抗原抗体反应及其应用
摘要 抗原抗体反应指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。免疫印迹，又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。双转印法、天然电泳及western blot 分析等是最近几年出现的新型蛋白印迹技术。单克隆抗体技术是20世纪后20年内最为重要的生物高技术之一。单克隆抗体药物在肿瘤治疗、抗感染等方面具有重要的作用。 关键词 抗原抗体反应、Western blotting、单克隆抗体技术
一、抗原抗体反应
抗原抗体反应指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。这种反应既可在机体内进行，也可以在机体外进行。抗原抗体反应的过程是经过一系列的化学和物理变化，包括抗原抗体特异性结合和非特异性促凝聚两个阶段，以及由亲水胶体转为疏水胶体的变化[1]。抗原是能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原表位是抗原上与抗体结合的区域。蛋白质抗原的表位是由相邻的连续的或非连续的氨基酸序列形成的局部表面结构[2]，如图1所示。抗体是指宿主对体内存在的外来分子、微生物或其他因子的应答而产生的蛋白质。 抗体主要由B淋巴细胞系的终末分化细胞-浆细胞产生，并且循环在血液和淋巴液中，在那里与抗原结合。 抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。抗体上与抗原表位结合的位点由重链和轻链的可变区构成[3]，如图2所示。 抗原抗体复合物通过大量非共价键连接。 某些免疫复合物中抗体或抗原的结构未发生改变，而另一些则出现巨大的构像改变。 研究抗原抗体复合物最有说服力的的方法是抗体-抗原共结晶的X射线衍射技术。
图1 抗原表位示意图 图2 抗体结构示意图
二、蛋白印迹技术
免疫印迹，又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。混合样品经ＳＤＳ-聚丙烯酰胺凝胶电泳后分离,凝胶中的蛋白质用电印迹方法被转移到化学惰性的高分子转移膜上。然后,将目的蛋白的特异性一级抗体(一抗)与转移膜上的目的蛋白进行免疫结合反应,再用标记过(如HRP)的二级抗体(二抗)与一抗结合,用对二抗分子中标记物的检测证明目的蛋白的存在[4]。主要步骤如下：
(1)电印迹———电转移:首先是将分离的蛋白从SDS-PAGE凝胶上转印到硝酸纤维素(NC) 膜、聚偏乙烯氟化物( PVDF) 膜等固相上,PVDF 膜较NC 膜具有更高的蛋白结合性能、物理强度和化学稳定性。目前,最广泛使用的印迹方法是电转印(电转印也称电转移),即在电场作用下将凝胶上的蛋白转移到转移液浸湿的膜上。电转印又分湿转印和半干转印2种。湿转印(wet transfer) 是将整个夹心式转印体系(支持垫-滤纸-转印膜-凝胶-滤纸-支持垫) 垂直地直接浸入缓冲液内进行转印。其装置多采用Towbin 设计的垂直式不锈钢/铂电极转印槽。半干转印(semi-dry transfer)是事先将转印体系中的凝胶、膜、滤纸及支持垫浸泡在转移缓冲液中,浸湿片刻后直接进行转印,而无须将其浸入缓冲液内。具体操作为：电泳完毕后对凝胶进行半干转膜(转膜缓冲液为48 mmol/L Tris, 39mmol/L甘氨酸,
1.3 mmol/L SDS, 含20%甲醇, pH 9.2)。半干式转膜槽阴极在上, 阳极在下, 在
