大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性

066

　　　　　　

华东理工大学学报(自然科学版)

Journal

of East China University of Science and Technology (Natural Science Edition )

Vol. 34No. 52008210

　　文章编号:100623080(2008) 0520660205

大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性

谭　黎, 　欧阳立明, 　丁庆豹, 　欧　伶

(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室, 上海)

　　摘要:将大肠杆菌K 212别克隆到p ET 211a 载体并转化大肠杆菌(2GE 分析和酶的活性测定, 37%以上, 与产核苷磷酸化酶的野生菌比较, , 构建的工程菌可以用来高效催化核苷的转糖基反应。

关键词:大肠杆菌; 嘌呤核苷磷酸化酶; 尿苷磷酸化酶; 胸苷磷酸化酶; 表达中图分类号:Q75文献标识码:A

Cloning , Expression and Activity Analysis of Nucleoside

Phosphorylases G enes from Escherichia coli K 12

T A N L i , 　OU YA N G L i 2mi n g , 　D I N G Qi ng 2bao , 　OU L i ng

(S tate Key L aboratory of B ioreactor Engi neeri ng , East Chi na U ni versit y of

S cience and Technolog y , S hang hai 200237, Chi na )

Abstract :The genes encoding pyrimidine nucleoside p ho sp horylase , uridine p hosp horrylase and t hy 2midine p ho sp horylase f rom Escherichi a coli K12were cloned respectively into expression vector p ET 211a.

The reco mbinant plasmids were t hen t ransformed into t he st rain E. coli BL21(DE3) . As a result t he enzymes were highly exp ressed after induction wit h IP T G. The expression product was analyzed wit h SDS 2PA GE varifying t hat target p roteins were expressed in soluble form and t he amount account s for more t han 37%of total p rotein in t he host. Compared wit h t he wild st rains which also p roduce nucleo side p hosp ho 2rylase well , t he enzyme activity of t hree recombinant st rains is evidently improved. In t he specific reaction conditions , t he new const ructed st rains can be used to t ransfer ribose or deoxyribose from a nucleoside to a new base efficiently.

K ey w ords :Escherichi a coli ; pyrimidine nucleo side p hosp horylase ; uridine p hosp horylase ; t hymidine p hosp horylase ; expression

　　核苷磷酸化酶(Nucleoside Phosp horylase , N Pase ) 广泛存在于动植物器官和微生物中, 在机体的核苷代谢尤其是在补救途径中起着十分重要的作用, 在进行核苷及其类似物的合成时, 它能催化核苷

收稿日期:2007212218

或脱氧核苷的可逆磷酸化反应, 能以核糖212磷酸为中间产物进行碱基交换, 形成另一种新的核苷[1]。核苷磷酸化酶分3类:嘌呤核苷磷酸化酶(Pyrimidine Nucleoside Phosp horylase , PN Pase ,

作者简介:谭　黎(19822) , 男, 湖南涟源人, 硕士, 研究方向为分子生物学。通讯联系人:欧　伶,E 2mail :ouling@ecust. edu. cn

第5期谭　黎, 等:

大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性166

EC 2. 4. 2. 1) 、尿苷磷酸化酶(Uridine Phosp horyl 2

ase ,U Pase ,EC 2. 4. 2. 4) 和胸苷磷酸化酶(Thymi 2dine Phosp horylase , TPase , EC 2. 4. 2. 3) , 其中, PN Pase 的天然蛋白质为六聚体(6×25. 82ku ) , U Pase 和TPase 分别为六聚体[2](6×27. 5ku ) 和二

检测器SPD 210Avp 。

1. 1. 3　菌株和质粒　大肠杆菌J M109和BL21(D E3) 、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes ) D GO 204、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erw i ni a carotovora ) 和p ET 211a 载体为本实验室保存,pMD182T 载体购自TA KARA 。1. 2　实验方法

1. 2. 1　　以大肠杆菌K12

聚体[3](2×45ku ) 。

核苷化合物主要应用在医药领域, 如抗病毒和抗肿瘤核苷药物, 也常作为调味品或奶制品添加剂。其传统的制造方法是从微生物如酵母中提取原料并采用化学法进行结构修饰, 这些方法步骤多, 高, 且不易提纯, 因此, 酶, 也就是N Pase 应来生产。一些具有较高酶活力的菌种如产气肠杆菌、乙酰短杆菌等应用于核苷类似物的酶法合成。但野生型菌种仍存在酶量相对较低、各种酶量的比例不协调、各酶的底物谱不一致等缺点, 限制了它们在工业上的应用。因此, 通过基因工程手段对各相关酶进行重组表达甚至定点突变改造后构建重组菌对优化核苷类似物的酶法合成具有重要意义。本文对大肠杆菌基因组中的3种核苷磷酸化酶基因分别进行了克隆表达, 结果表明, 重组菌中可溶性目的蛋白表达量大大提高, 达到菌体总蛋白的37%以上, 相同菌体量下的酶活力也显著高于出发菌株和其他野生型菌种。

