博学慎思，明辨笃行
发酵工程课后思考题
第一章绪论
1、发酵及发酵工程定义？
答：它是应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。由于它以培养微生物为主，所以又称为微生物工程。 2、发酵工程基本组成部分？
答：从广义上讲分为三部分：上游工程、发酵工程、下游工程 3、发酵工业产业化应抓好哪三个环节？
答：发酵工程产业化就是将有关应用微生物的科学研究成果转化为发酵产品，并投向市场的过程。 三个环节：投产试验、规模化生产和市场营销。
①投产试验：涉及到”上、中、下三游”工作，即研究成果的验证、小试、中试和扩大试验。 ②规模化生产：值得注意的是产品质量问题，其检测必须符合相应产品标准。
③市场营销：市场开拓对技术本身影响不大，但参与市场竞争却是产业化成败的决定因素。 4、当前发酵工业面临三大问题是什么？ 答：菌种问题
纯种，遗传稳定性，安全，周期短、转化率高产率高抗污染能力强：噬菌体、蛭弧菌； 合适的反应器
生产规模化原料利用量大，并且具有一定选择性，节能，结构多样化、操作制动化，节劳力。 基质的选择
价廉原料利用量大，并且具有一定选择性易被利用、副产物少，满足工艺要求。 5、我国发酵工业应该走什么样的产业化道路？发酵过程的组成部分？
答第一步为技术积累阶段、第二步为产业崛起阶段、第三步为持续发展阶段 典型的发酵过程可划分成六个基本组成部分： （1）繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定； （2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；
（3）培养出有活性、适量的纯种，接种入生产容器中；
（4）微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐中生长； （5）产物分离和精制；
（6）过程中排出的废弃物的处理。
第二章菌种的来源(1)
1、自然界分离微生物的一般操作步骤？
答：标本采集，预处理，富集培养，菌种分离（初筛，复筛），发酵性能鉴定，菌种保藏 2、从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集？ 答：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 3、什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？
答：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。
意义：自然选育是一种简单易行的方法，可达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产、提高产量的目的。虽然其突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。 4、诱变育种对出发菌株有哪些要求？
答：出发菌株指用于诱变育种的最初菌株或每代诱变的试验菌株。 选择出发菌株的要求：
对菌株产量，形态、生理等情况了解；
生长繁殖快，营养要求低，产孢子多且早； 对诱变剂敏感；
菌株要有一定的生产能力；
5
6781答：接种量指移入种子液的体积和接种后培养液体积之比。种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 2、影响种子质量的因素是哪些？
答：原材料质量、种龄、培养条件和斜面冷藏时间。 3、保证种子质量有哪些措施？
答：种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力，所以必须保证：①菌种的稳定性；②提供种子培养的适宜环境；③无杂菌侵入。 4、工业上接种方法有哪些？
双种法：两个种子罐接种到一个发酵罐中
倒种法：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐中发酵液
第三章发酵培养基
1、什么是培养基? 发酵培养基的特点和要求?
答：培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。 特点与要求：
①培养基能够满足产物最经济的合成； ②发酵后所形成的副产物尽可能的少；
③培养基的原料应因地制宜，价格低廉，且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应；
④所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。 2、常用碳源有哪些，常用糖类有哪些？
答：常用碳源：糖类、油脂、有机酸、正烷烃 常用糖类：
①葡萄糖（速效碳源）
几乎所有的微生物都能利用葡萄糖，抗生素、氨基酸、有机酸、多糖、甾体转化，但是过多会引起葡萄糖效应 ②糖蜜
糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物，是发酵培养基价廉物美的碳源。 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。 ③淀粉、糊精
使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类，经水解成单糖后再被吸收利用 3、什么是生理酸性物质，什么是生理碱性物质？
答：无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵；若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH 有积极作用。 4、常用无机氮源和有机氮源有哪些？有机氮源在发酵培养基中的作用？
答：常用无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水；常用有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。 有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外，有的还是某些产物的前体 5、什么是前体？前体添加方式？
答：前体指某些化合物加入到发酵培养基中后，能直接使微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。
用法：前体使用时普遍采用流加的方法。前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利。流加也有利于提高前体的转化率前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化。苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%
6、什么是生长因子？生长因子的来源？
答：从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B 簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子
7、举例说明培养基设计的方法与步骤。
答：①根据前人的经验和培养基成分，初步确定可能的培养基成分； ②通过单因素实验最终确定出最为适宜的培养基成分；
③当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。
第四章培养基灭菌与空气净化
1、灭菌的方法有哪些？如何根据灭菌对象和要求的不同选用不同的方法？
1) 干热灭菌法在烘箱内热空气灭菌，将物品放入烘箱内，然后升温至160℃-170℃，维持1-2小时。适用
对象：金属器械、玻璃器皿、陶瓷等，不适用于液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。 2) 火焰灭菌，即焚烧法（incineration ）是利用火焰直接杀死微生物的灭菌法。
简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。
适用于无经济价值的物品灭菌，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、玻璃棒、试管或三角瓶口的灭菌等。
3) 电磁波、射线灭菌法即辐射灭菌法（Radiation Sterilization ）是利用电磁波、紫外线、X 射线、γ射线
或放射性物质产生的高能粒子杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。
4) 湿热灭菌①高压蒸汽灭菌法方法：121℃（1kg/cm2或15磅/英寸2）维持15-20min 。 112℃（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min 。 115℃（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min 。 应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度
例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用121 ℃。 含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用112 ℃。
适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。
②煮沸灭菌法将待消毒物品如注射器、金属用具、解剖用具等在水中煮沸15min 或更长时间，以杀死细菌或其他微生物的营养体和少部分的芽孢或孢子。
③间歇灭菌法对于某些培养基，由于高压蒸汽灭菌会破坏某些营养成分，可用间隙灭菌法灭菌，即流通蒸汽(或蒸煮) 反复灭菌几次，
