11. 细胞爬片进行细胞免疫荧光检测
11.1将4.5×105个Hep3B细胞/孔传代于无菌6孔培养板中。
11.2培养24h后，用Lipofectamine TM 2000将37LRP siRNA转染Hep3B细胞（两个平行孔，Lipofectamine TM 2000转染具体操作见方法7），转染后的细胞置37℃、5％CO2培养箱培养，48h后收集细胞。同时各有两个平行孔的细胞进行阴性对照转染及不行转染。转染终浓度即siRNA终浓度为100nmol/L。
11.3培养48小时后收集细胞，用0.25%胰酶将贴壁培养细胞（约1×106个）从壁上消化下来并制成单细胞悬液 11.4将已消毒的20mm盖玻片置于6孔板中，按2×104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，置37℃、5％CO2培养箱培养，24小时后进行细胞免疫荧光检测。
11.5 PBS清洗标本 3次 各 1 min。
11.6 4%多聚甲醛固定 15 min。
11.7 空气干燥 5min。
11.8 PBS清洗标本 3次 各 2 min。
11.9 0.5%Triton X-100( PBS配 ) 孵育 1次 20 min。
11.10 PBS清洗标本 3次 各 2 min。
11.115％ BSA封闭30min。1ml/孔，室温，摇床摇。
11.12 一抗孵育（兔抗人37LR多克隆抗体，滴度1：50，用PBS稀释，置湿盒）4℃ 过夜或37℃ 60 min。阴性对照用PBS液代替一抗。 11.13 PBS清洗标本 3次 各 5 min。
11.14 FITC标记的羊抗兔IgG抗体(1:200)孵育（湿盒） 37℃ 30 min。 11.15 PBS清洗标本 3次 各 5 min。
11.16 DAPI 300nmol/L，室温摇5min。
11.17 PBS洗涤3×5min，最后一遍PBS勿倒出。
11.18将盖玻片反扣在载玻片上（载玻片预先加75％甘油20ul），荧光显微镜成像。
12.1将4.5×105个Hep3B细胞/孔传代于无菌6孔培养板中。
12.2培养24h后，用Lipofectamine TM 2000将37LRP siRNA转染Hep3B细胞（两个平行孔，Lipofectamine TM 2000转染具体操作见方法7），转染后的细胞置37℃、5％CO2培养箱培养，48h后收集细胞。同时各有两个平行孔的细胞进行阴性对照转染及不行转染。转染终浓度即siRNA终浓度为100nmol/L。
12.3培养48小时后收集细胞，用0.25%胰酶将贴壁培养细胞（约1×106个）从壁上消化下来并制成单细胞悬液。
12.4用无血清MEM培养基将Matrigel配制成10ug/250ul（1:300）的人工基底膜胶备用。
12.5 96孔板每孔中铺Matrigel 2ug/50ul，放于超净台中风干过夜。 12.6 96孔板每孔加入适量无血清MEM细胞培养液(或PBS或生理盐水)，放置60－90分钟，洗去多余的胶；
12.7取转染、阴性对照转染及不行转染的Hep3B细胞以4×103/孔接种在铺胶的96孔板中，设3个重复孔，放入37℃、5％CO2培养箱中分别培养20min、40min、60min。
12.8 在相应时间点取出96孔板，吸出培养液，用PBS洗3遍，洗去未粘附细胞。
12.9 每孔加入100 ul甲醇，固定15min。
12.10每孔加入100 ul姬姆萨染液，染色15min，蒸馏水洗去染液。 12.11 在200倍显微镜下计数粘附细胞数量（每孔在固定位置取8个视野）。
13.1 将4.5×105 个Hep3B细胞/孔传代于无菌6孔培养板中。
13.2培养24h后，用Lipofectamine TM 2000将37LRP siRNA转染Hep3B细胞（两个平行孔，Lipofectamine TM 2000转染具体操作见方法7），转染后的细胞置37℃、5％CO2培养箱培养，48h后收集细胞。同时各有两个平行孔的细胞进行阴性对照转染及不行转染。转染终浓度即siRNA终浓度为100nmol/L。 13.3 侵袭小室的制备 :将Matrigel原液置于冰上，于冰箱内4℃冰浴过夜使融化，用预冷的Tip头使其混匀。
用融化的Matrigel原液和预冷无血清MEM培养液配制Transwell chamber上室凝胶液(0.8μg/μl) (1:15)，以每孔100μl包被transwell上室，37℃放置2-4h使其成胶。
13.4 胰酶消化已转染和未转染的Hep3B细胞并收集计数，用无血清MEM稀释成1×106 /ml细胞悬液，每孔transwell上室加入100μl细胞悬液（1X105个细胞/well），下室加入600μl条件培养基（300μl含10％FBS已用于培养NIH3T3细胞的MEM上清和300μl含10％FBS的新鲜MEM），置于5％CO2培养箱培养36h～48h。