, 引物由上海生工生已报道的大肠杆菌3个核苷磷酸化酶的基因序列, 本文设计了3对引物(如表1) , 其中含N de Ⅰ和B am H Ⅰ酶切位点(表中划线部分) 。用表1的引物分别扩增了编码PN Pase (deoD ) 、U Pase (u d p ) 和TPase (deoA ) 的基因, 反应条件如下:95℃预变性5min ,94℃变性30s ,55℃

) ,72℃退火1min (deoD 为60℃延伸1min , 共30个循环, 最后72℃延伸10min , deoA 扩增体系中加

入PCR 增强剂。

1. 2. 2　克隆载体和表达载体的构建[4]　将上述PCR 产物与pMD182T 载体连接, 连接产物转化E.

coli J M109, 提取转化子的质粒送上海捷瑞生物技

术公司测序。将重组pMD182T 载体和表达质粒载体p ET 211a 用N de Ⅰ和B am H Ⅰ双酶切后连接, 连接产物转化E. coli J M109。提取转化子质粒酶切鉴定, 筛选出阳性克隆后转化宿主菌E. coli BL21(D E3) 。

表1　核苷磷酸化酶基因PCR 引物

T able 1　PCR primers of N Pase genes

Gene

deoD

1　材料和方法

1. 1　材料

1. 1. 1　试剂和培养基　DNA 聚合酶、dN TP 、限制

性内切酶、T4连接酶购自TA KARA 生物技术公

司,DNA 回收试剂盒购自天根生物技术公司, 琼脂糖、标准分子量的DNA (DNA Marker ) 、三羟甲基氨基甲烷(Tris ) 、丙烯酰胺、双丙烯酰胺和十二烷基磺酸钠(SDS ) 等试剂购自鼎国生物技术有限公司, 低分子量标准蛋白(Protein Marker ) 购自中国科学院上海生化所, 胰蛋白胨和酵母粉购自OXID , 其他试剂均为国产分析纯。

LB/Amp r 液体培养基:蛋白胨10g/L , 酵母提取物5g/L ,NaCl 10g/L , 另加入50μg/mL 氨苄青霉素钠。1. 1. 2　仪器　Techne 2TC412PCR 仪,D YCP 231水平电泳槽,D YCZ 224D 垂直板电泳槽,752紫外光栅分光光度计, D YCZ 224D 电泳仪, G L 2312UV 检测仪,J Y922Ⅱ超声破碎仪, 液相色谱仪L C 210A Tvp ,

Primers

P15′2GGT ACC GCT ACCCCACACATT AATGC P25′2GC TT ACTCTTT ATCGCCCA GCA GAAC U15′2GGGAA T TC GTCT GA T G U25′2GC TACA GCA GACGACGCGCC T15′2GGGAA T TC T TCTCGCACAA G T25′2GC TA T TCGCT GA TACGGCGA TA G

u d p

deoA 1)

1) Codon of nat ure gene of deoA is T T G

1. 2. 3　目的蛋白的诱导表达及TPase 诱导条件的

优化　挑取含重组表达质粒的单克隆,37℃于LB/Amp r 液体培养基中培养过夜后, 以此为种子液, 按1%转接到LB/Amp r 液体培养基中,37℃培养至

βOD 600=0. 6, 加入异丙基22硫代半乳糖苷(IP T G ) 至1mmol/L (同时设BL21(D E3) (p ET 211a ) 菌株和未

诱导的重组菌株作对照) ,37℃诱导4h 。

266华东理工大学学报(自然科学版) 第34

卷

由于TPase

诱导表达后出现了包涵体, 因此从诱导剂浓度和诱导温度两个方面对TPase 诱导条件进行了优化。分别设IP T G 浓度梯度和温度梯度,IP T G 浓度从1mmol/L 至1μmol/L , 温度从37℃至20℃, 诱导产物用12%的SDS 2PA GE 分析。1. 2. 4　蛋白质含量测定和HPL C 分析方法　参照Bradford 的考马斯亮蓝G 2250法测定3种粗酶的蛋

分别为线状质粒p ET 211a 和deoD , 琼脂糖凝胶电

泳如图2。重组质粒p ET 211a 2deoA 和p ET 211a 2u d p 分别经N de Ⅰ和B am H Ⅰ双酶切后, 得到了deoA (1. 3kb ) 、u d p (0. 7kb ) 和线状质粒p ET 211a (5. 7kb ) , 如图3

。

白总量[5]。在PN Pase 活性测定和核苷转化反应中采用H PL C 测定目的产物的含量, 柱子型号:Hypersil ODS25μm 、4. 6mm ×250mm , :V (乙腈) ∶V (H 2O ) =5∶95, 流速min , 长:254nm 。

1. 2. 5　酶活性测定Pase :1. 9mL 反应液(10mmol/L 肌苷, 1mmol/L ED TA , 80mmol/L 磷酸钾缓冲液,p H 7. 1) 于50℃水浴预热3min , 加入0. 112mg 粗酶启动反应, 立即计时, 用H PL C 测定反应液中次黄嘌呤的上升值。根据Roman 等[6]报道,PN Pase 的酶活单位定义为:在上

(a

) (b )

图1　PCR 扩增deoD (a ) 、ud p (b ) 和deoA (b )

Fig. 1　PCR amplification of deoD (a ) 、ud p (b ) and deoA (b )