④巴氏灭菌法低温维持法：只要在63℃下维持30min 高温瞬时法：只要在72℃下维持15s 超高温法：只要在135-150℃下维持2-6s
5) 化学药剂灭菌法某些化学药剂与微生物发生反应而杀死微生物的灭菌法。
常用的化学药剂有高锰酸钾、漂白粉、酒精、新洁尔灭、甲醛、过氧乙酸、戊二醛、酚类等。 多用于表面消毒或生产车间等环境的消毒。
6) 过滤除菌将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。
不耐热的液体培养基、血清、维生素、氨基酸及气体等物的灭菌多用此法除菌。过滤除菌的缺点是无法去除其中的病毒和噬菌体。
2、比较分批灭菌与连续灭菌的优缺点。 连续灭菌法优点:
①因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，比“实罐灭菌”提高产量5～10％；
②由于总的灭菌时间较分批灭菌明显减少，故缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率； ③由于蒸汽负荷均匀，提高了锅炉的利用率； ④适宜于自动化操作；
⑤降低了操作人员的劳动强度。 连续灭菌法缺点:
需要专门的灭菌设备。
操作要求较高，蒸汽压力和进料速度要求稳定。否则会容易导致灭菌不彻底。 不适合于含固体颗粒或较容易起泡的培养基灭菌。 空罐及管道的灭菌必须彻底，否则会引起二次污染 分批灭菌
优点：不需要专门的灭菌设备，投资少，设备简单，灭菌效果可靠，对蒸汽要求较低。
缺点：灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。营养成分的破坏比连续灭菌法大
3、影响培养基灭菌的主要因素有哪些？ （1）培养基成分
油脂、糖类、蛋白质都是传热的不良介质，会增加微生物的耐热性，使灭菌困难。 浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌。 高浓度的盐类，色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。 （2）pH 值的影响
pH 值对微生物的耐热性影响很大，pH 为6.0－8.0时微生物最不易死亡，pH
培养基pH 值越低，灭菌所需的时间越短。 （3）培养基中的颗粒物质
培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌容易。
一般说来，含有小于1mm 的颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。 （4）泡沫
泡沫对灭菌极为不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物。 可加入少量消泡剂。
4、分析过滤除菌机理与影响过滤除菌的因素，考虑如何提高过滤除菌的效率。
答：过滤除菌机理：微粒随气流通过滤层时，由于滤层纤维的层层阻碍，使气流出现无数次改变运动速度和方向的绕流运动，引起微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、布朗扩散、重力沉降、静电引力等作用把微粒滞留在纤维表面上，实现过滤的目的。 影响过滤除菌的因素：
提高过滤除菌效率的主要措施：
1) 设计合理的空气预处理设备，选择合适的空气净化流程，以达到除油、水和杂质的目的。 2) 设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。
3) 保证进口空气清洁度，如加强生产场地卫生管理，正确选择进风口，加强空气压缩前的预处理。
4) 降低进入空气过滤器的空气相对湿度，如使用无油润滑的空气压缩机，加强空气冷却和去油，提高进
入过滤器的空气温度。
微生物热死定律 t = 1/k lnN0/Nt =2.303/klogN0/Nt N 0——开始灭菌时原菌数（个） N t ——经时间t 后残留菌数（个） k ——反应速度常数（min -1） t ——灭菌时间（min ）
第5章发酵过程控制(一)
1、根据微生物对温度的依赖可分为哪几类微生物？
答：不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：
嗜冷菌：0～26℃生长，嗜温菌：15～43℃生长，嗜热菌：37～65℃生长，嗜高温菌：>65℃生长。 2、发酵过程温度会不会变化？为什么？
答：会变化。发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量、机械搅拌产生热量、通气热，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快；发酵热小，温度上升慢。 3、发酵热的定义？
所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。在发酵过程中产生菌分解基质产生热量、机械搅拌产生热量、通气热，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。发酵热与生物热、搅拌热、通气热、蒸发热和辐射热有关。Q 发酵＝Q 生物＋Q 搅拌＋ Q 通气－Q 蒸发－Q 辐射
4、生物热的大小与哪些因素有关？ 答：生物热与发酵类型有关；
生物热的大小与呼吸作用强弱有关。 5、温度对发酵有哪些影响？ 答：（1）、温度影响反应速率（产物形成）
一般，发酵温度升高，酶反应速率增大，生长代谢加快，生产期提前。
但温度过高酶又很容易失去活性，表现在菌体容易衰老，发酵周期缩短，影响最终产量
（2）、温度会改变发酵液的理化性质P94 影响基质溶解度 氧的溶解度
影响菌体对某些基质的分解吸收 间接影响产物的合成。 （3）、温度影响生物合成的方向 6、发酵过程温度选择有哪些依据？
答：根据菌种不同选择：微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求范围也不同。
根据发酵阶段选择：即二阶段发酵
根据培养条件选择：根据培养条件综合考虑，灵活选择。
根据菌体生长情况：菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。
第五章发酵过程控制(二)
1、发酵过程PH 会不会变化？为什么？ 发酵过程中pH 是不断变化的
1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH 下降。糖缺乏，pH 上升，是补料的标志之一
2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH 会下降；尿素被分解成NH3，pH 上升，NH3利用后pH 下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH 上升。 3）生理酸碱性物质利用后pH 会上升或下降
4）某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH 变化。如有机酸类产生使pH 下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH 上升。
5）菌体自溶 pH 上升，发酵后期，pH 上升 6）杂菌的污染，pH 下降
2、PH 对发酵的影响表现在哪些方面？
（1）影响菌体的生长 （2）pH 影响酶的活性
（3）pH 值影响微生物细胞膜所带电荷的改变
（4）pH 值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离 （5）pH 影响代谢方向 （6）影响产物稳定性
3、为了确定发酵的最佳PH, 我们应该如何实验？ 配制不同初始pH 的培养基，摇瓶考察发酵情况. 4、发酵过程ＰＨ控制可采取哪些措施？ （1）、调节好基础料的初始pH （2）、在基础料中加入维持pH 的物质
（3）、通过补料调节pH （4）、当补料与调pH 发生矛盾时，加酸碱调pH （5）、不同调pH 方法的影响 （6）、发酵的不同阶段采取不同的pH 值 5、发酵用的ＰＨ复合电极有哪些要求？
能高温灭菌，过高的温度将对玻璃膜材质和参比电极性质产生影响，造成不可逆转的破坏。
具有长时间的稳定性，应保证转换系数和不对称电位能适应发酵周期长、中途不能更换和不能标定的要求
要求一定的液络部流通，维持的液接界电位稳定，防止使用过程中液络部被含硫物、蛋白质和非水溶液污染，造成电极测量漂移
外加不锈钢护套或工程塑料护套后安装于罐内
第五章发酵过程控制（三）
1、比耗氧速度、呼吸强度、临界溶氧浓度、氧饱和度的概念？ 答：1）、比耗氧速率或呼吸强度（Q O2 ）：单位重量的细胞(干重) 在单位时间内所消耗的氧气，mmolO 2/(g菌•h) 2）、呼吸临界氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。如果对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。 3）、氧饱和度：发酵液中实际氧浓度/临界氧浓度。 2、影响微生物需氧的因素有哪些？
细胞浓度直接影响培养液的摄氧率，在分批发酵中摄氧率变化很大，不同生长阶段需氧不同，对数生长后期达最大值。培养基的成分和浓度显著影响微生物的摄氧率，碳源种类对细胞的需氧量有很大影响，一般葡萄糖的利用速度比其他的糖要快。 3、发酵液中的体积氧传递方程？
23
以单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为 a (m/m)
OTR=KL α (C* –CL ）
4、如何调节摇瓶发酵的供氧水平？ 往复，频率80-120分/次，振幅 8cm 旋转，偏心距转速250rpm 装液量，一般取1/10左右： 250ml 15-25 ml 500ml 30 ml 750ml 80 ml
5、如何调节通气搅拌发酵罐的供氧水平？
一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。
6、如何测定发酵液中的溶氧浓度，以及发酵罐的Kla?
