糖化酶生产菌株种子制备工艺优化

２００９年１９（６）生物技术

６９

的最佳培养基组成，进行实验，结果见表７。可知，经过响应面堆肥上的应用国内外尚未见报道。前期的实验表明ＣＨＢＩ能优化培养基后菌数比优化前提高了２７．３％。试验值与预测值有效促进堆肥温度，缩短腐熟时间，因而是研制有机物料促腐的误差为４．０８％，说明该实验值与模型预测值拟合良好，此模剂的良好菌种。本文主要从降低发酵生产成本的角度，筛选型可以用于预测嗜热脂肪土芽孢杆菌的液体发酵。

出以廉价的农副产品（豆粕、酵母粉）为主要原料的ＣＨＢｌ液体发酵培养基。利用廉价的农副产品进行发酵生产，大大降低了生产成本，且原材料易获取，适合用于大规模的工业化发酵３

生产。

表７模型验证结果扣２

７Ｉ抽ｌｅ７Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆ

ｍｏｄｅｌｖａｌｉｄａｔｉｏｎ

ｌ

项目菌数（函）

初始条件

２．４０×１０８

－０．９一Ｏ．３０Ｏ．３

Ｏ．９

响应面优化后３．０６×１０ｓ

Ｘ１

Ｆｉｘｅｄｌｅｖｅｌｓ：Ｘ３＝０

模型预测值２．９４Ｘ１０８

图ｌ

Ｙ＝ｆ（ｘ１，）（２）的响应面立体分析及其等高线图

优化后提高率（％）２７．３０％Ｆｉｇ．１

Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅａｎｄ

ｃｏｎｔｏｕｒｐｌｏｔｓｆｏｒＹ＝ｆ（Ｘ１，Ｘ２）（Ｆｉｘｅｄｌｅｖｅｌｓ：Ｘ３

实验值与模型预测值误差（％）

４．０８％

＝Ｏ）

在培养基优化过程中，合理的使用优化方法，可以减少实

验次数，取得良好的优化效果。本文借助ＳＡＳ统计软件进行０．９Ｐｌａｅｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ和响应面实验的设计和数据分析，在嗜热脂０．６Ｏ．３

肪土芽孢杆菌的液体发酵培养基优化过程中取得了良好的效２・

妥０

果。经响应面优化的最佳培养基为：酵母粉Ｏ．５ｌ％、豆粕０．｝；：

－０．３－０．６４２５％、Ｋ２Ｉ－ＩＰ０４０．９９４％。在优化后的培养基条件下发酵的菌・０．９

１．

数为３．０６Ｘ１护ｃｆｕ，比原来的提高了２７．３％。

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Ｙ＝ｆ（Ｘ２。Ｘ３）的响应面立体分析及其等高线图

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Ｆｉｇ．３

Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅ

ａｎｄｃｏｎｔｏｕｒｐｌｏｔｓｆｏｒ

Ｙ＝ｆ（ｘ２，Ｘ３）（Ｆｉｘｅｄｌｅｖｅｌｓ：Ｘ１

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的优化［Ｊ］．工业微生物，２００２，３２（１）：９—１２．

３讨论

［１０］杨超英，陶玉贵．响应面法优化苏云金杆菌固态发酵培养基［Ｊ］．中嗜热脂肪土芽孢杆菌ＣＨＢｌ是作者实验室筛选的菌株，在

国农学通报，２００８，２４（７）１６９—７３．

糖化酶生产菌株种子制备工艺优化

宋毅．李松，王正祥＋

（江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡２１４１２２）

摘要：目的：缩短糖化酶工业生产菌株黑曲霉Ａ．，妇盯ＣＩＣＩＭＧＢ０５０６的种子制备周期。方法：对该菌的活化培养基配方及种子制备方式进行改良，并通过１９（３４）正交试验对其液体培养方法进行优化。结果：在固体活化培养基中添加０．２％的酵母粉及１％的玉米淀粉，有利于加速菌体生长；加入４０粒，粒径３～４ｍｍ的玻璃珠１３０ｄｒａｉｎ，摇床培养可以获得更为分散、均一的种子液；液体种子制备的较优条件为初始ｐＨ４．５，装液量９０ｍＬ，琼脂加量０．１％，培养天数５ｄ。结论：新的制备工艺使糖化酶种子制备时间较现在工业生产上使用的工艺缩短了４ｄ，进行后续糖化酶摇瓶发酵产酶水平是原工艺的１．１８倍。

关键词：糖化酶；黑曲霉；种子制备

中图分类号：Ｑ９３５；ＴＱ９２

文献标识码：Ａ

文章编号：１００４—３１１Ｘ（２０（０）０６一００６９—０４

Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ

Ｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒ

ＩｎｏｃｕｌｕｍＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ

ｏｆ

Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ——ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＳｔｒａｉｎ

ＳＯＮＧＹｉ．ＵＳｏｎｇ．ＷＡＮＧＺｈｅｎｇ—ｘｉａｎｇ。

（Ｋｅｙ

Ｌａ｝ｍｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ

ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎａｎｄＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ＆Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，

ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＳｈｏｒｔｅｎｔｈｅｔｉｍｅｆｏｒｔｈｅｓｅｅｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＡ．ｎｉｇｅｒＣＩＣＩＭＧＢ０５０６，ａｇｌｕｃｏａｍｙａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｓｔｒａｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ａｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｉｎｏｃｕｌｕｍｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＡ．ａｇｅｒＣＩＣＩＭＧＢ０５０６ＷａＳｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓｇｒｏｗｔｈｗｅｌｌｗｈｅｎｙｅａＳｔｅｘｔｒａｃｔ（Ｏ．２％）ａｎｄｃｏｍｓｔａｒｃｈ（１％）ｗａｓａｄｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ．Ｈｉｇｈｌｅｖｅｌｓｏｆｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅｗｅｒｅｐｒｏｄｕｃｅｄｗｈｅｎ４０ｐａｒｔｉｃｌｅｏｆｄａｓｓｂｅａｄｓＷｅｒｅａｄｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｍｙｃｅｌｉａｇｒｏｗｔｈｍｅｄｉｕｍ．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｌｌｌｉｑｕｉｄｉｎｏｃｕｌｕｍｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＡ．

万　

方数据

７０生物技术

ｐＨ

２００９矩１９（６）

ｎ／ｇｅｒＣＩＣＩＭＧＢ０５０６ｗｅ陀ｔｈｅｉｎｉｔｉａｌ

４．５，ｌｉｑｕｉｄｃａｐａｃｉｔｙ９０ｍＬ，ａｇａｒ

０．１％，５ｄａｙｓｃｕｌｔｕｒｅｐｅｒｉｏｄ．Ｃｏｎｄｍｉｏｎ：Ｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｄａｙｓａｎｄｔｈｅｇｌｕｃｏｍｎｙｌａｓｅｙｉｅｌｄｉｎｔｈｅｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｓｈａｋｅ—ｆｌａｓｋｆｅｒ－

ｄｕｒａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｉｎｏｃｕｈｍｗａｓｓｈｏａｅｎ４

ｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｉｎｏｅｕｌｕｍｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．ｔｈｅ

ｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｓｔｗａｓ１．１８ｔｉｍｅｓｃｏｍｐａ／ｉｓｏｎｔｏｔｈｅ撕百Ｉｌａｌｐｒｏｃｅｓｓ．

Ｋｅｙ

ｗｏｒｄｓ：ｇｌｕｅｏａｍｙｌａｓｅ；觚孵融‰ｎ／ｇｅｒ；ｉｎｏｃｕｌｕｍｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ糖化酶即葡萄糖淀粉酶（１，４一ａ一葡聚糖葡聚糖水解酶，

