蛋 白 质 含 量 的 测 定
—微量凯氏定氮法
蛋白质的理论知识：
蛋白质组成：
必需AA，条件必需AA，非必需AA,限制AA,AA模式
蛋白质功能： 蛋白质来源： 蛋白质的评价：
食物蛋白质的营养评价：
一 蛋白质的含量
1.真消化率 二蛋白质消化率 2.表观消化率
1.生物价 三蛋白质利用率 2.蛋白质净利用率 3.蛋白质功效比值 4.氨基酸评分
蛋白质含量的测定方法:
1. 定氮法 2. 双缩尿法（Biuret法） 3. Folin－酚试剂法（Lowry法） 4. 紫外吸收法 5. 考马斯亮蓝法（Bradford法） 6. 红外线检测
蛋白质测定方法的比较：
在选择方法时应考虑：
•实验对测定所要求 的灵敏度和精确度
检测条件
测定所要花 费的时间等
在选择方法时应考虑
溶液中存在 的干扰物质
蛋白质特点
微量凯氏定氮法
一、实验目的：
1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理 和方法。
2、学会使用凯氏定氮仪。
二、实验原理：
1. 氮元素： 蛋白质区别于糖和脂肪的特征， 绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一 般恒定在15～17%，平均值为16%左右。 只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以相 应的蛋白质换算系数（均值为6.25、乳制品为 6.38），就可以计算出样品中的蛋白质含量。
2. 含氮量的测定
先高温条件下强酸(浓H2SO4)把 样品中的蛋白质的有机氮全部 消化为无机氮形式
消化
反应方程式
再强碱高温水蒸气蒸馏出氨气
蒸馏
用硼酸吸收氨气
吸收
用标准盐酸进行滴定
滴定
三、试剂：
1、消化液：硫酸 2、催化剂：硫酸铜、硫酸钾 3、碱溶液：40%氢氧化钠 4、吸收液：2%硼酸 5、混合指示剂： 0.1%甲基红乙醇溶液：0.1%甲基蓝乙醇溶液=（1：1） 6、标准滴定液：0.2M HCL
四．实验步骤
步骤一
步骤二
步骤三
消化
蒸馏、吸收
滴定
（一）消化
1、标记消化瓶 2、将下列物质加入消化瓶： 牛奶1ml、浓硫酸5ml、催化剂（ K2SO4， CuSO4 ）、玻璃珠
观察浓硫酸刚加入 牛奶中的颜色？
作用？
3、将消化瓶放入智能数控消化炉进行消化，至 液体变为无色或淡蓝色 ① ② ③ 250℃ 1h左右 350℃ 40min左右 450℃ 2.5h左右
（二）蒸馏、吸收
微量凯氏定氮蒸馏装置
1：电炉 2：水蒸气发生器 3：螺旋夹 4：小玻杯及棒状玻塞 5：反应室 6：反应室外层 7：橡皮管及螺旋夹 8：冷凝管 9：蒸馏液接收瓶
传统装置
1、确保仪器运行正常、管道内
部干净、管道及其连接口密 封性好 2、准备好吸收液（200ml 2%硼 酸 + 2ml 混合指示剂）并做好 标记 3、将碱溶液及去离子水桶与仪 器连接好，放入盛装消化好 样品的消化瓶，放入盛装吸 收液的锥形瓶并保证管口插 入液面下。
半自动凯
氏定氮仪
4、设置并启动程序
程序设置：
步骤 C0（样品检测) C1（样品间清洗） 加碱或加水 E0（加碱） E1 时间 5s 0s 20s 10s 蒸馏 E0 E1 E2 E3 时间 4min 2min 0min 4min
C2（试验结束后第一次清洗） E2（加水） C3（试验结束后第二次清洗） E3（加水）
（三）滴定：
至灰色或蓝紫色 终点 至灰色或蓝紫色
五、结果计算:
X ( V 1 V 2 ) C 0 . 014 m F 100
X：样品蛋白质含量 （g/100g 或g/100mL） V1、V2：测定用样、试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积 （mL） C：盐酸标准液的摩尔浓度 （mol/L） 0.014：1mol/L盐酸标准液1mL相当于氮的克数 m：样品质量（g）或体积（mL） F：蛋白质换算系数6.25
六、注意事项:
1、严禁酸碱污染吸收液、所用去离子水及管道等。 2、固体样品消化时防止挂壁且注意梯度升温。 3、硫酸钾提高反应温度，但不可过多，否则温度过多，引起生成 的铵盐分解产生氨，影响结果。 4、硫酸铜起催化剂作用并可指示消化终点。 5、注意标记。 6、取消化瓶时防止烫伤。 7、吸收前确保管口插入液面，吸收结束后使冷凝管下端离开液 面， 并用去离子水将管口冲洗干净并回收至接收瓶。 8、规范滴定操作，且终点判定要一致。
定氮法优缺点
优点：灵敏（0.2mg-1mg）、稳定、 成本低廉
凯氏定氮法被定为食品中蛋白质含量测定的现行国家 标准及国际通行的测定方法
缺点：耗时长、特异性差
化学式： C3N6H6 分子量：126 含氮量：66.6%
鲜牛奶的151倍，是奶粉的 23倍。每100g牛奶中添加 0.1克三聚氰胺，理论上就 能提高0.625%蛋白质
三聚氰胺
牛奶和奶粉添加三聚 氰胺，就是因为它能 冒充蛋白质
1.实验完成后记得清理台面。每组的小组长负责。 2.实验报告：
实验题目 实验目的 实验原理 实验步骤 实验结果 （空白滴定的结果可以共享） 实验讨论 （操作中现象的出现原因；结果的影响因素；与商标 上显示的结果对比等。）
结果每个小组可以相同，但是讨论不能相同！
