ISSN 100727626C
N 1123870ΠQ
中国生物化学与分子生物学报
2006年10月22(10):767～771
・综述・
脂筏在病毒感染中的作用
刘 坤
1),2)
, 姜 颖
1),2)3
, 贺福初
1),2),3)3
(1)军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京 100850;2)北京蛋白质组研究中心,北京 102206;3),上海 200032)
摘要 脂筏是细胞膜上富含鞘脂和胆固醇的微区结构信号分子和免疫受体,.,脂筏为细胞表面发生的蛋白质2蛋白质和蛋白质2.研究表明,很多病毒可以利用出芽.SV40、HIV等借助脂筏完成入侵以及流感病毒等利用脂筏完,并概述目前研究病毒与脂筏相互作用的方法及存在的问题.深入研究脂筏在病毒感染中的作用,将有助于对病毒与宿主细胞的相互作用的理解,从而可能发现新的、有效的对抗病毒的方法.关键词 脂筏;病毒感染;病毒组装中图分类号 Q28
RoleofLipidRaftsinVirusesEntryandAssembly
LIUKun
2)
3)
1),2)
,JIANGYing
1),2)3
,HEFu2Chu
1),2),3)3
(1)BeijingInstituteofRadiationMedicine,Beijing100850,China;
BeijingProteomeResearchCenter,Beijing102206,China;
InstitutesofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)
Abstract Theplasmamembranecontainsdetergent2insolubleraftmicrodomainthatareenrichedinsphingolipidsandcholesterol.Lipidraftsareubiquitousincellmembranesystem.Therearesomanysignaltransducerandimmuno2receptorsinlipidraftswhickhaveacentralroleincellularphysiologicalprocesses.Lipidraftsprovidethestructuralplatformsfornumerousprotein2proteinandlipid2proteininteractionsatthecellsurface.Considerablereportsdemonstratethatmanyvirusesinteractwithlipidrafts,entryhostcells,assemblyandbuddingfromhostcellsbyhijackinglipidrafts.Inthispaper,wewilladdressthemechanismofvirusessuchasSV40,HIVentryhostcells,influenzavirusassemblyandbuddingfromhostcellsbylipidrafts.Progressinthemeansbywhichvirusesexploitraftscanpromotetheunderstandingofvirus2cellinteraction,andmightleadtonewtherapeuticstrategiestopreventoralleviatecertainviraldiseases.Keywords lipidrafts;virusentry;virusassembly
细胞膜是介导和整合细胞与其周围环境间信息交流的特化结构,同时也是阻止病原入侵细胞的第一道屏障.经典的液态镶嵌模型(fluidmosaicmodel)认为,细胞膜是由镶嵌有蛋白的均质的脂质组成.但很多研究发现,细胞膜并不是均质的,脂质也不是均匀分布在细胞膜上,而是形成一些特化的脂质结构,这些结构富含鞘脂(sphingolipids)、胆固醇(cholesterol),含这种结构的微区(microdomain)被称
[1,2]
为脂筏(lipidrafts).鞘脂和胆固醇对脂筏的形成和稳定至关重要.鞘脂通过极性头间的氢键彼此相连,非极性的脂肪酸链间的疏水范德华力起到稳定