半干转移的凝胶“三明治”中, 先准备阳极侧滤纸, 然后重叠放置两张大小完全一致的0.2 m PVDF 膜, 再铺凝胶及阴极侧滤纸, 缓冲液为连续缓冲液, 蛋白质移动方向由上而下。转移电流50~250 mA, 转移时间15~50min。半干转印优于垂直转印,因为半干式蛋白质电泳印迹具有操作简单、快速、节约缓冲液、印迹条带背景清晰等特点，而且可以一次可以转印多块胶,而且所需电压较低。但也存在一定局限性, 对于分子量过低或者过高的蛋白质的印迹效果不太理想[5]。
(2)封闭:蛋白质分子从胶上转移到膜上后,为减少探针的非特异结合,用非反应活性分子封阻转移膜上未吸附蛋白质的区域,以降低检测的背景信号。应用最多的封阻剂是脱脂奶粉,还有:凝集素、牛血清蛋白、血红蛋白、酪蛋白等。使用时应注意它们各自的特点,如:牛血清蛋白含有碳氢化合物,用外源凝集素作探针时会增加背景;用血红蛋白封闭会对膜产生“负染”。目前,对带正电荷的尼龙膜封闭时,由于尚没有有效的封剂,需要用比ＮＣ膜更加有效的封阻剂,因为尼龙膜有很高的蛋白质结合能力而加深背景,常用10%明胶或牛血清白蛋白在50℃过夜封闭。
(3)免疫结合反应:用目的蛋白的抗体与转移膜上的目的蛋白(靶蛋白)进行特异性免疫结合反应,再用标记过的二抗与膜上的一抗反应。影响免疫印迹成败的主导因素之一是抗原分子中可被抗体识别的表位(抗原决定簇)性质。多数高分辨率的凝胶电泳多会引起抗原样品的变性,只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合。多克隆抗血清多含有这类抗体,所以在免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。相反,许多单克隆抗体不能与变性抗原反应,因为它识别的表位依赖于抗原蛋白天然折叠所形成的空间结构。单克隆抗体或多克隆抗体均可用于免疫印迹,但两者各有优缺点,见表1。免疫印迹中最好能使用混合单克隆抗体,兼具多克隆抗体和单克隆抗体的优点,既特异性强,又灵敏度高,是由一组能与特定的耐变性表位结合而不出现交叉反应的单克隆组成。除选择多抗/单抗外,还应注意抗体的种源性,掌握二抗一定要抗一抗的种源原则,如:一抗是兔源的,二抗一定要是能抗兔的抗体。对做成年或大动物时,有些抗体受到限制,应多做调查研究[6]。
表1 抗体的种类
(4)检测:根据连接二抗标识物的检出,如:化学发光、显色和放射性同位素测定等,间接检测出目的蛋白的存在。目前常用的的检测方法是化学发光法,即当结合在膜上的HRP标记过的抗体与荧光底物结合,经HRP酶的化学氧化产生激发 态发光产物。
三、新型蛋白印迹技术
1．双转印法
免疫印迹技术长期存在的一个主要问题,是第二抗体(二抗) 与印迹膜上非特异性蛋白产生的非特异性反应,由此产生了非特异性条带多,结果难以判定。为了降低二抗非特异性吸附所造成的假阳性反应,Lasne等建立了双转印法。大致步骤为:将蛋白条带转印至膜上,经封闭、加第一抗体(一抗) 、洗膜等程序后,将转印膜上的一抗第二次转印至另一张膜即DB 膜上。而抗原及其他干扰蛋白则不会发生转印而保留在转印膜上[7]。
2.天然电泳及western blot 分析
天然电泳即非变性电泳,因整个电泳系统(包括凝胶、缓冲液、样品处理液) 中不含SDS、DTT或二巯基乙醇等成分,样品也不加热,可保留被分离蛋白的结构完整性和生物学活性。在这种条件下,蛋白的迁移率由分子大小和所带电荷决定。非变性电泳的分辨率通常不SDS-PAGE ,但当需要保持分子天然结构和生物学活
性时,如进行酶分子或某些病毒蛋白的免疫转印时,这便是一种较理想的方法[8]。
3.斑点免疫结合试验
是将抗原直接或用点样仪点加于NC 膜上,孵育后按常法进行免疫印迹反应。根据膜上点样点的呈色反应来判断结果。Sumi 用此法在实验室建立了检测脑脊液结核抗原的方法,以诊断结核性脑膜炎[9]。其敏感性可达100 ng/ ml。
