蛋白质组学在植物科学研究中的进展

DOI :10. 15889/j . issn . 1002-1302. 2010. 01. 017

江苏农业科学　2010年第1期

程彦伟, 李建友, 姜爱良, 等. 蛋白质组学在植物科学研究中的进展[J ].江苏农业科学, 2010(1) :17-20.

—17—

蛋白质组学在植物科学研究中的进展

程彦伟

1, 2

, 李建友, 姜爱良, 齐耀程, 朱　倩, 赵　昕, 张　炜

222222

(1. 洛阳师范学院生命科学系, 河南洛阳471022; 2. 南京农业大学生命科学学院, 江苏南京210095)

　　摘要:蛋白质组学是后基因组时代出现的一个新兴研究领域。随着模式植物拟南芥和水稻基因组测序完成, 蛋白质组学已被广泛应用于植物研究的各个领域。本文综述了蛋白质组学在植物发育、逆境胁迫以及亚细胞水平的研究进展。

　　关键词:蛋白质组学; 亚细胞水平; 植物生长发育; 逆境

　　中图分类号:Q 946. 1　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010) 01-0017-04

　　近年来, 随着模式植物拟南芥和水稻基因组测序完成, 植物基因组研究己转入到功能基因组。目前一些研究功能基因组的新方法和试验技术体系如c D N A 微阵列、DN A 芯片、基因表达系统分析(s e r i a l a n a l y s i s o f g e n ee x p r e s s i o n , S A G E ) 和基因敲除(g e n e k n o c k o u t ) 均能有效分析大量基因的表达和功能模式, 并取得了很大进展。但是基因功能的实现最终是以蛋白质形式体现的, 核酸水平上的变化并不能确切反映其最终功能行使产物———蛋白质的变化; 进一步而言, 多种蛋白质合成之后要经过一定修饰(信号肽的切除、磷酸化修饰、糖基

[1]

化修饰) , 以及亚细胞定位后才能发挥其功能。因此有必要从蛋白质组水平上以及亚细胞水平上对细胞某一功能的实现机理进行研究。

1　蛋白质组学在植物发育中的应用

1. 1　种子形成及萌发过程中的蛋白质组学研究

种子形成及萌发过程中, 涉及到大量蛋白质的变化。前人已利用2-D 电泳方法研究了大麦种子发育期间蛋白质组

的变化。结果表明一些蛋白质如苹果酸脱氢酶在整个发育过程中均有表达, 而其他蛋白质如抗坏血酸过氧化物酶和冷调节蛋白C o r 14b 分别与灌浆早期或成熟干燥阶段有关。

收稿日期:2009-05-20基金项目:国家自然科学基金(编号:30400030) ; 教育部新世纪优秀人才支持计划(编号:N C E T-05-0494) 。

作者简介:程彦伟(1975—) , 男, 河南清丰人, 博士, 讲师, 主要从事植物逆境蛋白质组学研究。E-m a i l :c y w z t g @126. c o m 。

C o r 14b 蛋白质在种子成熟前干燥阶段出现, 在成熟种子中含量最多, 但在种子发芽期间降解, 说明这个蛋白质在种子耐干

性上具有一定作用。最值得关注的是发育过程中低分子量α-淀粉酶或胰蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂和参与抗氧化胁迫保护的酶大量积累。在整个灌浆时期α-淀粉酶或胰蛋白酶抑制剂表达量增加, 而糜蛋白酶出现在发育晚期, 这些抑制剂可能能够保护种子免遭昆虫危害

[2]

。

1. 2　植物个体发育过程中的蛋白质组学研究

叶片是高等植物光合作用和蒸腾作用的主要位置, 其功能的行使是植物产量和品质形成的重要基础。对水稻6个不同发育时期叶片蛋白质表达模式进行研究的结果表明, 有49个蛋白质点在不同时期发生显著变化, 质谱分析和数据库检索结果表明, 中高丰度表达蛋白质随着水稻的生长, 其累积量会稍微下降, 而一些抗氧化蛋白质的累积量更是在水稻成熟

[3]

早期显著降低。

根在植物中行使多种重要功能, 包括水分和营养吸收, 合成氨基酸、植物碱、有机氮和植物激素等。Z h o n g 等分离了水稻根中的蛋白, 用考马斯亮蓝染色后得到292个蛋白点, 42个蛋白得到鉴定。K o l l e r 等结合2-D E 和M u d P I T 2种方法研究水稻根、叶和种子中的蛋白, 一共发现了2528个不同的水稻蛋白, 其中叶片蛋白1022个、根蛋白1350个

[5]

[4]

。目

前, 关于根发育过程中的细胞蛋白质组学已有相关研究, 并鉴定到了多种蛋白质。这些蛋白质分别参与能量代谢、次生代谢、病害抵抗、贮藏、转运、信号传导、蛋白质合成、细胞结构形

[6-7]

成以及细胞生长和分裂等过程。相关结果还表明, 发育

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过程中, 根细胞蛋白质谱发生了较大变化:与发育5d 的玉米根细胞蛋白质组相比, 发育9d 的玉米根细胞蛋白质组, 仅有

[6]