氢键的作用.胆固醇则通过甾环与鞘氨醇、C32羟基
收稿日期:2006204210,接受日期:2006206216
北京市重大项目(No.H[1**********]0)重点资助课题
3
联系人 贺福初,Tel&Fax:[1**********]417,[1**********]208,E2mail:
[email protected];姜颖,Tel:[1**********]013,Fax:[1**********]155,E2mail:[email protected]
Received:April10,2006;Accepted:June16,2006
SupportedbyMajorProgramsofBeijing(No.H[1**********]0)
3
CorrespondingauthorHeFu2Chu,Tel&Fax:[1**********]417,862102
68171208,E2mail:[email protected];JiangYing,Tel:[1**********]013,Fax:[1**********]155,E2mail:[email protected]
768中国生物化学与分子生物学报22卷
与极性头间形成的氢键稳定脂筏结构.脂筏中也驻留有一些蛋白,或在适当的刺激下招募一些蛋白到
[3]
脂筏中来.脂筏在富含鞘脂和胆固醇的膜结构如细胞质膜、内吞体膜等中广泛存在.脂筏具有两个重要特性.一是可以选择性地富集某些蛋白,而将另一些蛋白特异性地排除在外.蛋白与脂筏间的相互作用是动态的,只有少数起维持脂筏结构作用的蛋白长久驻留在脂筏中;而大多数脂筏相关的蛋白只作短暂停留,它们利用脂筏来完成信号转导或胞外定位.脂筏的这种特性,上的蛋白变得区域化,脂,存在较大差异,,功能相关的脂筏可以相互融合,形成更大的脂筏域以协助完成特定功[2]
能.借助这两个特性,脂筏为调控大量发生在细胞表面的蛋白质2蛋白质和蛋白质2脂类分子之间的相互作用提供了一个平台.脂筏中选择性富集的蛋白多为重要的信号分子和免疫受体,它们在膜运输、蛋白分选以及细胞增殖、凋亡、迁移和黏附等过程中发挥着重要作用.面对病原入侵,细胞借助脂筏来调节防御反应中的信号转导事件,如参与免疫系统的激活.但病原体在进化和变异过程中,已经拥有了借助脂筏逃避宿主免疫监视的能力,很多病毒就可以通过脂筏完成其对宿主的感染.本文将综述脂筏在病毒感染过程中的作用.
离子型去垢剂如TritonX2100的提取,用密度梯度离心分离细胞组分时,脂筏会漂浮在低密度区.通常情况下,MHCI类分子很少能在去垢剂抵抗的膜组分中检测到;但当病毒感染时,这种膜组分中可以检测到富集有大量的MHCI类分子.以上结果提示,脂筏参与了SV40病毒入侵细胞的过程,但目前仍不清楚是由于SV40的结合促使MHCI类分子结合到已,还是细胞膜穴样内陷2.另-埃可病毒(echovirus1,.用实时监控显微镜(video2enhancedlivemicroscopy),可以明显观察到荧光标记的EV1被摄入到由绿色荧光标记的caveolin21组成的小窝体(caveosome).EV1的感染需要借助动力蛋白Ⅱ(dynaminⅡ)、胆固醇等来完成
[5]
.
包膜病毒的内化和Π或融合过程中也利用脂筏来完成.这类病毒大多通过与细胞膜融合进入细胞,这一过程需要借助病毒表面糖蛋白的构象从自然状态转变为融合激活状态.有些病毒的融合过程是pH依赖的,内化了的病毒将被运送到特定内吞区室(endocyticcompartment)中,如赛姆利基森林病毒(Semliki2forestvirus,SFV).而SFV的融合依赖于细胞膜上胆固醇和鞘脂的存在,这提示宿主细胞的脂筏可能参与了这一过程.研究发现,SFVE1蛋白与DRMs存在关联关系,E1插入脂筏中可以促进病毒与宿主细胞的融合,推测其机制可能是由于E1的插入诱导了相关脂筏间的融合,从而增加了膜表面局部区域内E1蛋白的浓度,促进了病毒与细胞的融合.但是,当用雄甾烯二酮代替胆固醇,使宿主细胞不能有效生成
DRMs,对E1蛋白的插入和病毒与宿主细胞的融合却没有产生任何影响;而当用二棕榈酰磷脂酰胆碱代替鞘脂,这样虽然不影响DRMs的形成,但却阻止了E1蛋白构象的改变和插入.因此推测,SFV与宿主细胞的融合可能并不依赖脂筏的存在,但融合却有可能在脂筏上完成,这是因为脂筏
[6]
中富集有胆固醇和鞘脂.
