第五章
工业微生物保藏技术
Gaoys
现代微生物发酵通常采用传代性能稳定的菌株进行 纯培养，绝大多数工业生产所用菌株是不可替换的。 （除非染菌、自然突变、破坏和死亡）； 生产中菌种变异造成的经济损失是巨大的。 培养物可再分离或再从保藏机构购买，但花费的时 间和精力等都相当高； 菌种是国家的重要资源的一部分； 有效的菌种保藏方法可以避免或减少这些损失。
2
菌种保藏的基本原理 挑选优良纯种，最好是休眠体（如分生孢子、芽孢 等）; 创造一个使微生物代谢不活泼，生长繁殖受抑制， 难以突变的环境条件（如干燥、低温、缺氧、缺营 养以及添加保护剂或酸度中和剂等），使保藏中的 菌种不进行增殖，不发生突变。 菌种保藏的每种方法都有各自的优缺点，没有任何 一种方法对所有的微生物都是适宜的。
3
理想的菌种保藏方法的要求 存活：经长期保藏后菌种存活健在； 重复性：保证研究结果获得良好的重复性； 保证高产稳产： 高产突变株不改变表型和基因型 （不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产 能力）； 简便、经济。
基本措施：低温、干燥、真空、寡营养。
4
保藏方法的选择 从保藏微生物的要求及使用者的需要考虑 保藏的活度要求； 增殖和细胞遗传变异的结果； 需要保藏的样品数； 取放菌种的频率； 保藏方法的成本费用； 菌种特性 实验室现有仪器的型号等
5
工业微生物菌种保藏技术
斜面保藏法 穿刺保藏法 沙土管干燥保藏法
菌种的保藏方法
真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
6
一、斜面保藏法 菌种在适宜的斜面培养基和温 度条件下培养并生长良好
4－5℃ 冰箱保藏3－6个月
重新接种再行保藏 简便实用； 短期保藏； 菌种易发生变异，染菌。
7
二、穿刺保藏法 1％软琼脂培养基装入小试管或螺 口小管，高1-2mm，灭菌
将菌种穿刺接入培养基1/2处，培养，覆盖23mm无菌液体石蜡，放入冰箱保藏 简便实用； 用于好气性细菌等保藏； 效果优于斜面； 不适于利用石蜡为碳源的微生物（固氮菌、根霉等）
8
三、沙土管干燥保藏法 沙土烘干过筛（80目沙、100目土），混匀 后分装于小试管，高度约1cm 121 ℃ 高压间歇灭菌至无菌，烘干备用 菌种制成浓的菌或孢子悬液，或孢子直接 刮下与载体混匀 干燥器真空抽干封口 置于干燥器中5 ℃冰箱保藏
9
四、菌种冷冻保藏
普通冷冻保藏技术(-20℃) 超低温冷冻保藏技术(-60－-80℃) 液氮冷冻保藏技术 真空冷冻干燥保藏法
10
1、普通冷冻保藏技术(-20℃) 1－2ml菌液加入密封性能好的螺口管中，封口后 直接放入冰箱低温区（ -20℃ ）保藏即可
应用方便； 一般要求菌悬液浓度较高； 注意冰箱故障和停电事故； 融化后菌种不能再继续低温保存，要重新移种后再 冷藏
11
2、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞
用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞
加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜
混匀后分装入冷冻指管或安瓿管中，-70℃超低温 冰箱中保藏（冷冻速度一般控制在1-2℃／min ）
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3、液氮冷冻保藏技术 基本步骤 Step1: 待冷冻保藏菌种菌悬液的制备
从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘油 的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌 体细胞悬液；0.2～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用 塑料瓶。 从浸没培养物制备菌悬液：浸没培养液加入等体积20% 无菌甘油，轻轻振荡混匀，如菌体絮凝，则先用玻璃 珠打散；0.2-lml分装安瓿管或液氮冷藏专用塑料瓶， 玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将封好的安瓿置于5℃冰 箱中3min，使细胞和悬浮培养基达到平衡。
13
Step2: 控速冷冻 经检验的安瓿管以 1 ℃ /min的速度冷却至 -25 ℃ ，再 放入液氮罐中； 有些菌种在放入液氮罐之前， 须用干冰－ 乙二醇等 制冷剂冷却至-78℃； 将安瓿管移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃) 中保存。保藏期一般为2－3年，长的可达9年。 如无控速冷冻机，一般可将安瓿管置于-70℃冰箱中 冷冻4h，然后迅速移入液氮罐保存。 保藏期间注意液N2的补充。
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Step3: 复苏 从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中； 迅速将安瓿置于38-40℃温水浴中振荡1－2min使之完 全融化； 用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌 液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次， 然后取0.1-0.2ml (约4、8滴)转接入琼脂斜面上。
15
4、真空冷冻干燥保藏法
各保藏机构广泛采用的主要保藏方法和最有效的方法之一
基本步骤 安瓿管处理 菌悬液制备
安瓿管保藏
冷冻干燥
16
冻干菌种的再生
超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿管，用砂轮在 安瓿管上锉一道沟，用无菌纱布包好安瓿，然后用手 掰开安瓿管； 安瓿管加入0.5～1ml液体培养基，慢慢旋转安瓿管， 使冻干菌种复水。然后转接到一含有再生培养基的无 菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板； 在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可将此直接振落 入盛有 l～2ml 液体培养基的试管中，轻轻振荡 5 ～ l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。
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五、菌种的悬液保藏法