采用ＣＤ３为活化培养基，分别采用不同规格玻璃珠，铁丝

ＥＣ．３．２．１．３），是淀粉糖化工艺的主要酶类，被广泛地应用于

对菌丝体进行打散，打散方式见表１。以菌体浓度及发酵摇瓶

酶活值为指标，检测打散效果。菌体浓度值由种子液经稀释，分别涂布３块ＣＤ３乎板计算得到的平均值，单位：×１∥个／

ｍＬ。

食品、医药、发酵等工业［１’２】。目前，糖化酶的生产菌种主要为

黑曲霉［３］。根据使用的生产菌种不同及发酵工艺不同，工业生产中，糖化酶的发酵生产水平在３５０００—５５０００Ｕ／ｍＬ不等。糖化酶的工业化生产从过去的固体发酵沿革到上世纪９０年代初，液体发酵工艺逐步取代了原固体发酵工艺。液体发酵工艺的建立与应用极大地改善了发酵产品质量并大幅度提升了糖化酶的发酵生产水平。但现有糖化酶发酵生产技术共同存在不足之处，其中种子制备周期和发酵生产周期很长是一个较突出的问题，如实验室的种子制备需要１５ｄ以上，发酵周期通常２００１ｔ以上。在此基础上，进一步缩短其制备周期的研究未见报道。

本文首先对糖化酶生产菌株的几种活化培养基的活化效果作了比较，其次确定了摇床培养种子液的最佳打散方式，进一步研究了影响菌丝体液体菌种质量的培养基初始ｐＨ值、摇

表１种子液打散方式

Ｔａｂｌｅ

１

Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｔｏｂｒｅａｋ

ｕｐｍｙｃｅｌｉａｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ

打散方法

ａ

特征描述

静置培养

１３０ｄｒａｉｎ，摇床培养；加入粒径６—７ｍｍ的玻璃珠２０粒１３０ｄｍｉｎ，摇床培养；加入粒径３。４ｍｍ的玻璃珠２０粒１３０ｄｍｉｎ，摇床培养；１Ｊｎ入粒径３～４ｍｍ的玻璃珠４０粒１３０ｆ／ｒａｉｎ，摇床培养；加入铁丝网，网疏松，并将其卡在瓶底１３０ｄｍｉｎ，摇床培养；加入铁丝网，网密集，并将其卡在瓶底

ｂ

ｃ

ｄ

ｅ

ｆ

１．２．４正交试验方法

针对影响种子制备效果比较明显的初始ｐＨ、培养时间、装

瓶装液量、培养时间等因素，获得了糖化酶液体种子制备的最

佳工艺条件，在保障糖化酶发酵生产水平的前提下，将糖化酶种子液的制备周期缩短了４ｄ。从而有效缩短了糖化酶的发酵生产周期，降低了种子制备过程中染菌风险，提高了糖化酶发酵生产效率和降低生产成本。

液量、琼脂加量，采用四因素三水平正交试验设计试验（表２）。

以菌丝干质量及发酵酶活值（每组试验３个摇瓶）为指标，检测种子制备效果。

表２正交试验因素水平表Ｔａｂｌｅ７ｌ（平…１

Ａ初始ｐＨ

ｌ２

４．５５．５

２

Ｆａｃｔｏｒｓ

ａｎｄｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅ

ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ

１材料与方法

１．１材料

１．１．１菌种

黑曲霉ＣＩＣＩＭＧＢ０５０６（Ａｓｐｅｒ＃／／ｕｓ

ｎ／ｇｅｒ

ＣＩＣＩＭ

固童

Ｂ培养时间（ｄ）Ｃ装液量（ｍＬ）Ｄ琼脂加量（ｗ／ｖ，％）

４５

４０６０

Ｏ．０５１

ＧＢ０５０６），携

注：种子液制备采用４０粒，粒径为３～４ｍｍ玻璃珠打散。

多拷贝糖化酶基因，为本实验室前期构建的基因工程菌Ｈｊ。１．１．２培养基

活化培养基Ｉ：采用１Ｚ培养基，每升含有３９牛肉膏、１５９蛋白胨、２９酵母抽提物、２９ＮａＣｌ、１５９淀粉、２０９琼脂，ｏＨ５．８。

活化培养基１１：在ＣＤ培养基中分别加入１％玉米淀粉

１．２．５菌体质量的测定方法

测定菌丝干质量法：先把洗净的５０ｍＬ离心管放到６５℃的ＰＨ０７０Ａ型培养箱／干燥箱中烘至恒质量，然后放到干燥器中冷

（ＣＤｌ）或０．２％酵母粉（ＣＤ２）或两者的混合物（Ｃｍ）。

种子固体培养基：采用查氏固体（ｃＤ）培养基。

种子液体培养基：每升含有３９牛肉膏、１５９蛋白胨、２９酵母抽提物、２９ＮａＣＩ、１５９淀粉、１９琼脂，ｐＨ４．５。

摇瓶发酵培养基：每升含有３０９玉米浆、３０９硝酸铵、１００９葡萄糖，ｐＨ５．５。在发酵培养基中接入８％种子液，３４。Ｃ、２２０ｒ／ｒｎｉｎ摇床发酵１２０～１４４ｈ，三角瓶装液量为５０ｍｌ＿／２５０ｍＬ。１．２方法

１．２．１活化培养方法

将一７０℃冰箱的黑曲霉重组菌甘油管保藏物适当稀释后，涂布活化培养基及种子固体培养基各３块，３４℃培养７２～１２０ｈ。以菌落大小及发酵摇瓶酶活值为指标，检测活化效果。菌落大小为每块平板随机选取３０个菌落的菌落直径平均值，单位：ｍｍ。

１．２．２种子液制备方法

以涂布活化培养基上挑出单菌落划线于种子固体培养

却到室温称质量得ｍ。，用干燥过的离心管离心得到菌丝体后，

放到６５℃的ＰＨ０７０Ａ型培养箱／干燥箱中烘至恒质量，然后放到干燥器中冷却到室温称质量得ｒｎ２，菌丝干质量Ｉｎ＝ｍ２一ｍ。。１．２．６酶活测定方法

糖化酶酶活测定按原轻工部部颁ＱＢ７４６—８０标准进行。酶活定义为：ＩｍＬ酶液，于４０℃、ｐＨ４．６的条件下，ｌｈ分解可溶性淀粉产生ｌｍｇ葡萄糖，即为一个酶活力单位，以Ｕ／ｍＬ表

示阶］。

２结果与分析

２．１

不同活化培养基种类对菌体生长及发酵产酶的影响表３结果显示，ＣＤ２活化培养基上形成的菌落最大；其次

为ＣＤ３的活化培养基上形成的菌落；以查氏培养基培养的种子菌落最小。ＣＤｌ培养的种子产酶活力最高，其次为ＣＤ３培

养的种子；二者酶活值均高于现行糖化酶生产工艺中使用的眩活化培养基。

表３不同活化培养基活化种子菌落大小及酶活

Ｔａｂｌｅ３Ｃｏｌｏｎｙｓｉｚｅａｎｄｇｈｃｏａｍｙｈｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ

基，３４℃培养７２～１２０ｈ；从种子固体平板上挖４ｃｍ２左右的琼脂块放入种子液体培养基，３４℃以不同打散方式培养９６—１４４ｈ。

１．２．３打散方法

收稿日期：２００９—０６—０８；修回日期：２００９—０８—２５

基金项目：国家“８６３”讨‘划重点项目（２００６ＡＡ０２０２０４）资助

作者简介：宋毅（１９８３一），女，在读硕士生，研究方向：工来微生物育种。＊通讯作者：王正祥（１９６４一），男，教授，博士生导师，从事工业微生物资源与育种、酶制剂改良研究，Ｅｍａｉｌ：ａ＇ｗａｎｇ＠ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｅｌｌ。