也有些包膜病毒进入宿主细胞,是通过非pH依赖的融合过程,如HIV.HIV21表面蛋白ENV是由非共价结合的2个亚基———gp120和gp41组成的Ⅰ型整合膜蛋白.病毒进入细胞过程中,gp120亚基结合作为病毒受体的CD4和作为共受体的趋化因子受体家族成员CCR51这一过程由gp41介导,同时需要4～6个CCR5受体、很多CD4分子和3～6个
1 作为病毒感染的通道
在病毒感染早期阶段,病毒通过与细胞表面的受体结合进入细胞.对于大多数非包膜病毒,病毒黏
附于细胞后即发生内化,并被运送到细胞内特定区室中.内化的途径有两种,一种是通过网格蛋白(clathrin)介导的内吞途径,腺病毒(adenovirus)就是利用这样的途径;另一种是通过非网格蛋白依赖的、由小窝蛋白(caveolin)介导的内吞途径,如猿病毒40(simianvirus,SV40)的内吞.SV40是通过结合到MHCI类分子然后进入细胞的,MHCI类分子介导病毒进
入细颈瓶形的细胞膜穴样内陷(caveolae)中.脂筏被认为参与了SV40侵入细胞的过程,因为用胆固醇驱散试剂破坏脂筏,就可以抑制SV40病毒的入侵.这也是目前研究脂筏常用的方法之一.另一种研究脂筏常用的方法是,低温下用非离子型去垢剂提取细胞去垢剂抵抗膜组分(detergent2resistantmembranes,DRMs).在低温条件下,脂筏可以抵制非
[4]
第10期刘 坤等:脂筏在病毒感染中的作用769
ENV三聚体共同完成.脂筏可能是这一过程发生的
位点.研究证明,gp120可以直接与脂筏中的鞘脂相
互作用,添加阻止鞘脂合成的药物可以阻止HIV21
[7]
感染.
HIV21可能通过脂筏调节gp120、CD4和共受体3者之间的相互作用,病毒结合脂筏中的CD4后,gp1202CD4复合体将向含有CCR5的脂筏侧向扩散
2 作为病毒组装和出芽的位点
研究人员在对包膜病毒的研究中发现,包膜病
毒通常只组装自身的包膜蛋白和内部蛋白;当两种不同包膜病毒感染同一宿主细胞时,组装的病毒可能同时含有两种病毒的表面蛋白,这种现象称为假型.此后研究人员提出了“假型悖论(pseudotypicparadox)))细胞膜组装细胞和.这些现象表明,病毒具有复杂的机制来识别病毒自身蛋白,不同包膜病毒可能具有共同的、高度特异的组装病毒表面结构的机制.
此后,研究人员发现,细胞脂筏蛋白常见的修饰在病毒蛋白中亦存在.很多病毒表面蛋白,无论修饰与否,都与脂筏相关;而包括一些反转录病毒在内的许多病毒,其包膜组成与宿主细胞胞膜的组成不同,
[17]
但与宿主细胞的脂筏组成非常接近.越来越多的证据表明,有些病毒是在脂筏组装并完成出芽的,如流感病毒、麻疹病毒、HIV21、埃博拉病毒等.
目前,研究病毒是否是在脂筏组装的方法有如下几种:1)经低温非离子型去垢剂提取脂筏,观察脂筏标志蛋白同病毒相关蛋白是否共富集;2)脂筏标志蛋白同病毒蛋白在质膜上是否可以荧光共定位;3)在病毒中是否可以检测到脂筏相关蛋白;4)检测病毒包膜的脂质组成和流动性,与脂筏组成是否接近;5)瓦解脂筏是否影响病毒的组装和出芽.研究流感病毒(influenzaAvirus)感染的细胞发现,病毒两种跨膜糖蛋白———血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)都可以在DRMs组分中富集;当单独表达HA或NA时,也可以得到相同结果,表明这两种蛋白都与脂筏具有固有的亲和性;添加胆固醇驱散剂后,HA不再在不溶于冷TritonX2100的DRMs组分中富集.荧光显微镜结果也表明,细胞表面的HA定位于脂筏.相对于HA和NA,流感病毒内膜表面的外周基质蛋白M1与脂筏没有亲和力或亲和力非常弱.但当流感病毒感染细胞时,HA和NA
[22,23]
可以招募M1到脂筏中来.用免疫金染色的方法定量分析病毒感染细胞表面HA蛋白的分布发现
,随着感染后时间的延长,HA表达水平的升高,细胞表面由HA蛋白组成的簇也越来越大,这些簇中还含有脂筏的特异标记物神经节苷脂GM1,而且
[24]
其形成依赖胆固醇的存在.流感病毒核蛋白也通
[25]
过脂筏依赖的机制特异定位在细胞顶膜.这些结
[18～21]
并聚合.目前已有很多研究结果支持这一推论,如当病毒结合到细胞表面时,会引起细胞表面脂筏的重分配;将具有相同亲和性的与脂筏相关联的C定位于非脂筏的膜结构中,CD42;V[9～11]
来逆转,表域中.