第五章发酵过程控制（四）
1、泡沫对发酵有哪些有益之处，有哪些有害之处？
答：泡沫可以增加气体与液体的接触面积，导致氧传递速率增加，也有利于二氧化碳气体的溢出。但过多泡沫对发酵不利，导致降低生产能力，浪费原料，影响菌的呼吸，引起杂菌 2、泡沫形成原因是什么？
答：泡沫形成的原因有三个。一是气液接触，气液接触有两类情况，分别是气体从外部进入液体与气体从液体内部产生；二是含助泡物，在未加助泡物，但并不纯净的水中产生的泡沫，其寿命在0.5秒之内，只能瞬间存在。摇荡纯溶剂不起泡，如蒸馏水，只有摇荡某种溶液才会起泡；三是起泡速度高于破泡速度，起泡的难易，取决于液体的成分及所经受的条件；破泡的难易取决于气泡和泡破灭后形成的液滴在表面自由能上的差别；同时还取决于泡沫破裂速度快慢。 3、发酵过程中泡沫多少与哪些因素有关？
答：发酵过程中泡沫多少与下列因素有关 （1）通气、搅拌的剧烈程度 （2）培养基配比与原料组成 （3）菌种质量与接种量 （4）灭菌质量
（5）发酵过程中发酵液随菌的代谢活动不断变化，也是泡沫消长的重要因素 4、发酵中控制泡沫途径有哪些？
答：① 调整培养基的成分（如少加或缓加易起泡的原材料）、或改变某些物理化学参数（如pH 、温度、通气和搅拌）或者改变发酵工艺（如采用分次投料）来控制，以减少泡沫形成的机会。但效果有限。 ② 选育在生长期不产生泡沫的微生物突变株。如有人已用杂交育种方法选育出不产生泡沫的土霉素菌株。
③ 机械消泡
④ 化学消泡：加消泡剂，当今发酵工业中常用的方法。 5、常用消泡剂有哪几类，并简述其性能？
答：常用的消泡剂有以下几类
（1）天然油脂。天然油脂是最早用的消泡剂，它来源容易，价格低，使用简单，一般来说没有明显副作用，如豆油、菜油、鱼油等，除了用作消泡外，还可作为碳源和中间补料用。油脂主要成分是高级脂肪酸酯和高级一元醇酯，还有高级醇、高级烃等。但油脂如保藏不好，易变质，使酸值增高，对发酵有毒性。此外，有些油是发酵产物的前体，如豆油是红霉素的前体，鱼油是螺旋霉素的前体。近年来出于对环境保护的重视，天然产物消泡剂的地位又有些提高，而且还在研究新的天然消泡剂。 （2）聚醚类消泡剂。聚醚类消泡剂种类很多，常用的主要是：聚氧丙烯甘油（GP 型消泡剂），用于链霉素发酵，代替天然油，加入基础料，效果很好；聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE 型消泡剂）。它们以一定比例配制的消泡剂叫泡敌，用量为0.03%～0.035%，用于四环素发酵效果很好，相当于豆油的10~20倍。 （3）高碳醇。高碳醇是强疏水弱亲水的线型分子，在水体系里是有效的消泡剂。C7~C9的醇是最有效的消泡剂。
（4）硅酮类。最常用的是聚二甲基硅氧烷，也称二甲基硅油。它表面能低，表面张力也较低，在水及一般油中的溶解度低且活性高。纯粹的聚二甲基硅氧烷，不经分散处理难以作为消泡剂。可能是由于它与水有高的界面张力，铺展系数低，不易分散在发泡介质上。因此将硅油混入分散剂SiO2气溶胶中，构成复合物，经一定温度、一定时间处理，就可制得。 6、对于粘稠发酵液应选怎样的消泡剂，对于较稀的呢？
GP 型消泡剂亲水性差，在发泡介质中的溶解度小，所以宜使用在稀薄的发酵液中。它的抑泡能力比消
泡能力优越，适宜在基础培养基中加入，以抑制整个发酵过程的泡沫产生。
GPE 型消泡剂亲水性较好，在发泡介质中易铺展，消泡能力强，但溶解度也较大，消泡活性维持时间
短，因此用在粘稠发酵液中效果较好。
第五章发酵过程控制（五）
1、中间补料的意义和原则是什么？补料方式有哪些？
意义：控制菌的生长速率以及培养中期的代谢活动，延长合成期推迟菌体自溶。另外加入前体增加合成产物的中间体，从而使产量大幅度提高。 原则：控制和引导产生菌在培养过程中，特别是中后期的生化代谢活动向着有利于产物积累的方向发展。 补料方式：
2、查阅文献，说明补糖时间和补糖量的控制。
补糖量的控制，以控制菌体浓度不增或略增为原则，使产生菌的代谢活动有利于产物合成。
一般在补糖开始阶段控制还原糖在较高水平，以利于产物合成，但高浓度的还原糖不宜维持过久，否则会导致菌体大量繁殖影响产物的合成。一般还原糖水平维持在0.8～1.5%之间较为合适。 例：不同补糖速率对L-缬氨酸发酵的影响
初糖浓度为80g/L，发酵30h 后，分别以10g/L·h 、25g/L·h 、40g/L·h 的补糖速度进行，结果如下：谷氨
补糖时间控制很重要，过早会刺激菌体生长，加速糖的消耗，不利于合成产物；过迟所需能量供应不上菌体已老化，合成产物的能力本身都很低了。 例：四环素
补糖时间 96h 效价
20h 6000u/ml 45h 10000u/ml 62h 6000u/ml
说明：开始补糖的时间必须根据代谢的变化情况来决定，即根据基础培养基的碳源种类及用量、菌丝生长情况、糖的消耗速率及残留水平来综合考虑，不能单纯以时间为依据。 3、前体对发酵有哪些影响？通过例子说明前体该如何使用。
添加前体:显著增加产量、控制发酵方向。 苯乙酸对青霉素产量和类型的影响
苯乙酸浓度过高时对青霉素有毒性。但在pH 低时比pH 高时对青霉素毒性大，因此发酵早期pH 低时加入会影响青霉素产量。
含高浓度苯乙酸(0.5%)的培养液pH 酸性时毒性很大，但在低浓度(0.3%)培养液pH 酸性时并不显毒性作用。
由于高浓度有毒性，苯乙酸应多次少量加入或采取流加方式。另外，前体添加时间也需要考虑，要通过实验来确定。
4、查阅文献，了解补料方式对发酵的影响。
补料方式可分为：连续流加
不连续流加 (少量多次、大量少次) 多周期流加
连续流加效果最好，可以避免因一次大量加入引起环境突然改变给菌体代谢带来的影响。每次流加又可分为：快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加。 从补加营养物成分来看，又有单组分补料和多组分补料。
第六章发酵染菌及防治
1、如何检查判断是否染菌？
溶解氧水平异常显示染菌（谷氨酸） 排气中CO 2异常显示染菌
CO 2的含量变化是有规律的；
☐ 染菌引起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，糖耗加快， CO 2含量增加； ☐ 染噬菌体，糖耗减慢， CO 2含量减少。 2、发酵染菌应从哪几个方面进行分析？
（1）根据污染杂菌种类分析 （2）根据染菌规模分析 （3）根据染菌时间分析
3、在工业生产中杂菌污染的途经及应采取哪些措施防止污染杂菌？
（1）种子带菌及预防
（2）培养基灭菌不彻底导致染菌及预防 （3）空气带菌及预防
（4）设备的渗漏或“死角”造成的染菌及预防 （5）操作不当造成染菌及预防 （6）噬菌体污染及预防
4、工业生产中发现染菌应采取哪些措施？
（1）、种子培养期染菌的处理
①一旦发现种子受到杂菌污染，该种子不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。
②采用备用种子，接入发酵罐继续进行发酵生产。
③如无备用种子，则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为种子，进行“倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，从而保证发酵生产正常进行。 （2）、发酵前期染菌的处理
①如果培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基重新进行灭菌后，再接入种子进行发酵。
②如果此时染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵。
③也可采取降温培养、调节pH 值、调整补料量、补加培养基等措施进行处理。 （3）、发酵中、后期染菌的处理
①可以加入适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度；也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等其它措施，进行处理。
②如果发酵过程的产物代谢已达到一定水平，此时产品的含量达一定值，只要明确是染菌也可放罐。 ③对于没有提取价值的发酵液，废弃前应加热至120℃以上、保持30min 后才能排放。 （4）、染菌后对设备的处理
染菌后的发酵罐在重新使用前，必须进行彻底清洗并灭菌后才能使用；也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h 以上等方法进行处理。
种子罐，灭菌前放水加温至100℃，加水量至少占罐体2/3，煮罐。 不用罐加热水浸泡。