寡营养保藏法； 将菌种悬浮在不含营养的蒸馏水、0.25mol/L PBS （pH）或生理盐水中； 在10 ℃或室温保藏（丝状真菌、肠道科细菌等）；
关键： 试管密封好，防止水分蒸发。
18
六、传代保藏
将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生 长温度下生长和保存的传代保藏方法 优点： 最为简单和经济，不要求任何特殊的设备。 缺点： 易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变； 不适宜生产菌种的长期保藏。 对策：
斜面培养物在密闭容器中5℃保藏，防止培养基脱水并能 降低代谢活性； 基本培养基上传代为好，可淘汰突变株； 转接菌量保持较低水平。 19
七、矿物油中浸没保藏 将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温保藏， 简便有效。 适用于难冷冻干燥的丝状真菌、酵母、细菌、放线菌 和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌的保藏； 操作要点： 待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经 170 ℃ 下灭菌 1-2h的矿物油，用量以高出培养物 1cm为宜。 一般保藏株2～3年也应做一次存活试验
20
以液体石蜡作为保存方法时注意：
能在液体石蜡下生长的菌种；
能同化液体石蜡的菌种（某些假丝酵母）； 对液体石蜡保藏敏感菌株都不能用液体石蜡保藏。
微生物活力和稳定性测定
所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。
保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。
工业生产菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。
加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的稳定性。在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测，可以用来预测菌种的稳定性。 成功长期保藏方法指标：
•保藏6个月、1年或更长时间存活百分率；
•细胞群体的形态学特征、生化特征应在菌种保藏前后保持同一性；
•实验室、中试车间和发酵生产产品滴度的稳定性。
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第五章
工业微生物保藏技术
Gaoys
现代微生物发酵通常采用传代性能稳定的菌株进行 纯培养，绝大多数工业生产所用菌株是不可替换的。 （除非染菌、自然突变、破坏和死亡）； 生产中菌种变异造成的经济损失是巨大的。 培养物可再分离或再从保藏机构购买，但花费的时 间和精力等都相当高； 菌种是国家的重要资源的一部分； 有效的菌种保藏方法可以避免或减少这些损失。
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菌种保藏的基本原理 挑选优良纯种，最好是休眠体（如分生孢子、芽孢 等）; 创造一个使微生物代谢不活泼，生长繁殖受抑制， 难以突变的环境条件（如干燥、低温、缺氧、缺营 养以及添加保护剂或酸度中和剂等），使保藏中的 菌种不进行增殖，不发生突变。 菌种保藏的每种方法都有各自的优缺点，没有任何 一种方法对所有的微生物都是适宜的。
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理想的菌种保藏方法的要求 存活：经长期保藏后菌种存活健在； 重复性：保证研究结果获得良好的重复性； 保证高产稳产： 高产突变株不改变表型和基因型 （不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产 能力）； 简便、经济。
基本措施：低温、干燥、真空、寡营养。
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保藏方法的选择 从保藏微生物的要求及使用者的需要考虑 保藏的活度要求； 增殖和细胞遗传变异的结果； 需要保藏的样品数； 取放菌种的频率； 保藏方法的成本费用； 菌种特性 实验室现有仪器的型号等
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工业微生物菌种保藏技术
斜面保藏法 穿刺保藏法 沙土管干燥保藏法
菌种的保藏方法
真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
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一、斜面保藏法 菌种在适宜的斜面培养基和温 度条件下培养并生长良好
4－5℃ 冰箱保藏3－6个月
重新接种再行保藏 简便实用； 短期保藏； 菌种易发生变异，染菌。
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二、穿刺保藏法 1％软琼脂培养基装入小试管或螺 口小管，高1-2mm，灭菌
将菌种穿刺接入培养基1/2处，培养，覆盖23mm无菌液体石蜡，放入冰箱保藏 简便实用； 用于好气性细菌等保藏； 效果优于斜面； 不适于利用石蜡为碳源的微生物（固氮菌、根霉等）
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三、沙土管干燥保藏法 沙土烘干过筛（80目沙、100目土），混匀 后分装于小试管，高度约1cm 121 ℃ 高压间歇灭菌至无菌，烘干备用 菌种制成浓的菌或孢子悬液，或孢子直接 刮下与载体混匀 干燥器真空抽干封口 置于干燥器中5 ℃冰箱保藏
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四、菌种冷冻保藏
普通冷冻保藏技术(-20℃) 超低温冷冻保藏技术(-60－-80℃) 液氮冷冻保藏技术 真空冷冻干燥保藏法
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1、普通冷冻保藏技术(-20℃) 1－2ml菌液加入密封性能好的螺口管中，封口后 直接放入冰箱低温区（ -20℃ ）保藏即可
应用方便； 一般要求菌悬液浓度较高； 注意冰箱故障和停电事故； 融化后菌种不能再继续低温保存，要重新移种后再 冷藏
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2、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞
用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞
加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜
混匀后分装入冷冻指管或安瓿管中，-70℃超低温 冰箱中保藏（冷冻速度一般控制在1-2℃／min ）
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3、液氮冷冻保藏技术 基本步骤 Step1: 待冷冻保藏菌种菌悬液的制备
从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘油 的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌 体细胞悬液；0.2～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用 塑料瓶。 从浸没培养物制备菌悬液：浸没培养液加入等体积20% 无菌甘油，轻轻振荡混匀，如菌体絮凝，则先用玻璃 珠打散；0.2-lml分装安瓿管或液氮冷藏专用塑料瓶， 玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将封好的安瓿置于5℃冰 箱中3min，使细胞和悬浮培养基达到平衡。
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Step2: 控速冷冻 经检验的安瓿管以 1 ℃ /min的速度冷却至 -25 ℃ ，再 放入液氮罐中； 有些菌种在放入液氮罐之前， 须用干冰－ 乙二醇等 制冷剂冷却至-78℃； 将安瓿管移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃) 中保存。保藏期一般为2－3年，长的可达9年。 如无控速冷冻机，一般可将安瓿管置于-70℃冰箱中 冷冻4h，然后迅速移入液氮罐保存。 保藏期间注意液N2的补充。
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Step3: 复苏 从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中； 迅速将安瓿置于38-40℃温水浴中振荡1－2min使之完 全融化； 用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌 液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次， 然后取0.1-0.2ml (约4、8滴)转接入琼脂斜面上。
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4、真空冷冻干燥保藏法
各保藏机构广泛采用的主要保藏方法和最有效的方法之一
基本步骤 安瓿管处理 菌悬液制备
安瓿管保藏
冷冻干燥
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冻干菌种的再生
超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿管，用砂轮在 安瓿管上锉一道沟，用无菌纱布包好安瓿，然后用手 掰开安瓿管； 安瓿管加入0.5～1ml液体培养基，慢慢旋转安瓿管， 使冻干菌种复水。然后转接到一含有再生培养基的无 菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板； 在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可将此直接振落 入盛有 l～2ml 液体培养基的试管中，轻轻振荡 5 ～ l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。
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五、菌种的悬液保藏法
寡营养保藏法； 将菌种悬浮在不含营养的蒸馏水、0.25mol/L PBS （pH）或生理盐水中； 在10 ℃或室温保藏（丝状真菌、肠道科细菌等）；
关键： 试管密封好，防止水分蒸发。
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六、传代保藏
将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生 长温度下生长和保存的传代保藏方法 优点： 最为简单和经济，不要求任何特殊的设备。 缺点： 易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变； 不适宜生产菌种的长期保藏。 对策：
斜面培养物在密闭容器中5℃保藏，防止培养基脱水并能 降低代谢活性； 基本培养基上传代为好，可淘汰突变株； 转接菌量保持较低水平。 19
七、矿物油中浸没保藏 将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温保藏， 简便有效。 适用于难冷冻干燥的丝状真菌、酵母、细菌、放线菌 和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌的保藏； 操作要点： 待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经 170 ℃ 下灭菌 1-2h的矿物油，用量以高出培养物 1cm为宜。 一般保藏株2～3年也应做一次存活试验
20
以液体石蜡作为保存方法时注意：
能在液体石蜡下生长的菌种；
能同化液体石蜡的菌种（某些假丝酵母）； 对液体石蜡保藏敏感菌株都不能用液体石蜡保藏。
微生物活力和稳定性测定
所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。
保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。
工业生产菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。
加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的稳定性。在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测，可以用来预测菌种的稳定性。 成功长期保藏方法指标：
•保藏6个月、1年或更长时间存活百分率；
•细胞群体的形态学特征、生化特征应在菌种保藏前后保持同一性；
•实验室、中试车间和发酵生产产品滴度的稳定性。
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