4.菌落免疫印迹试验
此法原理与斑点免疫结合试验大致相同,不同之处是直接将菌落印迹在膜上,用于检测细菌所分泌的毒素和表达的蛋白。Szakal 用此法来检测粪便中肠侵袭性大肠埃希菌( EIEC) 和志贺菌属表达的质粒编码侵袭蛋白( IpaC) ,取得较好效果。其做法是,将粪便标本或菌液涂布培养平板后,随即将NC 膜平铺在标本上,在菌落生长的同时, 细菌表达的蛋白便印迹在相应的膜的位置。37℃培养24 h 后将膜取下,用氯仿处理20 min 以杀死细菌; PBS洗膜后将膜浸泡于0.5 %Tween20 的PBS 中10 min ,然后置于100℃烤箱10 min ,以去除内源性碱性磷酸酶活性;洗膜后按常法进行免疫抗体反应并显色。此法也可以用于噬菌体抗体的筛选和鉴定
[10]。
四、单克隆抗体技术 1975年Kohler和Milstein成功地创建了淋巴细胞杂交瘤技术。 该技术被誉为免疫学的一次革命，是20世纪后20年内最为重要的生物高技术之一。其创建者因对人类做出了重要贡献而荣获1984年诺贝尔医学与生理学奖[11]。淋巴细胞杂交瘤技术是将在体外不能长期生存的免疫细胞与在体外能迅速增殖的瘤细胞在聚乙二醇的作用下融合而产生杂交瘤细胞。 所得的杂交瘤细胞承袭了两组亲代细胞的遗传特性，既保持了瘤细胞在体外迅速增殖传代能力，又继承了免疫细胞合成与分泌能力。淋巴细胞主要有B淋巴细胞(简称B细胞)和T淋巴细胞(简称T 细胞)两种B细胞主司细胞免疫,能产生淋巴因子.现已知有40余种B 细胞与胸腺瘤细胞融合,可产生能分泌淋巴因子的B细胞杂交瘤.T细胞主司体液免疫,能分泌特异性免疫球蛋白,又称抗体T细胞与骨髓瘤细胞融合则产生能分泌特异性抗体的细胞杂交瘤[12]。近年来单抗治疗药物迅速发展, 一些已经被应用于临床。下面就单克隆抗体药物的研究进展作一综述。
1．单克隆抗体在肿瘤治疗中的应用 单抗药物一般分为:治疗疾病(尤其是肿瘤)的单抗药剂、抗肿瘤单抗偶联物、治疗其他疾病的单抗。单抗药剂针对的靶点通常为细胞表面的疾病相关抗原或特定的受体。如:最早被美国FDA 批准用于治疗肿瘤的单抗药物利妥昔单抗;抗肿瘤单抗偶联物, 或称免疫偶联物(Immunoconjugate) 由单抗与有治疗作用的物质(如:放射性核素、毒素和药物等)两部分构成, 其中包括放射免疫偶联物、免疫毒素、化学免疫偶联物, 此外还有酶结合单抗偶联物、光敏剂结合单抗偶联物等[13]。 表2 概括了近年来美国FDA 批准上市的5 个治疗肿瘤的单克隆抗体药物的基本情况。
表2 近年美国FDA 批准上市的5 个治疗肿瘤的单克隆抗体药物
2．单克隆抗体在抗感染中的应用
艰难梭菌定殖在胃肠道的末端，可释放毒素使结肠发生炎症和损失，感染者的症状是腹痛和腹泻。长期广谱抗生素治疗以及院内感染是艰难梭菌感染的常见原因，在院内极易传播，老年患者尤其易感，对于某些患者通常是致命性的。需要警惕的是，艰难梭菌感染的发生率越来越高，感染者的病情越来越严重，而且越来越难以控制。现有的治疗还是主要依赖于抗生素，但是抗生素会进一步破坏肠道内的菌群平衡，从而导致感染更易复发。此外，耐药菌的出现也是个棘手的问题，现在甚至出现了多药耐药的艰难梭菌。抗感染单克隆抗体给艰难梭菌感染的治疗带来了希望，现在有越来越多的抗感染单克隆抗体开发出来。其中，Raxibacumab (ABthrax，Human Genome Sciences)已经被批用于炭疽病的治疗，表3中列出了几种处于临床研究阶段的单克隆抗体，还有一些处于临床前开发阶段。抗感染单克隆抗体可特异性杀死细菌，增强机体的防御能力，毒性比较低，而且生产速度相对较快。抗微生物药物是通过直接杀灭或抑制细菌的生长而起治疗作用的，而单克隆抗体可通过直接或间接增强机体的能力，使机体本身完成杀灭细菌的任务。这样就可以逐步纠正抗微生物药物导致的细菌耐药、双重感染以及菌群改变的问题[14]。