28%的相似性。S h e n 等用双向电泳分离水稻叶鞘蛋白, 用考马斯亮蓝染色后得到352个蛋白点, 测定了其中31个蛋白的N 端序列和

[8]

5个蛋白内部序列。T a n a k a 等用E d a m a n 降解法和质谱技术鉴定了叶鞘中79个和根中73个蛋白。后来, 他们研究了水稻基部组织的蛋白表达情况, 检测到700个蛋白点, 鉴定了61个蛋白。1. 3　植物生殖过程中的蛋白质组学研究

生殖过程是植物生命过程的重要组成部分。目前, 对植物生殖过程蛋白质组学的研究主要集中于花粉领域。花粉是高度退化的两细胞或三细胞生物体, 储藏了父本的全部遗传信息。K e r i m 等研究了花粉发育过程中蛋白表达的变化, 发现了150个差异点, 鉴定了其中40个蛋白, 代表33种不同的蛋白。D a i 等也对水稻成熟花粉蛋白进行了大规模鉴定, 共鉴定了322个蛋白, 其中很多是花粉特有的蛋白。其中, 参与信号转导、细胞壁重塑和代谢、蛋白质代谢以及糖类和能量代谢的蛋白质占有很大比例。另外, 水稻花粉萌发过程中, 73种蛋白质表达丰度上调, 包括几乎全部参与蛋白质代谢的蛋白质, 多数参与细胞骨架动态变化和离子转运的蛋白质, 以及部分参与糖类和能量代谢的蛋白质等。

关于授粉受精过程中蛋白质组变化也有报道。对自交不亲和杏在自花授粉和异花授粉过程中蛋白质组变化的研究表明, 9个蛋白质点在自交后柱头上特异性表达, 而1个蛋白质点能够在异花授粉柱头特异表达; 与自花授粉柱头蛋白质组相比, 异花授粉柱头细胞中16个蛋白质点被上调, 3个蛋白质下调。鉴定结果表明, 肌动蛋白12、烯醇酶、MY B 转录因子相似蛋白、热激蛋白70等在异花授粉后上升; 而肌动蛋白7、肌动蛋白8以及果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶仅在自花授粉后

[12]

的柱头中表达。1. 4　植物衰老过程中的蛋白质组学研究

衰老是植物生命过程的一个重要组成部分, 是受基因调控的程序性过程。关于衰老过程蛋白质组研究主要集中于叶片。豆科植物白三叶(T r i f o l i u mr e p e n s L . ) 叶片衰老过程中蛋白质组变化已被研究。结果表明下降蛋白主要包括r u b i s c o 大小亚基、ru b i s c o 活化酶以及1种光系统I I 复合体33k u 蛋白质, 暗示光合系统被损伤; 叶绿体中谷氨酰胺合成酶也发生了下降, 但仍保持在一定水平, 以供应谷氨酰胺到其他器官中。这些结果表明蛋白质降解、叶绿体损伤以及氮重新代谢

[13]

在叶片衰老中具有重要作用。

植物衰老往往还涉及到细胞程序性死亡的发生。S w i d z -i n s k i 等对衰老条件下拟南芥细胞程序性死亡过程中的蛋白质组变化进行了研究, 鉴定到11个上升蛋白质, 包括抗氧化蛋白质、线粒体蛋白质以及1种糖蛋白质, 它们可能在衰老细

[14]

胞P C D 过程中具有特异作用。2　植物逆境相关蛋白质组学分析

植物在生长发育过程中会遭遇各种不利环境因子的影响。感受这些逆境后, 植物细胞会调节抗逆相关蛋白的表达, ) , [11]

[10]

[9]

植物抗逆机制以及提高植物抗逆性能有着十分重要的意义。利用蛋白质组学技术为寻找更多、更有效的新抗逆相关基因

(或蛋白) 开辟了新的方向。2. 1　非生物胁迫下植物蛋白质组学分析

低温胁迫(包括寒害和冻害) 、盐胁迫以及干旱胁迫均是主要的非生物胁迫, 严重地影响了水稻的产量和地理分布。关于冷胁迫下植物蛋白质组变化已有相关报道。低温处理后, 植物叶片蛋白质发生明显变化:多个蛋白质受低温诱导。这些变化蛋白质分别参与信号转导、RN A 加工、蛋白质翻译、蛋白质加工、氧化还原平衡、光合作用、光呼吸以及能量代谢

[15-16]

等过程, 在多方面共同调控了植物的冷适应性。关于盐胁迫下植物蛋白质组变化也有相关报道, 150m m o l /LNa C l 处理水稻根后, 54个蛋白质点发生显著变化, 包括34个上调蛋白质和20个下调蛋白质。用M A L D I -T O F 和Q-T O F 质谱技术分析这些变化蛋白, 共鉴定了12个蛋白质点, 代表10个非冗余蛋白。这些蛋白主要参与碳水化合物、氮和能量代谢调节、活性氧种类清除、mR N A 加工、蛋白质加工以及细胞骨架稳定性, 在一定程度上反映了水稻的抗盐机制[1]。