目前普遍认为,CD4与脂筏相关,但对共受体CCR5是不是与脂筏相关存在争议.一些研究认为,CCR5可以与脂筏结合,CCR5可以与脂筏标志物
[12]
———神经节苷脂GM1共定位.也一些研究认为,CCR5并不与脂筏相关
[13]
[8]
,尽管目前仍不能解释脂
筏相关的CD4与非脂筏相关的CCR5相互作用的机理.
脂筏在某些病毒感染过程中的作用,甚至可能
[14]
比病毒受体还要重要.Thorp等研究包膜的冠状病毒———小鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirus,MHV)
β时,分别用富含甲基22环糊精或胆固醇的培养基来培养宿主细胞,以降低或提高细胞膜中固醇的含量.
细胞膜中固醇含量的降低导致病毒感染下降了2～20倍,而固醇含量的增加使得病毒感染提高了2～10倍.固醇含量的变化对病毒刺突蛋白(spikeproteins,S蛋白)与细胞癌胚抗原相关黏附分子(carcinoembryonicantigen2relatedcelladhesionmolecule,CEACAM)受体的亲和性没有影响,对由S蛋白介导的膜融合活性也没有产生影响.那么会不会是胆固醇促使CEACAM在脂筏中富集从而间接促进了由受体介导的膜融合过程呢?研究发现,大多数的CEACAM并不能在冷TritonX2100处理的DRMs中富集,经GPI(糖基化磷脂酰肌醇)修饰的CEACAM可以在脂筏中锚定,但经这样修饰的细胞对MHV的感染并没有变得特别敏感.如上结果提示,胆固醇在病毒侵入细胞的过程中扮演了更直接的作用.但在下调了胆固醇含量的细胞中,产生的MHV病毒体的浮力密度并没有发生变化,说明MHV
[15]
的出芽与脂筏并不相关.
770中国生物化学与分子生物学报22卷
果为流感病毒在脂筏组装、出芽提供了重要证据.
[26]
Sakamoto等以HCV亚基因组复制子细胞培养体系为模型,筛选到一种亲脂的真菌代谢物2NA225可以抑制HCV的复制,其机制是NA225能够阻止脂筏主要组成成分———鞘脂的合成,使得脂筏上的HCV非结构病毒蛋白与脂筏解离.这为治疗HCV感染提供了一种新的治疗策略.
为什么病毒选择在脂筏出芽呢?目前有几种推测:一种观点认为,脂筏能够富集病毒组装、出芽所需的蛋白,从而为病毒组装提供平台;为,病毒要保持其感染性,的脂质组成,从脂[27]
成;,从而借助这些蛋白逃脱细胞或整体免疫,脂筏正好可以满足病毒
[28]
的这种需求.
究多集中于哪种病毒蛋白是与脂筏相关的,现在研究的重点已经转移到解决如下问题:脂筏是否参与了病毒入侵和组装?脂筏在病毒入侵和组装过程中的具体作用是什么?脂筏在不同病毒入侵、组装过程中扮演的角色是否一致等.