２．２不同打散方式对菌体生长及发酵产酶的影响

万方数据　

２００９正１９（６）

生物技术７ｌ

为了获得较为均一的种子液，采用不同规格玻璃珠、铁丝网对菌丝进行打散。结果显示，以ｅ方式打散，培养５ｄ后所获种子液菌体浓度最高；其次为ｃ方式打散的种子液。采用打散方式ｄ，培养５ｄ后所获产酶能力最高；其次为以打散方式ｅ打散的种子液。经ｂ方式打散所获种子液种子液菌体浓度最低，产酶能力也最低（表４）。

表４不同打散方式所得种子液菌体浓度Ｔａｂｌｅ４Ｍｙｃｅｌｉｕｍｄｅｎｓｉｔｙｌ】ｆｉｎｄｉｆｆｅｍａｔｓｅｅｄ

ｓｕｇｏｅｎｓｉｏｎ

工业生产菌株Ａ．ｒｄｇｅｒＣＩＣＩⅣＩＧＢ０５０６活化培养基组成的研究

中发现，加入玉米淀粉有利于该菌糖化酶活力的提高，该结果类似于孙俊良等【７１所描述的情况。而酵母粉的加入对菌体生长则起着加速作用，这可能与酵母粉含有丰富的氨基酸和生长因子有关。丝状真菌菌丝的形态影响蛋白分泌的研究多有报道，短而高度分支的菌丝形态被认为更有利于酶的生产［８“训。ＡｍａｎｕｌｌａｈＡＣｌｌｌ指出搅拌强度对发酵液中菌丝形态的形成影响巨大，他指出在分批发酵阶段，生物量浓度、糖化酶分泌水平均随搅拌强度的增大而增加。本研究中，我们使用玻璃珠或铁丝网对摇瓶种子进行打散，实际上是增加了种子液制备过程中的搅拌强度。通过对不同方式、不同强度介质的选择，我们在分批发酵试验中得到了与之相似的结果。同２．３种子液体培养条件的优化

基于以上试验，进一步用正交试验设计实验研究和优化了种子培养阶段的初始ｐＨ、培养时间、摇瓶装液量、培养基中琼脂浓度。结果如表５所示。

表５正交试验结果ｂ（３４）

Ｔａｂｌｅ

５

Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆ

ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｂ（３４）

经极差分析可知，以菌体干重为指标时，四因素的主次顺序是Ｄ＞Ｃ＞Ｂ＞Ａ，较优组合为功ｃ３Ｂ３Ａ３，即初始ｐＨ６．５，装液量９０ｒａＬ，琼脂加量０．１５％，培养天数６ｄ。以后续摇瓶中糖化酶生产水平为指标时，四因素的主次顺序是培养基中Ｃ＞Ｄ＞Ｂ＞Ａ，较优组合为ＧＤ２玛Ａ２，即初始ｐＨ４．５、装液量９０ｒａＬ、琼脂加量０．１％、培养时间５ｄ。可以看出，菌体生长速率与种子用于后续糖化酶发酵生产并不完全同步。

曼

Ｃ

霪

故８枢霉日

昌

万　

方数据时，糖化酶生产菌株种子制备阶段的氧气供应对菌丝生长、具分泌活性菌丝的形成也产生重要影响ｕ引。糖化酶工业生产菌株Ａ．，ｌ／ｇｅｒＣＩＣＩＮＧＢ０５０６种子原始制备过程为静止培养，其通气性较差，而玻璃珠的使用使该培养过程能够在摇床上进行，该过程更有利于氧气的供应，这就为后续的发酵培养提供了更多、更分散的萌发点，不仅有利于糖化酶的分泌，也有利于降低发酵液粘度，从而进一步有利于氧气的传递。

丝状真菌具有强大的蛋白分泌能力，能进行各种翻译后加工，是真核蛋白潜在的表达宿主【１３－１５ｊ。同时，丝状真菌培养简便，成本低，而且生长迅速，发酵工艺比较成熟，为工程菌迅速投入工业生产打下了良好基础。本研究对糖化酶工业生产菌株Ａ．ｎｉｇｅｒＣＩＣＩＭＧＢ０５０６种子培养方法进行了优化，确定了添加０．２％酵母粉与１％玉米淀粉的查氏培养基活化；在装液量为９０ｍｌｄ２５０ｍＬ三角瓶中添加０．１％琼脂、起始ｐＨ为４．５的查氏液体培养基，加装４０粒粒径为３～４ｍｍ的玻璃珠或疏松的铁丝网，以转速为１３０ｒ／ｒａｉｎ摇床培养５ｄ。所获得的种子液用于后续的糖化酶摇瓶发酵试验，糖化酶的生产水平是原工艺的１．１８倍，而整个种子制备周期缩短了４ｄ，显著提高了菌株后续研究和应用的效率。．

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ｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ

７２生物技术

２００９年１９（６）

［１３］ＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎＤＢ．Ｉｍｐｌｕｖｅｍｅｎｔｏｆｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎ

ｍｎｉｅ

ｖａｎ

４驴鳓“［Ｊ］．Ａｎ・

Ｌ，ｅｔ

Ｌ七ａ匾ｗ℃ＩＩｈｏｅｋ。１９８７，５３：３４９—５２．

［Ｊ］．Ｔｒｍｄｓｍｏｔｅｄａｎｏｌ，１９９７，１５：２５６—６３．

［１５］ＣｌｅｖｅｌａｎｄＴＥ，ＹｕＪ，ＦｅｄｏｒｏｖａＮ，ｅｔａ１．Ｐ０ｔｅｎｆｉＭ

ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ

２７（３）：１５１—７．

ｇｕｄｎｏｎｌｉｃ８

［１４］Ｗｉｅｂｅ

ｐｅｒｇ／ｌｈｔｓ

Ｈｏｍｂ嘞ＪＰ，Ｖｃｍｄｅｒｖｏｏｒｔ

ｏｆ囟Ⅺ鳓站胁

ＰＪ，Ｆｒａｉｓｓｉｎｅｔ—Ｔａｃｈｅｔ

ａ１．Ａｓ－ｆｏｒｉｎ

ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｄｍ０１．，２００９Ｍａｒ。

ａｓａ

ｈｏｓｔｆｏｒｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｐｍｄｕｃｔｉｍ：ｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｏｆｐｒｏｔｅａｓｅｓ

副猪嗜血杆菌蜂胶苗的制备及免疫效果试验

赵恒章，赵坤，余燕，李国旺，马金友，张慧辉

（河南科技学院动科系，河南新乡４５３００３）

摘要：目的：以原场副猪嗜血杆菌为制苗菌株，制成自家细菌苗，预防本场猪格拉泽氏病。方法：用从河南济源一自繁自养大

型养猪场发病猪分离到的副猪嗜血杆菌进行培养，经甲醛灭活，以蜂胶为佐剂，制成原场副猪嗜血杆菌灭活苗，含菌量为２００亿／ＩＩｄ。母猪分别于产前３０ｄ和１５ｄ各注射４ｍｌ／头。仔猪出生后，分别在１５、３０日龄肌肉注射，１．５ｎⅣ头。结果：应用试验证明，该灭