蛋白质组学技术也已被应用于研究植物对干旱胁迫的响应。对海岸松针叶的研究表明, 38种蛋白质受干旱诱导, 其中包括参与氧化胁迫反应、热休克反应和木质素合成的酶[17]类。干旱胁迫后, 42个水稻叶片蛋白质明显变化, 其中数种参与氧化胁迫反应、细胞骨架、光合作用和能量代谢的酶类被诱导。相关研究还表明, 甜菜叶片中的79个蛋白质在干旱胁迫中发生变化, 上升蛋白质主要参与光合作用、氧化还原调节、氧化胁迫、信号转导和分子伴侣活性, 从不同方面提

[19]

高了植物的抗旱性。2. 2　植物生物逆境相关蛋白质组鉴定与分析病菌侵染时植物局部会发生坏死并诱导产生一些抗病蛋白质。2004年K i m 等发现水稻叶片中的O s P R-10、PB Z 1和R L K 受稻瘟病菌诱导表达。卵菌病原(A p h a n o m y c e s e u -t e i c h e s ) 侵染豆科植物后, 2个细胞壁蛋白质和2个小热激蛋

[21]

白质上升。赤霉病病菌侵染小麦抗病品种穗部后, 细胞蛋白质组发生较大变化, 30个蛋白质点呈现3倍以上差异。下降蛋白质主要参与碳代谢以及光合作用过程, 上升的蛋白质主要与植物抗性有关, 说明侵染后, 抗性响应被激活[22]。关于虫害下植物蛋白质组变化也有一定研究, 前人已利用双向电泳技术, 分析了极端抗虫水稻秧苗和极端感虫秧苗受虫害和未受虫害的蛋白质组的变化, 结果表明, 虫害48h 后, 感虫秧苗的1个分子量40k u 的蛋白质P 40表达明显减弱甚至消失, 而在抗虫秧苗中, P 40表达未受影响。推测P 40与褐飞虱危害后水稻的抗性应答有关3　植物亚细胞蛋白质组学相关研究

3. 1　植物叶绿体相关蛋白质组鉴定与分析

大部分叶绿体蛋白由核基因编码, 主要在细胞质中合成, 然后输入到叶绿体中。K l e f f m a n n 等用串联质谱技术鉴定了690个拟南芥叶绿体蛋白质。大部分蛋白质归属于已知蛋白复合体和代谢途径, 但是多于30%的蛋白质功能未知。叶, 154, [24]

[23]

[20]

[18]

。

程彦伟等:蛋白质组学在植物科学研究中的进展—19—

中76个蛋白质(占49%)为α-螺旋整合类囊体膜蛋白质; 27个新蛋白质功能未知, 但被预测为叶绿体运送肽, 其中

17个蛋白(63%)是整合类囊体膜蛋白质。这些新蛋白质包括2个红素氧还蛋白质和1个新D n a J 蛋白质, 它们可能与类

[25]

囊体的生物合成相关。最近C h e n 等用蓝绿胶和2D-P A G E 的方法分离水稻黄绿突变体中叶绿体类囊体膜上的蛋白复合物, 共鉴定52个蛋白点。

强光下拟南芥叶绿体蛋白质组变化已有相关报道。胁迫后, 62个蛋白质点发生明显变化, 鉴定到52个蛋白质。其中35个蛋白质降低, 14个蛋白质上调。下降蛋白质主要参与光合作用途径; 而上升的14个蛋白质中, 主要是强光胁迫相关蛋白质, 例如:热激蛋白(H S P s ) 、脱氢抗坏血酸还原酶(D H A R ) 以及超氧化物歧化酶(S O D ) 等。上升蛋白质还包括3种新发现的蛋白质, 但这3种蛋白质与强光胁迫之间的功能关系目前并不明确。3. 2　植物线粒体相关蛋白质组鉴定与分析

K r u f t 等制备了拟南芥悬浮细胞培养物的线粒体总蛋白质, 在单个p H 值3～10胶上共检测到650点。其中52种蛋白质点被鉴定到。这些蛋白质参与多种生化过程, 如呼吸作用、柠檬酸循环、氨基酸和核甘酸代谢、抗氧化保护、线粒体组

[28]

装、分子运输和蛋白质合成等。另外, M i l l a r 等用双向电泳分离拟南芥悬浮细胞培养物的线粒体蛋白质, 共鉴定了91个蛋白质, 其中81个蛋白质具有明确功能(基于序列比对) 。这些蛋白质分别参与呼吸电子传递、三羧酸循环、氨基酸代谢、蛋白质加工和组装、转录、膜运输以及抗氧化防御等。T a n a k a 等从水稻幼苗中分离纯化线粒体蛋白, 经双向电泳分离后共检测出蛋白点672个, 用E d a m a n 降解法和质谱技术2种方法共鉴定了283个蛋白点, 分别代表146种不同的

[30]