脂筏的研究为揭开诸如病毒入侵、细胞从外界,以及从,同时.(R)
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3 存在的问题
脂筏研究已经在病毒感染、组装等方面取得了很多重要的进展,越来越多的包膜病毒,甚至一些非
包膜病毒的入侵和组装都被认为与脂筏相关.这些脂筏依赖的病毒都被拿来解释不同包膜病毒的出芽机制以及假型悖论.但是,除了流感病毒外,病毒入侵和组装发生在脂筏的证据大多是间接的,需依赖病毒糖蛋白与TritonX2100不溶膜组分的共富集来证明.但是,目前仍有很多关键问题我们无法回答,如脂筏在病毒组装过程中具体起到怎样的作用?脂筏通过怎样的机制促进病毒的组装和出芽?对大多数被认为利用脂筏作为平台进行组装和出芽的病毒,是否真的能够在脂筏样膜结构中产生病毒体等.单个脂筏脂质或蛋白出现在病毒包膜中,并不能作为病毒选择性在脂筏组装和出芽的充分证据.如果一个病毒包膜只是部分由脂筏组成,这可能是由于脂筏参与了病毒组装的某一步,但也可能根本就没有参与其中,因为虽然脂筏非常小,但却广泛存在于质膜上.据估计,质膜的大部分(>50%)由脂筏覆[29]
盖.因此,脂筏可以通过随机的方式参入到正在形成中的病毒体中.脂筏是否参与了某些病毒的入侵及组装过程;如果相关,脂筏在其中扮演怎样的角色,还需要不断发展的研究方法和更直接结果来证明.
结束语 脂筏结构对正确理解细胞膜的结构和功能具有重要意义.自从发现一些病毒与脂筏相关后,这一领域迅速成为研究热点.以往脂筏领域的研
第10期刘 坤等:脂筏在病毒感染中的作用
influenza
virus
neuraminidase,
a
type
771
Ⅱtransmembrane
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细胞膜是介导和整合细胞与其周围环境间信息交流的特化结构,同时也是阻止病原入侵细胞的第一道屏障.经典的液态镶嵌模型(fluidmosaicmodel)认为,细胞膜是由镶嵌有蛋白的均质的脂质组成.但很多研究发现,细胞膜并不是均质的,脂质也不是均匀分布在细胞膜上,而是形成一些特化的脂质结构,这些结构富含鞘脂(sphingolipids)、胆固醇(cholesterol),含这种结构的微区(microdomain)被称
[1,2]
为脂筏(lipidrafts).鞘脂和胆固醇对脂筏的形成和稳定至关重要.鞘脂通过极性头间的氢键彼此相连,非极性的脂肪酸链间的疏水范德华力起到稳定
氢键的作用.胆固醇则通过甾环与鞘氨醇、C32羟基
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与极性头间形成的氢键稳定脂筏结构.脂筏中也驻留有一些蛋白,或在适当的刺激下招募一些蛋白到
[3]
脂筏中来.脂筏在富含鞘脂和胆固醇的膜结构如细胞质膜、内吞体膜等中广泛存在.脂筏具有两个重要特性.一是可以选择性地富集某些蛋白,而将另一些蛋白特异性地排除在外.蛋白与脂筏间的相互作用是动态的,只有少数起维持脂筏结构作用的蛋白长久驻留在脂筏中;而大多数脂筏相关的蛋白只作短暂停留,它们利用脂筏来完成信号转导或胞外定位.脂筏的这种特性,上的蛋白变得区域化,脂,存在较大差异,,功能相关的脂筏可以相互融合,形成更大的脂筏域以协助完成特定功[2]
能.借助这两个特性,脂筏为调控大量发生在细胞表面的蛋白质2蛋白质和蛋白质2脂类分子之间的相互作用提供了一个平台.脂筏中选择性富集的蛋白多为重要的信号分子和免疫受体,它们在膜运输、蛋白分选以及细胞增殖、凋亡、迁移和黏附等过程中发挥着重要作用.面对病原入侵,细胞借助脂筏来调节防御反应中的信号转导事件,如参与免疫系统的激活.但病原体在进化和变异过程中,已经拥有了借助脂筏逃避宿主免疫监视的能力,很多病毒就可以通过脂筏完成其对宿主的感染.本文将综述脂筏在病毒感染过程中的作用.