表3 进入临床试验的抗肿瘤单克隆抗体药物
3.新型单克隆抗体技术
Kohler和Milstein创建的淋巴细胞杂交瘤细胞来源于小鼠的B 细胞杂交瘤, 但人体免疫系统可以识别鼠源性单抗, 因此其应用受到了很大的限制。随着分子生物学技术的发展， 到20 世纪80 年代末逐步建立了抗体库技术。该技术是抗体工程领域的重大进展，它的出现主要是基于PCR 技术的建立和发展、抗体分子在大肠杆菌中的功能性表达及噬菌体展示技术的发展。1985 年，Smith第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1 的基因Ⅲ， 使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。20 世纪90 年代初，人们认识到了噬菌体展示技术在筛选上的巨大潜力，并把它应用于基因工程抗体的制备中，建立了噬菌体抗体库技术，即用已知抗原从较大的抗体库中筛选出目的抗体。该技术在人源性抗体的生产、抗体性能改造和抗体基因研究等方面具有较大的实用价值。与传统的杂交瘤技术相比， 噬菌体抗体库技术具有明显的优越性，即操作简单、稳定有效、筛选容量大、生产成本低等。现有一些利用该技术生产的抗体已进入临床Ⅱ／Ⅲ 期研究， 如Cambridge Antibody Technology （CAT） 的D2E7 和CAT2152， 分别用于治疗风湿性关节炎和青光眼。全人抗体是治疗性抗体的发展趋势。1989 年，Brüggemann利用转基因技术研制出第一个全人源单抗Adalimumab， 因能够识别结合并阻断肿瘤坏死因子（TNF）而被用于治疗类风湿性关节炎，2003 年在美国上市。Vectibix 是第二个全人序列单抗药物，靶标为上皮生长因子受体（EGFR），该药于2006 年9 月获FDA批准在美国上市，是直、结肠癌的三线治疗药物[15]。
目前抗体库技术还受2方面的因素影响：①从未经免疫动物的抗体库获得的抗体亲和力不高；②受外源基因转化率的限制， 抗体库的库容不足以涵盖某种动物的抗体多样性。大容量抗体库是获得高亲和力抗体和针对稀有抗原抗体的关键。核糖体展示技术避开了上述不足，可制备大容量抗体库。该技术依赖于mRNA、核糖体和抗体蛋白（或多肽）通过非共价结合形成三联复合体，在无细胞体系中完成转录和翻译，实现了基因型和表型的偶联， 翻译出来的抗体可用抗原进行筛选， 由于不经过体内转化， 构建的抗体库库容可达到甚至超过1011。利用核糖体展示技术可以获得特异的、高亲和力的抗体。2004 年，我国建成世界上第一个针对SARS 的基因工程抗体库。
参考文献
[1] Borghesi L, Milcarek C. From B cell to plasma cell: regulation of V(D)J recombination and antibody secretion. Immunol. Res. 2006, 36 (1-3): 27–32
[2] Parker D. T cell-dependent B cell activation. Annu Rev Immunol. 1993, 11
(1): 331–360
[3] Roux K. Immunoglobulin structure and function as revealed by electron microscopy. Int Arch Allergy Immunol. 1999, 120 (2): 85–99.
