相比例；点击下一步，进入sampler （采样器）设置，将进样冲洗改为AfterDraw(其他设置不用改变) ，点击下一步，进入ColumnOven （柱温）设置，一般无要求通常设置为：温度30C ；下限5.0；上限110.0；平衡时间0.5min ；就绪温度差1.0C ；点击下一步，进入UV （紫外）设置，设置按要求所需的紫外波长（通道1），峰宽0.05；点击下一步；进入FLD 设置（荧光检测器），若不用蒸发光则不需开FLD ；点击下一步，出现对话框，将所需要做的样品名称填写上，点击完成后，再点击左上角保存，即可。全部设置完成后，点击仪器，出现主界面，点击Pump ，将流动相比例改成之前设置的比例，再点击UV ，将紫外波长改为要求的波长。
注：如需要进行梯度洗脱，则每个时间段的流动相比例不一样，进入泵设置的流速梯度，删除平衡阶段，按要求和时间段填写流动相比例，（每次按要求的时间再延长十分钟且流动相比例与最初0分钟的保持一致）。如果之前有创建，可以直接调用之前的。
3.2建立序列：
3.2.1点击数据键，点序列，创建一个样品文件夹，再点击序列，点创建，点击序列，点击HPLC ，点下一步，出现对话框，填写进样名称（样品名）、样品数、进样次数、开始位置、进样量；点击下一步，出现对话框，在浏览中选择所需要的仪器方法（上一步创建仪器方法），点击下一步，点完成，在对象名称栏中填写样品名称，点保存，出现序列，在名称栏中填写所做的样品名称（注明批号），类型栏中填写校准标准品（对照品）或未知（样品），级别栏默认数值，位置栏填写样品瓶的位置；进样量按要求填写所需的进样量，点击保存。
3.3待基线稳定后(一般30min) ，点击“监视基线”，点击确定，关闭查看基线。
3.4 将对照品及样品按序列中的位置逐个放在样品盘中；
3.5点击左下方“数据”，并选中要分析的序列，然后点击“开始”启动样品表进行分析（如果序列里有完成的样品，则会变成继续，点继续；如果该序列还在队列中则会显示删除，点击删除后在点击继续）；
3.6样品全部检测结束后，如果不再分析样品应立即关掉氘灯，延长氘灯使用的寿命。
四、数据处理
4.1 方法一：在序列里选择所需要处理的数据双击，点击处理键，出现对话框，选中积分区域，点下一步直到完成。
4.2 方法二：双击图谱在数据处理界面点击校准和数据处理方法，进入界面，在色谱图下方点击“检测”，运行cobra 向导执行检测参数的优化， 选中要积分的峰，依次进行积分区域、基线噪声（可选择较平滑的一段）、平滑度、最小峰面积通道和进样类型进行选择直至完成。
4.3 打印图谱：点击报告设计器，点总结即可看到所建序列里所有数据；点击旁边的积分，点击页面布局，点页面预览，点击打印，即可。
4.4 打印样品报告。
五、关机：
5.1样品全部检测结束后，如果不再分析样品应立即关掉氘灯，延长氘灯使用的寿命，冲洗色谱柱（如果使用了缓冲盐，首先使用10%甲醇水溶液冲洗色谱柱
30分钟，然后使用纯甲醇冲洗色谱柱30分钟或用设定的智能关机系统自动冲洗，具体操作步骤：点击仪器，点击一起方法，找到仪器方法中C-10%甲醇-D 复制粘贴到序列，添加一个序列，将类型栏改为空白，仪器方法设为C-10%甲醇-D ）。
5.2关闭泵马达，断开连接，关闭工作站。
5.3双击屏幕右下角“服务管理器”快捷图标, 出现对话界面后点击“停止仪器控制器”, 等显示“本地仪器控制器 已停止”, 可以关闭界面。
5.4关闭检测器、柱温箱、自动进样器、泵的电源。
5.5关闭计算机。关闭电源。
六、注意事项：
6.1溶剂泵的使用注意事项：
（1） 使用时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转会磨损柱
塞、缸体和密封环，最终产生漏夜。
（2） 防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质微粒都会磨损
柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体
颗粒。流动相过滤，可采用滤膜（0.2um 或0.45um ）等滤过。
（3） 输液泵的工作压力不能超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变
形，产生漏夜。
（4） 流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果
有大量的气泡，
泵就无法正常工作。
（5） 溶剂泵长期不用时，用甲醇以1.0ml/min冲洗各个通道。
（6） 泵的清洗液要勤换。
（7） 每次开启泵之前要排除管道中是气泡。
（8） 流动相由无机盐溶液转换有机溶剂前要用90%去离子水清洗管路。
（9） 转换不同流动相时注意两者是否容易混合或者发生反应。
（10）长期不用或运输前要到空清洗液瓶。
6.2色谱柱的使用注意事项：
（1） 免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色
谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也
会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，进样阀的转动不能过缓。
（2） 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产厂家指明该柱可以反冲时，才可
以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
（3） 选择使用适宜的流动相（尤其是pH ），以避免固定相被破坏。有时可
以在进样器前连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析之前被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被破坏。
（4） 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进
行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是有相似固定相的短柱，也有用浸透限制固定相短柱。保护柱可以经常更换。
（5） 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥
发干燥。绝对禁止将缓冲液留在柱内静置过夜或更长时间。
6.3检测器的使用注意事项：
（1） 长时间检测池中无流动相流动时，关闭检测器氘灯。
（2） 不要将物品或其他仪器档住检测器的散热孔。
（3） 检测器安装的位置应没有震动，温度变化不大，避免阳光直射。
（4） 在关灯命令发出后，再次开灯须等待5分钟以上的时间。否则灯会因
为过热而损坏。