检查：A 、罐体及附属设备是否渗漏； B 、管道是否通畅； C 、罐体有无污垢堆积； D 、设备仪表管道安装是否合理； E 、仪表是否失灵； F 、过滤器是否失效。 （5）污染噬菌体处理
☐ 发酵液经灭菌后再放罐，严格控制培养液流失。 ☐ 清理生产环境，清除噬菌体载体——发酵液残渣。 ☐ 生产环境用漂白粉、新洁尔灭等消毒。
☐ 调换生产菌种。培养基中加草酸。噬菌体具有专一性。 ☐ 暂时停产1~4周，车间用甲醛消毒。 ☐ 选育抗噬菌体的新菌株。 （6）、其它处理
● 染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道
灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌。
● 染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用 甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲
醛蒸汽消毒。
发酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以总结防治发酵染菌的经验教训，避免以后有类似情况发生，
并积极采取必要措施处理。
第七章有机酸的生产工艺
1、柠檬酸的产生菌有哪些？
大规模生产中多采用黑曲霉和温氏曲霉。
石油副产品为原料，主要以假丝酵母属为生产菌种，其次为毕赤酵母、球拟酵母、汉逊酵母和红酵母属等。
2、柠檬酸合成途径有哪些？
(1) 由葡萄糖合成柠檬酸的途径：EMP 、HMP 、TCA 。
(2) 由乙酸合成柠檬酸途径：TCA 及乙醛酸循环。
(3) 以正烷烃为碳源时的合成途径：正烷烃→脂肪酸→乙酸→柠檬酸。
3、柠檬酸发酵工艺有哪几种？
（1）表面发酵：利用生长在液体培养基表面的微生物之代谢作用，将原料转化为柠檬酸的发酵方式。
（2）固体发酵：将发酵原料及菌体吸附在疏松的固体支持物上，经过微生物的代谢活动，将原料中可发酵成分转化为柠檬酸的发酵方式
1）薄层发酵
2）厚层通风发酵
（3）深层发酵：菌体在液体培养基中，在通气条件下通过代谢转
化可发酵原料形成柠檬酸的发酵方式。
4、柠檬酸分离提取的方法有哪些？
钙盐法；直接提取法；溶媒萃取法；离子交换法；渗析法。
第八章氨基酸生产工艺
1、试述谷氨酸生产中应注意哪些环节？
控制发酵的条件
控制细胞渗透性
降低反馈作用物的浓度
消除终产物的反馈抑制与阻遏作用
促进A TP 的积累，以利氨基酸的生物合成
2、影响谷氨酸结晶的因素有哪些？
控制加酸的速度，不能太快，避免形成大量晶核；
晶粒形成温度30~25℃，不能高于30 ℃，温度不能回升，控制酸的流加速度来防止回升。
添加α型晶种：0.2%~0.3%。谷氨酸含量5%以上，pH4.5~4.0时投种；谷氨酸含量4%~5%时pH4.0时投种。 搅拌转速适当30~35r/min，浆式二档交叉搅拌为宜。
发酵液产酸高，结晶好；
天门冬氨酸、苯甲氨酸、酪氨酸、脯氨酸等促进α型生成；
Ca2+、Mg2+影响结晶（>0.34g/100ml）
3、在氨基酸发酵中人工控制代谢有哪些主要的手段？
培养基
(1)、碳源：一般以淀粉水解糖、糖蜜为碳源。
碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。
（2）、氮源：铵盐、氨水；尿素、玉米浆、豆饼、棉子饼、麸皮水解液等。
●同时调整pH 值。
●尿素须和培养基分开单独灭菌，可分批流加。
●氨水用pH 自动控制连续流加。
（3）、合适C/N
氨基酸发酵，氮源的需要量比一般发酵要多（氨基酸合成需要、用来调节pH 值）。Glu 发酵：C/N为100：15～21。
（4）、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时糖代谢受抑制。
（5）、微量元素：镁、钾、钠、锰、铁等
注意：铜离子对氨基酸发酵有明显毒害作用。
（6）、生长因子：生物素
●作用：影响细胞膜透性和代谢途径。
●浓度：过多促进菌体生长，但氨基酸产量低。过少菌体生长缓慢甚至不长，发酵周期长。
●种类：玉米浆、麸皮水解液、糖蜜为来源
PH pH 对氨基酸发酵影响：影响酶的活性和菌的代谢方向。
控制pH 方法：流加尿素或氨水。
流加方式：根据菌体生长、pH 变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定。
温度◆菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度不同。
◆菌体生长阶段温度过高，则菌体易衰老，生产上常出现前劲大后劲小，后期产酸缓慢、产酸低等；若温度过低，则菌体繁殖缓慢，周期长等现象。
◆在发酵中、后期，菌体生长已基本停止，需要维持最适的产酸温度。
氧●要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生物合成与TCA 循环
有关。
谷氨酸族Aa ：谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸等。
●适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸发
酵：菌体呼吸受阻时产量最大。
●供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵。
天冬氨酸族Aa ：天冬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸等。
4、氨基酸高产菌选育中常用的哪些方案？
博学慎思，明辨笃行
发酵工程课后思考题
第一章绪论
1、发酵及发酵工程定义？
答：它是应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。由于它以培养微生物为主，所以又称为微生物工程。 2、发酵工程基本组成部分？
答：从广义上讲分为三部分：上游工程、发酵工程、下游工程 3、发酵工业产业化应抓好哪三个环节？
答：发酵工程产业化就是将有关应用微生物的科学研究成果转化为发酵产品，并投向市场的过程。 三个环节：投产试验、规模化生产和市场营销。
①投产试验：涉及到”上、中、下三游”工作，即研究成果的验证、小试、中试和扩大试验。 ②规模化生产：值得注意的是产品质量问题，其检测必须符合相应产品标准。
③市场营销：市场开拓对技术本身影响不大，但参与市场竞争却是产业化成败的决定因素。 4、当前发酵工业面临三大问题是什么？ 答：菌种问题
纯种，遗传稳定性，安全，周期短、转化率高产率高抗污染能力强：噬菌体、蛭弧菌； 合适的反应器
生产规模化原料利用量大，并且具有一定选择性，节能，结构多样化、操作制动化，节劳力。 基质的选择
价廉原料利用量大，并且具有一定选择性易被利用、副产物少，满足工艺要求。 5、我国发酵工业应该走什么样的产业化道路？发酵过程的组成部分？
答第一步为技术积累阶段、第二步为产业崛起阶段、第三步为持续发展阶段 典型的发酵过程可划分成六个基本组成部分： （1）繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定； （2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；
（3）培养出有活性、适量的纯种，接种入生产容器中；
（4）微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐中生长； （5）产物分离和精制；
（6）过程中排出的废弃物的处理。
第二章菌种的来源(1)
1、自然界分离微生物的一般操作步骤？
答：标本采集，预处理，富集培养，菌种分离（初筛，复筛），发酵性能鉴定，菌种保藏 2、从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集？ 答：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 3、什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？
答：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。
意义：自然选育是一种简单易行的方法，可达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产、提高产量的目的。虽然其突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。 4、诱变育种对出发菌株有哪些要求？