[4] 张燕婉,叶珏,时那,孟宪敏,王来元. 蛋白质免疫印迹技术的实验研究[J]. 实
验技术与管理. 2008(10)
[5] 赵俊芳,王学谦,丁红梅,孙晓慧,潘春莹. 免疫印迹法检测过敏原特异性IgE[J]. 现代检验医学杂志. 2008(01)
[6] 原喆,高重天,孙群. 如何降低免疫印迹实验的成本[J]. 生物学通报.2008(02) [7] Reese G,Schmechel D,Ayuso R,et al.Grid-immunoblotting: a fast and simple technique to test multiple allergens with small amounts of antibody for cross-reactivity. Journal of Chromatography B . 2001 [8] Manoussopoulos I N,Maiss E,Tsagris M.Native elctrophoresis and western blot analysis (NEWeB): a method for characterization of different forms of potyvirus particles and similar nucleoprotein complexes in extracts of infected plant tissues. Journal of General Virology . 2000 [9] Lasne F.Double-blotting: a solution to the problem of nonspecific binding of secondary antibodies in immunoblotting procedures. Journal of Immunological Methods . 2003 [10] Bergendahl V,Glaser B T,Burgess R R.A fast western blot procedure improved for quantitative analysis by direct fluorescence labeling of primary antibodies. Journal of Immunological Methods . 2003
[11] Smith GP.Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display coloned antigens on the virion surface. Science . 1985
[12] 李莉,王丽花,孔宪涛. 单克隆抗体治疗的过去、现在和未来[J]. 免疫学杂志. 2005 [13] Verhoeyen M,Milstein C,Winter G.Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity. Science . 1988 [14] Mattheakis L C,Bhatt R R,Dower W J.An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 1994 [15] Douthwaitel JA,Groves MA.An improved method for an ef-ficient and easily accessible eukaryotic ribosome displaytechnology. Protein
Engineering,Design&Selection . 2006
抗原抗体反应及其应用
摘要 抗原抗体反应指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。免疫印迹，又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。双转印法、天然电泳及western blot 分析等是最近几年出现的新型蛋白印迹技术。单克隆抗体技术是20世纪后20年内最为重要的生物高技术之一。单克隆抗体药物在肿瘤治疗、抗感染等方面具有重要的作用。 关键词 抗原抗体反应、Western blotting、单克隆抗体技术
一、抗原抗体反应
