凝胶层析法教程

实验十 凝胶层析法

一、基本原理

概念(排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通

过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小 不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离 的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移 动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同 程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程 较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。（分子筛 效应）

二、凝胶的种类和性质

（一） 、交联葡聚糖凝胶（Sephadex) 由多聚葡萄糖与环氧化氯丙烷通过交联反应制成的有孔颗粒 凝胶。 Sephadex G G 后的数字为凝胶吸水值（ml水/g干胶）的10倍。如 Sephadex G-25 表示吸水量是2.5ml/g干胶。 G ：不同型号的凝胶。反应凝胶的交联程度、膨胀程度和 分部范围。

凝胶的选择

一般来讲，选择凝胶首先要根据样品的情况确定一 个合适的分离范围，根据分离范围选择合适型号的 凝胶。例如蛋白脱盐常采取分离范围较小的 Sephadex G-10或G-15。 选择凝胶的另一个方面就是凝胶的颗粒的大小。颗 粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，有 时会造成扩散现象严重；颗粒大，流速快，分辨率 较低但条件得当也可以得到满意的结果。

葡聚糖凝胶的物理特性

品 名 干胶颗粒 直径/μm  40­120  40­120  100­300  50­150  20­80  10­40  100­300  50­150  20­80  10­40  40­120  10­40  40­120  10­40  40­120  10­40  40­120  10­40  得水值  ­1  W /g.g  f  1.0±0.1  1.5±0.2  床体积  ­1  /mL.g  2­3  2.5­3.5  最适分段分离范围 球蛋白分 子质量／Da  700  1500  线性葡聚糖 分子质量/Da  700  1500  溶胀所需 时间/h  20℃ 3  3  lOO  ℃  1  1  最大流体 静力压/Pa  (cmH  O)  2  >9810(100)  >9810(100)

Sephadex G­10  Sephadex G­15  Sephadex  G­25  粗 中粗 细 超细  粗 中粗 细 超细  中粗 超细  中粗 超细  中粗 超细  中粗 超细

2.5±0.2

4­6

1000­5000

100­5000

6

2

>9810(100)

Sephadex  G­50  Sephadex  G­75  Sephdex  G­100  Sephadex  G­150  Sephadex  G­200

5.0±0.3

9­11

1500­30000

500­10000

6

2

>9810(100)

7.5±0.5  10±l.0  15±1.5  20±2.0

12­15  15­20  20­30  30­40

3000­70000  4000­150000  5000­400000  5000­800000

1000­50000  1000­100000  1000­150000  1000­200000

24  48  72  72

3  5  5  5

4905(50)  3434(35)  1472(15)  981(10)

n

n

（二） 、琼脂糖凝胶（Sepharose ;  pharmacia;Bio­Gel(Blo­Rad)  从琼脂中分离出来的天然凝胶。是大分子 的多聚糖，由D­半乳糖和3，6­脱水­L­半乳 糖交替结合而成。依靠糖链之间的

次级键如 氢键维持网状结构。琼脂糖密度越大，网状 结构越密集。

(三) 、聚丙烯酰胺凝胶

n

一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单 位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越 多，孔隙度越小。

三、 凝胶过滤的特点及应用

凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手 段，它具有设备简单、操作方便、样品回 收率高、实验重复性好、特别是不改变样 品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白 质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分 离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测 定、脱盐、样品浓缩等。

四 操作

n

分离溴酚兰（小分子）和血红蛋白（大 分子）

1 凝胶溶胀 2 装柱：装洗脱液 检查尼龙布 关闭层析 柱下口 灌凝胶 关闭下口 在柱床表面加一层洗脱液 接洗脱液平衡凝胶 柱 3 上样：关闭下口及洗脱液 打开柱下口， 柱床上留一层薄的洗脱液 上样（溴酚兰 2 滴，血红蛋白 5 滴） 4 洗脱：打开柱下口，待样品进入柱后，关闭下口，在 柱床上加一层洗脱液，接通洗脱瓶 5 凝胶的再生与保存:洗脱液洗30min,4℃保存

五 注意事项

n n

n

1 凝胶中水不能太多 2 加胶要连续，不能时断时续。装柱要均匀，既 不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装 柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。 3始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸 发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入 大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离无 法进行，不得不重新装柱。