活苗保护率达９８％。结论：该蜂胶苗安全、可靠，对猪格拉泽氏病有较好的预防作用。

关键词：副猪嗜血杆菌；猪格拉泽氏病；蜂胶苗

中图分类号：Ｑ８５２．６１＋４；￥８５２．４

文献标识码：Ａ

文章编号：１００４—３１１Ｘ（２００９）０６—００７２—０３

ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｒｏｐｏｌｉｓＩｎａｃｔｉｖａｔｅｄＶａｃｃｉｎｅ

ｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ

ＺＨＡＯＨｅｎｇ—ｚｈａｎｇ，ＺＨＡＯＫｕｎ，ＹＵＹａｎ，ＬＩＧｕｏ—ｗａｎｇ，ＭＡＪｉｎ—ｙｏｕ，ＺＨＡＮＧＨｕｉ—ｈｕｉ

（Ｈｅｎ∞ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏ母，。Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００３，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｍ．ＩｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｗａｓｐｒｅｖｅｎｔｅｄＧｌａｓｓｅｒ’Ｓｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｈａｅ—

ｆｒｏｍｐｉｇｆａｒｍｆｏｒｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＪｉｙｕａｎｏｆＨｅｎｎａｎ，ｗｅｒｅｍａｄｅｏｆｐｒｏｐｏｌｉｓｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｍｏｐｌｄｌｕｓｐｍ－ａｓｕｉｓｔｏｃａｕｓｅＧｌａｓｓｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ｉｓｏｌａｔｅｄ

０．４％ｃｏｍｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ．Ｉｔｃｏｎｔａｉｎｅｄ２０ｂｉｌｌｉｏｎｇｅｒｍｓｐｅｎｎ１．Ｒｅｓｕｌｔ：ＩｆｉｔＷａｓｉｎｊｅｃｔｅｄｓａｗｂｅｆｏｒｅｐａｒｔｕｒｉｔｉｏｎａｎｄｐｉｇ－

ｌｅｔｓ．ｉｔｃａｌｌｐｒｅｖｅｎｔ９８ｐｅｒｃｅｎｔｏｆｔｈｅｓａＩｌｌｅｔｙｐｅｓｔｒａｉｎｆｒｏｍｉｎｆｅｃｔｉｎｇ．Ｃｏｎｄｕｓｌｏｎ：Ｔｈｅｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｗａｓｓａｆｅａｎｄｗａｓａｓｏｅｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｅ一时．ＩｔｃｏｕｌｄｐｒｏｔｅｃｔｐｉｇｌｅｔｓａｇａｉｎｓｔＧｌａｓｓｅｒ’Ｓｄｉｓｅａｓｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．

ｖａｃｃｉｎｅｂｙ

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ；Ｇｌａｓｓｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ；ｐｒｏｐｏｌｉｓｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅ

近年来，河南济源一大型猪场持续暴发副猪嗜血杆菌病，５～８周龄断奶仔猪有不同程度的发病，整个猪群主要表现为：

梨醇、甘露醇、半乳糖、尿素酶等微量生化鉴定管，杭州天河微生物试剂有限公司；革兰氏染色液自制。１．１．３仪器

显微镜（ＯＬＹＭＰＵＳ日本）；低速冷冻大容量离心机（ＤＬ一６０００Ｂ—Ｃ上海安亭科学仪器厂）；生化培养箱（ＳＨＰ一２５０上海三发科学仪器有限公司）；不锈钢电热蒸馏水器（ＹＡ—ＩＤ２—１０

体温升高到４１．５ｑＣ，精神沉郁，食欲减退，消瘦，咳嗽，腹泻，关

节肿胀。少数病例急性死亡，表现严重呼吸困难，心力衰竭。多数呈慢性经过，体温稍高，腹式呼吸，咳嗽、腹泻，逐渐减食，有的病例口鼻流出泡沫样黏性渗出液，膝关节肿胀，有的跛行；鼻背、颌下、两耳、四肢内侧以及胸腹少毛处出现大片蓝紫色斑。该病发病率与死亡率都较高，即使治愈也影响生长，有的成了僵猪，猪场蒙受极大经济损失。为此，从该猪场分离出地方副猪嗜血杆菌菌株制成蜂胶苗用于该猪场后，副猪嗜血杆菌病得到有效的控制。

ｌ

上海申安医疗器械厂）；立式压力蒸汽灭菌锅（ＬＯＺＸ一３上海

申安医疗器械厂）；电热恒温干燥箱（２０２—３天津市奈斯特仪器有限公司）；双人单面净化工作台（ＳＷ—ｑ—ＺＦＤ苏州净化设备有限公司）；电冰箱（ＢＣＤ一２５８ＭＢ海尔）。１．１．４培养基

材料与方法

５％血液巧克力琼脂平板、兔鲜血琼脂平板、２％蛋白胨琼

脂平板、牛心脑浸液液体培养基…。

１．２方法

１．１材料

１．１．１菌种与试验动物

ｃ璐删）菌株，购于哈尔滨兽医研究所，河南科技学院预防兽

医学实验室保存；试验动物为长大二元猪（Ｓｕｓｓｃｍｆａ），４０日龄健康仔猪４头、１５Ｅｔ龄健康仔猪６头、怀孕母猪２头均由病料

型患副猪嗜血杆菌病猪场；标准金黄色葡萄球菌（鼠咖衄．

来源猪场提供。

１．１．２试剂

副猪嗜血杆菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｈ岱阳ｍｓ妇）分离于河南济源一大

１．２．１菌种分离

将一般检查后的病猪解剖，无菌采取肺脏、胸膜腔积水、

心包积液、关节液等病料涂片，革兰氏染色，镜检。同时接种于巧克力琼脂平板和ＴＳＡ平板３７℃恒温培养２４ｈ，挑取单个菌落进行纯培，取纯培养物做涂片染色镜检，同时观察细菌生长形态。

１．２．２菌种鉴定

１．２．２．１生长特性鉴定“。１

分离菌进行ＣＡＭＰ试验：将分离菌分别接种于鲜血琼脂

结晶紫，天津市博迪化工有限公司；碱性品红、石炭酸，天津市瑞金特化学品有限公司；碘、碘化钾、无水乙醇，天津市东丽区天大化学试剂厂；草酸铵，天津市北方天医化学试剂厂；硫柳汞钠盐，上海沪丰生物科技有限公司；甲醛溶液，烟台市双双化学有限公司；营养琼脂、伊红美蓝、琼脂粉琼脂、胰酪蛋

上并划一直线，再用金黄色葡萄球菌垂直划线，置烛缸中，

”℃恒温培养２４ｈ，观察细菌生长表现。同时将分离菌分别接种于含有１５ｖｅＣ，，ａＮＡＤ（酰胺腺嘌呤二核苷酸）牛心脑浸液液体培养基和不含ＮＡＤ牛心脑浸液液体培养基中，置３７。Ｃ培养２４ｈ，观察其生长情况。

１．２．２．２对生长因子需要的试验Ｈ’

将分离菌分别接种于巧克力琼脂平板、经１２０。Ｃ高压３０ｍｉｎ的巧克力琼脂平板和２％蛋自胨琼脂平板，然后于已接种待检细菌的蛋白胨琼脂上，再用葡萄球菌作一直线接种，置３７℃的温箱内培养２４～７２ｈ，观察分离菌在３种培养基上的生长情况。

１．２．２．３生化鉴定ｂ’

取上述分离菌的单菌落纯培养后分别接种于葡萄糖、木

白胨、酵母浸出粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤ）购自北京鼎国生物科技有限公司；以上试剂均为分析纯。葡萄糖、木糖、果糖、山梨糖、甘露糖、山

收稿日期：２００８—０９—２７；修回日期：２００９—０６—０５

基金项目：河南省科技攻关重点项目（“河南省副猪嗜血杆菌分子流行病学与综合防治模式研究”，０９２１０２１１０１５７）；河南省教育厅自然科学研究计划项目（“河南省副猪嗜血杆菌分子流行病学与抗繁基因筛选”，２００９８２３００５）资助

