第14卷第6期2002
年11月
化 学 进 展
PRO GR ESS I N CH E M ISTR Y
V o l . 14N o. 6
N ov . , 2002
氧化还原蛋白质电化学研究3
刘慧宏1, 2 庞代文133
(11武汉大学化学系 武汉430072; 21襄樊学院化学系 襄樊441053)
摘 要 研究氧化还原蛋白质与电极之间的电子传递过程不仅为理解代谢过程提供有价值的信息, 而且为制备生物传感器奠定基础。本文从蛋白质修饰电极、蛋白质在电极表面的定向固定及蛋白质人工改造三方面, 评述了近年来氧化还原蛋白质电化学研究的进展, 并提出了今后可能的研究方向。
关键词 氧化还原蛋白质 酶 生物电化学
中图分类号:Q 59112; Q 814; O 64615 文献标识码:A 文章编号:10052281X (2002) 0620425208
Stud ies i n Electrochem istry of Redox Prote i n s
L iu H u ihong
1, 2
3
P D a i w en 133
(1. D ep artm en t of Chem istry , W uhan , uhan Ch ina ; 2. D ep artm en t of Chem istry , X 441053, Ch ina )
Abstract T he Study 2rocess betw een the redox p ro tein s and electrodes is no t on ly valuabe understand the m etabo lic p rocess , bu t also is the basis of the . t advances in electrochem istry of redox p ro tein s o r enzym es are review ed , p rep arati on rs
including the p ro tein 2electrode in terfaces , directi onal i m m ob ilizati on of p ro tein s on electrodes and p ro tein recon structi on , m odificati on o r engineering fo r electrochem istry . Fu rther research areas are sug 2gested .
Key words redox p ro tein s ; enzym es ; b i oelectrochem istry
实现氧化还原蛋白质(包括酶) 与电极之间的直
一、引 言
1977年, H ill [1]和Kuw ana [2]分别发现马心细胞
接电子传递并非易事。首先, 根据M arcu s 电子转移理论, 两氧化还原电对之间电子传递的动力学特性
由以下因素决定[11]:推动力(如电势的差异) , 重组能(定性反映氧化还原物质的结构) 和氧化还原中心间的距离。通常, 由于氧化还原蛋白质的辅基(生物活性基团常常为电化学活性基团) 被多肽链所包裹, 其与电极表面的距离较大, 因而难于进行电子传递。其次, 氧化还原酶分为含有或不含电子传递通道两类[12], 前者在自然体系中参与电子传递过程, 其活性中心与酶分子表面之间存在电子传递通道; 相反, 后者不参与电子转移过程, 所以在其分子中不存在电子传递通道, 这类氧化还原酶很难实现直接电化
色素c (Cyt c ) 与金电极和掺锡氧化铟电极之间有直接可逆的电化学反应。1979年, 酶与电极的直接电子传递也见报道[3]。这些开创性的工作为用电化学手段探索生物体系的奥秘打开了大门[4—10]。一方面, 用电极充当电子的给予体或接受体, 可以模拟生物体系电子传递机理和代谢过程, 测定热力学和动力学参数; 另一方面, 利用生物反应的特异性和电分析方法的灵敏性及实时检测性相结合, 制备生物电化学传感器, 为生物物质的检测提供强有力的手段。
收稿:2002年1月, 收修改稿:2002年5月
3国家自然科学基金(20025311) 和湖北省教育厅科研基金资助项目(2001B 69002) 33通讯联系人 e 2m ail :dw p ang @w hu . edu . cn
・426・
化 学 进 展
第14卷
学反应, 除非它的氧化还原活性点位于酶分子表面; 第三, 氧化还原蛋白质结构复杂且具有各向异性, 它们的活性中心并不正好位于蛋白的中心, 此外蛋白质分子表面还呈现电荷分布不均匀性。在生物体系中, 一些氧化还原蛋白质之间具有较大的电子传递速度, 这归功于围绕电子传递活性中心的氨基酸残基的作用, 这些氨基酸残基能够调节蛋白质的相对位置, 使蛋白质的氧化还原中心之间的距离尽可能地缩短, 从而提高电子传递速率。因此蛋白质在电极表面的取向是实现蛋白质2电极直接电子传递的重要因素。本文将对蛋白质修饰电极、蛋白质在电极表面定向固定及蛋白质人工改造三方面的最新进展作一评述。
程。[3Fe 24S ]对金属离子有亲和作用, 当溶液中存在金属离子M 时, [3Fe 24S ]转化为[M 3Fe 24S ],在循环伏安图上出现新的氧化还原峰。而且[3Fe 24S ]对金属离子的亲和力与其氧化态有关, 金属离子对[3Fe 24S ]的亲和力也有差异, 如Cd >Zn >Fe [15]。
PFV 也被成功地应用到酶的研究。细胞色素c
氧化酶在低温低离子强度条件下, 吸附在PEG 电极表面, 无H 2O 2时, 得血红素Fe ( ) Fe ( ) 电对可逆的氧化还原峰。当加入H 2O 2后, 则得催化氧化
[16]
H 2O 2的电流峰。研究多活性中心酶分子内的电
二、蛋白质修饰电极
蛋白质在电极表面具有良好的取向是实现蛋白质2电极之间直接快速电子传递的前提。因此采用适当的方法在电极表面固定蛋白质, 是目前蛋白质电化学研究的热点。
11蛋白质膜修饰电极
由A rm strong 伏安法(PFV ) 13]:简单, ; (2) 克服了溶液体系中蛋白质的扩散系数较小的限制; (3) 能使用快速扫描伏安法研究电子传递过程; (4) 通过电化学数据分析可获得丰富的生物化学信息。
蛋白质膜修饰电极的制备:经过抛光的棱面裂解石墨电极(PEG ) 表面产生较多的亲水含氧基团。在低温(0°低离子强度和共吸附剂(如氨基环多C ) 、
醇) 的存在下, 通过静电吸附作用, 在电极表面形成一层蛋白质膜(吸附量10-11—10-12m o l c m -2) 。共吸附剂在荷电的蛋白质和电极之间起着促进电子传递的作用。
蛋白质中的铁2硫簇是电子传递中心, 但铁2硫簇缺乏特征光谱, 难以实时监测氧化还原过程中铁2硫簇组成和结构的变化。PFV 所得的循环伏安曲线犹如蛋白质中铁2硫簇氧化还原电势的指纹图, 清晰地给出蛋白质中不同铁2硫簇的氧化还原电势。含7个铁原子的铁蛋白呈现三对氧化还原峰:其中[3Fe 2
4S ]显示两对峰, 分别属于[3Fe 24S ]+ 和[3Fe 2
2-+
4S ]0 ; 另一对是[4Fe 24S ]2+ 的氧化还原峰。其中
2-[3Fe 24S ]0 的还原电势与溶液的pH 有关, 表明电子传递过程同时伴随质子传递[14]。
PFV 能研究铁2硫簇与金属离子键合反应过
子传递过程, PFV 也显示出优势[17, 18]。马富酸还原酶的循环伏安图反映出3种铁2硫簇和FAD 的两对可逆氧化还原峰, 当加入马富酸时, 可得两个催化电流峰。从峰的电势、内的两种电子传递途径:Fe 3Fe →FAD 和4Fe FAD []。
21蛋白质2溶胶 凝胶修饰电极蛋白质包埋在溶胶 凝胶中, 一方面与硅酸酯形成氢健, 使之构象不易变化; 另一方面, 与硅酸酯中的甲基等疏水基团存在相互作用, 既能保持蛋白质的活性, 又可防止蛋白质从凝胶膜内泄漏, 而一些小分子、离子则可以自由进出溶胶 凝胶的孔隙。特别是一些掺杂和衍生的溶胶 凝胶, 克服了生物分子在溶胶 凝胶形成过程中, 因温度、酸度及有机溶剂等不利条件而降低酶活性的问题[19—21]。
在溶胶 凝胶中加入聚乙烯醇接枝42乙烯吡啶(PVA 2g 2PV P ) , 由于PVA 2g 2PV P 具有良好的生物相溶性, 能与酶分子的外部环境相匹配, 且分子中的大量氢键能稳定酶如葡萄糖氧化酶(GOD ) 的天然构型, 极大地保持了酶的活性。另外, 溶胶 凝胶与水凝胶相互交联成网, 能增加酶的固定化效率[22]。
在溶胶 凝胶衍生的复合陶瓷2碳电极(CCE s ) 中, 酶首先吸附在载体上(石墨粉) 以避免溶胶 凝胶形成过程中不利条件的影响。衍生的溶胶 凝胶又营造了适宜酶的环境。将吸附GOD 的石墨粉包埋在由N 2[(32三甲氧基硅烷基) 丙基]二茂铁基酰胺、甲基三甲氧基硅烷和丙氨基硅烷等共聚合的硅酸脂聚合物骨架内, 在此聚合物中含有石墨粉、二茂铁、氨基和甲基等。其中石墨粉起导电作用; 硅酸脂通过交联形成刚性骨架以包埋GOD ; 二茂铁作为电子媒介
体; 质子化的氨基对荷负电的GOD 有亲合作用; 亲
第6期
刘慧宏等 氧化还原蛋白质电化学研究・427・
水的氨基与疏水的甲基能保持电极表面的润湿状态[23]。
利用溶胶 凝胶制备生物传感器时, 有3种方法可防止电子媒介体的泄漏损失:一是将媒介体共价键合在酶分子上[24]; 二是通过自组装方式将媒介体共价结合在镀有金的石墨粉上[25]; 三是将媒介体接枝到制备溶胶 凝胶的硅酸脂前体分子中[23, 26]。
将GOD 和HR P 同时包埋在溶胶 凝胶中, 构成无媒介体的双酶传感器[27], 特别是丝网印刷技术的使用[28], 为研究以溶胶 凝胶为基质的氧化还原蛋白质的电化学特性和制备生物传感器提供了新的思路和途径。目前应重点改善制备凝胶过程中一些不利于保持蛋白质构象和活性的苛刻条件。
31蛋白质2表面活性剂膜修饰电极
生物膜主要由蛋白质和磷脂组成。磷脂分子结构的两性特征决定了它们在生物膜中的双分子层排列及其与各种蛋白质相结合的特性。表面活性剂具有类磷脂两性结构, 膜[29], 传递[30]。