(a ) M —DNA marker , 1—PCR product of deoD ; (b ) M —DNA marker , 1—PCR product of u d p , 2—PCR product of

deoA

述反应条件下, 每分钟产生1μmol 次黄嘌呤所需的酶量定义为一个酶活单位。

U Pase 和TPase 活性测定:1mL 反应液(25mmol/L 尿苷或胸苷,1mmol/L ED TA ,50mmol/L 磷酸钾缓冲液,p H 7. 3) 于50℃水浴预热3min ,

加入0. 025mg 粗酶启动反应, 立即计时, 用紫外分光光度计(290nm ,p H 13) 测定尿嘧啶或胸腺嘧啶的上升值。U Pase 和TPase 酶活单位定义为:在上述条件下,1min 内A 290变化0. 01所需的酶量定义为一个酶活力单位。重组菌和野生菌的活性按上述方法测定。1. 2. 6　重组表达菌对核苷的转化反应　在4mL 反应液(20mmol/L 核苷和20mmol/L 碱基, 1mmol/L ED TA , 50mmol/L 磷酸钾缓冲液, p H7. 1～7. 3) 中加入0. 5%的湿菌体, 在50℃恒温

图2　p ET 211a 2deoD 双酶切结果

Fig. 2　Plasmid p ET 211a 2deoD digested by double enzymes

M —DNA marker , 1～6—p ET 211a 2deoD/N de Ⅰ+B am H Ⅰ; 7—PCR product of

deoD

水浴中反应2h 后, 煮沸灭活5min , 离心取上清, 用H PL C 测定底物的转化率。

图3　p ET 211a 2deoA/ud p 双酶切结果

2　结果与讨论

2. 1　重组载体pET 211a 2deoD (ud p , deoA ) 的构建与

Fig. 3　Plasmid p ET 211a 2deoA/ud p digested

by double enzymes

M —DNA marker , 1～3—p ET 211a 2deoA/N de Ⅰ+B am H Ⅰ; 4～6—p ET 211a 2u d p/N de Ⅰ+B am H Ⅰ

鉴定

以E. coli K12基因组DNA 为模板,PCR 扩增

deoD , u d p 和deoA , 分别得到720bp , 760bp 和1300bp 左右的特异条带(图1) 。　　重组载体p ET 211a 2deoD 经N de Ⅰ和B am H Ⅰ双酶切, 得到5700bp 左右和700bp 左右两条带,

　　对重组质粒测序表明, 插入片段deoD 、u d p 和deoA 都是以A T G 为起始密码子, TAA 为终止密码子, 全长分别为720bp 、762bp 和1323bp 。序列对比表明与GenBank 上公布的大肠杆菌K12序列完全一致。

第5期谭　黎, 等:大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性366

2. 2　重组菌诱导表达的SDS 2PAGE 分析

按照1. 2. 3诱导重组大肠杆菌4h 并处理发酵

液。

(1) PN Pase 的诱导表达结果:E. coli BL21(p ET 211a 2deoD ) 各组分SDS 2PA GE 分析结果如图4a 。以E. coli BL21(p ET 211a ) 为对照可以看出, 重组菌在2. 6×104左右明显增加了表达蛋白条带, 与文献报道的PN Pase 亚基分子量(2. 582×104) 相符, 应为表达产物PN Pase 。电泳结果表明, 诱导表达产物以胞内可溶蛋白形式存在, 并有少量分泌到培养基上清中; 经Bandscan , 后的上清(

约占

60%。诱

导3

h 后表达的PN Pase 占重组大肠杆菌细胞总蛋白量的48%左右。

(2) U Pase 和TPase 的诱导表达结果:E. coli BL21(p ET 211a 2u d p ) 和E. coli BL21(p ET 211a 2de 2oA ) 各组分SDS 2PA GE 的结果如图4b 和4c , 同样以E. coli BL21(p ET 211a ) 为对照, 重组菌在2. 8×104左右(图4b ) 和4. 3×104左右(图4c ) 明显增加了表达蛋白的条带, 分表达产物U Pase 和, 。诱导4h 后U 的表达量分别约占大肠37%和54%; 在胞内可溶蛋白中, 则分别高达65%和70%。从图4b 、4c 可以看出, 两重组菌在诱导表达前的本底表达很低。

(a ) deoD (b ) ud p (c ) deoA

图4　deoD 、ud p 和deoA 在重组菌中表达的SDS 2PA GE 分析

Fig. 4　SDS 2PA GE result of expression product of deoD 、ud p and deoA

M —Protein marker ; 1—Supernate after total cell centrifugation ; 2—Precipitate after sonication ; 3—Supernate after sonication ; 4—Control of

E. coli BL21(p ET 211a ) after inducing ; 5～7(in a ) —Inducing for 3h , 2h , and 1h respetively ; 8(in a ) —Sample before adding IP T G; 5～8

(in b or c ) —Inducing for 4h , 3h , 2h and 1h respectively ; 9—Sample before adding IP T G