蛋白。关于植物线粒体比较蛋白质组学也有一定研究。S w e e t -l o v e 等研究了氧化胁迫对拟南芥悬浮细胞线粒体蛋白质组变化的影响。结果表明有25个蛋白质点在胁迫后显著上升, 10个蛋白质点明显下降, 另有一些线粒体蛋白质发生了降解。上升蛋白质中, 9个是对照中没有的, 包括硫氧化还原蛋白依赖性的过氧化物酶(t h i o r e d o x i n -d e p e n d e n t p e r o x i d a s e ) 以及硫氧化还原蛋白依赖性的二硫化物异构酶(t h i o r e d o x i n r e d u c t a s e -d e p e n d e n t p r o t e i nd i s u l p h i d ei s o m e r a s e ) , 它们可能参与植物线粒体内氧化还原反应, 使细胞获得适应性。C h e n 等用蓝绿胶及双向电泳对盐胁迫诱导水稻根尖细胞凋亡的线粒体进行了比较蛋白质组研究, 发现了8个与细胞凋亡有关的蛋白, 其中糖基水解酶(G l y c o s i d e H y d r o l a s e ) 、线粒体热休克蛋白H S P 70、20S 蛋白酶体亚基、超氧化物歧化酶(C u /Z n -S O D ) 上调表达; A T P 合成酶β亚基、细胞色素C 亚基6b 、腺苷蛋氨酸合成酶2、转录启动因子e I F-3下调表达。3. 3　植物细胞核相关蛋白质组鉴定与分析

细胞核(n u c l e i ) 是另一个亚细胞水平上的重要细胞器。它包含绝大部分的遗传信息, 对基因表达调控起着重要作用。B a e 等用双向电泳和M A L D I -T O F-M S 技术分离并鉴定了拟南芥叶片细胞核蛋白质组成。结果表明在2-D 胶上具有, , [32]

[31][29]

[27]

[26]

白对应着158个不同蛋白质, 按细胞功能将其分成8类, 如信号转导和基因调控、蛋白质折叠和降解(包括分子伴侣、蛋白酶和蛋白酶体组分) 、RN A 代谢(包括核基因转录、剪接体组装、前体m R N A 剪接和R N A 降解) 、结构蛋白、蛋白翻译、D N A 复制、修复和修饰以及碳代谢。但有19. 6%的蛋白没有明确的细胞功能[33]。

关于植物细胞核比较蛋白质组学也有一定研究。前人研究了冷胁迫后拟南芥细胞核蛋白质组的变化, 发现54个蛋白质点发生显著变化:上升或者下降。上升蛋白质包括60Sr i -b o s o m a l p r o t e i nP 2-A 、U2s n R N P -A 、DE A Db o x R N A 解螺旋酶、HS P 70、富丝氨酸蛋白、转录因子等, 这些蛋白质分别参与蛋白质合成、RN A 代谢、蛋白质折叠以及转录调控等过程, 在多方面参与了细胞核对于冷胁迫的适应性[33]。

3. 4　植物细胞质膜相关蛋白质组鉴定与分析

质膜是植物与外界物质交换、信息交换和能量交换的最主要位置。在植物生命各项活动中具有重要作用。通过应用蛋白质组学手段, 多种质膜组成蛋白质已被鉴定。A l e x -a n d e r s s o n 等从拟南芥的叶片和叶柄中提取并高度纯化细胞质膜蛋白质, 经生物质谱分析, 共鉴定了238个推断质膜蛋白质, 其中114个蛋白质被预测有跨膜区或是糖基磷酸肌醇锚定蛋白质。大约33. 3%的镶嵌膜蛋白质以前未曾说明是质膜蛋白质。鉴定到的238个蛋白质, 主要参与转运、信号转导、膜运输和逆境响应等生化途径。几乎25%的鉴定蛋白功

[34]

能未知, 但这些半数以上的蛋白被预测是膜镶嵌蛋白质。T a n a k a 等分离鉴定得到质膜蛋白58种, C h e n 等从水稻悬浮细胞提取质膜蛋白, 银染胶上共有250～300个可见蛋白点, 但只鉴定了14个涉及壳聚糖抗性途径的蛋白质。

冷驯化后拟南芥叶片质膜蛋白质组的变化已被研究。结果表明38个蛋白质发生了显著变化, 变化的蛋白质包括D N A 修复蛋白R A D 23、CO R 47家族脱水素蛋白、烟草D R E P P 相似蛋白、碳酸酐酶-2、伴侣素-20、以及r u b i s c o 亚基等。它们分别参与膜损伤的修复、保护膜应对渗透胁迫、信号传

导、促进C O 2固定以及蛋白质周转等过程, 从不同方面共同引起拟南芥抗冷性的提高[36]。4　讨论

综上所述, 植物蛋白质组学研究已得到广泛开展。然而植物蛋白质组学研究与其他生物(动物和微生物) 蛋白质组学研究相比, 还处于相对落后状态。除了受常规技术局限以外, 植物蛋白质组学研究还面临着更多挑战。例如, 植物样品制备受到很多影响, 比如植物细胞壁具有很强韧性, 中央大液泡中含有多种次生代谢产物; 液泡含有大量盐、有机酸、酚类物质、蛋白酶、色素等, 严重干扰蛋白质制样及等电聚焦的物质。另外, 植物研究是一个非常广泛的领域, 无论是发育、还是逆境条件下植物蛋白质组学研究仍处于起步阶段, 更多工作仍有待于完成。

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DOI :10. 15889/j . issn . 1002-1302. 2010. 01. 017

江苏农业科学　2010年第1期

程彦伟, 李建友, 姜爱良, 等. 蛋白质组学在植物科学研究中的进展[J ].江苏农业科学, 2010(1) :17-20.