制备蛋白质2:(1) , 氯仿挥发后, , 该电极可从溶液中吸附蛋白质; (2) 将蛋白质与表面活性剂的微囊分散混合, 取混合液蘸涂至电极表面, 空气干燥。基体电极以棱面裂解石墨、金、铂电极为佳, 而膜在掺锡氧化铟和银电极上的稳定性较差。
在表面活性剂膜中, 蛋白质保持着原始构象不变, 与电极之间的电子传递速度大大加快。肌红蛋白(M b ) [31, 32]、血红蛋白(H b ) [33]、细胞色素P 450(Cyt
[34]
辣根过氧化物酶(HR P ) [35]、过氧化氢氧P 450) 、
化酶[36, 37]、细胞色素c 氧化酶[38]等含有血红素的蛋
白质, 都可实现Fe ( ) Fe ( ) 电对与电极之间直接、可逆、快速的电子传递过程。在表面活性剂膜中, 蛋白质表现出较强的催化活性[39, 40]。表面活性剂的结构和所带净电荷对蛋白质在电极表面的取向有一定影响[41]。
4. 蛋白质2双层类脂膜修饰电极
双层类脂膜在结构上与天然生物膜相似, 能将生物分子嵌入其中同时保持其生物活性。利用各种固相载体支撑的自组装双层类脂膜或混合层类脂膜的高度有序且稳定性良好[42]的特点, 作为仿生膜, 可以模拟氧化还原蛋白质生物代谢过程的特性[43]。
将细胞色素c 氧化酶固定在双层类脂膜中, 与
金电极之间直接传递电子, 且能氧化溶液中的Cyt c
将HR P 固定于盐桥支撑的双层类脂膜
中, 实现了直接电化学反应及对H 2O 2的催化还原[46]。
51蛋白质-D NA 膜修饰电极
DNA 和氧化还原蛋白质同存在于线粒体内, 研究氧化还原蛋白质与DNA 的作用, 对理解生物呼吸链能量转换具有极其重要的意义。DNA 在金电极和碳电极表面能形成稳定的薄膜, 可用于基因杂交指示剂的选择和DNA 损伤检测[47, 48]。R u sling 等采用逐层组装的方法, 将DNA 2M b 和DNA 2Cyt P 450固定在电极表面, 得到Fe ( ) Fe ( ) 电对的可逆电化学反应, 应用于环境污染物的检测与转化[49]。用DNA 固定HR P , 加快了HR P H 2O 2的检测[50]。
DNA 膜具有独, 为电化学模拟氧化。寻找适当的载努力的方向。
61蛋白质2纳米粒子修饰电极
[44, 45]
纳米粒子具有比表面积大、催化活性高、亲和力强的特点, 用于固定生物组分备受关注。HR P 固定于金纳米粒子表面, 制得HR P 2A u 胶粒修饰电极, 不需媒介体便能催化还原H 2O 2, 说明金微粒与HR P 作用, 缩短了酶活性中心与电极表面的距离, 实现了直接电子传递过程[51]。用自组装膜吸附纳米金粒, 再固定HR P 或H b , 其辅基血红素直接与电极传递电子, 且能催化还原H 2O 2。HR P 或H b 在电极表面的覆盖量和催化能力与金粒直径大小有关, 直径越小, 催化效率越高[52, 53]。
用纳米憎水A u 颗粒、亲水A u 颗粒、憎水Si O 2
颗粒以及A u 和Si O 2颗粒混合与聚乙烯醇缩丁醛(PVB ) 构成复合固定酶膜基质, 用溶胶 凝胶法固定GOD 制备纳米增强型葡萄糖传感器。实验表明, 纳
米颗粒可以大幅度提高固定化酶的催化活性, 认为是通过A u 颗粒的作用, 葡萄糖氧化酶的辅基FAD 与铂电极间直接进行电子传递[54]。将纳米金自组装至三维硅凝胶中, 可实现HR P 的直接电化学反应, 构筑第三代电化学生物传感器[55]。
纳米T i O 2膜电极不仅具有生物亲和性和相容性, 而且能加快氧化还原蛋白质的电子传递速度[56]。利用H b T i O 2电极的光电特性, 可研究蛋白质光氧化还原现象, 检测水溶液中微量的一氧化
・428・
化 学 进 展
吡咯和苯酚功能化生物素的电聚合[68,
69]
第14
卷
碳[57]。在磁性纳米粒子表面修饰媒介体, 可作为酶与电极之间电子传递的开关, 制备由磁场控制的生物电化学传感器[58]。碳纳米管对Cyt c 的电子传递也有加速作用[59]。
随着纳米粒子与蛋白质作用机理研究的深入, 各种新型纳米粒子的制备, 特别是量子点的引入及制备微型传感器和芯片实验室技术的发展, 可望从分子水平动态研究生物体系, 揭示其内在规律。
、共价偶
合[70]、抗原 抗体[71]及丝网印刷[72]等。
31抗原2抗体体系固定法
利用抗原2抗体之间的专一亲和性(K a 为105—1011M -1) , 也可在电极表面修饰单层或多层酶。首先在电极表面吸附抗原, 然后与连接有酶的抗体作用, 可制得单层酶修饰电极。如果酶分子同时连接有抗体和抗抗体, 可制得多层酶修饰电极, 并能准确地控制酶的反应活性和取向[73—75]。依据抗原 抗体的亲和性建立的电化学免疫分析方法发展较快[76]。
41凝集素2糖基体系固定法
伴刀豆球蛋白A (Con A ) 是一种外源凝集素,
三、氧化还原蛋白质的定向固定
蛋白质在电极表面的取向是直接影响电子传递的重要因素。使用化学方法在电极表面定向固定蛋白质, 目前主要有4种方法。
11自组装膜固定法含—N H 2、—COO H 的巯基化合物在A u 电极表面自组装成单分子层膜, 然后与蛋白质分子表面的氨基酸残基键合, 形成单层的蛋白质2自组装膜修饰电极。所固定蛋白质的构象没有改变, 接(存在媒介体) 与底物反应。, 可形成多层蛋白质修饰电极, 的量, [61]要有:(1) 的氨基偶联; (2 天冬氨酸残基的羧基偶联; (3) 氨基通过双功能基团试剂与蛋白质中赖氨酸残基的氨基交联。
Go rton 等用(1) (2) 和吸附在自组装膜修饰电极表面的方法固定微过氧化物酶211。发现不同的固定方法, 其电子传递速度相差较大, 说明酶在电极表面的覆盖量、结构和取向是影响电子传递的主要因素[62]。用碳二亚胺偶合剂将细胞色素c 氧化酶固定在32巯基丙酸自组装膜修饰金电极表面, 可得到其可逆电化学反应, 并能氧化溶液中的Cyt c [63]。W ill 2ner 等将葡萄糖氧化酶和谷光苷肽还原酶固定在自组装膜修饰电极表面, 并在酶分子上接枝媒介体, 形成分子导线, 作为酶与底物的电子传递路径[64]。
21生物素2亲和素体系固定法
亲和素对生物素有很强的亲和力, 结合常数(K a ) 达1015M -1, 其复合物能耐酸碱、温度和有机溶剂等。每个亲和素分子可以结合4个生物素分子。将生物素分子固定在电极表面, 然后连接在酶分子上的亲和素分子与之结合, 形成单层或多层酶修饰电极, 制成相应底物的安培型传感器[65]。为获得快速、稳定、灵敏电化学响应信号, 应用了一些技术和方法在电极表面固定生物素, 如光刻技术[66]、电沉积[67]、
其分子中包含能与甘露糖特异亲和的4个位点。
Kobayasi 等利用化学交联方法在酶分子中引入甘露糖, 利用Con A , 定向固[77, 78]P 的分子表面, A 作用而固定酶于电极[80]。
, 要尽可能地消除应。
四、蛋白质的分子改造
加速氧化还原蛋白质与电极之间的电子传递速度, 除了对电极进行表面修饰, 使蛋白质处于适宜的取向外, 另一重要途径是采用化学方法或生物学技术对酶分子进行人工改造, 设计和构造有利于电子传递的新的蛋白质体系[81]。
1. 酶分子的化学修饰
W illner 提出了重组酶分子的方法, 将酶的氧化还原中心(辅基) 直接与电极相联[82]。其方法是首先将全酶的辅基取出, 得到无辅基的酶蛋白; 然后将固定在电极表面的辅基分子重组至酶蛋白中。对于在电极上过电势较高的辅基, 可引入媒介体分子作为传输电子的分子导线。其方法是将固定在电极表面且连有媒介体的辅基重组至酶蛋白中, 得到含有双功能氧化还原中心的辅基的酶。
Go rton 等重组了HR P , 重组HR P 的辅基血红素直接与金电极相接。在金电极表面形成混合自组装膜:一种分子为32巯基丙酸, 另外一种为32巯基丙酸N 2琥珀酰亚胺酯。二氨基烷烃的一个氨基与32巯基丙酸N 2琥珀酰亚胺酯反应相接, 另一个氨基在碳二亚胺偶合剂的作用下与血红素交联, 将此电极浸泡在含有脱辅基的HR P 蛋白中, 即得重组
第6期
刘慧宏等 氧化还原蛋白质电化学研究・429・
这种方法的优点是可以改变连接HR P 的修饰电极。
血红素的碳链长度。实验结果表明, 碳链较短(C 4) 时, 不能形成重组产物, 而长碳链(C 12) 形成重组
[83]
HR P 的电子传递速度较慢。
度[96]。采用融合蛋白技术可构建具有双酶(葡萄糖氧化酶和糖化酶) 活力的融合蛋白, 制备顺序酶传感器[97]。
4. 定点突变技术
定点突变技术可以有目的地对蛋白质中的少数氨基酸残基进行替换, 蛋白质的结构和性能基本维持不变。
HR P 的表面存在8个糖基化位点, 其碳水化合
W illner 等重组了葡萄糖氧化酶和D 2氨基酸氧化酶, 首先将酶的辅基(FAD ) 取出, 得到无辅基的
酶蛋白; 然后将固定在电极表面接有媒介体(二茂铁、吡咯喹啉醌PQQ ) 的辅基, 重组至酶蛋白中, 得到含有双功能氧化还原中心的辅基的重组酶。该酶显示出生物电催化氧化葡萄糖或D 2丙氨酸的特性。重组酶既保持了对底物催化的专一性和高的催化效率, 又避免了氧、抗坏血酸和尿酸等的干扰[84]。最近他们又利用重组酶巧妙地构建了自给电能(不需外加电源) 的生物传感器[85]。重组葡萄糖脱氢酶(PQQ 2GDH ) [86]和肌红蛋白[87]的电化学研究也有报道。
聚乙二醇(PEG ) 的化学性质稳定, 具有亲脂亲水且与蛋白质相容的特性, 等领域应用十分广泛。经过PEG 酶, 具有较高的热稳定性[88, 89], 速度大大加快[90], 用, , 也加强对底物的电催化作用[91, 92]2. 蛋白质全新设计
蛋白质全新设计是对蛋白质进行模拟, 了解蛋白质结构与功能的关系[93, 94]。W illner 等将含有两个血红素辅基的4肽螺旋束共价键合至自组装膜修饰金电极表面。两个血红素辅基由于与电极表面的距离不同, 其氧化还原电势也不同, 分别为-0143V 和-0136V (vs SCE ) 。这一性质可应用于制备生物电子整流器。另外, 这种模拟蛋白质可以作为硝酸根还原酶或Co ( ) 原卟啉重组血红蛋白的电子媒介体, 催化还原NO -3或催化22炔2丁二酸加氢[95]。