抗原抗体反应指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。这种反应既可在机体内进行，也可以在机体外进行。抗原抗体反应的过程是经过一系列的化学和物理变化，包括抗原抗体特异性结合和非特异性促凝聚两个阶段，以及由亲水胶体转为疏水胶体的变化[1]。抗原是能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原表位是抗原上与抗体结合的区域。蛋白质抗原的表位是由相邻的连续的或非连续的氨基酸序列形成的局部表面结构[2]，如图1所示。抗体是指宿主对体内存在的外来分子、微生物或其他因子的应答而产生的蛋白质。 抗体主要由B淋巴细胞系的终末分化细胞-浆细胞产生，并且循环在血液和淋巴液中，在那里与抗原结合。 抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。抗体上与抗原表位结合的位点由重链和轻链的可变区构成[3]，如图2所示。 抗原抗体复合物通过大量非共价键连接。 某些免疫复合物中抗体或抗原的结构未发生改变，而另一些则出现巨大的构像改变。 研究抗原抗体复合物最有说服力的的方法是抗体-抗原共结晶的X射线衍射技术。
图1 抗原表位示意图 图2 抗体结构示意图
二、蛋白印迹技术
免疫印迹，又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。混合样品经ＳＤＳ-聚丙烯酰胺凝胶电泳后分离,凝胶中的蛋白质用电印迹方法被转移到化学惰性的高分子转移膜上。然后,将目的蛋白的特异性一级抗体(一抗)与转移膜上的目的蛋白进行免疫结合反应,再用标记过(如HRP)的二级抗体(二抗)与一抗结合,用对二抗分子中标记物的检测证明目的蛋白的存在[4]。主要步骤如下：
(1)电印迹———电转移:首先是将分离的蛋白从SDS-PAGE凝胶上转印到硝酸纤维素(NC) 膜、聚偏乙烯氟化物( PVDF) 膜等固相上,PVDF 膜较NC 膜具有更高的蛋白结合性能、物理强度和化学稳定性。目前,最广泛使用的印迹方法是电转印(电转印也称电转移),即在电场作用下将凝胶上的蛋白转移到转移液浸湿的膜上。电转印又分湿转印和半干转印2种。湿转印(wet transfer) 是将整个夹心式转印体系(支持垫-滤纸-转印膜-凝胶-滤纸-支持垫) 垂直地直接浸入缓冲液内进行转印。其装置多采用Towbin 设计的垂直式不锈钢/铂电极转印槽。半干转印(semi-dry transfer)是事先将转印体系中的凝胶、膜、滤纸及支持垫浸泡在转移缓冲液中,浸湿片刻后直接进行转印,而无须将其浸入缓冲液内。具体操作为：电泳完毕后对凝胶进行半干转膜(转膜缓冲液为48 mmol/L Tris, 39mmol/L甘氨酸,
1.3 mmol/L SDS, 含20%甲醇, pH 9.2)。半干式转膜槽阴极在上, 阳极在下, 在
半干转移的凝胶“三明治”中, 先准备阳极侧滤纸, 然后重叠放置两张大小完全一致的0.2 m PVDF 膜, 再铺凝胶及阴极侧滤纸, 缓冲液为连续缓冲液, 蛋白质移动方向由上而下。转移电流50~250 mA, 转移时间15~50min。半干转印优于垂直转印,因为半干式蛋白质电泳印迹具有操作简单、快速、节约缓冲液、印迹条带背景清晰等特点，而且可以一次可以转印多块胶,而且所需电压较低。但也存在一定局限性, 对于分子量过低或者过高的蛋白质的印迹效果不太理想[5]。
(2)封闭:蛋白质分子从胶上转移到膜上后,为减少探针的非特异结合,用非反应活性分子封阻转移膜上未吸附蛋白质的区域,以降低检测的背景信号。应用最多的封阻剂是脱脂奶粉,还有:凝集素、牛血清蛋白、血红蛋白、酪蛋白等。使用时应注意它们各自的特点,如:牛血清蛋白含有碳氢化合物,用外源凝集素作探针时会增加背景;用血红蛋白封闭会对膜产生“负染”。目前,对带正电荷的尼龙膜封闭时,由于尚没有有效的封剂,需要用比ＮＣ膜更加有效的封阻剂,因为尼龙膜有很高的蛋白质结合能力而加深背景,常用10%明胶或牛血清白蛋白在50℃过夜封闭。