—17—

蛋白质组学在植物科学研究中的进展

程彦伟

1, 2

, 李建友, 姜爱良, 齐耀程, 朱　倩, 赵　昕, 张　炜

222222

(1. 洛阳师范学院生命科学系, 河南洛阳471022; 2. 南京农业大学生命科学学院, 江苏南京210095)

　　摘要:蛋白质组学是后基因组时代出现的一个新兴研究领域。随着模式植物拟南芥和水稻基因组测序完成, 蛋白质组学已被广泛应用于植物研究的各个领域。本文综述了蛋白质组学在植物发育、逆境胁迫以及亚细胞水平的研究进展。

　　关键词:蛋白质组学; 亚细胞水平; 植物生长发育; 逆境

　　中图分类号:Q 946. 1　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010) 01-0017-04

　　近年来, 随着模式植物拟南芥和水稻基因组测序完成, 植物基因组研究己转入到功能基因组。目前一些研究功能基因组的新方法和试验技术体系如c D N A 微阵列、DN A 芯片、基因表达系统分析(s e r i a l a n a l y s i s o f g e n ee x p r e s s i o n , S A G E ) 和基因敲除(g e n e k n o c k o u t ) 均能有效分析大量基因的表达和功能模式, 并取得了很大进展。但是基因功能的实现最终是以蛋白质形式体现的, 核酸水平上的变化并不能确切反映其最终功能行使产物———蛋白质的变化; 进一步而言, 多种蛋白质合成之后要经过一定修饰(信号肽的切除、磷酸化修饰、糖基

[1]

化修饰) , 以及亚细胞定位后才能发挥其功能。因此有必要从蛋白质组水平上以及亚细胞水平上对细胞某一功能的实现机理进行研究。

1　蛋白质组学在植物发育中的应用

1. 1　种子形成及萌发过程中的蛋白质组学研究

种子形成及萌发过程中, 涉及到大量蛋白质的变化。前人已利用2-D 电泳方法研究了大麦种子发育期间蛋白质组

的变化。结果表明一些蛋白质如苹果酸脱氢酶在整个发育过程中均有表达, 而其他蛋白质如抗坏血酸过氧化物酶和冷调节蛋白C o r 14b 分别与灌浆早期或成熟干燥阶段有关。

收稿日期:2009-05-20基金项目:国家自然科学基金(编号:30400030) ; 教育部新世纪优秀人才支持计划(编号:N C E T-05-0494) 。

作者简介:程彦伟(1975—) , 男, 河南清丰人, 博士, 讲师, 主要从事植物逆境蛋白质组学研究。E-m a i l :c y w z t g @126. c o m 。

C o r 14b 蛋白质在种子成熟前干燥阶段出现, 在成熟种子中含量最多, 但在种子发芽期间降解, 说明这个蛋白质在种子耐干

性上具有一定作用。最值得关注的是发育过程中低分子量α-淀粉酶或胰蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂和参与抗氧化胁迫保护的酶大量积累。在整个灌浆时期α-淀粉酶或胰蛋白酶抑制剂表达量增加, 而糜蛋白酶出现在发育晚期, 这些抑制剂可能能够保护种子免遭昆虫危害

[2]

。

1. 2　植物个体发育过程中的蛋白质组学研究

叶片是高等植物光合作用和蒸腾作用的主要位置, 其功能的行使是植物产量和品质形成的重要基础。对水稻6个不同发育时期叶片蛋白质表达模式进行研究的结果表明, 有49个蛋白质点在不同时期发生显著变化, 质谱分析和数据库检索结果表明, 中高丰度表达蛋白质随着水稻的生长, 其累积量会稍微下降, 而一些抗氧化蛋白质的累积量更是在水稻成熟

[3]

早期显著降低。

根在植物中行使多种重要功能, 包括水分和营养吸收, 合成氨基酸、植物碱、有机氮和植物激素等。Z h o n g 等分离了水稻根中的蛋白, 用考马斯亮蓝染色后得到292个蛋白点, 42个蛋白得到鉴定。K o l l e r 等结合2-D E 和M u d P I T 2种方法研究水稻根、叶和种子中的蛋白, 一共发现了2528个不同的水稻蛋白, 其中叶片蛋白1022个、根蛋白1350个

[5]

[4]

。目

前, 关于根发育过程中的细胞蛋白质组学已有相关研究, 并鉴定到了多种蛋白质。这些蛋白质分别参与能量代谢、次生代谢、病害抵抗、贮藏、转运、信号传导、蛋白质合成、细胞结构形

[6-7]

成以及细胞生长和分裂等过程。相关结果还表明, 发育

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—18—江苏农业科学　2010年第1期

过程中, 根细胞蛋白质谱发生了较大变化:与发育5d 的玉米根细胞蛋白质组相比, 发育9d 的玉米根细胞蛋白质组, 仅有

[6]