　　但从图4c 也可看到, TPase 和PN Pase 、U Pase

不同, 在37℃诱导表达时, 除了胞内可溶蛋白之外还形成了大量包涵体。为了减少包涵体并增加可溶性蛋白的表达, 对TPase 的诱导表达条件进行了优化。减少诱导剂IP T G 的浓度至10-6mol/L 对包涵体的产生影响不大, 而降低诱导温度至28℃时可明显减少包涵体的生成, 但不能完全消除, 同时可溶性目的蛋白可占细胞破碎上清的72%。

通过对诱导剂添加时间与蛋白表达量关系的研究发现, 当OD 600在0. 5～0. 6时添加诱导剂, 目的蛋白的表达量最高。2. 3　工程菌与野生菌的酶活力比较

以含空载体大肠杆菌为对照, 测两组平行数据,

) 诱导4h 对用1mmol/L IP T G 37℃(TP 为28℃后的细胞破碎液直接进行酶活测定。按照上述酶活

定义,3个重组菌诱导4h 后细胞破碎液中粗酶PN Pase 活力为179U/mg 蛋白, U Pase 为15393U/mg 蛋白, TPase 为11883U/mg 蛋白。为了考

两种曾应用于核苷酶法合成的菌种———产气肠杆菌和胡萝卜软腐欧文氏菌中N Pase 的活性。比较重组菌与

野生菌以及对照菌(E. coli BL21(p ET 211a ) ) 的N Pase 活力, 重组菌相对应的酶活力要显

著高于野生菌和对照菌(如表2) 。2. 4　重组表达菌对核苷的转化反应

将重组菌诱导表达后的菌体用于核苷的转化反应,3种酶可以高效合成新的核苷(表3) 。　　由表3可知, 携带deoD 基因的重组菌(E. coli BL21p ET 2deoD ) 可以高效由肌苷或鸟苷合成得到2,62二氨基嘌呤核苷或腺苷, 其中以肌苷为核糖供

体, 腺苷或2,62二氨基嘌呤核苷转化率分别为87%和66. 9%。以鸟苷为核糖供体时, 腺苷或2,62二氨基嘌呤核苷转化率分别为62. 7%和94%。携带u d p 基因的重组菌(E. coli BL21p ET 2u d p ) 可以高效催化合成52甲基尿苷, 以尿苷为核糖供体时, 转化率为51%。携带deoA 基因的重组菌(E. coli BL21p ET 2deoA ) 亦可以高效合成52氟脱氧尿苷,

察重组菌相对野生菌的酶活性差异, 还测定了另外以胸苷为脱氧核糖供体时, 转化率为54. 8%。以上

466华东理工大学学报(自然科学版) 第34卷

表2　重组大肠杆菌与两株野生菌株的酶活力比较

T able 2　Activity comparison of recombinant E. coli and two wild strains 1)

Enzyme activity/(U ・mg -1)

E. coli BL21

E. coli BL21

E. coli BL21

E. coli BL21

Enterobacter aerogenes

Erw inia carotovora

(p ET 2deoD )

PNPase U Pase TPase

116

(p ET 2u d p ) (p ET 2deoA ) (p ET 211a )

14730500

—

3532

——

3550

13765383

19828661

——

—

1) Data were obtained by assaying t he activity of free integrity cells and U/as 表3　T able 3　of catalyzed by NPases

Substrate

2,62Diaminopurine +Inosine

Adenine +Inosine Adenine +Guanosine 2,62Diaminopurine +Guanosine

Thymine +Uridine 52Fluorouracil +Thymidine

Product

2,62Diaminopurine nucleoside

Adenosine Adenosine

2,62Diaminopurine nucleoside

52Met hyluridine 52Fluorodeoxyuridine

NPase PNPase PNPase PNPase PNPase U Pase TPase

Conversion rate of E. coli BL21(p ET 211a ) (%)

9. 614. 310. 212. 612. 79. 1

Conversion rate of recombinant strains (%)

66. 987. 062. 794. 051. 054. 8

核苷合成的效率均明显高于只携带空白质粒的

p ET11a 的E. coli 。

　　另外, 与野生菌相比[7～9]酶的使用量也从湿菌体量的5%降低到0. 5%, 酶的用量大幅降低, 因此重组菌表现出较强的应用前景。

phosphorylases :Proper 2ties ,functions and clinical aspect s[J].Pharmacology &Therapentics ,2000, 88:3492425.

[3]　Walter M R , Cook W J. Three 2dimensional structure of t hy 2

midine phosphorylase from Escherichia coli at 2. 8A resolution [J].The Journal of Biological Chemistry , 1999, 23:[1**********].

[4]　Sambrook J , Frit sch E F. Molecular Cloning :A Laboratory

Manual (2nd ) [M ].New Y ork :Cold Spring Harbor Laborato 2ry Press ,1989. 34257.

[5]　张龙翔. 生化试验方法和技术(第2版) [M ].北京:高等教育出

3　讨　论

　　本研究选取大肠杆菌K12菌株的基因组作为

模板, 用PCR 方法克隆得到核苷磷酸化酶基因deoD 、u d p 和deoA 。利用原核表达载体p ET 211a 的强启动子T7配合宿主菌进行诱导表达, 使重组菌中目的蛋白的表达量和活性都获得了很大提高, 重组菌经诱导后, 其湿菌体可以酶法合成新的核苷, 并取得较好的转化率, 显示构建的重组菌具有很好的的应用价值。参考文献:

[1]　闫蓬勃, 邱蔚然, 丁庆豹. 核苷磷酸化酶的产酶条件优化的研究

[J].药物生物技术,2001, 8(2) :83286. [2]　Bzowska A , Kulikowska E , Shugar D.