(3)免疫结合反应:用目的蛋白的抗体与转移膜上的目的蛋白(靶蛋白)进行特异性免疫结合反应,再用标记过的二抗与膜上的一抗反应。影响免疫印迹成败的主导因素之一是抗原分子中可被抗体识别的表位(抗原决定簇)性质。多数高分辨率的凝胶电泳多会引起抗原样品的变性,只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合。多克隆抗血清多含有这类抗体,所以在免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。相反,许多单克隆抗体不能与变性抗原反应,因为它识别的表位依赖于抗原蛋白天然折叠所形成的空间结构。单克隆抗体或多克隆抗体均可用于免疫印迹,但两者各有优缺点,见表1。免疫印迹中最好能使用混合单克隆抗体,兼具多克隆抗体和单克隆抗体的优点,既特异性强,又灵敏度高,是由一组能与特定的耐变性表位结合而不出现交叉反应的单克隆组成。除选择多抗/单抗外,还应注意抗体的种源性,掌握二抗一定要抗一抗的种源原则,如:一抗是兔源的,二抗一定要是能抗兔的抗体。对做成年或大动物时,有些抗体受到限制,应多做调查研究[6]。
表1 抗体的种类
(4)检测:根据连接二抗标识物的检出,如:化学发光、显色和放射性同位素测定等,间接检测出目的蛋白的存在。目前常用的的检测方法是化学发光法,即当结合在膜上的HRP标记过的抗体与荧光底物结合,经HRP酶的化学氧化产生激发 态发光产物。
三、新型蛋白印迹技术
1．双转印法
免疫印迹技术长期存在的一个主要问题,是第二抗体(二抗) 与印迹膜上非特异性蛋白产生的非特异性反应,由此产生了非特异性条带多,结果难以判定。为了降低二抗非特异性吸附所造成的假阳性反应,Lasne等建立了双转印法。大致步骤为:将蛋白条带转印至膜上,经封闭、加第一抗体(一抗) 、洗膜等程序后,将转印膜上的一抗第二次转印至另一张膜即DB 膜上。而抗原及其他干扰蛋白则不会发生转印而保留在转印膜上[7]。
2.天然电泳及western blot 分析
天然电泳即非变性电泳,因整个电泳系统(包括凝胶、缓冲液、样品处理液) 中不含SDS、DTT或二巯基乙醇等成分,样品也不加热,可保留被分离蛋白的结构完整性和生物学活性。在这种条件下,蛋白的迁移率由分子大小和所带电荷决定。非变性电泳的分辨率通常不SDS-PAGE ,但当需要保持分子天然结构和生物学活
性时,如进行酶分子或某些病毒蛋白的免疫转印时,这便是一种较理想的方法[8]。
3.斑点免疫结合试验
是将抗原直接或用点样仪点加于NC 膜上,孵育后按常法进行免疫印迹反应。根据膜上点样点的呈色反应来判断结果。Sumi 用此法在实验室建立了检测脑脊液结核抗原的方法,以诊断结核性脑膜炎[9]。其敏感性可达100 ng/ ml。
4.菌落免疫印迹试验
此法原理与斑点免疫结合试验大致相同,不同之处是直接将菌落印迹在膜上,用于检测细菌所分泌的毒素和表达的蛋白。Szakal 用此法来检测粪便中肠侵袭性大肠埃希菌( EIEC) 和志贺菌属表达的质粒编码侵袭蛋白( IpaC) ,取得较好效果。其做法是,将粪便标本或菌液涂布培养平板后,随即将NC 膜平铺在标本上,在菌落生长的同时, 细菌表达的蛋白便印迹在相应的膜的位置。37℃培养24 h 后将膜取下,用氯仿处理20 min 以杀死细菌; PBS洗膜后将膜浸泡于0.5 %Tween20 的PBS 中10 min ,然后置于100℃烤箱10 min ,以去除内源性碱性磷酸酶活性;洗膜后按常法进行免疫抗体反应并显色。此法也可以用于噬菌体抗体的筛选和鉴定
[10]。
四、单克隆抗体技术 1975年Kohler和Milstein成功地创建了淋巴细胞杂交瘤技术。 该技术被誉为免疫学的一次革命，是20世纪后20年内最为重要的生物高技术之一。其创建者因对人类做出了重要贡献而荣获1984年诺贝尔医学与生理学奖[11]。淋巴细胞杂交瘤技术是将在体外不能长期生存的免疫细胞与在体外能迅速增殖的瘤细胞在聚乙二醇的作用下融合而产生杂交瘤细胞。 所得的杂交瘤细胞承袭了两组亲代细胞的遗传特性，既保持了瘤细胞在体外迅速增殖传代能力，又继承了免疫细胞合成与分泌能力。淋巴细胞主要有B淋巴细胞(简称B细胞)和T淋巴细胞(简称T 细胞)两种B细胞主司细胞免疫,能产生淋巴因子.现已知有40余种B 细胞与胸腺瘤细胞融合,可产生能分泌淋巴因子的B细胞杂交瘤.T细胞主司体液免疫,能分泌特异性免疫球蛋白,又称抗体T细胞与骨髓瘤细胞融合则产生能分泌特异性抗体的细胞杂交瘤[12]。近年来单抗治疗药物迅速发展, 一些已经被应用于临床。下面就单克隆抗体药物的研究进展作一综述。