28%的相似性。S h e n 等用双向电泳分离水稻叶鞘蛋白, 用考马斯亮蓝染色后得到352个蛋白点, 测定了其中31个蛋白的N 端序列和

[8]

5个蛋白内部序列。T a n a k a 等用E d a m a n 降解法和质谱技术鉴定了叶鞘中79个和根中73个蛋白。后来, 他们研究了水稻基部组织的蛋白表达情况, 检测到700个蛋白点, 鉴定了61个蛋白。1. 3　植物生殖过程中的蛋白质组学研究

生殖过程是植物生命过程的重要组成部分。目前, 对植物生殖过程蛋白质组学的研究主要集中于花粉领域。花粉是高度退化的两细胞或三细胞生物体, 储藏了父本的全部遗传信息。K e r i m 等研究了花粉发育过程中蛋白表达的变化, 发现了150个差异点, 鉴定了其中40个蛋白, 代表33种不同的蛋白。D a i 等也对水稻成熟花粉蛋白进行了大规模鉴定, 共鉴定了322个蛋白, 其中很多是花粉特有的蛋白。其中, 参与信号转导、细胞壁重塑和代谢、蛋白质代谢以及糖类和能量代谢的蛋白质占有很大比例。另外, 水稻花粉萌发过程中, 73种蛋白质表达丰度上调, 包括几乎全部参与蛋白质代谢的蛋白质, 多数参与细胞骨架动态变化和离子转运的蛋白质, 以及部分参与糖类和能量代谢的蛋白质等。

关于授粉受精过程中蛋白质组变化也有报道。对自交不亲和杏在自花授粉和异花授粉过程中蛋白质组变化的研究表明, 9个蛋白质点在自交后柱头上特异性表达, 而1个蛋白质点能够在异花授粉柱头特异表达; 与自花授粉柱头蛋白质组相比, 异花授粉柱头细胞中16个蛋白质点被上调, 3个蛋白质下调。鉴定结果表明, 肌动蛋白12、烯醇酶、MY B 转录因子相似蛋白、热激蛋白70等在异花授粉后上升; 而肌动蛋白7、肌动蛋白8以及果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶仅在自花授粉后

[12]

的柱头中表达。1. 4　植物衰老过程中的蛋白质组学研究

衰老是植物生命过程的一个重要组成部分, 是受基因调控的程序性过程。关于衰老过程蛋白质组研究主要集中于叶片。豆科植物白三叶(T r i f o l i u mr e p e n s L . ) 叶片衰老过程中蛋白质组变化已被研究。结果表明下降蛋白主要包括r u b i s c o 大小亚基、ru b i s c o 活化酶以及1种光系统I I 复合体33k u 蛋白质, 暗示光合系统被损伤; 叶绿体中谷氨酰胺合成酶也发生了下降, 但仍保持在一定水平, 以供应谷氨酰胺到其他器官中。这些结果表明蛋白质降解、叶绿体损伤以及氮重新代谢

[13]

在叶片衰老中具有重要作用。

植物衰老往往还涉及到细胞程序性死亡的发生。S w i d z -i n s k i 等对衰老条件下拟南芥细胞程序性死亡过程中的蛋白质组变化进行了研究, 鉴定到11个上升蛋白质, 包括抗氧化蛋白质、线粒体蛋白质以及1种糖蛋白质, 它们可能在衰老细

[14]

胞P C D 过程中具有特异作用。2　植物逆境相关蛋白质组学分析

植物在生长发育过程中会遭遇各种不利环境因子的影响。感受这些逆境后, 植物细胞会调节抗逆相关蛋白的表达, ) , [11]

[10]

[9]

植物抗逆机制以及提高植物抗逆性能有着十分重要的意义。利用蛋白质组学技术为寻找更多、更有效的新抗逆相关基因

(或蛋白) 开辟了新的方向。2. 1　非生物胁迫下植物蛋白质组学分析

低温胁迫(包括寒害和冻害) 、盐胁迫以及干旱胁迫均是主要的非生物胁迫, 严重地影响了水稻的产量和地理分布。关于冷胁迫下植物蛋白质组变化已有相关报道。低温处理后, 植物叶片蛋白质发生明显变化:多个蛋白质受低温诱导。这些变化蛋白质分别参与信号转导、RN A 加工、蛋白质翻译、蛋白质加工、氧化还原平衡、光合作用、光呼吸以及能量代谢

[15-16]

等过程, 在多方面共同调控了植物的冷适应性。关于盐胁迫下植物蛋白质组变化也有相关报道, 150m m o l /LNa C l 处理水稻根后, 54个蛋白质点发生显著变化, 包括34个上调蛋白质和20个下调蛋白质。用M A L D I -T O F 和Q-T O F 质谱技术分析这些变化蛋白, 共鉴定了12个蛋白质点, 代表10个非冗余蛋白。这些蛋白主要参与碳水化合物、氮和能量代谢调节、活性氧种类清除、mR N A 加工、蛋白质加工以及细胞骨架稳定性, 在一定程度上反映了水稻的抗盐机制[1]。