作者简介：赵恒章（１９７２一），男，唐河人，学士，讲师，从事动物疫病防治研究，发表论文ｌＯ余篇、专著ｌ部。

万方数据　

糖化酶生产菌株种子制备工艺优化

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：

宋毅， 李松， 王正祥， SONG Yi， LI Song， WANG Zheng-xiang

江南大学生物工程学院,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122生物技术

BIOTECHNOLOGY 2009,19(6)

参考文献(15条)

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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_swjs200906027.aspx

２００９年１９（６）生物技术

６９

的最佳培养基组成，进行实验，结果见表７。可知，经过响应面堆肥上的应用国内外尚未见报道。前期的实验表明ＣＨＢＩ能优化培养基后菌数比优化前提高了２７．３％。试验值与预测值有效促进堆肥温度，缩短腐熟时间，因而是研制有机物料促腐的误差为４．０８％，说明该实验值与模型预测值拟合良好，此模剂的良好菌种。本文主要从降低发酵生产成本的角度，筛选型可以用于预测嗜热脂肪土芽孢杆菌的液体发酵。

出以廉价的农副产品（豆粕、酵母粉）为主要原料的ＣＨＢｌ液体发酵培养基。利用廉价的农副产品进行发酵生产，大大降低了生产成本，且原材料易获取，适合用于大规模的工业化发酵３

生产。

表７模型验证结果扣２

７Ｉ抽ｌｅ７Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆ

ｍｏｄｅｌｖａｌｉｄａｔｉｏｎ

ｌ

项目菌数（函）

初始条件

２．４０×１０８

－０．９一Ｏ．３０Ｏ．３

Ｏ．９

响应面优化后３．０６×１０ｓ

Ｘ１

Ｆｉｘｅｄｌｅｖｅｌｓ：Ｘ３＝０

模型预测值２．９４Ｘ１０８

图ｌ

Ｙ＝ｆ（ｘ１，）（２）的响应面立体分析及其等高线图

优化后提高率（％）２７．３０％Ｆｉｇ．１

Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅａｎｄ

ｃｏｎｔｏｕｒｐｌｏｔｓｆｏｒＹ＝ｆ（Ｘ１，Ｘ２）（Ｆｉｘｅｄｌｅｖｅｌｓ：Ｘ３

实验值与模型预测值误差（％）

４．０８％

＝Ｏ）

在培养基优化过程中，合理的使用优化方法，可以减少实

验次数，取得良好的优化效果。本文借助ＳＡＳ统计软件进行０．９Ｐｌａｅｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ和响应面实验的设计和数据分析，在嗜热脂０．６Ｏ．３

肪土芽孢杆菌的液体发酵培养基优化过程中取得了良好的效２・

妥０

果。经响应面优化的最佳培养基为：酵母粉Ｏ．５ｌ％、豆粕０．｝；：

－０．３－０．６４２５％、Ｋ２Ｉ－ＩＰ０４０．９９４％。在优化后的培养基条件下发酵的菌・０．９

１．

数为３．０６Ｘ１护ｃｆｕ，比原来的提高了２７．３％。

参考文献：

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的影响［Ｊ］．环境科学学报，２００６，２６（９）：１４５８—１４６２．

图２

Ｙ＝ｆ（ｘ１。）（３）的响应面立体分析及其等高线图

［２］王景伟，陶磅，冷平，等．柿酒渣与牛粪混合高温堆肥效应研究［Ｊ］．Ｆｉｇ，２ＲｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅａｎｄｃｏｎｔｏｕｒｐｌｏｔｓｆｏｒＹ＝ｆ（Ｘ１，Ｘ３）（Ｆｉｘｅｄｌｅｖｅｌｓ：Ｘ２

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＝０）

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砷２

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Ｙ＝ｆ（Ｘ２。Ｘ３）的响应面立体分析及其等高线图

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Ｆｉｇ．３

Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅ

ａｎｄｃｏｎｔｏｕｒｐｌｏｔｓｆｏｒ

Ｙ＝ｆ（ｘ２，Ｘ３）（Ｆｉｘｅｄｌｅｖｅｌｓ：Ｘ１

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３讨论

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国农学通报，２００８，２４（７）１６９—７３．

糖化酶生产菌株种子制备工艺优化

宋毅．李松，王正祥＋

（江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡２１４１２２）

摘要：目的：缩短糖化酶工业生产菌株黑曲霉Ａ．，妇盯ＣＩＣＩＭＧＢ０５０６的种子制备周期。方法：对该菌的活化培养基配方及种子制备方式进行改良，并通过１９（３４）正交试验对其液体培养方法进行优化。结果：在固体活化培养基中添加０．２％的酵母粉及１％的玉米淀粉，有利于加速菌体生长；加入４０粒，粒径３～４ｍｍ的玻璃珠１３０ｄｒａｉｎ，摇床培养可以获得更为分散、均一的种子液；液体种子制备的较优条件为初始ｐＨ４．５，装液量９０ｍＬ，琼脂加量０．１％，培养天数５ｄ。结论：新的制备工艺使糖化酶种子制备时间较现在工业生产上使用的工艺缩短了４ｄ，进行后续糖化酶摇瓶发酵产酶水平是原工艺的１．１８倍。

关键词：糖化酶；黑曲霉；种子制备

中图分类号：Ｑ９３５；ＴＱ９２

文献标识码：Ａ

文章编号：１００４—３１１Ｘ（２０（０）０６一００６９—０４

Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ

Ｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒ

ＩｎｏｃｕｌｕｍＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ

ｏｆ

Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ——ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＳｔｒａｉｎ

ＳＯＮＧＹｉ．ＵＳｏｎｇ．ＷＡＮＧＺｈｅｎｇ—ｘｉａｎｇ。

（Ｋｅｙ

Ｌａ｝ｍｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ

ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎａｎｄＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ＆Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，

ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＳｈｏｒｔｅｎｔｈｅｔｉｍｅｆｏｒｔｈｅｓｅｅｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＡ．ｎｉｇｅｒＣＩＣＩＭＧＢ０５０６，ａｇｌｕｃｏａｍｙａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｓｔｒａｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ａｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｉｎｏｃｕｌｕｍｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＡ．ａｇｅｒＣＩＣＩＭＧＢ０５０６ＷａＳｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓｇｒｏｗｔｈｗｅｌｌｗｈｅｎｙｅａＳｔｅｘｔｒａｃｔ（Ｏ．２％）ａｎｄｃｏｍｓｔａｒｃｈ（１％）ｗａｓａｄｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ．Ｈｉｇｈｌｅｖｅｌｓｏｆｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅｗｅｒｅｐｒｏｄｕｃｅｄｗｈｅｎ４０ｐａｒｔｉｃｌｅｏｆｄａｓｓｂｅａｄｓＷｅｒｅａｄｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｍｙｃｅｌｉａｇｒｏｗｔｈｍｅｄｉｕｍ．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｌｌｌｉｑｕｉｄｉｎｏｃｕｌｕｍｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＡ．

万　

方数据

７０生物技术

ｐＨ

２００９矩１９（６）

ｎ／ｇｅｒＣＩＣＩＭＧＢ０５０６ｗｅ陀ｔｈｅｉｎｉｔｉａｌ

４．５，ｌｉｑｕｉｄｃａｐａｃｉｔｙ９０ｍＬ，ａｇａｒ

０．１％，５ｄａｙｓｃｕｌｔｕｒｅｐｅｒｉｏｄ．Ｃｏｎｄｍｉｏｎ：Ｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｄａｙｓａｎｄｔｈｅｇｌｕｃｏｍｎｙｌａｓｅｙｉｅｌｄｉｎｔｈｅｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｓｈａｋｅ—ｆｌａｓｋｆｅｒ－

ｄｕｒａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｉｎｏｃｕｈｍｗａｓｓｈｏａｅｎ４

ｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｉｎｏｅｕｌｕｍｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．ｔｈｅ

ｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｓｔｗａｓ１．１８ｔｉｍｅｓｃｏｍｐａ／ｉｓｏｎｔｏｔｈｅ撕百Ｉｌａｌｐｒｏｃｅｓｓ．

Ｋｅｙ

ｗｏｒｄｓ：ｇｌｕｅｏａｍｙｌａｓｅ；觚孵融‰ｎ／ｇｅｒ；ｉｎｏｃｕｌｕｍｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ糖化酶即葡萄糖淀粉酶（１，４一ａ一葡聚糖葡聚糖水解酶，

采用ＣＤ３为活化培养基，分别采用不同规格玻璃珠，铁丝

ＥＣ．３．２．１．３），是淀粉糖化工艺的主要酶类，被广泛地应用于

对菌丝体进行打散，打散方式见表１。以菌体浓度及发酵摇瓶

酶活值为指标，检测打散效果。菌体浓度值由种子液经稀释，分别涂布３块ＣＤ３乎板计算得到的平均值，单位：×１∥个／

ｍＬ。

食品、医药、发酵等工业［１’２】。目前，糖化酶的生产菌种主要为

黑曲霉［３］。根据使用的生产菌种不同及发酵工艺不同，工业生产中，糖化酶的发酵生产水平在３５０００—５５０００Ｕ／ｍＬ不等。糖化酶的工业化生产从过去的固体发酵沿革到上世纪９０年代初，液体发酵工艺逐步取代了原固体发酵工艺。液体发酵工艺的建立与应用极大地改善了发酵产品质量并大幅度提升了糖化酶的发酵生产水平。但现有糖化酶发酵生产技术共同存在不足之处，其中种子制备周期和发酵生产周期很长是一个较突出的问题，如实验室的种子制备需要１５ｄ以上，发酵周期通常２００１ｔ以上。在此基础上，进一步缩短其制备周期的研究未见报道。

本文首先对糖化酶生产菌株的几种活化培养基的活化效果作了比较，其次确定了摇床培养种子液的最佳打散方式，进一步研究了影响菌丝体液体菌种质量的培养基初始ｐＨ值、摇

表１种子液打散方式

Ｔａｂｌｅ

１

Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｔｏｂｒｅａｋ

ｕｐｍｙｃｅｌｉａｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ

打散方法

ａ

特征描述

静置培养

１３０ｄｒａｉｎ，摇床培养；加入粒径６—７ｍｍ的玻璃珠２０粒１３０ｄｍｉｎ，摇床培养；加入粒径３。４ｍｍ的玻璃珠２０粒１３０ｄｍｉｎ，摇床培养；１Ｊｎ入粒径３～４ｍｍ的玻璃珠４０粒１３０ｆ／ｒａｉｎ，摇床培养；加入铁丝网，网疏松，并将其卡在瓶底１３０ｄｍｉｎ，摇床培养；加入铁丝网，网密集，并将其卡在瓶底

ｂ

ｃ

ｄ

ｅ

ｆ

１．２．４正交试验方法

针对影响种子制备效果比较明显的初始ｐＨ、培养时间、装

瓶装液量、培养时间等因素，获得了糖化酶液体种子制备的最

佳工艺条件，在保障糖化酶发酵生产水平的前提下，将糖化酶种子液的制备周期缩短了４ｄ。从而有效缩短了糖化酶的发酵生产周期，降低了种子制备过程中染菌风险，提高了糖化酶发酵生产效率和降低生产成本。

液量、琼脂加量，采用四因素三水平正交试验设计试验（表２）。

以菌丝干质量及发酵酶活值（每组试验３个摇瓶）为指标，检测种子制备效果。

表２正交试验因素水平表Ｔａｂｌｅ７ｌ（平…１

Ａ初始ｐＨ

ｌ２

４．５５．５

２

Ｆａｃｔｏｒｓ

ａｎｄｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅ

ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ

１材料与方法

１．１材料

１．１．１菌种

黑曲霉ＣＩＣＩＭＧＢ０５０６（Ａｓｐｅｒ＃／／ｕｓ

ｎ／ｇｅｒ

ＣＩＣＩＭ

固童

Ｂ培养时间（ｄ）Ｃ装液量（ｍＬ）Ｄ琼脂加量（ｗ／ｖ，％）

４５

４０６０

Ｏ．０５１

ＧＢ０５０６），携

注：种子液制备采用４０粒，粒径为３～４ｍｍ玻璃珠打散。

多拷贝糖化酶基因，为本实验室前期构建的基因工程菌Ｈｊ。１．１．２培养基

活化培养基Ｉ：采用１Ｚ培养基，每升含有３９牛肉膏、１５９蛋白胨、２９酵母抽提物、２９ＮａＣｌ、１５９淀粉、２０９琼脂，ｏＨ５．８。

活化培养基１１：在ＣＤ培养基中分别加入１％玉米淀粉

１．２．５菌体质量的测定方法

测定菌丝干质量法：先把洗净的５０ｍＬ离心管放到６５℃的ＰＨ０７０Ａ型培养箱／干燥箱中烘至恒质量，然后放到干燥器中冷

（ＣＤｌ）或０．２％酵母粉（ＣＤ２）或两者的混合物（Ｃｍ）。

种子固体培养基：采用查氏固体（ｃＤ）培养基。

种子液体培养基：每升含有３９牛肉膏、１５９蛋白胨、２９酵母抽提物、２９ＮａＣＩ、１５９淀粉、１９琼脂，ｐＨ４．５。

摇瓶发酵培养基：每升含有３０９玉米浆、３０９硝酸铵、１００９葡萄糖，ｐＨ５．５。在发酵培养基中接入８％种子液，３４。Ｃ、２２０ｒ／ｒｎｉｎ摇床发酵１２０～１４４ｈ，三角瓶装液量为５０ｍｌ＿／２５０ｍＬ。１．２方法

１．２．１活化培养方法

将一７０℃冰箱的黑曲霉重组菌甘油管保藏物适当稀释后，涂布活化培养基及种子固体培养基各３块，３４℃培养７２～１２０ｈ。以菌落大小及发酵摇瓶酶活值为指标，检测活化效果。菌落大小为每块平板随机选取３０个菌落的菌落直径平均值，单位：ｍｍ。

１．２．２种子液制备方法

以涂布活化培养基上挑出单菌落划线于种子固体培养

却到室温称质量得ｍ。，用干燥过的离心管离心得到菌丝体后，

放到６５℃的ＰＨ０７０Ａ型培养箱／干燥箱中烘至恒质量，然后放到干燥器中冷却到室温称质量得ｒｎ２，菌丝干质量Ｉｎ＝ｍ２一ｍ。。１．２．６酶活测定方法

糖化酶酶活测定按原轻工部部颁ＱＢ７４６—８０标准进行。酶活定义为：ＩｍＬ酶液，于４０℃、ｐＨ４．６的条件下，ｌｈ分解可溶性淀粉产生ｌｍｇ葡萄糖，即为一个酶活力单位，以Ｕ／ｍＬ表

示阶］。

２结果与分析

２．１

不同活化培养基种类对菌体生长及发酵产酶的影响表３结果显示，ＣＤ２活化培养基上形成的菌落最大；其次

为ＣＤ３的活化培养基上形成的菌落；以查氏培养基培养的种子菌落最小。ＣＤｌ培养的种子产酶活力最高，其次为ＣＤ３培

养的种子；二者酶活值均高于现行糖化酶生产工艺中使用的眩活化培养基。

表３不同活化培养基活化种子菌落大小及酶活

Ｔａｂｌｅ３Ｃｏｌｏｎｙｓｉｚｅａｎｄｇｈｃｏａｍｙｈｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ

基，３４℃培养７２～１２０ｈ；从种子固体平板上挖４ｃｍ２左右的琼脂块放入种子液体培养基，３４℃以不同打散方式培养９６—１４４ｈ。

１．２．３打散方法

收稿日期：２００９—０６—０８；修回日期：２００９—０８—２５

基金项目：国家“８６３”讨‘划重点项目（２００６ＡＡ０２０２０４）资助

作者简介：宋毅（１９８３一），女，在读硕士生，研究方向：工来微生物育种。＊通讯作者：王正祥（１９６４一），男，教授，博士生导师，从事工业微生物资源与育种、酶制剂改良研究，Ｅｍａｉｌ：ａ＇ｗａｎｇ＠ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｅｌｌ。

２．２不同打散方式对菌体生长及发酵产酶的影响

万方数据　

２００９正１９（６）

生物技术７ｌ

为了获得较为均一的种子液，采用不同规格玻璃珠、铁丝网对菌丝进行打散。结果显示，以ｅ方式打散，培养５ｄ后所获种子液菌体浓度最高；其次为ｃ方式打散的种子液。采用打散方式ｄ，培养５ｄ后所获产酶能力最高；其次为以打散方式ｅ打散的种子液。经ｂ方式打散所获种子液种子液菌体浓度最低，产酶能力也最低（表４）。

表４不同打散方式所得种子液菌体浓度Ｔａｂｌｅ４Ｍｙｃｅｌｉｕｍｄｅｎｓｉｔｙｌ】ｆｉｎｄｉｆｆｅｍａｔｓｅｅｄ

ｓｕｇｏｅｎｓｉｏｎ

工业生产菌株Ａ．ｒｄｇｅｒＣＩＣＩⅣＩＧＢ０５０６活化培养基组成的研究

中发现，加入玉米淀粉有利于该菌糖化酶活力的提高，该结果类似于孙俊良等【７１所描述的情况。而酵母粉的加入对菌体生长则起着加速作用，这可能与酵母粉含有丰富的氨基酸和生长因子有关。丝状真菌菌丝的形态影响蛋白分泌的研究多有报道，短而高度分支的菌丝形态被认为更有利于酶的生产［８“训。ＡｍａｎｕｌｌａｈＡＣｌｌｌ指出搅拌强度对发酵液中菌丝形态的形成影响巨大，他指出在分批发酵阶段，生物量浓度、糖化酶分泌水平均随搅拌强度的增大而增加。本研究中，我们使用玻璃珠或铁丝网对摇瓶种子进行打散，实际上是增加了种子液制备过程中的搅拌强度。通过对不同方式、不同强度介质的选择，我们在分批发酵试验中得到了与之相似的结果。同２．３种子液体培养条件的优化

基于以上试验，进一步用正交试验设计实验研究和优化了种子培养阶段的初始ｐＨ、培养时间、摇瓶装液量、培养基中琼脂浓度。结果如表５所示。

表５正交试验结果ｂ（３４）

Ｔａｂｌｅ

５

Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆ

ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｂ（３４）

经极差分析可知，以菌体干重为指标时，四因素的主次顺序是Ｄ＞Ｃ＞Ｂ＞Ａ，较优组合为功ｃ３Ｂ３Ａ３，即初始ｐＨ６．５，装液量９０ｒａＬ，琼脂加量０．１５％，培养天数６ｄ。以后续摇瓶中糖化酶生产水平为指标时，四因素的主次顺序是培养基中Ｃ＞Ｄ＞Ｂ＞Ａ，较优组合为ＧＤ２玛Ａ２，即初始ｐＨ４．５、装液量９０ｒａＬ、琼脂加量０．１％、培养时间５ｄ。可以看出，菌体生长速率与种子用于后续糖化酶发酵生产并不完全同步。

曼

Ｃ

霪

故８枢霉日

昌

万　

方数据时，糖化酶生产菌株种子制备阶段的氧气供应对菌丝生长、具分泌活性菌丝的形成也产生重要影响ｕ引。糖化酶工业生产菌株Ａ．，ｌ／ｇｅｒＣＩＣＩＮＧＢ０５０６种子原始制备过程为静止培养，其通气性较差，而玻璃珠的使用使该培养过程能够在摇床上进行，该过程更有利于氧气的供应，这就为后续的发酵培养提供了更多、更分散的萌发点，不仅有利于糖化酶的分泌，也有利于降低发酵液粘度，从而进一步有利于氧气的传递。

丝状真菌具有强大的蛋白分泌能力，能进行各种翻译后加工，是真核蛋白潜在的表达宿主【１３－１５ｊ。同时，丝状真菌培养简便，成本低，而且生长迅速，发酵工艺比较成熟，为工程菌迅速投入工业生产打下了良好基础。本研究对糖化酶工业生产菌株Ａ．ｎｉｇｅｒＣＩＣＩＭＧＢ０５０６种子培养方法进行了优化，确定了添加０．２％酵母粉与１％玉米淀粉的查氏培养基活化；在装液量为９０ｍｌｄ２５０ｍＬ三角瓶中添加０．１％琼脂、起始ｐＨ为４．５的查氏液体培养基，加装４０粒粒径为３～４ｍｍ的玻璃珠或疏松的铁丝网，以转速为１３０ｒ／ｒａｉｎ摇床培养５ｄ。所获得的种子液用于后续的糖化酶摇瓶发酵试验，糖化酶的生产水平是原工艺的１．１８倍，而整个种子制备周期缩短了４ｄ，显著提高了菌株后续研究和应用的效率。．

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ｈｏｓｔｆｏｒｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｐｍｄｕｃｔｉｍ：ｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｏｆｐｒｏｔｅａｓｅｓ

副猪嗜血杆菌蜂胶苗的制备及免疫效果试验

赵恒章，赵坤，余燕，李国旺，马金友，张慧辉

（河南科技学院动科系，河南新乡４５３００３）

摘要：目的：以原场副猪嗜血杆菌为制苗菌株，制成自家细菌苗，预防本场猪格拉泽氏病。方法：用从河南济源一自繁自养大

型养猪场发病猪分离到的副猪嗜血杆菌进行培养，经甲醛灭活，以蜂胶为佐剂，制成原场副猪嗜血杆菌灭活苗，含菌量为２００亿／ＩＩｄ。母猪分别于产前３０ｄ和１５ｄ各注射４ｍｌ／头。仔猪出生后，分别在１５、３０日龄肌肉注射，１．５ｎⅣ头。结果：应用试验证明，该灭

活苗保护率达９８％。结论：该蜂胶苗安全、可靠，对猪格拉泽氏病有较好的预防作用。

关键词：副猪嗜血杆菌；猪格拉泽氏病；蜂胶苗

中图分类号：Ｑ８５２．６１＋４；￥８５２．４

文献标识码：Ａ

文章编号：１００４—３１１Ｘ（２００９）０６—００７２—０３

ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｒｏｐｏｌｉｓＩｎａｃｔｉｖａｔｅｄＶａｃｃｉｎｅ

ｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ

ＺＨＡＯＨｅｎｇ—ｚｈａｎｇ，ＺＨＡＯＫｕｎ，ＹＵＹａｎ，ＬＩＧｕｏ—ｗａｎｇ，ＭＡＪｉｎ—ｙｏｕ，ＺＨＡＮＧＨｕｉ—ｈｕｉ

（Ｈｅｎ∞ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏ母，。Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００３，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｍ．ＩｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｗａｓｐｒｅｖｅｎｔｅｄＧｌａｓｓｅｒ’Ｓｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｈａｅ—