3. 蛋白质融合技术
采用分子生物学方法, 将氧化还原性蛋白质模块(如电子传递模块) 与功能性蛋白质模块(如生物催化模块) 融合, 显著改善蛋白质的应用特性, 形成新型多功能蛋白质。
Gilardi 等使用黄素蛋白作为电子传递蛋白模块, 以Cyt c 555和Cyt P 450cam 作为催化蛋白模块, 通过蛋白质工程技术, 用肽链联接一种蛋白的C 末端和另一种蛋白的N 末端或者引入双硫键桥, 使两种蛋白融合。实验表明, 黄素蛋白的引入, 加速了Cyt c 555和Cyt P 450BM 3与电极的电子传递速
物的含量达18%。这些碳水化合物尤如一道屏障, 阻碍了酶的氧化还原中心与电极的电子传递。Go r 2ton 等利用基因工程手段, 制得不含糖基化位点的HR P 突变体; 另外在其基础上, 制得分子表面含有6个组氨酸分子的突变体, 由于组氨酸与金较强的
亲和力, 使HR P 。这两种突变体的电子传递速度由-417s -1和71-
:NAD P +还原[99(H 64) 用甘, 其直接电子传递速度大大增加[100]。
H ill 等将Cyt P 450cam 分子表面的5个半胱氨
1[98]
酸全部突变为丙氨酸, 而将与电子传递相关联的4个氨基酸残基分别独立地突变为半胱氨酸。半胱氨酸的—SH 与金电极表面键合, 定向固定蛋白质, 使电子传递通道与电极表面接近[101]。他们研究了定点突变蛋白质(Cyt P 450cam 、天青蛋白和Cyt c ) 的电化学特性, 用扫描探针显微镜观察电极表面蛋白质的结构和形貌[102]。
从Sachanm yce cerevisiae 分离的Cyt b 2是乳酸脱氢酶, 通过基因工程技术改变其中的两个氨基酸(A 108G 、L 230A ) , 则改变了黄素微区的活性, 使该酶对L 2扁桃体酸具有催化脱氢作用。当存在媒介体时, 该酶能催化L 2扁桃体酸脱氢且具有较好的选择性[103]。Sode 等定点突变了葡萄糖脱氢酶(辅基为吡咯喹啉醌, PQQ GDH ) , H is 775A sp 和H is 775A sn 。用两种变体酶制备成复合酶传感器, 对葡萄糖的选择性好、响应快、检测线性宽[104]。
应用化学方法和生物学技术设计和改造蛋白质分子, 不仅对于理解生物体内电子传递机理、生物代谢过程, 而且对于发展生物传感器均具有重要意义。
五、展 望
氧化还原蛋白质的电化学研究具有重要的理论价值和广阔的应用前景, 值得重视的研究方向为:
・430・
化 学 进 展
[18]
第14
卷
(1) 深入研究氧化还原蛋白质的电子传递过程,
Jones A K , Cam ba R , Keid G A , Chapm an S K , A rm 2strong F A . J . Am . Chem . Soc . , 2000, 122(28) :6494—6495
弄清反应机理;
(2) 通过基因工程、蛋白质工程和蛋白质化学修饰等技术和手段, 合成新的酶, 寻找新的酶促体系; (3) 发掘酶的催化活性, 提高酶促反应的效率;
(4) 人工酶模拟研究, 发展特异、高效、稳定的非
[19]. Chem . , 2000, 72Co llinson M M , How ells A R . A nal (19) :702A —709A
[20]L ev O , W u Z , Bharath S , Glezer V , M odestov A , Gun J ,
R abinovich L , Sampath S . Chem . M ater . , 1997, 9(11) :2354—2375
[21]
蛋白质结构的电催化剂; (5) 制备寿命长、价格低、使用方便的电化学酶传感器; 开发生物能源电池、计算机生物芯片。
参考文献
[1][2][3]
Eddow s M J , H ill H A O . J . Chem . Soc . , Chem . Com 2m un . , 1977, 21:771—772
Yeh P , Kuw ana T . Chem . L ett . , 1977, 70(10) :1145—1148
T araserich M R , Yaropo lov A I , Bogdnovskaya V A , V ar 2fo lom eer S D . B i oelectrochem . B i oeng . , 1979, 6(3) :393—403
[4]
王炳全(W ang B Q ) , 程广金(Cheng G J ) , 董绍俊(Dong
. Chem . ) , 1999, 27(8) :S J ) . 分析化学(Ch inese J . A nal 982—988
[22]W ang B , L iB , D eng Q , Dong S . A nal . Chem . , 1998, 70
(15) :3170—3174
[23][24][25][26]
. Ch i Gun J , L ev O . A nal m . A cta , 1996, 336(1) :95—106Sampath S , L ev O . E lectroanalysis , 1996, 8(12) :1112-1116
. , 1997, 426(12Sampath S , L ev O . J . E 2) :137
(11) :1933—1938Gun J , O. 2) :[N , Chen M .
2621—2631
[29][30][31]
R usling J F . A cc . Chem . R es . , 1998, 31(6) :363—369Chattopadhyay K , M azum dar S . B i oelectrochem . , 2000, 53:17—24
Zhang Z , R usling J F . B i ophys . Chem . , 1997, 63:133—146
[32]N assar A E F , Zhang Z , H u N , R usling J F , Kumo sinsk i
T F . J . Phys . Chem . B , 1997, 101(12) :2224—2231
[33]L u Z , H uang Q , R usling J F . J . E lectroanal . Chem . ,
1997, 423(1) :59—66
[34]
Zhang Z , N zssar A E F , L u Z , Schenkm an J B , R usling J F . J . Am . Chem . Soc . , Faraday T rans . , 1997, 93(9) :1769—1774
[35]W u Z Y , W ang B Q , Cheng Z L , Yang X R , Dong S J ,
W ang E K . B i o sens . B i oelectron . , 2001, 16(1) :47—52[36]
Ino rg . Chem . , 1991, 36:
[37]
Chem .
Soc .
[38][39]
Chen X , X ie H , Kong J . D eng J . B i o sens . B i oelectron . , 2001, 16(2) :115—120
Zhang Z , Chouchen S , M agli ozzo R S , R usling J F . Chem . Comm un . , 2001, (2) :177—178
R ho ten M C , Burgess J D , H aw k ridge F M . E lectroch i m . A cta , 2000, 45(18) :2855—2860
Chem . M ater . , 1997, 9(12) :
[27]J , . lectroanal . Chem . , 1998,
董绍俊(Dong S J ) , 车广礼(Che G L ) , 谢远武(X ie Y W ) . 化学修饰电极(Chem ically M odified E lectrode ) . 北京(jing ) :科学出版社(Science P ress ) , 1995. [5][6][7]
H ill H A O . Coo rd . Chem . . , Gh indilis A L , , E . , 1997, 9(9:Go rton L , L A , L arsson T , M unteanu F D , R usgas . A nal . Ch i T , Gazaryan I m . A cta , 1999, 400(1) :91—108
[8]A rm strong F A , W ilson G S . E lectroch i m ica A cta , 2000,
45:2623—2645
[9][10]
T he Royal Society of Chem istry :Faraday D iscussi on , V o l 106. Cam bridge :T he Royal Society of Chem istry , 2000Guidelli R , A lo isi L , Becucci L , Do lfi A , M oncelliM R , . Chem . , 2001, 504(1) :Buoninsegni F T . J . E lectroanal 1—28
[11]V arfo lom eev S D , Kurouchk in I V . B i o sen . B i oelectron . ,
1996, 11(9) :863—871
[12]
Guo L H , H ill H A O . A dv . 341—375
[13]A rm strong F A , H eering H A , H irst J .