蛋白质组学技术也已被应用于研究植物对干旱胁迫的响应。对海岸松针叶的研究表明, 38种蛋白质受干旱诱导, 其中包括参与氧化胁迫反应、热休克反应和木质素合成的酶[17]类。干旱胁迫后, 42个水稻叶片蛋白质明显变化, 其中数种参与氧化胁迫反应、细胞骨架、光合作用和能量代谢的酶类被诱导。相关研究还表明, 甜菜叶片中的79个蛋白质在干旱胁迫中发生变化, 上升蛋白质主要参与光合作用、氧化还原调节、氧化胁迫、信号转导和分子伴侣活性, 从不同方面提

[19]

高了植物的抗旱性。2. 2　植物生物逆境相关蛋白质组鉴定与分析病菌侵染时植物局部会发生坏死并诱导产生一些抗病蛋白质。2004年K i m 等发现水稻叶片中的O s P R-10、PB Z 1和R L K 受稻瘟病菌诱导表达。卵菌病原(A p h a n o m y c e s e u -t e i c h e s ) 侵染豆科植物后, 2个细胞壁蛋白质和2个小热激蛋

[21]

白质上升。赤霉病病菌侵染小麦抗病品种穗部后, 细胞蛋白质组发生较大变化, 30个蛋白质点呈现3倍以上差异。下降蛋白质主要参与碳代谢以及光合作用过程, 上升的蛋白质主要与植物抗性有关, 说明侵染后, 抗性响应被激活[22]。关于虫害下植物蛋白质组变化也有一定研究, 前人已利用双向电泳技术, 分析了极端抗虫水稻秧苗和极端感虫秧苗受虫害和未受虫害的蛋白质组的变化, 结果表明, 虫害48h 后, 感虫秧苗的1个分子量40k u 的蛋白质P 40表达明显减弱甚至消失, 而在抗虫秧苗中, P 40表达未受影响。推测P 40与褐飞虱危害后水稻的抗性应答有关3　植物亚细胞蛋白质组学相关研究

3. 1　植物叶绿体相关蛋白质组鉴定与分析

大部分叶绿体蛋白由核基因编码, 主要在细胞质中合成, 然后输入到叶绿体中。K l e f f m a n n 等用串联质谱技术鉴定了690个拟南芥叶绿体蛋白质。大部分蛋白质归属于已知蛋白复合体和代谢途径, 但是多于30%的蛋白质功能未知。叶, 154, [24]

[23]

[20]

[18]

。

程彦伟等:蛋白质组学在植物科学研究中的进展—19—

中76个蛋白质(占49%)为α-螺旋整合类囊体膜蛋白质; 27个新蛋白质功能未知, 但被预测为叶绿体运送肽, 其中

17个蛋白(63%)是整合类囊体膜蛋白质。这些新蛋白质包括2个红素氧还蛋白质和1个新D n a J 蛋白质, 它们可能与类

[25]

囊体的生物合成相关。最近C h e n 等用蓝绿胶和2D-P A G E 的方法分离水稻黄绿突变体中叶绿体类囊体膜上的蛋白复合物, 共鉴定52个蛋白点。

强光下拟南芥叶绿体蛋白质组变化已有相关报道。胁迫后, 62个蛋白质点发生明显变化, 鉴定到52个蛋白质。其中35个蛋白质降低, 14个蛋白质上调。下降蛋白质主要参与光合作用途径; 而上升的14个蛋白质中, 主要是强光胁迫相关蛋白质, 例如:热激蛋白(H S P s ) 、脱氢抗坏血酸还原酶(D H A R ) 以及超氧化物歧化酶(S O D ) 等。上升蛋白质还包括3种新发现的蛋白质, 但这3种蛋白质与强光胁迫之间的功能关系目前并不明确。3. 2　植物线粒体相关蛋白质组鉴定与分析

K r u f t 等制备了拟南芥悬浮细胞培养物的线粒体总蛋白质, 在单个p H 值3～10胶上共检测到650点。其中52种蛋白质点被鉴定到。这些蛋白质参与多种生化过程, 如呼吸作用、柠檬酸循环、氨基酸和核甘酸代谢、抗氧化保护、线粒体组

[28]

装、分子运输和蛋白质合成等。另外, M i l l a r 等用双向电泳分离拟南芥悬浮细胞培养物的线粒体蛋白质, 共鉴定了91个蛋白质, 其中81个蛋白质具有明确功能(基于序列比对) 。这些蛋白质分别参与呼吸电子传递、三羧酸循环、氨基酸代谢、蛋白质加工和组装、转录、膜运输以及抗氧化防御等。T a n a k a 等从水稻幼苗中分离纯化线粒体蛋白, 经双向电泳分离后共检测出蛋白点672个, 用E d a m a n 降解法和质谱技术2种方法共鉴定了283个蛋白点, 分别代表146种不同的

[30]