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[7]　Utagawa T , Morisawa H , Yamanaka S , et al . Mechanism of

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Enzymatic production of

ribavirin from pyrimidine nucleosides by Enterobacter aero 2

genes AJ 11125[J].Agric Biol Chem , 1988, 52(5) :12332

1237.

[9]　Shirae H , Y okozeki , Kubota K. Enzymatic production of riba 2

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华东理工大学学报(自然科学版)

Journal

of East China University of Science and Technology (Natural Science Edition )

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　　文章编号:100623080(2008) 0520660205

大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性

谭　黎, 　欧阳立明, 　丁庆豹, 　欧　伶

(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室, 上海)

　　摘要:将大肠杆菌K 212别克隆到p ET 211a 载体并转化大肠杆菌(2GE 分析和酶的活性测定, 37%以上, 与产核苷磷酸化酶的野生菌比较, , 构建的工程菌可以用来高效催化核苷的转糖基反应。

关键词:大肠杆菌; 嘌呤核苷磷酸化酶; 尿苷磷酸化酶; 胸苷磷酸化酶; 表达中图分类号:Q75文献标识码:A

Cloning , Expression and Activity Analysis of Nucleoside

Phosphorylases G enes from Escherichia coli K 12

T A N L i , 　OU YA N G L i 2mi n g , 　D I N G Qi ng 2bao , 　OU L i ng

(S tate Key L aboratory of B ioreactor Engi neeri ng , East Chi na U ni versit y of

S cience and Technolog y , S hang hai 200237, Chi na )

Abstract :The genes encoding pyrimidine nucleoside p ho sp horylase , uridine p hosp horrylase and t hy 2midine p ho sp horylase f rom Escherichi a coli K12were cloned respectively into expression vector p ET 211a.

The reco mbinant plasmids were t hen t ransformed into t he st rain E. coli BL21(DE3) . As a result t he enzymes were highly exp ressed after induction wit h IP T G. The expression product was analyzed wit h SDS 2PA GE varifying t hat target p roteins were expressed in soluble form and t he amount account s for more t han 37%of total p rotein in t he host. Compared wit h t he wild st rains which also p roduce nucleo side p hosp ho 2rylase well , t he enzyme activity of t hree recombinant st rains is evidently improved. In t he specific reaction conditions , t he new const ructed st rains can be used to t ransfer ribose or deoxyribose from a nucleoside to a new base efficiently.

K ey w ords :Escherichi a coli ; pyrimidine nucleo side p hosp horylase ; uridine p hosp horylase ; t hymidine p hosp horylase ; expression

　　核苷磷酸化酶(Nucleoside Phosp horylase , N Pase ) 广泛存在于动植物器官和微生物中, 在机体的核苷代谢尤其是在补救途径中起着十分重要的作用, 在进行核苷及其类似物的合成时, 它能催化核苷

收稿日期:2007212218

或脱氧核苷的可逆磷酸化反应, 能以核糖212磷酸为中间产物进行碱基交换, 形成另一种新的核苷[1]。核苷磷酸化酶分3类:嘌呤核苷磷酸化酶(Pyrimidine Nucleoside Phosp horylase , PN Pase ,

作者简介:谭　黎(19822) , 男, 湖南涟源人, 硕士, 研究方向为分子生物学。通讯联系人:欧　伶,E 2mail :ouling@ecust. edu. cn

第5期谭　黎, 等:

大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性166

EC 2. 4. 2. 1) 、尿苷磷酸化酶(Uridine Phosp horyl 2

ase ,U Pase ,EC 2. 4. 2. 4) 和胸苷磷酸化酶(Thymi 2dine Phosp horylase , TPase , EC 2. 4. 2. 3) , 其中, PN Pase 的天然蛋白质为六聚体(6×25. 82ku ) , U Pase 和TPase 分别为六聚体[2](6×27. 5ku ) 和二

检测器SPD 210Avp 。

1. 1. 3　菌株和质粒　大肠杆菌J M109和BL21(D E3) 、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes ) D GO 204、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erw i ni a carotovora ) 和p ET 211a 载体为本实验室保存,pMD182T 载体购自TA KARA 。1. 2　实验方法

1. 2. 1　　以大肠杆菌K12

聚体[3](2×45ku ) 。

核苷化合物主要应用在医药领域, 如抗病毒和抗肿瘤核苷药物, 也常作为调味品或奶制品添加剂。其传统的制造方法是从微生物如酵母中提取原料并采用化学法进行结构修饰, 这些方法步骤多, 高, 且不易提纯, 因此, 酶, 也就是N Pase 应来生产。一些具有较高酶活力的菌种如产气肠杆菌、乙酰短杆菌等应用于核苷类似物的酶法合成。但野生型菌种仍存在酶量相对较低、各种酶量的比例不协调、各酶的底物谱不一致等缺点, 限制了它们在工业上的应用。因此, 通过基因工程手段对各相关酶进行重组表达甚至定点突变改造后构建重组菌对优化核苷类似物的酶法合成具有重要意义。本文对大肠杆菌基因组中的3种核苷磷酸化酶基因分别进行了克隆表达, 结果表明, 重组菌中可溶性目的蛋白表达量大大提高, 达到菌体总蛋白的37%以上, 相同菌体量下的酶活力也显著高于出发菌株和其他野生型菌种。