R ev . , 1997, 26:169—179
[14]D uff J L C , B reton C J , Butt J N , A rm strong F A , T hom 2
son A J . J . Am . Chem . Soc . , 1996, 118(36) :8593—8603
[15]Butt J N , A rm strong F A , B reton J , Geo rge S J , T hom 2
son A J , H atch ik ian E C . J . Am . Chem . Soc . , 1991, 113(17) :6663—6670
[16]M ondalM S, Fuller H A , A rm strong F A. J. Am. Chem.
Soc . , 1996, 118(1) :263—264
[17]
Sucheta A , Camm ack R , W einer J , A rm strong F A . B i o 2chem istry , 1993, 32:5455
[42][40][41]
胡乃非(H u N F ) , 李溱(L i Z ) , 马红艳(M a H Y ) . 高等学校化学学报(Chem . J . Ch inese U niversities ) , 2001, 22
(3) :450-454
R usling J F . Interface , 1997, 6(4) :26—31
刘慧宏(L iu H H ) , 陈显堂(Chen X T ) , 李俊(L i J ) , H ill
. Chem. ) , 2001, 29H A O. 分析化学(Ch inese J. A nal (5) :511-515
罗立强(L uo L Q ) , 杨秀荣(Yang X R ) . 分析化学(Ch i 2
. Chem . ) , 2000, 28(9) :1165-1171nese J . A nal
第6期
[43]
刘慧宏等 氧化还原蛋白质电化学研究
[68][69]
・431・
. Sci . , T ien H T , Barish R H , Gu L Q , O ttova A L . A nal 1998, 14(1) :3—18
Yang S T , W itkow sk i A , H uthch ins R S , Sco tt D L , Bachas L G . E lectroanalysis , 1998, 10(1) :58—60Co snier S, Galland B, Gondaan C, L e P A. analysis , 1998, 10(12) :808—813
E lectro 2
[44]Burgess J D , R ho ten M C, H aw k ridge F M. J. Am.
Chem . Soc . , 1998, 120(18) :4488—4491
[45]Burgess J D , R ho ten M C , H aw k ridge F M . L angm uir ,
1998, 14(9) :2467—2475
[46][47][48]
Zhang Y L , J in S Z , Zhang C X , Shen H X . E lectro 2analysis , 2001, 13(2) :137—142
. Chem . , 1998, 70(15) :Pang D W , A bruna H D . A nal 3162—3169
. Chem . , 2000, 72(19) :Pang D W , A bruna H D . A nal 4700—4706
[49]L vov Y M , L u Z , R usling J F . J . Am . Chem . Soc . ,
1996, 118(12) :3043—3044
[50][51]
. Ch i Chen X , R uan C , Kong J . D eng J , A nal m . A cta , 2000, 41(1) :89—98
Zhao J, H enkens R W , Stonehuerm er J , O ’Dang J P, . Chem. , 1992, 327(1) :C rum bliss A L. J. E lectroanal 109
[52][53][54]
. B i ochem . , 2000, X iao H Y , L u H X , Chen H Y . A nal 278:22—28
. Chem Gu H Y , Yu A M , Chen H Y . J . E lectroanal 2001, 516:119—126
[70]A nicet A , A nne A , M o iroux J , Sav éant J M , D equaire M .
J . Am . Chem . Soc . , 1998, 120(28) :7115—7116
[71]A nicet N , Bourdillon C , M o iroux J , Sav éant J M . J .
Phys . Chem . B , 1998, 102(49) :9844—9849
[72]D egrand C , L i m oges B . J . Am . Chem . Soc . , 1999, 121
(29) , 6946—6974
[73]Bourdillon C , D em aille C , M o iroux J , Sav éant J M . A cc .
Chem , R es . , 1996, 29(11) :529—535
[74]Bardea A , Katz E , W illner I . E lectroanalysis , 2000, 12
(14) :1097—1106
[75]Dong Y , Shannoa C .
2371—2376
[76]W arsinke A , Benkert A , F W.
. Chem. , 2000, 366() :634A nal
[77A nzai J , J . Chem .
T . II , 2) 461—462
]
, ura N , Ho sh i T . Senso rs and A ctua 2rs , 65:94—96
[A nzai J , Kobayash i Y . L angm uir , 2000, 16(6) :2851—
2856
[80][81][82][83]
. Chem . , 2001, 507Kobayash i Y , A nzai J . J . E lectroanal (2) :250—255
Gilardi G , Fantuzzi A , Sadegh i S J . Current Op ini on in Structural B i o logy , 2001, 11:491—499
R ik lin A , Katz E , W illner I , Stocker A , Buckm ann A F . N ature , 1995, 376:672—675
Zi m m erm ann H , L indgren A , Schuhm ann W , Go rton L . Chem . Eur . J . , 2000, 6(4) :592—599
[84]W illner I , H eleg 2Shabtai V , B londer R , Katz E , T ao G ,
Buckm ann A F , H eller A . J . Am . Chem . Soc . , 1996, 118(42) :10321—10322
[85][86][87][88][89]
. Kate E , Sch lereth D D , Schm idt H L . J . E lectroanal Chem . , 1994, 368(122) :165—171
. J . Am . Chem . Soc . , Katz E , Buckm ann A F , W illner I 2001, 123:10752—10753
Guo L H , M c L andon G , R azafitri m o H , Gao Y . J . M ater . Chem . , 1996, 6(2) :369—374Kaw ahara V , O hno H . 161—166
Kaw ahara N V , O hno H . E lectroch i m . A cta , 1998, 43(10) :1493—1497
[90]N akam ura N , N akam ura Y , T ani . m ura R , et al
troch i m . A cta , 2001, 46:1605—1608
[91]Ban K, U ek i T , T am ada Y, Saito T ,
653
[92]W righ t M , Honeychurch M J , H ill H A O . E lectrochem .
Comm un . , 1999, 1:609—613
I m abayash i S,
W atanabe M. E lectrochem. Comm un . , 2001, 3:649—
E lec 2
So lid State I onics , 1998, 113:
Soc . ,
F resenius J.
. A nal
Chem . , 2000, 72(11) :
唐琼芳(T ang Q F ) , 孟宪伟() , 冉均国(R an J G ) , (C Q ) . 中国科学B in Ch B ) , 30(2) :119-124
[55]J ia J B , W , u A G , Cheng G J , L i Z , Dong S J . . Chem . , 2002, 74(9) :2217—2223A nal
E lectroanalysis , 2001, 13(5) :
[56]L i Q , L uo G , Feng J .
359—363
[57][58]
Topoglidis E , L utz T , W ills R L , Barnett C J , Cass A E G , D urrant J R . F raday D iscuss . , 2000, 16:35—46. J. Am. Chem. Soc . , 2000, H irst R , Katz E, W illner I 122:12053—12054
[59]W ang J X , L i M X , Sh i Z J , L i N Q , Gu Z N . A nal .
Chem . , 2002, 74(9) :1993—1997[60]
Ferretti S , Paynter S , R ussellD A , Sap sfo rd K E . T rA C :. Chem . , 2000, 19(9) :530—540T rends A nal
[61]W illner I , Katz A , W iller B .
(13) :965—977
[62]
. Chem . , R uzgas T , Gaigalas A , Go rton L . J . E lectroanal 1999, 469(1) :123—131
[63]L i J , Cheng G , Dong S J . E lectroanal . Chem . , 1996, 416
(1) :97—104
[64]W illner I , R ik lin A , Shoham B , R ivenzon O , Katz E .
A dv . M ater . , 1993, 5(12) :912—915[65]
. Chem . , 1999, 71(9) :H ayes M A , Kuh r W G . A nal 1720—1727
[66]D untha N , N ow allW B, Kuh rW G . A nal . Chem. , 1997,
69(14) :2619—2625
[67]D eihamm er R S , Ho M , A nderegg J W , Po rter M D .
L angm uir , 1994, 10(4) :1306—1313
E lectroanalysis , 1997, 9
・432・
[93][94
]
R au H K , D ej onge N , H aehnel W . A ngew . Chem . . , 2000, 39(1) :250—
253Ed . Engl
化 学 进 展
Int .
第14
卷
[99]M adoz G J , A bad J M , Fernandez R J , V elezM , V azquez
L , Gom ez M C , Fernandez V M . J . Am . Chem . Soc . , 2000, 122(40) :9808—9817
[100]V an 2D yke B R , Saltm an P, A rm strong F A. J. Am.
Chem . Soc . , 1996, 118(14) :3490—3492
[101]L o K K W , W ong L L , H ill H A O . FEBS L ett . , 1999,
451:342—346
[102]D avis J J , H ill H A O , Bond A M . Coo rd . Chem . R ev . ,
2000, 200:411—442
[103]L iu H , H ill H A O , Chapm an S K .
Chem . , 2001, 500(1) :598—603
[104]Yam azak i T , Ko ji . Chem . , 2000, 72m a K , Sode K . A nal
(16) :4689—4693
J .