答：出发菌株指用于诱变育种的最初菌株或每代诱变的试验菌株。 选择出发菌株的要求：
对菌株产量，形态、生理等情况了解；
生长繁殖快，营养要求低，产孢子多且早； 对诱变剂敏感；
菌株要有一定的生产能力；
5
6781答：接种量指移入种子液的体积和接种后培养液体积之比。种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 2、影响种子质量的因素是哪些？
答：原材料质量、种龄、培养条件和斜面冷藏时间。 3、保证种子质量有哪些措施？
答：种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力，所以必须保证：①菌种的稳定性；②提供种子培养的适宜环境；③无杂菌侵入。 4、工业上接种方法有哪些？
双种法：两个种子罐接种到一个发酵罐中
倒种法：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐中发酵液
第三章发酵培养基
1、什么是培养基? 发酵培养基的特点和要求?
答：培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。 特点与要求：
①培养基能够满足产物最经济的合成； ②发酵后所形成的副产物尽可能的少；
③培养基的原料应因地制宜，价格低廉，且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应；
④所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。 2、常用碳源有哪些，常用糖类有哪些？
答：常用碳源：糖类、油脂、有机酸、正烷烃 常用糖类：
①葡萄糖（速效碳源）
几乎所有的微生物都能利用葡萄糖，抗生素、氨基酸、有机酸、多糖、甾体转化，但是过多会引起葡萄糖效应 ②糖蜜
糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物，是发酵培养基价廉物美的碳源。 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。 ③淀粉、糊精
使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类，经水解成单糖后再被吸收利用 3、什么是生理酸性物质，什么是生理碱性物质？
答：无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵；若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH 有积极作用。 4、常用无机氮源和有机氮源有哪些？有机氮源在发酵培养基中的作用？
答：常用无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水；常用有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。 有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外，有的还是某些产物的前体 5、什么是前体？前体添加方式？
答：前体指某些化合物加入到发酵培养基中后，能直接使微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。
用法：前体使用时普遍采用流加的方法。前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利。流加也有利于提高前体的转化率前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化。苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%
6、什么是生长因子？生长因子的来源？
答：从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B 簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子
7、举例说明培养基设计的方法与步骤。
答：①根据前人的经验和培养基成分，初步确定可能的培养基成分； ②通过单因素实验最终确定出最为适宜的培养基成分；
③当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。
第四章培养基灭菌与空气净化
1、灭菌的方法有哪些？如何根据灭菌对象和要求的不同选用不同的方法？
1) 干热灭菌法在烘箱内热空气灭菌，将物品放入烘箱内，然后升温至160℃-170℃，维持1-2小时。适用
对象：金属器械、玻璃器皿、陶瓷等，不适用于液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。 2) 火焰灭菌，即焚烧法（incineration ）是利用火焰直接杀死微生物的灭菌法。
简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。
适用于无经济价值的物品灭菌，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、玻璃棒、试管或三角瓶口的灭菌等。
3) 电磁波、射线灭菌法即辐射灭菌法（Radiation Sterilization ）是利用电磁波、紫外线、X 射线、γ射线
或放射性物质产生的高能粒子杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。
4) 湿热灭菌①高压蒸汽灭菌法方法：121℃（1kg/cm2或15磅/英寸2）维持15-20min 。 112℃（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min 。 115℃（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min 。 应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度
例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用121 ℃。 含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用112 ℃。
适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。
②煮沸灭菌法将待消毒物品如注射器、金属用具、解剖用具等在水中煮沸15min 或更长时间，以杀死细菌或其他微生物的营养体和少部分的芽孢或孢子。
③间歇灭菌法对于某些培养基，由于高压蒸汽灭菌会破坏某些营养成分，可用间隙灭菌法灭菌，即流通蒸汽(或蒸煮) 反复灭菌几次，
④巴氏灭菌法低温维持法：只要在63℃下维持30min 高温瞬时法：只要在72℃下维持15s 超高温法：只要在135-150℃下维持2-6s
5) 化学药剂灭菌法某些化学药剂与微生物发生反应而杀死微生物的灭菌法。
常用的化学药剂有高锰酸钾、漂白粉、酒精、新洁尔灭、甲醛、过氧乙酸、戊二醛、酚类等。 多用于表面消毒或生产车间等环境的消毒。
6) 过滤除菌将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。
不耐热的液体培养基、血清、维生素、氨基酸及气体等物的灭菌多用此法除菌。过滤除菌的缺点是无法去除其中的病毒和噬菌体。
2、比较分批灭菌与连续灭菌的优缺点。 连续灭菌法优点:
①因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，比“实罐灭菌”提高产量5～10％；
②由于总的灭菌时间较分批灭菌明显减少，故缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率； ③由于蒸汽负荷均匀，提高了锅炉的利用率； ④适宜于自动化操作；
⑤降低了操作人员的劳动强度。 连续灭菌法缺点:
需要专门的灭菌设备。
操作要求较高，蒸汽压力和进料速度要求稳定。否则会容易导致灭菌不彻底。 不适合于含固体颗粒或较容易起泡的培养基灭菌。 空罐及管道的灭菌必须彻底，否则会引起二次污染 分批灭菌
优点：不需要专门的灭菌设备，投资少，设备简单，灭菌效果可靠，对蒸汽要求较低。