蛋白。关于植物线粒体比较蛋白质组学也有一定研究。S w e e t -l o v e 等研究了氧化胁迫对拟南芥悬浮细胞线粒体蛋白质组变化的影响。结果表明有25个蛋白质点在胁迫后显著上升, 10个蛋白质点明显下降, 另有一些线粒体蛋白质发生了降解。上升蛋白质中, 9个是对照中没有的, 包括硫氧化还原蛋白依赖性的过氧化物酶(t h i o r e d o x i n -d e p e n d e n t p e r o x i d a s e ) 以及硫氧化还原蛋白依赖性的二硫化物异构酶(t h i o r e d o x i n r e d u c t a s e -d e p e n d e n t p r o t e i nd i s u l p h i d ei s o m e r a s e ) , 它们可能参与植物线粒体内氧化还原反应, 使细胞获得适应性。C h e n 等用蓝绿胶及双向电泳对盐胁迫诱导水稻根尖细胞凋亡的线粒体进行了比较蛋白质组研究, 发现了8个与细胞凋亡有关的蛋白, 其中糖基水解酶(G l y c o s i d e H y d r o l a s e ) 、线粒体热休克蛋白H S P 70、20S 蛋白酶体亚基、超氧化物歧化酶(C u /Z n -S O D ) 上调表达; A T P 合成酶β亚基、细胞色素C 亚基6b 、腺苷蛋氨酸合成酶2、转录启动因子e I F-3下调表达。3. 3　植物细胞核相关蛋白质组鉴定与分析

细胞核(n u c l e i ) 是另一个亚细胞水平上的重要细胞器。它包含绝大部分的遗传信息, 对基因表达调控起着重要作用。B a e 等用双向电泳和M A L D I -T O F-M S 技术分离并鉴定了拟南芥叶片细胞核蛋白质组成。结果表明在2-D 胶上具有, , [32]

[31][29]

[27]

[26]

白对应着158个不同蛋白质, 按细胞功能将其分成8类, 如信号转导和基因调控、蛋白质折叠和降解(包括分子伴侣、蛋白酶和蛋白酶体组分) 、RN A 代谢(包括核基因转录、剪接体组装、前体m R N A 剪接和R N A 降解) 、结构蛋白、蛋白翻译、D N A 复制、修复和修饰以及碳代谢。但有19. 6%的蛋白没有明确的细胞功能[33]。

关于植物细胞核比较蛋白质组学也有一定研究。前人研究了冷胁迫后拟南芥细胞核蛋白质组的变化, 发现54个蛋白质点发生显著变化:上升或者下降。上升蛋白质包括60Sr i -b o s o m a l p r o t e i nP 2-A 、U2s n R N P -A 、DE A Db o x R N A 解螺旋酶、HS P 70、富丝氨酸蛋白、转录因子等, 这些蛋白质分别参与蛋白质合成、RN A 代谢、蛋白质折叠以及转录调控等过程, 在多方面参与了细胞核对于冷胁迫的适应性[33]。

3. 4　植物细胞质膜相关蛋白质组鉴定与分析

质膜是植物与外界物质交换、信息交换和能量交换的最主要位置。在植物生命各项活动中具有重要作用。通过应用蛋白质组学手段, 多种质膜组成蛋白质已被鉴定。A l e x -a n d e r s s o n 等从拟南芥的叶片和叶柄中提取并高度纯化细胞质膜蛋白质, 经生物质谱分析, 共鉴定了238个推断质膜蛋白质, 其中114个蛋白质被预测有跨膜区或是糖基磷酸肌醇锚定蛋白质。大约33. 3%的镶嵌膜蛋白质以前未曾说明是质膜蛋白质。鉴定到的238个蛋白质, 主要参与转运、信号转导、膜运输和逆境响应等生化途径。几乎25%的鉴定蛋白功

[34]

能未知, 但这些半数以上的蛋白被预测是膜镶嵌蛋白质。T a n a k a 等分离鉴定得到质膜蛋白58种, C h e n 等从水稻悬浮细胞提取质膜蛋白, 银染胶上共有250～300个可见蛋白点, 但只鉴定了14个涉及壳聚糖抗性途径的蛋白质。

冷驯化后拟南芥叶片质膜蛋白质组的变化已被研究。结果表明38个蛋白质发生了显著变化, 变化的蛋白质包括D N A 修复蛋白R A D 23、CO R 47家族脱水素蛋白、烟草D R E P P 相似蛋白、碳酸酐酶-2、伴侣素-20、以及r u b i s c o 亚基等。它们分别参与膜损伤的修复、保护膜应对渗透胁迫、信号传

导、促进C O 2固定以及蛋白质周转等过程, 从不同方面共同引起拟南芥抗冷性的提高[36]。4　讨论

综上所述, 植物蛋白质组学研究已得到广泛开展。然而植物蛋白质组学研究与其他生物(动物和微生物) 蛋白质组学研究相比, 还处于相对落后状态。除了受常规技术局限以外, 植物蛋白质组学研究还面临着更多挑战。例如, 植物样品制备受到很多影响, 比如植物细胞壁具有很强韧性, 中央大液泡中含有多种次生代谢产物; 液泡含有大量盐、有机酸、酚类物质、蛋白酶、色素等, 严重干扰蛋白质制样及等电聚焦的物质。另外, 植物研究是一个非常广泛的领域, 无论是发育、还是逆境条件下植物蛋白质组学研究仍处于起步阶段, 更多工作仍有待于完成。

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