离子型去垢剂如TritonX2100的提取,用密度梯度离心分离细胞组分时,脂筏会漂浮在低密度区.通常情况下,MHCI类分子很少能在去垢剂抵抗的膜组分中检测到;但当病毒感染时,这种膜组分中可以检测到富集有大量的MHCI类分子.以上结果提示,脂筏参与了SV40病毒入侵细胞的过程,但目前仍不清楚是由于SV40的结合促使MHCI类分子结合到已,还是细胞膜穴样内陷2.另-埃可病毒(echovirus1,.用实时监控显微镜(video2enhancedlivemicroscopy),可以明显观察到荧光标记的EV1被摄入到由绿色荧光标记的caveolin21组成的小窝体(caveosome).EV1的感染需要借助动力蛋白Ⅱ(dynaminⅡ)、胆固醇等来完成
[5]
.
包膜病毒的内化和Π或融合过程中也利用脂筏来完成.这类病毒大多通过与细胞膜融合进入细胞,这一过程需要借助病毒表面糖蛋白的构象从自然状态转变为融合激活状态.有些病毒的融合过程是pH依赖的,内化了的病毒将被运送到特定内吞区室(endocyticcompartment)中,如赛姆利基森林病毒(Semliki2forestvirus,SFV).而SFV的融合依赖于细胞膜上胆固醇和鞘脂的存在,这提示宿主细胞的脂筏可能参与了这一过程.研究发现,SFVE1蛋白与DRMs存在关联关系,E1插入脂筏中可以促进病毒与宿主细胞的融合,推测其机制可能是由于E1的插入诱导了相关脂筏间的融合,从而增加了膜表面局部区域内E1蛋白的浓度,促进了病毒与细胞的融合.但是,当用雄甾烯二酮代替胆固醇,使宿主细胞不能有效生成
DRMs,对E1蛋白的插入和病毒与宿主细胞的融合却没有产生任何影响;而当用二棕榈酰磷脂酰胆碱代替鞘脂,这样虽然不影响DRMs的形成,但却阻止了E1蛋白构象的改变和插入.因此推测,SFV与宿主细胞的融合可能并不依赖脂筏的存在,但融合却有可能在脂筏上完成,这是因为脂筏
[6]
中富集有胆固醇和鞘脂.
也有些包膜病毒进入宿主细胞,是通过非pH依赖的融合过程,如HIV.HIV21表面蛋白ENV是由非共价结合的2个亚基———gp120和gp41组成的Ⅰ型整合膜蛋白.病毒进入细胞过程中,gp120亚基结合作为病毒受体的CD4和作为共受体的趋化因子受体家族成员CCR51这一过程由gp41介导,同时需要4～6个CCR5受体、很多CD4分子和3～6个
1 作为病毒感染的通道
在病毒感染早期阶段,病毒通过与细胞表面的受体结合进入细胞.对于大多数非包膜病毒,病毒黏
附于细胞后即发生内化,并被运送到细胞内特定区室中.内化的途径有两种,一种是通过网格蛋白(clathrin)介导的内吞途径,腺病毒(adenovirus)就是利用这样的途径;另一种是通过非网格蛋白依赖的、由小窝蛋白(caveolin)介导的内吞途径,如猿病毒40(simianvirus,SV40)的内吞.SV40是通过结合到MHCI类分子然后进入细胞的,MHCI类分子介导病毒进
入细颈瓶形的细胞膜穴样内陷(caveolae)中.脂筏被认为参与了SV40侵入细胞的过程,因为用胆固醇驱散试剂破坏脂筏,就可以抑制SV40病毒的入侵.这也是目前研究脂筏常用的方法之一.另一种研究脂筏常用的方法是,低温下用非离子型去垢剂提取细胞去垢剂抵抗膜组分(detergent2resistantmembranes,DRMs).在低温条件下,脂筏可以抵制非
[4]
第10期刘 坤等:脂筏在病毒感染中的作用769
ENV三聚体共同完成.脂筏可能是这一过程发生的
位点.研究证明,gp120可以直接与脂筏中的鞘脂相
互作用,添加阻止鞘脂合成的药物可以阻止HIV21
[7]
感染.