. E lectroanal
Schnerpf R , Ho rth P, B ill E, W ieghardt K, H ildebrandt P, H aehnel W. J. Am. Chem. Soc . , 2001, 123(10) :2186—2195
[95]W illner I , H eleg 2Shabtai V , Katz E , R au H K , H aehnel
W . J . Am . Chem . Soc . , 1999, 121(27) :6455—6468[96][97]
Sadegh i S , M eharenna Y T , FantuzziA , V aletti F , Gilardi G . Farady D iscuss . , 2000, 116:135—153
P resnova G , Grigo renko V , Ego reov A , R uzgas T , L in 2gren A , Go rton L , Bo rchers T . Farady D iscuss . , 2000, 116:281—289
[98]
Zhou Y F , Zhang X E , L iu H , Zhang Z P , Zhang C G , Cass A E G . B i oconjugate Chem . , 2001, 12:924—931
第14卷第6期2002
年11月
化 学 进 展
PRO GR ESS I N CH E M ISTR Y
V o l . 14N o. 6
N ov . , 2002
氧化还原蛋白质电化学研究3
刘慧宏1, 2 庞代文133
(11武汉大学化学系 武汉430072; 21襄樊学院化学系 襄樊441053)
摘 要 研究氧化还原蛋白质与电极之间的电子传递过程不仅为理解代谢过程提供有价值的信息, 而且为制备生物传感器奠定基础。本文从蛋白质修饰电极、蛋白质在电极表面的定向固定及蛋白质人工改造三方面, 评述了近年来氧化还原蛋白质电化学研究的进展, 并提出了今后可能的研究方向。
关键词 氧化还原蛋白质 酶 生物电化学
中图分类号:Q 59112; Q 814; O 64615 文献标识码:A 文章编号:10052281X (2002) 0620425208
Stud ies i n Electrochem istry of Redox Prote i n s
L iu H u ihong
1, 2
3
P D a i w en 133
(1. D ep artm en t of Chem istry , W uhan , uhan Ch ina ; 2. D ep artm en t of Chem istry , X 441053, Ch ina )
Abstract T he Study 2rocess betw een the redox p ro tein s and electrodes is no t on ly valuabe understand the m etabo lic p rocess , bu t also is the basis of the . t advances in electrochem istry of redox p ro tein s o r enzym es are review ed , p rep arati on rs
including the p ro tein 2electrode in terfaces , directi onal i m m ob ilizati on of p ro tein s on electrodes and p ro tein recon structi on , m odificati on o r engineering fo r electrochem istry . Fu rther research areas are sug 2gested .
Key words redox p ro tein s ; enzym es ; b i oelectrochem istry
实现氧化还原蛋白质(包括酶) 与电极之间的直
一、引 言
1977年, H ill [1]和Kuw ana [2]分别发现马心细胞
接电子传递并非易事。首先, 根据M arcu s 电子转移理论, 两氧化还原电对之间电子传递的动力学特性
由以下因素决定[11]:推动力(如电势的差异) , 重组能(定性反映氧化还原物质的结构) 和氧化还原中心间的距离。通常, 由于氧化还原蛋白质的辅基(生物活性基团常常为电化学活性基团) 被多肽链所包裹, 其与电极表面的距离较大, 因而难于进行电子传递。其次, 氧化还原酶分为含有或不含电子传递通道两类[12], 前者在自然体系中参与电子传递过程, 其活性中心与酶分子表面之间存在电子传递通道; 相反, 后者不参与电子转移过程, 所以在其分子中不存在电子传递通道, 这类氧化还原酶很难实现直接电化
色素c (Cyt c ) 与金电极和掺锡氧化铟电极之间有直接可逆的电化学反应。1979年, 酶与电极的直接电子传递也见报道[3]。这些开创性的工作为用电化学手段探索生物体系的奥秘打开了大门[4—10]。一方面, 用电极充当电子的给予体或接受体, 可以模拟生物体系电子传递机理和代谢过程, 测定热力学和动力学参数; 另一方面, 利用生物反应的特异性和电分析方法的灵敏性及实时检测性相结合, 制备生物电化学传感器, 为生物物质的检测提供强有力的手段。
收稿:2002年1月, 收修改稿:2002年5月
3国家自然科学基金(20025311) 和湖北省教育厅科研基金资助项目(2001B 69002) 33通讯联系人 e 2m ail :dw p ang @w hu . edu . cn
・426・
化 学 进 展
第14卷
学反应, 除非它的氧化还原活性点位于酶分子表面; 第三, 氧化还原蛋白质结构复杂且具有各向异性, 它们的活性中心并不正好位于蛋白的中心, 此外蛋白质分子表面还呈现电荷分布不均匀性。在生物体系中, 一些氧化还原蛋白质之间具有较大的电子传递速度, 这归功于围绕电子传递活性中心的氨基酸残基的作用, 这些氨基酸残基能够调节蛋白质的相对位置, 使蛋白质的氧化还原中心之间的距离尽可能地缩短, 从而提高电子传递速率。因此蛋白质在电极表面的取向是实现蛋白质2电极直接电子传递的重要因素。本文将对蛋白质修饰电极、蛋白质在电极表面定向固定及蛋白质人工改造三方面的最新进展作一评述。
程。[3Fe 24S ]对金属离子有亲和作用, 当溶液中存在金属离子M 时, [3Fe 24S ]转化为[M 3Fe 24S ],在循环伏安图上出现新的氧化还原峰。而且[3Fe 24S ]对金属离子的亲和力与其氧化态有关, 金属离子对[3Fe 24S ]的亲和力也有差异, 如Cd >Zn >Fe [15]。
PFV 也被成功地应用到酶的研究。细胞色素c
氧化酶在低温低离子强度条件下, 吸附在PEG 电极表面, 无H 2O 2时, 得血红素Fe ( ) Fe ( ) 电对可逆的氧化还原峰。当加入H 2O 2后, 则得催化氧化
[16]
H 2O 2的电流峰。研究多活性中心酶分子内的电
二、蛋白质修饰电极
蛋白质在电极表面具有良好的取向是实现蛋白质2电极之间直接快速电子传递的前提。因此采用适当的方法在电极表面固定蛋白质, 是目前蛋白质电化学研究的热点。
11蛋白质膜修饰电极
由A rm strong 伏安法(PFV ) 13]:简单, ; (2) 克服了溶液体系中蛋白质的扩散系数较小的限制; (3) 能使用快速扫描伏安法研究电子传递过程; (4) 通过电化学数据分析可获得丰富的生物化学信息。
蛋白质膜修饰电极的制备:经过抛光的棱面裂解石墨电极(PEG ) 表面产生较多的亲水含氧基团。在低温(0°低离子强度和共吸附剂(如氨基环多C ) 、
醇) 的存在下, 通过静电吸附作用, 在电极表面形成一层蛋白质膜(吸附量10-11—10-12m o l c m -2) 。共吸附剂在荷电的蛋白质和电极之间起着促进电子传递的作用。
蛋白质中的铁2硫簇是电子传递中心, 但铁2硫簇缺乏特征光谱, 难以实时监测氧化还原过程中铁2硫簇组成和结构的变化。PFV 所得的循环伏安曲线犹如蛋白质中铁2硫簇氧化还原电势的指纹图, 清晰地给出蛋白质中不同铁2硫簇的氧化还原电势。含7个铁原子的铁蛋白呈现三对氧化还原峰:其中[3Fe 2
4S ]显示两对峰, 分别属于[3Fe 24S ]+ 和[3Fe 2
2-+
4S ]0 ; 另一对是[4Fe 24S ]2+ 的氧化还原峰。其中
2-[3Fe 24S ]0 的还原电势与溶液的pH 有关, 表明电子传递过程同时伴随质子传递[14]。
PFV 能研究铁2硫簇与金属离子键合反应过
子传递过程, PFV 也显示出优势[17, 18]。马富酸还原酶的循环伏安图反映出3种铁2硫簇和FAD 的两对可逆氧化还原峰, 当加入马富酸时, 可得两个催化电流峰。从峰的电势、内的两种电子传递途径:Fe 3Fe →FAD 和4Fe FAD []。
21蛋白质2溶胶 凝胶修饰电极蛋白质包埋在溶胶 凝胶中, 一方面与硅酸酯形成氢健, 使之构象不易变化; 另一方面, 与硅酸酯中的甲基等疏水基团存在相互作用, 既能保持蛋白质的活性, 又可防止蛋白质从凝胶膜内泄漏, 而一些小分子、离子则可以自由进出溶胶 凝胶的孔隙。特别是一些掺杂和衍生的溶胶 凝胶, 克服了生物分子在溶胶 凝胶形成过程中, 因温度、酸度及有机溶剂等不利条件而降低酶活性的问题[19—21]。
在溶胶 凝胶中加入聚乙烯醇接枝42乙烯吡啶(PVA 2g 2PV P ) , 由于PVA 2g 2PV P 具有良好的生物相溶性, 能与酶分子的外部环境相匹配, 且分子中的大量氢键能稳定酶如葡萄糖氧化酶(GOD ) 的天然构型, 极大地保持了酶的活性。另外, 溶胶 凝胶与水凝胶相互交联成网, 能增加酶的固定化效率[22]。
在溶胶 凝胶衍生的复合陶瓷2碳电极(CCE s ) 中, 酶首先吸附在载体上(石墨粉) 以避免溶胶 凝胶形成过程中不利条件的影响。衍生的溶胶 凝胶又营造了适宜酶的环境。将吸附GOD 的石墨粉包埋在由N 2[(32三甲氧基硅烷基) 丙基]二茂铁基酰胺、甲基三甲氧基硅烷和丙氨基硅烷等共聚合的硅酸脂聚合物骨架内, 在此聚合物中含有石墨粉、二茂铁、氨基和甲基等。其中石墨粉起导电作用; 硅酸脂通过交联形成刚性骨架以包埋GOD ; 二茂铁作为电子媒介
体; 质子化的氨基对荷负电的GOD 有亲合作用; 亲
第6期
刘慧宏等 氧化还原蛋白质电化学研究・427・