实验十 凝胶层析法

一、基本原理

概念(排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通

过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小 不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离 的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移 动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同 程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程 较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。（分子筛 效应）

二、凝胶的种类和性质

（一） 、交联葡聚糖凝胶（Sephadex) 由多聚葡萄糖与环氧化氯丙烷通过交联反应制成的有孔颗粒 凝胶。 Sephadex G G 后的数字为凝胶吸水值（ml水/g干胶）的10倍。如 Sephadex G-25 表示吸水量是2.5ml/g干胶。 G ：不同型号的凝胶。反应凝胶的交联程度、膨胀程度和 分部范围。

凝胶的选择

一般来讲，选择凝胶首先要根据样品的情况确定一 个合适的分离范围，根据分离范围选择合适型号的 凝胶。例如蛋白脱盐常采取分离范围较小的 Sephadex G-10或G-15。 选择凝胶的另一个方面就是凝胶的颗粒的大小。颗 粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，有 时会造成扩散现象严重；颗粒大，流速快，分辨率 较低但条件得当也可以得到满意的结果。

葡聚糖凝胶的物理特性

品 名 干胶颗粒 直径/μm  40­120  40­120  100­300  50­150  20­80  10­40  100­300  50­150  20­80  10­40  40­120  10­40  40­120  10­40  40­120  10­40  40­120  10­40  得水值  ­1  W /g.g  f  1.0±0.1  1.5±0.2  床体积  ­1  /mL.g  2­3  2.5­3.5  最适分段分离范围 球蛋白分 子质量／Da  700  1500  线性葡聚糖 分子质量/Da  700  1500  溶胀所需 时间/h  20℃ 3  3  lOO  ℃  1  1  最大流体 静力压/Pa  (cmH  O)  2  >9810(100)  >9810(100)

Sephadex G­10  Sephadex G­15  Sephadex  G­25  粗 中粗 细 超细  粗 中粗 细 超细  中粗 超细  中粗 超细  中粗 超细  中粗 超细

2.5±0.2

4­6

1000­5000

100­5000

6

2

>9810(100)

Sephadex  G­50  Sephadex  G­75  Sephdex  G­100  Sephadex  G­150  Sephadex  G­200

5.0±0.3

9­11

1500­30000

500­10000

6

2

>9810(100)

7.5±0.5  10±l.0  15±1.5  20±2.0

12­15  15­20  20­30  30­40

3000­70000  4000­150000  5000­400000  5000­800000

1000­50000  1000­100000  1000­150000  1000­200000

24  48  72  72

3  5  5  5

4905(50)  3434(35)  1472(15)  981(10)

n

n

（二） 、琼脂糖凝胶（Sepharose ;  pharmacia;Bio­Gel(Blo­Rad)  从琼脂中分离出来的天然凝胶。是大分子 的多聚糖，由D­半乳糖和3，6­脱水­L­半乳 糖交替结合而成。依靠糖链之间的

次级键如 氢键维持网状结构。琼脂糖密度越大，网状 结构越密集。

(三) 、聚丙烯酰胺凝胶

n

一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单 位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越 多，孔隙度越小。

三、 凝胶过滤的特点及应用

凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手 段，它具有设备简单、操作方便、样品回 收率高、实验重复性好、特别是不改变样 品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白 质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分 离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测 定、脱盐、样品浓缩等。

四 操作

n

分离溴酚兰（小分子）和血红蛋白（大 分子）

1 凝胶溶胀 2 装柱：装洗脱液 检查尼龙布 关闭层析 柱下口 灌凝胶 关闭下口 在柱床表面加一层洗脱液 接洗脱液平衡凝胶 柱 3 上样：关闭下口及洗脱液 打开柱下口， 柱床上留一层薄的洗脱液 上样（溴酚兰 2 滴，血红蛋白 5 滴） 4 洗脱：打开柱下口，待样品进入柱后，关闭下口，在 柱床上加一层洗脱液，接通洗脱瓶 5 凝胶的再生与保存:洗脱液洗30min,4℃保存

五 注意事项

n n

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1 凝胶中水不能太多 2 加胶要连续，不能时断时续。装柱要均匀，既 不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装 柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。 3始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸 发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入 大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离无 法进行，不得不重新装柱。