ｆｒｏｍｐｉｇｆａｒｍｆｏｒｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＪｉｙｕａｎｏｆＨｅｎｎａｎ，ｗｅｒｅｍａｄｅｏｆｐｒｏｐｏｌｉｓｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｍｏｐｌｄｌｕｓｐｍ－ａｓｕｉｓｔｏｃａｕｓｅＧｌａｓｓｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ｉｓｏｌａｔｅｄ

０．４％ｃｏｍｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ．Ｉｔｃｏｎｔａｉｎｅｄ２０ｂｉｌｌｉｏｎｇｅｒｍｓｐｅｎｎ１．Ｒｅｓｕｌｔ：ＩｆｉｔＷａｓｉｎｊｅｃｔｅｄｓａｗｂｅｆｏｒｅｐａｒｔｕｒｉｔｉｏｎａｎｄｐｉｇ－

ｌｅｔｓ．ｉｔｃａｌｌｐｒｅｖｅｎｔ９８ｐｅｒｃｅｎｔｏｆｔｈｅｓａＩｌｌｅｔｙｐｅｓｔｒａｉｎｆｒｏｍｉｎｆｅｃｔｉｎｇ．Ｃｏｎｄｕｓｌｏｎ：Ｔｈｅｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｗａｓｓａｆｅａｎｄｗａｓａｓｏｅｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｅ一时．ＩｔｃｏｕｌｄｐｒｏｔｅｃｔｐｉｇｌｅｔｓａｇａｉｎｓｔＧｌａｓｓｅｒ’Ｓｄｉｓｅａｓｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．

ｖａｃｃｉｎｅｂｙ

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ；Ｇｌａｓｓｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ；ｐｒｏｐｏｌｉｓｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅ

近年来，河南济源一大型猪场持续暴发副猪嗜血杆菌病，５～８周龄断奶仔猪有不同程度的发病，整个猪群主要表现为：

梨醇、甘露醇、半乳糖、尿素酶等微量生化鉴定管，杭州天河微生物试剂有限公司；革兰氏染色液自制。１．１．３仪器

显微镜（ＯＬＹＭＰＵＳ日本）；低速冷冻大容量离心机（ＤＬ一６０００Ｂ—Ｃ上海安亭科学仪器厂）；生化培养箱（ＳＨＰ一２５０上海三发科学仪器有限公司）；不锈钢电热蒸馏水器（ＹＡ—ＩＤ２—１０

体温升高到４１．５ｑＣ，精神沉郁，食欲减退，消瘦，咳嗽，腹泻，关

节肿胀。少数病例急性死亡，表现严重呼吸困难，心力衰竭。多数呈慢性经过，体温稍高，腹式呼吸，咳嗽、腹泻，逐渐减食，有的病例口鼻流出泡沫样黏性渗出液，膝关节肿胀，有的跛行；鼻背、颌下、两耳、四肢内侧以及胸腹少毛处出现大片蓝紫色斑。该病发病率与死亡率都较高，即使治愈也影响生长，有的成了僵猪，猪场蒙受极大经济损失。为此，从该猪场分离出地方副猪嗜血杆菌菌株制成蜂胶苗用于该猪场后，副猪嗜血杆菌病得到有效的控制。

ｌ

上海申安医疗器械厂）；立式压力蒸汽灭菌锅（ＬＯＺＸ一３上海

申安医疗器械厂）；电热恒温干燥箱（２０２—３天津市奈斯特仪器有限公司）；双人单面净化工作台（ＳＷ—ｑ—ＺＦＤ苏州净化设备有限公司）；电冰箱（ＢＣＤ一２５８ＭＢ海尔）。１．１．４培养基

材料与方法

５％血液巧克力琼脂平板、兔鲜血琼脂平板、２％蛋白胨琼

脂平板、牛心脑浸液液体培养基…。

１．２方法

１．１材料

１．１．１菌种与试验动物

ｃ璐删）菌株，购于哈尔滨兽医研究所，河南科技学院预防兽

医学实验室保存；试验动物为长大二元猪（Ｓｕｓｓｃｍｆａ），４０日龄健康仔猪４头、１５Ｅｔ龄健康仔猪６头、怀孕母猪２头均由病料

型患副猪嗜血杆菌病猪场；标准金黄色葡萄球菌（鼠咖衄．

来源猪场提供。

１．１．２试剂

副猪嗜血杆菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｈ岱阳ｍｓ妇）分离于河南济源一大

１．２．１菌种分离

将一般检查后的病猪解剖，无菌采取肺脏、胸膜腔积水、

心包积液、关节液等病料涂片，革兰氏染色，镜检。同时接种于巧克力琼脂平板和ＴＳＡ平板３７℃恒温培养２４ｈ，挑取单个菌落进行纯培，取纯培养物做涂片染色镜检，同时观察细菌生长形态。

１．２．２菌种鉴定

１．２．２．１生长特性鉴定“。１

分离菌进行ＣＡＭＰ试验：将分离菌分别接种于鲜血琼脂

结晶紫，天津市博迪化工有限公司；碱性品红、石炭酸，天津市瑞金特化学品有限公司；碘、碘化钾、无水乙醇，天津市东丽区天大化学试剂厂；草酸铵，天津市北方天医化学试剂厂；硫柳汞钠盐，上海沪丰生物科技有限公司；甲醛溶液，烟台市双双化学有限公司；营养琼脂、伊红美蓝、琼脂粉琼脂、胰酪蛋

上并划一直线，再用金黄色葡萄球菌垂直划线，置烛缸中，

”℃恒温培养２４ｈ，观察细菌生长表现。同时将分离菌分别接种于含有１５ｖｅＣ，，ａＮＡＤ（酰胺腺嘌呤二核苷酸）牛心脑浸液液体培养基和不含ＮＡＤ牛心脑浸液液体培养基中，置３７。Ｃ培养２４ｈ，观察其生长情况。

１．２．２．２对生长因子需要的试验Ｈ’

将分离菌分别接种于巧克力琼脂平板、经１２０。Ｃ高压３０ｍｉｎ的巧克力琼脂平板和２％蛋自胨琼脂平板，然后于已接种待检细菌的蛋白胨琼脂上，再用葡萄球菌作一直线接种，置３７℃的温箱内培养２４～７２ｈ，观察分离菌在３种培养基上的生长情况。

１．２．２．３生化鉴定ｂ’

取上述分离菌的单菌落纯培养后分别接种于葡萄糖、木

白胨、酵母浸出粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤ）购自北京鼎国生物科技有限公司；以上试剂均为分析纯。葡萄糖、木糖、果糖、山梨糖、甘露糖、山

收稿日期：２００８—０９—２７；修回日期：２００９—０６—０５

基金项目：河南省科技攻关重点项目（“河南省副猪嗜血杆菌分子流行病学与综合防治模式研究”，０９２１０２１１０１５７）；河南省教育厅自然科学研究计划项目（“河南省副猪嗜血杆菌分子流行病学与抗繁基因筛选”，２００９８２３００５）资助

作者简介：赵恒章（１９７２一），男，唐河人，学士，讲师，从事动物疫病防治研究，发表论文ｌＯ余篇、专著ｌ部。

万方数据　

糖化酶生产菌株种子制备工艺优化

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：

宋毅， 李松， 王正祥， SONG Yi， LI Song， WANG Zheng-xiang

江南大学生物工程学院,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122生物技术

BIOTECHNOLOGY 2009,19(6)

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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_swjs200906027.aspx