水的氨基与疏水的甲基能保持电极表面的润湿状态[23]。
利用溶胶 凝胶制备生物传感器时, 有3种方法可防止电子媒介体的泄漏损失:一是将媒介体共价键合在酶分子上[24]; 二是通过自组装方式将媒介体共价结合在镀有金的石墨粉上[25]; 三是将媒介体接枝到制备溶胶 凝胶的硅酸脂前体分子中[23, 26]。
将GOD 和HR P 同时包埋在溶胶 凝胶中, 构成无媒介体的双酶传感器[27], 特别是丝网印刷技术的使用[28], 为研究以溶胶 凝胶为基质的氧化还原蛋白质的电化学特性和制备生物传感器提供了新的思路和途径。目前应重点改善制备凝胶过程中一些不利于保持蛋白质构象和活性的苛刻条件。
31蛋白质2表面活性剂膜修饰电极
生物膜主要由蛋白质和磷脂组成。磷脂分子结构的两性特征决定了它们在生物膜中的双分子层排列及其与各种蛋白质相结合的特性。表面活性剂具有类磷脂两性结构, 膜[29], 传递[30]。
制备蛋白质2:(1) , 氯仿挥发后, , 该电极可从溶液中吸附蛋白质; (2) 将蛋白质与表面活性剂的微囊分散混合, 取混合液蘸涂至电极表面, 空气干燥。基体电极以棱面裂解石墨、金、铂电极为佳, 而膜在掺锡氧化铟和银电极上的稳定性较差。
在表面活性剂膜中, 蛋白质保持着原始构象不变, 与电极之间的电子传递速度大大加快。肌红蛋白(M b ) [31, 32]、血红蛋白(H b ) [33]、细胞色素P 450(Cyt
[34]
辣根过氧化物酶(HR P ) [35]、过氧化氢氧P 450) 、
化酶[36, 37]、细胞色素c 氧化酶[38]等含有血红素的蛋
白质, 都可实现Fe ( ) Fe ( ) 电对与电极之间直接、可逆、快速的电子传递过程。在表面活性剂膜中, 蛋白质表现出较强的催化活性[39, 40]。表面活性剂的结构和所带净电荷对蛋白质在电极表面的取向有一定影响[41]。
4. 蛋白质2双层类脂膜修饰电极
双层类脂膜在结构上与天然生物膜相似, 能将生物分子嵌入其中同时保持其生物活性。利用各种固相载体支撑的自组装双层类脂膜或混合层类脂膜的高度有序且稳定性良好[42]的特点, 作为仿生膜, 可以模拟氧化还原蛋白质生物代谢过程的特性[43]。
将细胞色素c 氧化酶固定在双层类脂膜中, 与
金电极之间直接传递电子, 且能氧化溶液中的Cyt c
将HR P 固定于盐桥支撑的双层类脂膜
中, 实现了直接电化学反应及对H 2O 2的催化还原[46]。
51蛋白质-D NA 膜修饰电极
DNA 和氧化还原蛋白质同存在于线粒体内, 研究氧化还原蛋白质与DNA 的作用, 对理解生物呼吸链能量转换具有极其重要的意义。DNA 在金电极和碳电极表面能形成稳定的薄膜, 可用于基因杂交指示剂的选择和DNA 损伤检测[47, 48]。R u sling 等采用逐层组装的方法, 将DNA 2M b 和DNA 2Cyt P 450固定在电极表面, 得到Fe ( ) Fe ( ) 电对的可逆电化学反应, 应用于环境污染物的检测与转化[49]。用DNA 固定HR P , 加快了HR P H 2O 2的检测[50]。
DNA 膜具有独, 为电化学模拟氧化。寻找适当的载努力的方向。
61蛋白质2纳米粒子修饰电极
[44, 45]
纳米粒子具有比表面积大、催化活性高、亲和力强的特点, 用于固定生物组分备受关注。HR P 固定于金纳米粒子表面, 制得HR P 2A u 胶粒修饰电极, 不需媒介体便能催化还原H 2O 2, 说明金微粒与HR P 作用, 缩短了酶活性中心与电极表面的距离, 实现了直接电子传递过程[51]。用自组装膜吸附纳米金粒, 再固定HR P 或H b , 其辅基血红素直接与电极传递电子, 且能催化还原H 2O 2。HR P 或H b 在电极表面的覆盖量和催化能力与金粒直径大小有关, 直径越小, 催化效率越高[52, 53]。
用纳米憎水A u 颗粒、亲水A u 颗粒、憎水Si O 2
颗粒以及A u 和Si O 2颗粒混合与聚乙烯醇缩丁醛(PVB ) 构成复合固定酶膜基质, 用溶胶 凝胶法固定GOD 制备纳米增强型葡萄糖传感器。实验表明, 纳
米颗粒可以大幅度提高固定化酶的催化活性, 认为是通过A u 颗粒的作用, 葡萄糖氧化酶的辅基FAD 与铂电极间直接进行电子传递[54]。将纳米金自组装至三维硅凝胶中, 可实现HR P 的直接电化学反应, 构筑第三代电化学生物传感器[55]。
纳米T i O 2膜电极不仅具有生物亲和性和相容性, 而且能加快氧化还原蛋白质的电子传递速度[56]。利用H b T i O 2电极的光电特性, 可研究蛋白质光氧化还原现象, 检测水溶液中微量的一氧化
・428・
化 学 进 展
吡咯和苯酚功能化生物素的电聚合[68,
69]
第14
卷
碳[57]。在磁性纳米粒子表面修饰媒介体, 可作为酶与电极之间电子传递的开关, 制备由磁场控制的生物电化学传感器[58]。碳纳米管对Cyt c 的电子传递也有加速作用[59]。
随着纳米粒子与蛋白质作用机理研究的深入, 各种新型纳米粒子的制备, 特别是量子点的引入及制备微型传感器和芯片实验室技术的发展, 可望从分子水平动态研究生物体系, 揭示其内在规律。
、共价偶
合[70]、抗原 抗体[71]及丝网印刷[72]等。
31抗原2抗体体系固定法
利用抗原2抗体之间的专一亲和性(K a 为105—1011M -1) , 也可在电极表面修饰单层或多层酶。首先在电极表面吸附抗原, 然后与连接有酶的抗体作用, 可制得单层酶修饰电极。如果酶分子同时连接有抗体和抗抗体, 可制得多层酶修饰电极, 并能准确地控制酶的反应活性和取向[73—75]。依据抗原 抗体的亲和性建立的电化学免疫分析方法发展较快[76]。
41凝集素2糖基体系固定法
伴刀豆球蛋白A (Con A ) 是一种外源凝集素,
三、氧化还原蛋白质的定向固定
蛋白质在电极表面的取向是直接影响电子传递的重要因素。使用化学方法在电极表面定向固定蛋白质, 目前主要有4种方法。
11自组装膜固定法含—N H 2、—COO H 的巯基化合物在A u 电极表面自组装成单分子层膜, 然后与蛋白质分子表面的氨基酸残基键合, 形成单层的蛋白质2自组装膜修饰电极。所固定蛋白质的构象没有改变, 接(存在媒介体) 与底物反应。, 可形成多层蛋白质修饰电极, 的量, [61]要有:(1) 的氨基偶联; (2 天冬氨酸残基的羧基偶联; (3) 氨基通过双功能基团试剂与蛋白质中赖氨酸残基的氨基交联。
Go rton 等用(1) (2) 和吸附在自组装膜修饰电极表面的方法固定微过氧化物酶211。发现不同的固定方法, 其电子传递速度相差较大, 说明酶在电极表面的覆盖量、结构和取向是影响电子传递的主要因素[62]。用碳二亚胺偶合剂将细胞色素c 氧化酶固定在32巯基丙酸自组装膜修饰金电极表面, 可得到其可逆电化学反应, 并能氧化溶液中的Cyt c [63]。W ill 2ner 等将葡萄糖氧化酶和谷光苷肽还原酶固定在自组装膜修饰电极表面, 并在酶分子上接枝媒介体, 形成分子导线, 作为酶与底物的电子传递路径[64]。
21生物素2亲和素体系固定法
亲和素对生物素有很强的亲和力, 结合常数(K a ) 达1015M -1, 其复合物能耐酸碱、温度和有机溶剂等。每个亲和素分子可以结合4个生物素分子。将生物素分子固定在电极表面, 然后连接在酶分子上的亲和素分子与之结合, 形成单层或多层酶修饰电极, 制成相应底物的安培型传感器[65]。为获得快速、稳定、灵敏电化学响应信号, 应用了一些技术和方法在电极表面固定生物素, 如光刻技术[66]、电沉积[67]、
其分子中包含能与甘露糖特异亲和的4个位点。
Kobayasi 等利用化学交联方法在酶分子中引入甘露糖, 利用Con A , 定向固[77, 78]P 的分子表面, A 作用而固定酶于电极[80]。
, 要尽可能地消除应。
四、蛋白质的分子改造
加速氧化还原蛋白质与电极之间的电子传递速度, 除了对电极进行表面修饰, 使蛋白质处于适宜的取向外, 另一重要途径是采用化学方法或生物学技术对酶分子进行人工改造, 设计和构造有利于电子传递的新的蛋白质体系[81]。
1. 酶分子的化学修饰
W illner 提出了重组酶分子的方法, 将酶的氧化还原中心(辅基) 直接与电极相联[82]。其方法是首先将全酶的辅基取出, 得到无辅基的酶蛋白; 然后将固定在电极表面的辅基分子重组至酶蛋白中。对于在电极上过电势较高的辅基, 可引入媒介体分子作为传输电子的分子导线。其方法是将固定在电极表面且连有媒介体的辅基重组至酶蛋白中, 得到含有双功能氧化还原中心的辅基的酶。
Go rton 等重组了HR P , 重组HR P 的辅基血红素直接与金电极相接。在金电极表面形成混合自组装膜:一种分子为32巯基丙酸, 另外一种为32巯基丙酸N 2琥珀酰亚胺酯。二氨基烷烃的一个氨基与32巯基丙酸N 2琥珀酰亚胺酯反应相接, 另一个氨基在碳二亚胺偶合剂的作用下与血红素交联, 将此电极浸泡在含有脱辅基的HR P 蛋白中, 即得重组
第6期
刘慧宏等 氧化还原蛋白质电化学研究・429・
这种方法的优点是可以改变连接HR P 的修饰电极。
血红素的碳链长度。实验结果表明, 碳链较短(C 4) 时, 不能形成重组产物, 而长碳链(C 12) 形成重组
[83]
HR P 的电子传递速度较慢。
度[96]。采用融合蛋白技术可构建具有双酶(葡萄糖氧化酶和糖化酶) 活力的融合蛋白, 制备顺序酶传感器[97]。
4. 定点突变技术
定点突变技术可以有目的地对蛋白质中的少数氨基酸残基进行替换, 蛋白质的结构和性能基本维持不变。
HR P 的表面存在8个糖基化位点, 其碳水化合
W illner 等重组了葡萄糖氧化酶和D 2氨基酸氧化酶, 首先将酶的辅基(FAD ) 取出, 得到无辅基的
酶蛋白; 然后将固定在电极表面接有媒介体(二茂铁、吡咯喹啉醌PQQ ) 的辅基, 重组至酶蛋白中, 得到含有双功能氧化还原中心的辅基的重组酶。该酶显示出生物电催化氧化葡萄糖或D 2丙氨酸的特性。重组酶既保持了对底物催化的专一性和高的催化效率, 又避免了氧、抗坏血酸和尿酸等的干扰[84]。最近他们又利用重组酶巧妙地构建了自给电能(不需外加电源) 的生物传感器[85]。重组葡萄糖脱氢酶(PQQ 2GDH ) [86]和肌红蛋白[87]的电化学研究也有报道。
聚乙二醇(PEG ) 的化学性质稳定, 具有亲脂亲水且与蛋白质相容的特性, 等领域应用十分广泛。经过PEG 酶, 具有较高的热稳定性[88, 89], 速度大大加快[90], 用, , 也加强对底物的电催化作用[91, 92]2. 蛋白质全新设计