蛋 白 质 含 量 的 测 定
—微量凯氏定氮法
蛋白质的理论知识：
蛋白质组成：
必需AA，条件必需AA，非必需AA,限制AA,AA模式
蛋白质功能： 蛋白质来源： 蛋白质的评价：
食物蛋白质的营养评价：
一 蛋白质的含量
1.真消化率 二蛋白质消化率 2.表观消化率
1.生物价 三蛋白质利用率 2.蛋白质净利用率 3.蛋白质功效比值 4.氨基酸评分
蛋白质含量的测定方法:
1. 定氮法 2. 双缩尿法（Biuret法） 3. Folin－酚试剂法（Lowry法） 4. 紫外吸收法 5. 考马斯亮蓝法（Bradford法） 6. 红外线检测
蛋白质测定方法的比较：
在选择方法时应考虑：
•实验对测定所要求 的灵敏度和精确度
检测条件
测定所要花 费的时间等
在选择方法时应考虑
溶液中存在 的干扰物质
蛋白质特点
微量凯氏定氮法
一、实验目的：
1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理 和方法。
2、学会使用凯氏定氮仪。
二、实验原理：
1. 氮元素： 蛋白质区别于糖和脂肪的特征， 绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一 般恒定在15～17%，平均值为16%左右。 只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以相 应的蛋白质换算系数（均值为6.25、乳制品为 6.38），就可以计算出样品中的蛋白质含量。
2. 含氮量的测定
先高温条件下强酸(浓H2SO4)把 样品中的蛋白质的有机氮全部 消化为无机氮形式
消化
反应方程式
再强碱高温水蒸气蒸馏出氨气
蒸馏
用硼酸吸收氨气
吸收
用标准盐酸进行滴定
滴定
三、试剂：
1、消化液：硫酸 2、催化剂：硫酸铜、硫酸钾 3、碱溶液：40%氢氧化钠 4、吸收液：2%硼酸 5、混合指示剂： 0.1%甲基红乙醇溶液：0.1%甲基蓝乙醇溶液=（1：1） 6、标准滴定液：0.2M HCL
四．实验步骤
步骤一
步骤二
步骤三
消化
蒸馏、吸收
滴定
（一）消化
1、标记消化瓶 2、将下列物质加入消化瓶： 牛奶1ml、浓硫酸5ml、催化剂（ K2SO4， CuSO4 ）、玻璃珠
观察浓硫酸刚加入 牛奶中的颜色？
作用？
3、将消化瓶放入智能数控消化炉进行消化，至 液体变为无色或淡蓝色 ① ② ③ 250℃ 1h左右 350℃ 40min左右 450℃ 2.5h左右
（二）蒸馏、吸收
微量凯氏定氮蒸馏装置
1：电炉 2：水蒸气发生器 3：螺旋夹 4：小玻杯及棒状玻塞 5：反应室 6：反应室外层 7：橡皮管及螺旋夹 8：冷凝管 9：蒸馏液接收瓶
传统装置
1、确保仪器运行正常、管道内
部干净、管道及其连接口密 封性好 2、准备好吸收液（200ml 2%硼 酸 + 2ml 混合指示剂）并做好 标记 3、将碱溶液及去离子水桶与仪 器连接好，放入盛装消化好 样品的消化瓶，放入盛装吸 收液的锥形瓶并保证管口插 入液面下。
半自动凯
氏定氮仪
4、设置并启动程序
程序设置：
步骤 C0（样品检测) C1（样品间清洗） 加碱或加水 E0（加碱） E1 时间 5s 0s 20s 10s 蒸馏 E0 E1 E2 E3 时间 4min 2min 0min 4min
C2（试验结束后第一次清洗） E2（加水） C3（试验结束后第二次清洗） E3（加水）
（三）滴定：
至灰色或蓝紫色 终点 至灰色或蓝紫色
五、结果计算:
X ( V 1 V 2 ) C 0 . 014 m F 100
X：样品蛋白质含量 （g/100g 或g/100mL） V1、V2：测定用样、试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积 （mL） C：盐酸标准液的摩尔浓度 （mol/L） 0.014：1mol/L盐酸标准液1mL相当于氮的克数 m：样品质量（g）或体积（mL） F：蛋白质换算系数6.25
六、注意事项:
1、严禁酸碱污染吸收液、所用去离子水及管道等。 2、固体样品消化时防止挂壁且注意梯度升温。 3、硫酸钾提高反应温度，但不可过多，否则温度过多，引起生成 的铵盐分解产生氨，影响结果。 4、硫酸铜起催化剂作用并可指示消化终点。 5、注意标记。 6、取消化瓶时防止烫伤。 7、吸收前确保管口插入液面，吸收结束后使冷凝管下端离开液 面， 并用去离子水将管口冲洗干净并回收至接收瓶。 8、规范滴定操作，且终点判定要一致。
定氮法优缺点
优点：灵敏（0.2mg-1mg）、稳定、 成本低廉
凯氏定氮法被定为食品中蛋白质含量测定的现行国家 标准及国际通行的测定方法
缺点：耗时长、特异性差
化学式： C3N6H6 分子量：126 含氮量：66.6%
鲜牛奶的151倍，是奶粉的 23倍。每100g牛奶中添加 0.1克三聚氰胺，理论上就 能提高0.625%蛋白质
三聚氰胺
牛奶和奶粉添加三聚 氰胺，就是因为它能 冒充蛋白质
1.实验完成后记得清理台面。每组的小组长负责。 2.实验报告：
实验题目 实验目的 实验原理 实验步骤 实验结果 （空白滴定的结果可以共享） 实验讨论 （操作中现象的出现原因；结果的影响因素；与商标 上显示的结果对比等。）
结果每个小组可以相同，但是讨论不能相同！