, 引物由上海生工生已报道的大肠杆菌3个核苷磷酸化酶的基因序列, 本文设计了3对引物(如表1) , 其中含N de Ⅰ和B am H Ⅰ酶切位点(表中划线部分) 。用表1的引物分别扩增了编码PN Pase (deoD ) 、U Pase (u d p ) 和TPase (deoA ) 的基因, 反应条件如下:95℃预变性5min ,94℃变性30s ,55℃

) ,72℃退火1min (deoD 为60℃延伸1min , 共30个循环, 最后72℃延伸10min , deoA 扩增体系中加

入PCR 增强剂。

1. 2. 2　克隆载体和表达载体的构建[4]　将上述PCR 产物与pMD182T 载体连接, 连接产物转化E.

coli J M109, 提取转化子的质粒送上海捷瑞生物技

术公司测序。将重组pMD182T 载体和表达质粒载体p ET 211a 用N de Ⅰ和B am H Ⅰ双酶切后连接, 连接产物转化E. coli J M109。提取转化子质粒酶切鉴定, 筛选出阳性克隆后转化宿主菌E. coli BL21(D E3) 。

表1　核苷磷酸化酶基因PCR 引物

T able 1　PCR primers of N Pase genes

Gene

deoD

1　材料和方法

1. 1　材料

1. 1. 1　试剂和培养基　DNA 聚合酶、dN TP 、限制

性内切酶、T4连接酶购自TA KARA 生物技术公

司,DNA 回收试剂盒购自天根生物技术公司, 琼脂糖、标准分子量的DNA (DNA Marker ) 、三羟甲基氨基甲烷(Tris ) 、丙烯酰胺、双丙烯酰胺和十二烷基磺酸钠(SDS ) 等试剂购自鼎国生物技术有限公司, 低分子量标准蛋白(Protein Marker ) 购自中国科学院上海生化所, 胰蛋白胨和酵母粉购自OXID , 其他试剂均为国产分析纯。

LB/Amp r 液体培养基:蛋白胨10g/L , 酵母提取物5g/L ,NaCl 10g/L , 另加入50μg/mL 氨苄青霉素钠。1. 1. 2　仪器　Techne 2TC412PCR 仪,D YCP 231水平电泳槽,D YCZ 224D 垂直板电泳槽,752紫外光栅分光光度计, D YCZ 224D 电泳仪, G L 2312UV 检测仪,J Y922Ⅱ超声破碎仪, 液相色谱仪L C 210A Tvp ,

Primers

P15′2GGT ACC GCT ACCCCACACATT AATGC P25′2GC TT ACTCTTT ATCGCCCA GCA GAAC U15′2GGGAA T TC GTCT GA T G U25′2GC TACA GCA GACGACGCGCC T15′2GGGAA T TC T TCTCGCACAA G T25′2GC TA T TCGCT GA TACGGCGA TA G

u d p

deoA 1)

1) Codon of nat ure gene of deoA is T T G

1. 2. 3　目的蛋白的诱导表达及TPase 诱导条件的

优化　挑取含重组表达质粒的单克隆,37℃于LB/Amp r 液体培养基中培养过夜后, 以此为种子液, 按1%转接到LB/Amp r 液体培养基中,37℃培养至

βOD 600=0. 6, 加入异丙基22硫代半乳糖苷(IP T G ) 至1mmol/L (同时设BL21(D E3) (p ET 211a ) 菌株和未

诱导的重组菌株作对照) ,37℃诱导4h 。

266华东理工大学学报(自然科学版) 第34

卷

由于TPase

诱导表达后出现了包涵体, 因此从诱导剂浓度和诱导温度两个方面对TPase 诱导条件进行了优化。分别设IP T G 浓度梯度和温度梯度,IP T G 浓度从1mmol/L 至1μmol/L , 温度从37℃至20℃, 诱导产物用12%的SDS 2PA GE 分析。1. 2. 4　蛋白质含量测定和HPL C 分析方法　参照Bradford 的考马斯亮蓝G 2250法测定3种粗酶的蛋

分别为线状质粒p ET 211a 和deoD , 琼脂糖凝胶电

泳如图2。重组质粒p ET 211a 2deoA 和p ET 211a 2u d p 分别经N de Ⅰ和B am H Ⅰ双酶切后, 得到了deoA (1. 3kb ) 、u d p (0. 7kb ) 和线状质粒p ET 211a (5. 7kb ) , 如图3

。

白总量[5]。在PN Pase 活性测定和核苷转化反应中采用H PL C 测定目的产物的含量, 柱子型号:Hypersil ODS25μm 、4. 6mm ×250mm , :V (乙腈) ∶V (H 2O ) =5∶95, 流速min , 长:254nm 。