缺点：灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。营养成分的破坏比连续灭菌法大
3、影响培养基灭菌的主要因素有哪些？ （1）培养基成分
油脂、糖类、蛋白质都是传热的不良介质，会增加微生物的耐热性，使灭菌困难。 浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌。 高浓度的盐类，色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。 （2）pH 值的影响
pH 值对微生物的耐热性影响很大，pH 为6.0－8.0时微生物最不易死亡，pH
培养基pH 值越低，灭菌所需的时间越短。 （3）培养基中的颗粒物质
培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌容易。
一般说来，含有小于1mm 的颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。 （4）泡沫
泡沫对灭菌极为不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物。 可加入少量消泡剂。
4、分析过滤除菌机理与影响过滤除菌的因素，考虑如何提高过滤除菌的效率。
答：过滤除菌机理：微粒随气流通过滤层时，由于滤层纤维的层层阻碍，使气流出现无数次改变运动速度和方向的绕流运动，引起微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、布朗扩散、重力沉降、静电引力等作用把微粒滞留在纤维表面上，实现过滤的目的。 影响过滤除菌的因素：
提高过滤除菌效率的主要措施：
1) 设计合理的空气预处理设备，选择合适的空气净化流程，以达到除油、水和杂质的目的。 2) 设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。
3) 保证进口空气清洁度，如加强生产场地卫生管理，正确选择进风口，加强空气压缩前的预处理。
4) 降低进入空气过滤器的空气相对湿度，如使用无油润滑的空气压缩机，加强空气冷却和去油，提高进
入过滤器的空气温度。
微生物热死定律 t = 1/k lnN0/Nt =2.303/klogN0/Nt N 0——开始灭菌时原菌数（个） N t ——经时间t 后残留菌数（个） k ——反应速度常数（min -1） t ——灭菌时间（min ）
第5章发酵过程控制(一)
1、根据微生物对温度的依赖可分为哪几类微生物？
答：不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：
嗜冷菌：0～26℃生长，嗜温菌：15～43℃生长，嗜热菌：37～65℃生长，嗜高温菌：>65℃生长。 2、发酵过程温度会不会变化？为什么？
答：会变化。发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量、机械搅拌产生热量、通气热，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快；发酵热小，温度上升慢。 3、发酵热的定义？
所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。在发酵过程中产生菌分解基质产生热量、机械搅拌产生热量、通气热，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。发酵热与生物热、搅拌热、通气热、蒸发热和辐射热有关。Q 发酵＝Q 生物＋Q 搅拌＋ Q 通气－Q 蒸发－Q 辐射
4、生物热的大小与哪些因素有关？ 答：生物热与发酵类型有关；
生物热的大小与呼吸作用强弱有关。 5、温度对发酵有哪些影响？ 答：（1）、温度影响反应速率（产物形成）
一般，发酵温度升高，酶反应速率增大，生长代谢加快，生产期提前。
但温度过高酶又很容易失去活性，表现在菌体容易衰老，发酵周期缩短，影响最终产量
（2）、温度会改变发酵液的理化性质P94 影响基质溶解度 氧的溶解度
影响菌体对某些基质的分解吸收 间接影响产物的合成。 （3）、温度影响生物合成的方向 6、发酵过程温度选择有哪些依据？
答：根据菌种不同选择：微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求范围也不同。
根据发酵阶段选择：即二阶段发酵
根据培养条件选择：根据培养条件综合考虑，灵活选择。
根据菌体生长情况：菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。
第五章发酵过程控制(二)
1、发酵过程PH 会不会变化？为什么？ 发酵过程中pH 是不断变化的
1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH 下降。糖缺乏，pH 上升，是补料的标志之一
2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH 会下降；尿素被分解成NH3，pH 上升，NH3利用后pH 下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH 上升。 3）生理酸碱性物质利用后pH 会上升或下降
4）某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH 变化。如有机酸类产生使pH 下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH 上升。
5）菌体自溶 pH 上升，发酵后期，pH 上升 6）杂菌的污染，pH 下降
2、PH 对发酵的影响表现在哪些方面？
（1）影响菌体的生长 （2）pH 影响酶的活性
（3）pH 值影响微生物细胞膜所带电荷的改变
（4）pH 值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离 （5）pH 影响代谢方向 （6）影响产物稳定性
3、为了确定发酵的最佳PH, 我们应该如何实验？ 配制不同初始pH 的培养基，摇瓶考察发酵情况. 4、发酵过程ＰＨ控制可采取哪些措施？ （1）、调节好基础料的初始pH （2）、在基础料中加入维持pH 的物质
（3）、通过补料调节pH （4）、当补料与调pH 发生矛盾时，加酸碱调pH （5）、不同调pH 方法的影响 （6）、发酵的不同阶段采取不同的pH 值 5、发酵用的ＰＨ复合电极有哪些要求？
能高温灭菌，过高的温度将对玻璃膜材质和参比电极性质产生影响，造成不可逆转的破坏。
具有长时间的稳定性，应保证转换系数和不对称电位能适应发酵周期长、中途不能更换和不能标定的要求
要求一定的液络部流通，维持的液接界电位稳定，防止使用过程中液络部被含硫物、蛋白质和非水溶液污染，造成电极测量漂移
外加不锈钢护套或工程塑料护套后安装于罐内
第五章发酵过程控制（三）
1、比耗氧速度、呼吸强度、临界溶氧浓度、氧饱和度的概念？ 答：1）、比耗氧速率或呼吸强度（Q O2 ）：单位重量的细胞(干重) 在单位时间内所消耗的氧气，mmolO 2/(g菌•h) 2）、呼吸临界氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。如果对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。 3）、氧饱和度：发酵液中实际氧浓度/临界氧浓度。 2、影响微生物需氧的因素有哪些？
细胞浓度直接影响培养液的摄氧率，在分批发酵中摄氧率变化很大，不同生长阶段需氧不同，对数生长后期达最大值。培养基的成分和浓度显著影响微生物的摄氧率，碳源种类对细胞的需氧量有很大影响，一般葡萄糖的利用速度比其他的糖要快。 3、发酵液中的体积氧传递方程？
23
以单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为 a (m/m)
OTR=KL α (C* –CL ）
4、如何调节摇瓶发酵的供氧水平？ 往复，频率80-120分/次，振幅 8cm 旋转，偏心距转速250rpm 装液量，一般取1/10左右： 250ml 15-25 ml 500ml 30 ml 750ml 80 ml
5、如何调节通气搅拌发酵罐的供氧水平？
一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。
6、如何测定发酵液中的溶氧浓度，以及发酵罐的Kla?