HIV21可能通过脂筏调节gp120、CD4和共受体3者之间的相互作用,病毒结合脂筏中的CD4后,gp1202CD4复合体将向含有CCR5的脂筏侧向扩散
2 作为病毒组装和出芽的位点
研究人员在对包膜病毒的研究中发现,包膜病
毒通常只组装自身的包膜蛋白和内部蛋白;当两种不同包膜病毒感染同一宿主细胞时,组装的病毒可能同时含有两种病毒的表面蛋白,这种现象称为假型.此后研究人员提出了“假型悖论(pseudotypicparadox)))细胞膜组装细胞和.这些现象表明,病毒具有复杂的机制来识别病毒自身蛋白,不同包膜病毒可能具有共同的、高度特异的组装病毒表面结构的机制.
此后,研究人员发现,细胞脂筏蛋白常见的修饰在病毒蛋白中亦存在.很多病毒表面蛋白,无论修饰与否,都与脂筏相关;而包括一些反转录病毒在内的许多病毒,其包膜组成与宿主细胞胞膜的组成不同,
[17]
但与宿主细胞的脂筏组成非常接近.越来越多的证据表明,有些病毒是在脂筏组装并完成出芽的,如流感病毒、麻疹病毒、HIV21、埃博拉病毒等.
目前,研究病毒是否是在脂筏组装的方法有如下几种:1)经低温非离子型去垢剂提取脂筏,观察脂筏标志蛋白同病毒相关蛋白是否共富集;2)脂筏标志蛋白同病毒蛋白在质膜上是否可以荧光共定位;3)在病毒中是否可以检测到脂筏相关蛋白;4)检测病毒包膜的脂质组成和流动性,与脂筏组成是否接近;5)瓦解脂筏是否影响病毒的组装和出芽.研究流感病毒(influenzaAvirus)感染的细胞发现,病毒两种跨膜糖蛋白———血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)都可以在DRMs组分中富集;当单独表达HA或NA时,也可以得到相同结果,表明这两种蛋白都与脂筏具有固有的亲和性;添加胆固醇驱散剂后,HA不再在不溶于冷TritonX2100的DRMs组分中富集.荧光显微镜结果也表明,细胞表面的HA定位于脂筏.相对于HA和NA,流感病毒内膜表面的外周基质蛋白M1与脂筏没有亲和力或亲和力非常弱.但当流感病毒感染细胞时,HA和NA
[22,23]
可以招募M1到脂筏中来.用免疫金染色的方法定量分析病毒感染细胞表面HA蛋白的分布发现
,随着感染后时间的延长,HA表达水平的升高,细胞表面由HA蛋白组成的簇也越来越大,这些簇中还含有脂筏的特异标记物神经节苷脂GM1,而且
[24]
其形成依赖胆固醇的存在.流感病毒核蛋白也通
[25]
过脂筏依赖的机制特异定位在细胞顶膜.这些结
[18～21]
并聚合.目前已有很多研究结果支持这一推论,如当病毒结合到细胞表面时,会引起细胞表面脂筏的重分配;将具有相同亲和性的与脂筏相关联的C定位于非脂筏的膜结构中,CD42;V[9～11]
来逆转,表域中.
目前普遍认为,CD4与脂筏相关,但对共受体CCR5是不是与脂筏相关存在争议.一些研究认为,CCR5可以与脂筏结合,CCR5可以与脂筏标志物
[12]
———神经节苷脂GM1共定位.也一些研究认为,CCR5并不与脂筏相关
[13]
[8]
,尽管目前仍不能解释脂
筏相关的CD4与非脂筏相关的CCR5相互作用的机理.
脂筏在某些病毒感染过程中的作用,甚至可能
[14]
比病毒受体还要重要.Thorp等研究包膜的冠状病毒———小鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirus,MHV)
β时,分别用富含甲基22环糊精或胆固醇的培养基来培养宿主细胞,以降低或提高细胞膜中固醇的含量.