1. 2. 5　酶活性测定Pase :1. 9mL 反应液(10mmol/L 肌苷, 1mmol/L ED TA , 80mmol/L 磷酸钾缓冲液,p H 7. 1) 于50℃水浴预热3min , 加入0. 112mg 粗酶启动反应, 立即计时, 用H PL C 测定反应液中次黄嘌呤的上升值。根据Roman 等[6]报道,PN Pase 的酶活单位定义为:在上

(a

) (b )

图1　PCR 扩增deoD (a ) 、ud p (b ) 和deoA (b )

Fig. 1　PCR amplification of deoD (a ) 、ud p (b ) and deoA (b )

(a ) M —DNA marker , 1—PCR product of deoD ; (b ) M —DNA marker , 1—PCR product of u d p , 2—PCR product of

deoA

述反应条件下, 每分钟产生1μmol 次黄嘌呤所需的酶量定义为一个酶活单位。

U Pase 和TPase 活性测定:1mL 反应液(25mmol/L 尿苷或胸苷,1mmol/L ED TA ,50mmol/L 磷酸钾缓冲液,p H 7. 3) 于50℃水浴预热3min ,

加入0. 025mg 粗酶启动反应, 立即计时, 用紫外分光光度计(290nm ,p H 13) 测定尿嘧啶或胸腺嘧啶的上升值。U Pase 和TPase 酶活单位定义为:在上述条件下,1min 内A 290变化0. 01所需的酶量定义为一个酶活力单位。重组菌和野生菌的活性按上述方法测定。1. 2. 6　重组表达菌对核苷的转化反应　在4mL 反应液(20mmol/L 核苷和20mmol/L 碱基, 1mmol/L ED TA , 50mmol/L 磷酸钾缓冲液, p H7. 1～7. 3) 中加入0. 5%的湿菌体, 在50℃恒温

图2　p ET 211a 2deoD 双酶切结果

Fig. 2　Plasmid p ET 211a 2deoD digested by double enzymes

M —DNA marker , 1～6—p ET 211a 2deoD/N de Ⅰ+B am H Ⅰ; 7—PCR product of

deoD

水浴中反应2h 后, 煮沸灭活5min , 离心取上清, 用H PL C 测定底物的转化率。

图3　p ET 211a 2deoA/ud p 双酶切结果

2　结果与讨论

2. 1　重组载体pET 211a 2deoD (ud p , deoA ) 的构建与

Fig. 3　Plasmid p ET 211a 2deoA/ud p digested

by double enzymes

M —DNA marker , 1～3—p ET 211a 2deoA/N de Ⅰ+B am H Ⅰ; 4～6—p ET 211a 2u d p/N de Ⅰ+B am H Ⅰ

鉴定

以E. coli K12基因组DNA 为模板,PCR 扩增

deoD , u d p 和deoA , 分别得到720bp , 760bp 和1300bp 左右的特异条带(图1) 。　　重组载体p ET 211a 2deoD 经N de Ⅰ和B am H Ⅰ双酶切, 得到5700bp 左右和700bp 左右两条带,

　　对重组质粒测序表明, 插入片段deoD 、u d p 和deoA 都是以A T G 为起始密码子, TAA 为终止密码子, 全长分别为720bp 、762bp 和1323bp 。序列对比表明与GenBank 上公布的大肠杆菌K12序列完全一致。

第5期谭　黎, 等:大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性366

2. 2　重组菌诱导表达的SDS 2PAGE 分析

按照1. 2. 3诱导重组大肠杆菌4h 并处理发酵

液。

(1) PN Pase 的诱导表达结果:E. coli BL21(p ET 211a 2deoD ) 各组分SDS 2PA GE 分析结果如图4a 。以E. coli BL21(p ET 211a ) 为对照可以看出, 重组菌在2. 6×104左右明显增加了表达蛋白条带, 与文献报道的PN Pase 亚基分子量(2. 582×104) 相符, 应为表达产物PN Pase 。电泳结果表明, 诱导表达产物以胞内可溶蛋白形式存在, 并有少量分泌到培养基上清中; 经Bandscan , 后的上清(

约占

60%。诱

导3

h 后表达的PN Pase 占重组大肠杆菌细胞总蛋白量的48%左右。

(2) U Pase 和TPase 的诱导表达结果:E. coli BL21(p ET 211a 2u d p ) 和E. coli BL21(p ET 211a 2de 2oA ) 各组分SDS 2PA GE 的结果如图4b 和4c , 同样以E. coli BL21(p ET 211a ) 为对照, 重组菌在2. 8×104左右(图4b ) 和4. 3×104左右(图4c ) 明显增加了表达蛋白的条带, 分表达产物U Pase 和, 。诱导4h 后U 的表达量分别约占大肠37%和54%; 在胞内可溶蛋白中, 则分别高达65%和70%。从图4b 、4c 可以看出, 两重组菌在诱导表达前的本底表达很低。

(a ) deoD (b ) ud p (c ) deoA

图4　deoD 、ud p 和deoA 在重组菌中表达的SDS 2PA GE 分析

Fig. 4　SDS 2PA GE result of expression product of deoD 、ud p and deoA

M —Protein marker ; 1—Supernate after total cell centrifugation ; 2—Precipitate after sonication ; 3—Supernate after sonication ; 4—Control of