第五章发酵过程控制（四）
1、泡沫对发酵有哪些有益之处，有哪些有害之处？
答：泡沫可以增加气体与液体的接触面积，导致氧传递速率增加，也有利于二氧化碳气体的溢出。但过多泡沫对发酵不利，导致降低生产能力，浪费原料，影响菌的呼吸，引起杂菌 2、泡沫形成原因是什么？
答：泡沫形成的原因有三个。一是气液接触，气液接触有两类情况，分别是气体从外部进入液体与气体从液体内部产生；二是含助泡物，在未加助泡物，但并不纯净的水中产生的泡沫，其寿命在0.5秒之内，只能瞬间存在。摇荡纯溶剂不起泡，如蒸馏水，只有摇荡某种溶液才会起泡；三是起泡速度高于破泡速度，起泡的难易，取决于液体的成分及所经受的条件；破泡的难易取决于气泡和泡破灭后形成的液滴在表面自由能上的差别；同时还取决于泡沫破裂速度快慢。 3、发酵过程中泡沫多少与哪些因素有关？
答：发酵过程中泡沫多少与下列因素有关 （1）通气、搅拌的剧烈程度 （2）培养基配比与原料组成 （3）菌种质量与接种量 （4）灭菌质量
（5）发酵过程中发酵液随菌的代谢活动不断变化，也是泡沫消长的重要因素 4、发酵中控制泡沫途径有哪些？
答：① 调整培养基的成分（如少加或缓加易起泡的原材料）、或改变某些物理化学参数（如pH 、温度、通气和搅拌）或者改变发酵工艺（如采用分次投料）来控制，以减少泡沫形成的机会。但效果有限。 ② 选育在生长期不产生泡沫的微生物突变株。如有人已用杂交育种方法选育出不产生泡沫的土霉素菌株。
③ 机械消泡
④ 化学消泡：加消泡剂，当今发酵工业中常用的方法。 5、常用消泡剂有哪几类，并简述其性能？
答：常用的消泡剂有以下几类
（1）天然油脂。天然油脂是最早用的消泡剂，它来源容易，价格低，使用简单，一般来说没有明显副作用，如豆油、菜油、鱼油等，除了用作消泡外，还可作为碳源和中间补料用。油脂主要成分是高级脂肪酸酯和高级一元醇酯，还有高级醇、高级烃等。但油脂如保藏不好，易变质，使酸值增高，对发酵有毒性。此外，有些油是发酵产物的前体，如豆油是红霉素的前体，鱼油是螺旋霉素的前体。近年来出于对环境保护的重视，天然产物消泡剂的地位又有些提高，而且还在研究新的天然消泡剂。 （2）聚醚类消泡剂。聚醚类消泡剂种类很多，常用的主要是：聚氧丙烯甘油（GP 型消泡剂），用于链霉素发酵，代替天然油，加入基础料，效果很好；聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE 型消泡剂）。它们以一定比例配制的消泡剂叫泡敌，用量为0.03%～0.035%，用于四环素发酵效果很好，相当于豆油的10~20倍。 （3）高碳醇。高碳醇是强疏水弱亲水的线型分子，在水体系里是有效的消泡剂。C7~C9的醇是最有效的消泡剂。
（4）硅酮类。最常用的是聚二甲基硅氧烷，也称二甲基硅油。它表面能低，表面张力也较低，在水及一般油中的溶解度低且活性高。纯粹的聚二甲基硅氧烷，不经分散处理难以作为消泡剂。可能是由于它与水有高的界面张力，铺展系数低，不易分散在发泡介质上。因此将硅油混入分散剂SiO2气溶胶中，构成复合物，经一定温度、一定时间处理，就可制得。 6、对于粘稠发酵液应选怎样的消泡剂，对于较稀的呢？
GP 型消泡剂亲水性差，在发泡介质中的溶解度小，所以宜使用在稀薄的发酵液中。它的抑泡能力比消
泡能力优越，适宜在基础培养基中加入，以抑制整个发酵过程的泡沫产生。
GPE 型消泡剂亲水性较好，在发泡介质中易铺展，消泡能力强，但溶解度也较大，消泡活性维持时间
短，因此用在粘稠发酵液中效果较好。
第五章发酵过程控制（五）
1、中间补料的意义和原则是什么？补料方式有哪些？
意义：控制菌的生长速率以及培养中期的代谢活动，延长合成期推迟菌体自溶。另外加入前体增加合成产物的中间体，从而使产量大幅度提高。 原则：控制和引导产生菌在培养过程中，特别是中后期的生化代谢活动向着有利于产物积累的方向发展。 补料方式：
2、查阅文献，说明补糖时间和补糖量的控制。
补糖量的控制，以控制菌体浓度不增或略增为原则，使产生菌的代谢活动有利于产物合成。
一般在补糖开始阶段控制还原糖在较高水平，以利于产物合成，但高浓度的还原糖不宜维持过久，否则会导致菌体大量繁殖影响产物的合成。一般还原糖水平维持在0.8～1.5%之间较为合适。 例：不同补糖速率对L-缬氨酸发酵的影响
初糖浓度为80g/L，发酵30h 后，分别以10g/L·h 、25g/L·h 、40g/L·h 的补糖速度进行，结果如下：谷氨
补糖时间控制很重要，过早会刺激菌体生长，加速糖的消耗，不利于合成产物；过迟所需能量供应不上菌体已老化，合成产物的能力本身都很低了。 例：四环素
补糖时间 96h 效价
20h 6000u/ml 45h 10000u/ml 62h 6000u/ml
说明：开始补糖的时间必须根据代谢的变化情况来决定，即根据基础培养基的碳源种类及用量、菌丝生长情况、糖的消耗速率及残留水平来综合考虑，不能单纯以时间为依据。 3、前体对发酵有哪些影响？通过例子说明前体该如何使用。
添加前体:显著增加产量、控制发酵方向。 苯乙酸对青霉素产量和类型的影响
苯乙酸浓度过高时对青霉素有毒性。但在pH 低时比pH 高时对青霉素毒性大，因此发酵早期pH 低时加入会影响青霉素产量。
含高浓度苯乙酸(0.5%)的培养液pH 酸性时毒性很大，但在低浓度(0.3%)培养液pH 酸性时并不显毒性作用。
由于高浓度有毒性，苯乙酸应多次少量加入或采取流加方式。另外，前体添加时间也需要考虑，要通过实验来确定。
4、查阅文献，了解补料方式对发酵的影响。
补料方式可分为：连续流加
不连续流加 (少量多次、大量少次) 多周期流加
连续流加效果最好，可以避免因一次大量加入引起环境突然改变给菌体代谢带来的影响。每次流加又可分为：快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加。 从补加营养物成分来看，又有单组分补料和多组分补料。
第六章发酵染菌及防治
1、如何检查判断是否染菌？
溶解氧水平异常显示染菌（谷氨酸） 排气中CO 2异常显示染菌
CO 2的含量变化是有规律的；
☐ 染菌引起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，糖耗加快， CO 2含量增加； ☐ 染噬菌体，糖耗减慢， CO 2含量减少。 2、发酵染菌应从哪几个方面进行分析？
（1）根据污染杂菌种类分析 （2）根据染菌规模分析 （3）根据染菌时间分析
3、在工业生产中杂菌污染的途经及应采取哪些措施防止污染杂菌？
（1）种子带菌及预防
（2）培养基灭菌不彻底导致染菌及预防 （3）空气带菌及预防
（4）设备的渗漏或“死角”造成的染菌及预防 （5）操作不当造成染菌及预防 （6）噬菌体污染及预防
4、工业生产中发现染菌应采取哪些措施？
（1）、种子培养期染菌的处理
①一旦发现种子受到杂菌污染，该种子不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。
②采用备用种子，接入发酵罐继续进行发酵生产。
③如无备用种子，则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为种子，进行“倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，从而保证发酵生产正常进行。 （2）、发酵前期染菌的处理