细胞膜中固醇含量的降低导致病毒感染下降了2～20倍,而固醇含量的增加使得病毒感染提高了2～10倍.固醇含量的变化对病毒刺突蛋白(spikeproteins,S蛋白)与细胞癌胚抗原相关黏附分子(carcinoembryonicantigen2relatedcelladhesionmolecule,CEACAM)受体的亲和性没有影响,对由S蛋白介导的膜融合活性也没有产生影响.那么会不会是胆固醇促使CEACAM在脂筏中富集从而间接促进了由受体介导的膜融合过程呢?研究发现,大多数的CEACAM并不能在冷TritonX2100处理的DRMs中富集,经GPI(糖基化磷脂酰肌醇)修饰的CEACAM可以在脂筏中锚定,但经这样修饰的细胞对MHV的感染并没有变得特别敏感.如上结果提示,胆固醇在病毒侵入细胞的过程中扮演了更直接的作用.但在下调了胆固醇含量的细胞中,产生的MHV病毒体的浮力密度并没有发生变化,说明MHV
[15]
的出芽与脂筏并不相关.
770中国生物化学与分子生物学报22卷
果为流感病毒在脂筏组装、出芽提供了重要证据.
[26]
Sakamoto等以HCV亚基因组复制子细胞培养体系为模型,筛选到一种亲脂的真菌代谢物2NA225可以抑制HCV的复制,其机制是NA225能够阻止脂筏主要组成成分———鞘脂的合成,使得脂筏上的HCV非结构病毒蛋白与脂筏解离.这为治疗HCV感染提供了一种新的治疗策略.
为什么病毒选择在脂筏出芽呢?目前有几种推测:一种观点认为,脂筏能够富集病毒组装、出芽所需的蛋白,从而为病毒组装提供平台;为,病毒要保持其感染性,的脂质组成,从脂[27]
成;,从而借助这些蛋白逃脱细胞或整体免疫,脂筏正好可以满足病毒
[28]
的这种需求.
究多集中于哪种病毒蛋白是与脂筏相关的,现在研究的重点已经转移到解决如下问题:脂筏是否参与了病毒入侵和组装?脂筏在病毒入侵和组装过程中的具体作用是什么?脂筏在不同病毒入侵、组装过程中扮演的角色是否一致等.
脂筏的研究为揭开诸如病毒入侵、细胞从外界,以及从,同时.(R)
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3 存在的问题
脂筏研究已经在病毒感染、组装等方面取得了很多重要的进展,越来越多的包膜病毒,甚至一些非
包膜病毒的入侵和组装都被认为与脂筏相关.这些脂筏依赖的病毒都被拿来解释不同包膜病毒的出芽机制以及假型悖论.但是,除了流感病毒外,病毒入侵和组装发生在脂筏的证据大多是间接的,需依赖病毒糖蛋白与TritonX2100不溶膜组分的共富集来证明.但是,目前仍有很多关键问题我们无法回答,如脂筏在病毒组装过程中具体起到怎样的作用?脂筏通过怎样的机制促进病毒的组装和出芽?对大多数被认为利用脂筏作为平台进行组装和出芽的病毒,是否真的能够在脂筏样膜结构中产生病毒体等.单个脂筏脂质或蛋白出现在病毒包膜中,并不能作为病毒选择性在脂筏组装和出芽的充分证据.如果一个病毒包膜只是部分由脂筏组成,这可能是由于脂筏参与了病毒组装的某一步,但也可能根本就没有参与其中,因为虽然脂筏非常小,但却广泛存在于质膜上.据估计,质膜的大部分(>50%)由脂筏覆[29]
盖.因此,脂筏可以通过随机的方式参入到正在形成中的病毒体中.脂筏是否参与了某些病毒的入侵及组装过程;如果相关,脂筏在其中扮演怎样的角色,还需要不断发展的研究方法和更直接结果来证明.
结束语 脂筏结构对正确理解细胞膜的结构和功能具有重要意义.自从发现一些病毒与脂筏相关后,这一领域迅速成为研究热点.以往脂筏领域的研
第10期刘 坤等:脂筏在病毒感染中的作用
influenza
virus
neuraminidase,
a
type
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2006年9月