E. coli BL21(p ET 211a ) after inducing ; 5～7(in a ) —Inducing for 3h , 2h , and 1h respetively ; 8(in a ) —Sample before adding IP T G; 5～8

(in b or c ) —Inducing for 4h , 3h , 2h and 1h respectively ; 9—Sample before adding IP T G

　　但从图4c 也可看到, TPase 和PN Pase 、U Pase

不同, 在37℃诱导表达时, 除了胞内可溶蛋白之外还形成了大量包涵体。为了减少包涵体并增加可溶性蛋白的表达, 对TPase 的诱导表达条件进行了优化。减少诱导剂IP T G 的浓度至10-6mol/L 对包涵体的产生影响不大, 而降低诱导温度至28℃时可明显减少包涵体的生成, 但不能完全消除, 同时可溶性目的蛋白可占细胞破碎上清的72%。

通过对诱导剂添加时间与蛋白表达量关系的研究发现, 当OD 600在0. 5～0. 6时添加诱导剂, 目的蛋白的表达量最高。2. 3　工程菌与野生菌的酶活力比较

以含空载体大肠杆菌为对照, 测两组平行数据,

) 诱导4h 对用1mmol/L IP T G 37℃(TP 为28℃后的细胞破碎液直接进行酶活测定。按照上述酶活

定义,3个重组菌诱导4h 后细胞破碎液中粗酶PN Pase 活力为179U/mg 蛋白, U Pase 为15393U/mg 蛋白, TPase 为11883U/mg 蛋白。为了考

两种曾应用于核苷酶法合成的菌种———产气肠杆菌和胡萝卜软腐欧文氏菌中N Pase 的活性。比较重组菌与

野生菌以及对照菌(E. coli BL21(p ET 211a ) ) 的N Pase 活力, 重组菌相对应的酶活力要显

著高于野生菌和对照菌(如表2) 。2. 4　重组表达菌对核苷的转化反应

将重组菌诱导表达后的菌体用于核苷的转化反应,3种酶可以高效合成新的核苷(表3) 。　　由表3可知, 携带deoD 基因的重组菌(E. coli BL21p ET 2deoD ) 可以高效由肌苷或鸟苷合成得到2,62二氨基嘌呤核苷或腺苷, 其中以肌苷为核糖供

体, 腺苷或2,62二氨基嘌呤核苷转化率分别为87%和66. 9%。以鸟苷为核糖供体时, 腺苷或2,62二氨基嘌呤核苷转化率分别为62. 7%和94%。携带u d p 基因的重组菌(E. coli BL21p ET 2u d p ) 可以高效催化合成52甲基尿苷, 以尿苷为核糖供体时, 转化率为51%。携带deoA 基因的重组菌(E. coli BL21p ET 2deoA ) 亦可以高效合成52氟脱氧尿苷,

察重组菌相对野生菌的酶活性差异, 还测定了另外以胸苷为脱氧核糖供体时, 转化率为54. 8%。以上

466华东理工大学学报(自然科学版) 第34卷

表2　重组大肠杆菌与两株野生菌株的酶活力比较

T able 2　Activity comparison of recombinant E. coli and two wild strains 1)

Enzyme activity/(U ・mg -1)

E. coli BL21

E. coli BL21

E. coli BL21

E. coli BL21

Enterobacter aerogenes

Erw inia carotovora

(p ET 2deoD )

PNPase U Pase TPase

116

(p ET 2u d p ) (p ET 2deoA ) (p ET 211a )

14730500

—

3532

——

3550

13765383

19828661

——

—

1) Data were obtained by assaying t he activity of free integrity cells and U/as 表3　T able 3　of catalyzed by NPases

Substrate

2,62Diaminopurine +Inosine

Adenine +Inosine Adenine +Guanosine 2,62Diaminopurine +Guanosine

Thymine +Uridine 52Fluorouracil +Thymidine

Product

2,62Diaminopurine nucleoside

Adenosine Adenosine

2,62Diaminopurine nucleoside

52Met hyluridine 52Fluorodeoxyuridine

NPase PNPase PNPase PNPase PNPase U Pase TPase

Conversion rate of E. coli BL21(p ET 211a ) (%)

9. 614. 310. 212. 612. 79. 1

Conversion rate of recombinant strains (%)

66. 987. 062. 794. 051. 054. 8

核苷合成的效率均明显高于只携带空白质粒的

p ET11a 的E. coli 。

　　另外, 与野生菌相比[7～9]酶的使用量也从湿菌体量的5%降低到0. 5%, 酶的用量大幅降低, 因此重组菌表现出较强的应用前景。

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[5]　张龙翔. 生化试验方法和技术(第2版) [M ].北京:高等教育出

3　讨　论

　　本研究选取大肠杆菌K12菌株的基因组作为

模板, 用PCR 方法克隆得到核苷磷酸化酶基因deoD 、u d p 和deoA 。利用原核表达载体p ET 211a 的强启动子T7配合宿主菌进行诱导表达, 使重组菌中目的蛋白的表达量和活性都获得了很大提高, 重组菌经诱导后, 其湿菌体可以酶法合成新的核苷, 并取得较好的转化率, 显示构建的重组菌具有很好的的应用价值。参考文献:

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