蛋白质全新设计是对蛋白质进行模拟, 了解蛋白质结构与功能的关系[93, 94]。W illner 等将含有两个血红素辅基的4肽螺旋束共价键合至自组装膜修饰金电极表面。两个血红素辅基由于与电极表面的距离不同, 其氧化还原电势也不同, 分别为-0143V 和-0136V (vs SCE ) 。这一性质可应用于制备生物电子整流器。另外, 这种模拟蛋白质可以作为硝酸根还原酶或Co ( ) 原卟啉重组血红蛋白的电子媒介体, 催化还原NO -3或催化22炔2丁二酸加氢[95]。
3. 蛋白质融合技术
采用分子生物学方法, 将氧化还原性蛋白质模块(如电子传递模块) 与功能性蛋白质模块(如生物催化模块) 融合, 显著改善蛋白质的应用特性, 形成新型多功能蛋白质。
Gilardi 等使用黄素蛋白作为电子传递蛋白模块, 以Cyt c 555和Cyt P 450cam 作为催化蛋白模块, 通过蛋白质工程技术, 用肽链联接一种蛋白的C 末端和另一种蛋白的N 末端或者引入双硫键桥, 使两种蛋白融合。实验表明, 黄素蛋白的引入, 加速了Cyt c 555和Cyt P 450BM 3与电极的电子传递速
物的含量达18%。这些碳水化合物尤如一道屏障, 阻碍了酶的氧化还原中心与电极的电子传递。Go r 2ton 等利用基因工程手段, 制得不含糖基化位点的HR P 突变体; 另外在其基础上, 制得分子表面含有6个组氨酸分子的突变体, 由于组氨酸与金较强的
亲和力, 使HR P 。这两种突变体的电子传递速度由-417s -1和71-
:NAD P +还原[99(H 64) 用甘, 其直接电子传递速度大大增加[100]。
H ill 等将Cyt P 450cam 分子表面的5个半胱氨
1[98]
酸全部突变为丙氨酸, 而将与电子传递相关联的4个氨基酸残基分别独立地突变为半胱氨酸。半胱氨酸的—SH 与金电极表面键合, 定向固定蛋白质, 使电子传递通道与电极表面接近[101]。他们研究了定点突变蛋白质(Cyt P 450cam 、天青蛋白和Cyt c ) 的电化学特性, 用扫描探针显微镜观察电极表面蛋白质的结构和形貌[102]。
从Sachanm yce cerevisiae 分离的Cyt b 2是乳酸脱氢酶, 通过基因工程技术改变其中的两个氨基酸(A 108G 、L 230A ) , 则改变了黄素微区的活性, 使该酶对L 2扁桃体酸具有催化脱氢作用。当存在媒介体时, 该酶能催化L 2扁桃体酸脱氢且具有较好的选择性[103]。Sode 等定点突变了葡萄糖脱氢酶(辅基为吡咯喹啉醌, PQQ GDH ) , H is 775A sp 和H is 775A sn 。用两种变体酶制备成复合酶传感器, 对葡萄糖的选择性好、响应快、检测线性宽[104]。
应用化学方法和生物学技术设计和改造蛋白质分子, 不仅对于理解生物体内电子传递机理、生物代谢过程, 而且对于发展生物传感器均具有重要意义。
五、展 望
氧化还原蛋白质的电化学研究具有重要的理论价值和广阔的应用前景, 值得重视的研究方向为:
・430・
化 学 进 展
[18]
第14
卷
(1) 深入研究氧化还原蛋白质的电子传递过程,
Jones A K , Cam ba R , Keid G A , Chapm an S K , A rm 2strong F A . J . Am . Chem . Soc . , 2000, 122(28) :6494—6495
弄清反应机理;
(2) 通过基因工程、蛋白质工程和蛋白质化学修饰等技术和手段, 合成新的酶, 寻找新的酶促体系; (3) 发掘酶的催化活性, 提高酶促反应的效率;
(4) 人工酶模拟研究, 发展特异、高效、稳定的非
[19]. Chem . , 2000, 72Co llinson M M , How ells A R . A nal (19) :702A —709A
[20]L ev O , W u Z , Bharath S , Glezer V , M odestov A , Gun J ,
R abinovich L , Sampath S . Chem . M ater . , 1997, 9(11) :2354—2375
[21]
蛋白质结构的电催化剂; (5) 制备寿命长、价格低、使用方便的电化学酶传感器; 开发生物能源电池、计算机生物芯片。
参考文献
[1][2][3]
Eddow s M J , H ill H A O . J . Chem . Soc . , Chem . Com 2m un . , 1977, 21:771—772
Yeh P , Kuw ana T . Chem . L ett . , 1977, 70(10) :1145—1148
T araserich M R , Yaropo lov A I , Bogdnovskaya V A , V ar 2fo lom eer S D . B i oelectrochem . B i oeng . , 1979, 6(3) :393—403
[4]
王炳全(W ang B Q ) , 程广金(Cheng G J ) , 董绍俊(Dong
. Chem . ) , 1999, 27(8) :S J ) . 分析化学(Ch inese J . A nal 982—988
[22]W ang B , L iB , D eng Q , Dong S . A nal . Chem . , 1998, 70
(15) :3170—3174
[23][24][25][26]
. Ch i Gun J , L ev O . A nal m . A cta , 1996, 336(1) :95—106Sampath S , L ev O . E lectroanalysis , 1996, 8(12) :1112-1116
. , 1997, 426(12Sampath S , L ev O . J . E 2) :137
(11) :1933—1938Gun J , O. 2) :[N , Chen M .
2621—2631
[29][30][31]
R usling J F . A cc . Chem . R es . , 1998, 31(6) :363—369Chattopadhyay K , M azum dar S . B i oelectrochem . , 2000, 53:17—24
Zhang Z , R usling J F . B i ophys . Chem . , 1997, 63:133—146
[32]N assar A E F , Zhang Z , H u N , R usling J F , Kumo sinsk i
T F . J . Phys . Chem . B , 1997, 101(12) :2224—2231
[33]L u Z , H uang Q , R usling J F . J . E lectroanal . Chem . ,
1997, 423(1) :59—66
[34]
Zhang Z , N zssar A E F , L u Z , Schenkm an J B , R usling J F . J . Am . Chem . Soc . , Faraday T rans . , 1997, 93(9) :1769—1774
[35]W u Z Y , W ang B Q , Cheng Z L , Yang X R , Dong S J ,
W ang E K . B i o sens . B i oelectron . , 2001, 16(1) :47—52[36]
Ino rg . Chem . , 1991, 36:
[37]
Chem .
Soc .
[38][39]
Chen X , X ie H , Kong J . D eng J . B i o sens . B i oelectron . , 2001, 16(2) :115—120
Zhang Z , Chouchen S , M agli ozzo R S , R usling J F . Chem . Comm un . , 2001, (2) :177—178
R ho ten M C , Burgess J D , H aw k ridge F M . E lectroch i m . A cta , 2000, 45(18) :2855—2860
Chem . M ater . , 1997, 9(12) :
[27]J , . lectroanal . Chem . , 1998,
董绍俊(Dong S J ) , 车广礼(Che G L ) , 谢远武(X ie Y W ) . 化学修饰电极(Chem ically M odified E lectrode ) . 北京(jing ) :科学出版社(Science P ress ) , 1995. [5][6][7]
H ill H A O . Coo rd . Chem . . , Gh indilis A L , , E . , 1997, 9(9:Go rton L , L A , L arsson T , M unteanu F D , R usgas . A nal . Ch i T , Gazaryan I m . A cta , 1999, 400(1) :91—108
[8]A rm strong F A , W ilson G S . E lectroch i m ica A cta , 2000,
45:2623—2645
[9][10]
T he Royal Society of Chem istry :Faraday D iscussi on , V o l 106. Cam bridge :T he Royal Society of Chem istry , 2000Guidelli R , A lo isi L , Becucci L , Do lfi A , M oncelliM R , . Chem . , 2001, 504(1) :Buoninsegni F T . J . E lectroanal 1—28
[11]V arfo lom eev S D , Kurouchk in I V . B i o sen . B i oelectron . ,
1996, 11(9) :863—871
[12]
Guo L H , H ill H A O . A dv . 341—375
[13]A rm strong F A , H eering H A , H irst J .