①如果培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基重新进行灭菌后，再接入种子进行发酵。
②如果此时染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵。
③也可采取降温培养、调节pH 值、调整补料量、补加培养基等措施进行处理。 （3）、发酵中、后期染菌的处理
①可以加入适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度；也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等其它措施，进行处理。
②如果发酵过程的产物代谢已达到一定水平，此时产品的含量达一定值，只要明确是染菌也可放罐。 ③对于没有提取价值的发酵液，废弃前应加热至120℃以上、保持30min 后才能排放。 （4）、染菌后对设备的处理
染菌后的发酵罐在重新使用前，必须进行彻底清洗并灭菌后才能使用；也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h 以上等方法进行处理。
种子罐，灭菌前放水加温至100℃，加水量至少占罐体2/3，煮罐。 不用罐加热水浸泡。
检查：A 、罐体及附属设备是否渗漏； B 、管道是否通畅； C 、罐体有无污垢堆积； D 、设备仪表管道安装是否合理； E 、仪表是否失灵； F 、过滤器是否失效。 （5）污染噬菌体处理
☐ 发酵液经灭菌后再放罐，严格控制培养液流失。 ☐ 清理生产环境，清除噬菌体载体——发酵液残渣。 ☐ 生产环境用漂白粉、新洁尔灭等消毒。
☐ 调换生产菌种。培养基中加草酸。噬菌体具有专一性。 ☐ 暂时停产1~4周，车间用甲醛消毒。 ☐ 选育抗噬菌体的新菌株。 （6）、其它处理
● 染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道
灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌。
● 染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用 甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲
醛蒸汽消毒。
发酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以总结防治发酵染菌的经验教训，避免以后有类似情况发生，
并积极采取必要措施处理。
第七章有机酸的生产工艺
1、柠檬酸的产生菌有哪些？
大规模生产中多采用黑曲霉和温氏曲霉。
石油副产品为原料，主要以假丝酵母属为生产菌种，其次为毕赤酵母、球拟酵母、汉逊酵母和红酵母属等。
2、柠檬酸合成途径有哪些？
(1) 由葡萄糖合成柠檬酸的途径：EMP 、HMP 、TCA 。
(2) 由乙酸合成柠檬酸途径：TCA 及乙醛酸循环。
(3) 以正烷烃为碳源时的合成途径：正烷烃→脂肪酸→乙酸→柠檬酸。
3、柠檬酸发酵工艺有哪几种？
（1）表面发酵：利用生长在液体培养基表面的微生物之代谢作用，将原料转化为柠檬酸的发酵方式。
（2）固体发酵：将发酵原料及菌体吸附在疏松的固体支持物上，经过微生物的代谢活动，将原料中可发酵成分转化为柠檬酸的发酵方式
1）薄层发酵
2）厚层通风发酵
（3）深层发酵：菌体在液体培养基中，在通气条件下通过代谢转
化可发酵原料形成柠檬酸的发酵方式。
4、柠檬酸分离提取的方法有哪些？
钙盐法；直接提取法；溶媒萃取法；离子交换法；渗析法。
第八章氨基酸生产工艺
1、试述谷氨酸生产中应注意哪些环节？
控制发酵的条件
控制细胞渗透性
降低反馈作用物的浓度
消除终产物的反馈抑制与阻遏作用
促进A TP 的积累，以利氨基酸的生物合成
2、影响谷氨酸结晶的因素有哪些？
控制加酸的速度，不能太快，避免形成大量晶核；
晶粒形成温度30~25℃，不能高于30 ℃，温度不能回升，控制酸的流加速度来防止回升。
添加α型晶种：0.2%~0.3%。谷氨酸含量5%以上，pH4.5~4.0时投种；谷氨酸含量4%~5%时pH4.0时投种。 搅拌转速适当30~35r/min，浆式二档交叉搅拌为宜。
发酵液产酸高，结晶好；
天门冬氨酸、苯甲氨酸、酪氨酸、脯氨酸等促进α型生成；
Ca2+、Mg2+影响结晶（>0.34g/100ml）
3、在氨基酸发酵中人工控制代谢有哪些主要的手段？
培养基
(1)、碳源：一般以淀粉水解糖、糖蜜为碳源。
碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。
（2）、氮源：铵盐、氨水；尿素、玉米浆、豆饼、棉子饼、麸皮水解液等。
●同时调整pH 值。
●尿素须和培养基分开单独灭菌，可分批流加。
●氨水用pH 自动控制连续流加。
（3）、合适C/N
氨基酸发酵，氮源的需要量比一般发酵要多（氨基酸合成需要、用来调节pH 值）。Glu 发酵：C/N为100：15～21。
（4）、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时糖代谢受抑制。
（5）、微量元素：镁、钾、钠、锰、铁等
注意：铜离子对氨基酸发酵有明显毒害作用。
（6）、生长因子：生物素
●作用：影响细胞膜透性和代谢途径。
●浓度：过多促进菌体生长，但氨基酸产量低。过少菌体生长缓慢甚至不长，发酵周期长。
●种类：玉米浆、麸皮水解液、糖蜜为来源
PH pH 对氨基酸发酵影响：影响酶的活性和菌的代谢方向。
控制pH 方法：流加尿素或氨水。
流加方式：根据菌体生长、pH 变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定。
温度◆菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度不同。
◆菌体生长阶段温度过高，则菌体易衰老，生产上常出现前劲大后劲小，后期产酸缓慢、产酸低等；若温度过低，则菌体繁殖缓慢，周期长等现象。
◆在发酵中、后期，菌体生长已基本停止，需要维持最适的产酸温度。
氧●要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生物合成与TCA 循环
有关。
谷氨酸族Aa ：谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸等。
●适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸发
酵：菌体呼吸受阻时产量最大。
●供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵。
天冬氨酸族Aa ：天冬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸等。
4、氨基酸高产菌选育中常用的哪些方案？