1．单克隆抗体在肿瘤治疗中的应用 单抗药物一般分为:治疗疾病(尤其是肿瘤)的单抗药剂、抗肿瘤单抗偶联物、治疗其他疾病的单抗。单抗药剂针对的靶点通常为细胞表面的疾病相关抗原或特定的受体。如:最早被美国FDA 批准用于治疗肿瘤的单抗药物利妥昔单抗;抗肿瘤单抗偶联物, 或称免疫偶联物(Immunoconjugate) 由单抗与有治疗作用的物质(如:放射性核素、毒素和药物等)两部分构成, 其中包括放射免疫偶联物、免疫毒素、化学免疫偶联物, 此外还有酶结合单抗偶联物、光敏剂结合单抗偶联物等[13]。 表2 概括了近年来美国FDA 批准上市的5 个治疗肿瘤的单克隆抗体药物的基本情况。
表2 近年美国FDA 批准上市的5 个治疗肿瘤的单克隆抗体药物
2．单克隆抗体在抗感染中的应用
艰难梭菌定殖在胃肠道的末端，可释放毒素使结肠发生炎症和损失，感染者的症状是腹痛和腹泻。长期广谱抗生素治疗以及院内感染是艰难梭菌感染的常见原因，在院内极易传播，老年患者尤其易感，对于某些患者通常是致命性的。需要警惕的是，艰难梭菌感染的发生率越来越高，感染者的病情越来越严重，而且越来越难以控制。现有的治疗还是主要依赖于抗生素，但是抗生素会进一步破坏肠道内的菌群平衡，从而导致感染更易复发。此外，耐药菌的出现也是个棘手的问题，现在甚至出现了多药耐药的艰难梭菌。抗感染单克隆抗体给艰难梭菌感染的治疗带来了希望，现在有越来越多的抗感染单克隆抗体开发出来。其中，Raxibacumab (ABthrax，Human Genome Sciences)已经被批用于炭疽病的治疗，表3中列出了几种处于临床研究阶段的单克隆抗体，还有一些处于临床前开发阶段。抗感染单克隆抗体可特异性杀死细菌，增强机体的防御能力，毒性比较低，而且生产速度相对较快。抗微生物药物是通过直接杀灭或抑制细菌的生长而起治疗作用的，而单克隆抗体可通过直接或间接增强机体的能力，使机体本身完成杀灭细菌的任务。这样就可以逐步纠正抗微生物药物导致的细菌耐药、双重感染以及菌群改变的问题[14]。
表3 进入临床试验的抗肿瘤单克隆抗体药物
3.新型单克隆抗体技术
Kohler和Milstein创建的淋巴细胞杂交瘤细胞来源于小鼠的B 细胞杂交瘤, 但人体免疫系统可以识别鼠源性单抗, 因此其应用受到了很大的限制。随着分子生物学技术的发展， 到20 世纪80 年代末逐步建立了抗体库技术。该技术是抗体工程领域的重大进展，它的出现主要是基于PCR 技术的建立和发展、抗体分子在大肠杆菌中的功能性表达及噬菌体展示技术的发展。1985 年，Smith第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1 的基因Ⅲ， 使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。20 世纪90 年代初，人们认识到了噬菌体展示技术在筛选上的巨大潜力，并把它应用于基因工程抗体的制备中，建立了噬菌体抗体库技术，即用已知抗原从较大的抗体库中筛选出目的抗体。该技术在人源性抗体的生产、抗体性能改造和抗体基因研究等方面具有较大的实用价值。与传统的杂交瘤技术相比， 噬菌体抗体库技术具有明显的优越性，即操作简单、稳定有效、筛选容量大、生产成本低等。现有一些利用该技术生产的抗体已进入临床Ⅱ／Ⅲ 期研究， 如Cambridge Antibody Technology （CAT） 的D2E7 和CAT2152， 分别用于治疗风湿性关节炎和青光眼。全人抗体是治疗性抗体的发展趋势。1989 年，Brüggemann利用转基因技术研制出第一个全人源单抗Adalimumab， 因能够识别结合并阻断肿瘤坏死因子（TNF）而被用于治疗类风湿性关节炎，2003 年在美国上市。Vectibix 是第二个全人序列单抗药物，靶标为上皮生长因子受体（EGFR），该药于2006 年9 月获FDA批准在美国上市，是直、结肠癌的三线治疗药物[15]。
目前抗体库技术还受2方面的因素影响：①从未经免疫动物的抗体库获得的抗体亲和力不高；②受外源基因转化率的限制， 抗体库的库容不足以涵盖某种动物的抗体多样性。大容量抗体库是获得高亲和力抗体和针对稀有抗原抗体的关键。核糖体展示技术避开了上述不足，可制备大容量抗体库。该技术依赖于mRNA、核糖体和抗体蛋白（或多肽）通过非共价结合形成三联复合体，在无细胞体系中完成转录和翻译，实现了基因型和表型的偶联， 翻译出来的抗体可用抗原进行筛选， 由于不经过体内转化， 构建的抗体库库容可达到甚至超过1011。利用核糖体展示技术可以获得特异的、高亲和力的抗体。2004 年，我国建成世界上第一个针对SARS 的基因工程抗体库。
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