R ev . , 1997, 26:169—179
[14]D uff J L C , B reton C J , Butt J N , A rm strong F A , T hom 2
son A J . J . Am . Chem . Soc . , 1996, 118(36) :8593—8603
[15]Butt J N , A rm strong F A , B reton J , Geo rge S J , T hom 2
son A J , H atch ik ian E C . J . Am . Chem . Soc . , 1991, 113(17) :6663—6670
[16]M ondalM S, Fuller H A , A rm strong F A. J. Am. Chem.
Soc . , 1996, 118(1) :263—264
[17]
Sucheta A , Camm ack R , W einer J , A rm strong F A . B i o 2chem istry , 1993, 32:5455
[42][40][41]
胡乃非(H u N F ) , 李溱(L i Z ) , 马红艳(M a H Y ) . 高等学校化学学报(Chem . J . Ch inese U niversities ) , 2001, 22
(3) :450-454
R usling J F . Interface , 1997, 6(4) :26—31
刘慧宏(L iu H H ) , 陈显堂(Chen X T ) , 李俊(L i J ) , H ill
. Chem. ) , 2001, 29H A O. 分析化学(Ch inese J. A nal (5) :511-515
罗立强(L uo L Q ) , 杨秀荣(Yang X R ) . 分析化学(Ch i 2
. Chem . ) , 2000, 28(9) :1165-1171nese J . A nal
第6期
[43]
刘慧宏等 氧化还原蛋白质电化学研究
[68][69]
・431・
. Sci . , T ien H T , Barish R H , Gu L Q , O ttova A L . A nal 1998, 14(1) :3—18
Yang S T , W itkow sk i A , H uthch ins R S , Sco tt D L , Bachas L G . E lectroanalysis , 1998, 10(1) :58—60Co snier S, Galland B, Gondaan C, L e P A. analysis , 1998, 10(12) :808—813
E lectro 2
[44]Burgess J D , R ho ten M C, H aw k ridge F M. J. Am.
Chem . Soc . , 1998, 120(18) :4488—4491
[45]Burgess J D , R ho ten M C , H aw k ridge F M . L angm uir ,
1998, 14(9) :2467—2475
[46][47][48]
Zhang Y L , J in S Z , Zhang C X , Shen H X . E lectro 2analysis , 2001, 13(2) :137—142
. Chem . , 1998, 70(15) :Pang D W , A bruna H D . A nal 3162—3169
. Chem . , 2000, 72(19) :Pang D W , A bruna H D . A nal 4700—4706
[49]L vov Y M , L u Z , R usling J F . J . Am . Chem . Soc . ,
1996, 118(12) :3043—3044
[50][51]
. Ch i Chen X , R uan C , Kong J . D eng J , A nal m . A cta , 2000, 41(1) :89—98
Zhao J, H enkens R W , Stonehuerm er J , O ’Dang J P, . Chem. , 1992, 327(1) :C rum bliss A L. J. E lectroanal 109
[52][53][54]
. B i ochem . , 2000, X iao H Y , L u H X , Chen H Y . A nal 278:22—28
. Chem Gu H Y , Yu A M , Chen H Y . J . E lectroanal 2001, 516:119—126
[70]A nicet A , A nne A , M o iroux J , Sav éant J M , D equaire M .
J . Am . Chem . Soc . , 1998, 120(28) :7115—7116
[71]A nicet N , Bourdillon C , M o iroux J , Sav éant J M . J .
Phys . Chem . B , 1998, 102(49) :9844—9849
[72]D egrand C , L i m oges B . J . Am . Chem . Soc . , 1999, 121
(29) , 6946—6974
[73]Bourdillon C , D em aille C , M o iroux J , Sav éant J M . A cc .
Chem , R es . , 1996, 29(11) :529—535
[74]Bardea A , Katz E , W illner I . E lectroanalysis , 2000, 12
(14) :1097—1106
[75]Dong Y , Shannoa C .
2371—2376
[76]W arsinke A , Benkert A , F W.
. Chem. , 2000, 366() :634A nal
[77A nzai J , J . Chem .
T . II , 2) 461—462
]
, ura N , Ho sh i T . Senso rs and A ctua 2rs , 65:94—96
[A nzai J , Kobayash i Y . L angm uir , 2000, 16(6) :2851—
2856
[80][81][82][83]
. Chem . , 2001, 507Kobayash i Y , A nzai J . J . E lectroanal (2) :250—255
Gilardi G , Fantuzzi A , Sadegh i S J . Current Op ini on in Structural B i o logy , 2001, 11:491—499
R ik lin A , Katz E , W illner I , Stocker A , Buckm ann A F . N ature , 1995, 376:672—675
Zi m m erm ann H , L indgren A , Schuhm ann W , Go rton L . Chem . Eur . J . , 2000, 6(4) :592—599
[84]W illner I , H eleg 2Shabtai V , B londer R , Katz E , T ao G ,
Buckm ann A F , H eller A . J . Am . Chem . Soc . , 1996, 118(42) :10321—10322
[85][86][87][88][89]
. Kate E , Sch lereth D D , Schm idt H L . J . E lectroanal Chem . , 1994, 368(122) :165—171
. J . Am . Chem . Soc . , Katz E , Buckm ann A F , W illner I 2001, 123:10752—10753
Guo L H , M c L andon G , R azafitri m o H , Gao Y . J . M ater . Chem . , 1996, 6(2) :369—374Kaw ahara V , O hno H . 161—166
Kaw ahara N V , O hno H . E lectroch i m . A cta , 1998, 43(10) :1493—1497
[90]N akam ura N , N akam ura Y , T ani . m ura R , et al
troch i m . A cta , 2001, 46:1605—1608
[91]Ban K, U ek i T , T am ada Y, Saito T ,
653
[92]W righ t M , Honeychurch M J , H ill H A O . E lectrochem .
Comm un . , 1999, 1:609—613
I m abayash i S,
W atanabe M. E lectrochem. Comm un . , 2001, 3:649—
E lec 2
So lid State I onics , 1998, 113:
Soc . ,
F resenius J.
. A nal
Chem . , 2000, 72(11) :
唐琼芳(T ang Q F ) , 孟宪伟() , 冉均国(R an J G ) , (C Q ) . 中国科学B in Ch B ) , 30(2) :119-124
[55]J ia J B , W , u A G , Cheng G J , L i Z , Dong S J . . Chem . , 2002, 74(9) :2217—2223A nal
E lectroanalysis , 2001, 13(5) :
[56]L i Q , L uo G , Feng J .
359—363
[57][58]
Topoglidis E , L utz T , W ills R L , Barnett C J , Cass A E G , D urrant J R . F raday D iscuss . , 2000, 16:35—46. J. Am. Chem. Soc . , 2000, H irst R , Katz E, W illner I 122:12053—12054
[59]W ang J X , L i M X , Sh i Z J , L i N Q , Gu Z N . A nal .
Chem . , 2002, 74(9) :1993—1997[60]
Ferretti S , Paynter S , R ussellD A , Sap sfo rd K E . T rA C :. Chem . , 2000, 19(9) :530—540T rends A nal
[61]W illner I , Katz A , W iller B .
(13) :965—977
[62]
. Chem . , R uzgas T , Gaigalas A , Go rton L . J . E lectroanal 1999, 469(1) :123—131
[63]L i J , Cheng G , Dong S J . E lectroanal . Chem . , 1996, 416
(1) :97—104
[64]W illner I , R ik lin A , Shoham B , R ivenzon O , Katz E .
A dv . M ater . , 1993, 5(12) :912—915[65]
. Chem . , 1999, 71(9) :H ayes M A , Kuh r W G . A nal 1720—1727
[66]D untha N , N ow allW B, Kuh rW G . A nal . Chem. , 1997,
69(14) :2619—2625
[67]D eihamm er R S , Ho M , A nderegg J W , Po rter M D .
L angm uir , 1994, 10(4) :1306—1313
E lectroanalysis , 1997, 9
・432・
[93][94
]
R au H K , D ej onge N , H aehnel W . A ngew . Chem . . , 2000, 39(1) :250—
253Ed . Engl
化 学 进 展
Int .
第14
卷
[99]M adoz G J , A bad J M , Fernandez R J , V elezM , V azquez
L , Gom ez M C , Fernandez V M . J . Am . Chem . Soc . , 2000, 122(40) :9808—9817
[100]V an 2D yke B R , Saltm an P, A rm strong F A. J. Am.
Chem . Soc . , 1996, 118(14) :3490—3492
[101]L o K K W , W ong L L , H ill H A O . FEBS L ett . , 1999,
451:342—346
[102]D avis J J , H ill H A O , Bond A M . Coo rd . Chem . R ev . ,
2000, 200:411—442
[103]L iu H , H ill H A O , Chapm an S K .
Chem . , 2001, 500(1) :598—603
[104]Yam azak i T , Ko ji . Chem . , 2000, 72m a K , Sode K . A nal
(16) :4689—4693
J .
. E lectroanal
Schnerpf R , Ho rth P, B ill E, W ieghardt K, H ildebrandt P, H aehnel W. J. Am. Chem. Soc . , 2001, 123(10) :2186—2195
[95]W illner I , H eleg 2Shabtai V , Katz E , R au H K , H aehnel
W . J . Am . Chem . Soc . , 1999, 121(27) :6455—6468[96][97]
Sadegh i S , M eharenna Y T , FantuzziA , V aletti F , Gilardi G . Farady D iscuss . , 2000, 116:135—153
P resnova G , Grigo renko V , Ego reov A , R uzgas T , L in 2gren A , Go rton L , Bo rchers T . Farady D iscuss . , 2000, 116:281—289
[98]
Zhou Y F , Zhang X E , L iu H , Zhang Z P , Zhang C G , Cass A E G . B i oconjugate Chem . , 2001, 12:924—931