13.5 从双室培养板中取出transwell小室，吸弃液体，用2根棉签檫净基底膜胶，PBS漂洗后立即4％甲醛固定15 min，PBS漂洗2min，1×Giemsa染色30min，ddH2O漂洗数秒钟，200倍镜下观察，选取上中下左右5个视野计数并拍照。
14. 运动实验
步骤基本同上述侵袭实验，但省略侵袭小室的制备，细胞铺入Transwell小室后培养24h～36h后进行染色，固定前也要用棉签擦拭上室面，目的是去除未穿过的细胞。
11. 细胞爬片进行细胞免疫荧光检测
11.1将4.5×105个Hep3B细胞/孔传代于无菌6孔培养板中。
11.2培养24h后，用Lipofectamine TM 2000将37LRP siRNA转染Hep3B细胞（两个平行孔，Lipofectamine TM 2000转染具体操作见方法7），转染后的细胞置37℃、5％CO2培养箱培养，48h后收集细胞。同时各有两个平行孔的细胞进行阴性对照转染及不行转染。转染终浓度即siRNA终浓度为100nmol/L。
11.3培养48小时后收集细胞，用0.25%胰酶将贴壁培养细胞（约1×106个）从壁上消化下来并制成单细胞悬液 11.4将已消毒的20mm盖玻片置于6孔板中，按2×104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，置37℃、5％CO2培养箱培养，24小时后进行细胞免疫荧光检测。
11.5 PBS清洗标本 3次 各 1 min。
11.6 4%多聚甲醛固定 15 min。
11.7 空气干燥 5min。
11.8 PBS清洗标本 3次 各 2 min。
11.9 0.5%Triton X-100( PBS配 ) 孵育 1次 20 min。
11.10 PBS清洗标本 3次 各 2 min。
11.115％ BSA封闭30min。1ml/孔，室温，摇床摇。
11.12 一抗孵育（兔抗人37LR多克隆抗体，滴度1：50，用PBS稀释，置湿盒）4℃ 过夜或37℃ 60 min。阴性对照用PBS液代替一抗。 11.13 PBS清洗标本 3次 各 5 min。
11.14 FITC标记的羊抗兔IgG抗体(1:200)孵育（湿盒） 37℃ 30 min。 11.15 PBS清洗标本 3次 各 5 min。
11.16 DAPI 300nmol/L，室温摇5min。
11.17 PBS洗涤3×5min，最后一遍PBS勿倒出。
11.18将盖玻片反扣在载玻片上（载玻片预先加75％甘油20ul），荧光显微镜成像。
12.1将4.5×105个Hep3B细胞/孔传代于无菌6孔培养板中。
12.2培养24h后，用Lipofectamine TM 2000将37LRP siRNA转染Hep3B细胞（两个平行孔，Lipofectamine TM 2000转染具体操作见方法7），转染后的细胞置37℃、5％CO2培养箱培养，48h后收集细胞。同时各有两个平行孔的细胞进行阴性对照转染及不行转染。转染终浓度即siRNA终浓度为100nmol/L。
12.3培养48小时后收集细胞，用0.25%胰酶将贴壁培养细胞（约1×106个）从壁上消化下来并制成单细胞悬液。
12.4用无血清MEM培养基将Matrigel配制成10ug/250ul（1:300）的人工基底膜胶备用。
12.5 96孔板每孔中铺Matrigel 2ug/50ul，放于超净台中风干过夜。 12.6 96孔板每孔加入适量无血清MEM细胞培养液(或PBS或生理盐水)，放置60－90分钟，洗去多余的胶；
12.7取转染、阴性对照转染及不行转染的Hep3B细胞以4×103/孔接种在铺胶的96孔板中，设3个重复孔，放入37℃、5％CO2培养箱中分别培养20min、40min、60min。
12.8 在相应时间点取出96孔板，吸出培养液，用PBS洗3遍，洗去未粘附细胞。
12.9 每孔加入100 ul甲醇，固定15min。
12.10每孔加入100 ul姬姆萨染液，染色15min，蒸馏水洗去染液。 12.11 在200倍显微镜下计数粘附细胞数量（每孔在固定位置取8个视野）。
13.1 将4.5×105 个Hep3B细胞/孔传代于无菌6孔培养板中。
13.2培养24h后，用Lipofectamine TM 2000将37LRP siRNA转染Hep3B细胞（两个平行孔，Lipofectamine TM 2000转染具体操作见方法7），转染后的细胞置37℃、5％CO2培养箱培养，48h后收集细胞。同时各有两个平行孔的细胞进行阴性对照转染及不行转染。转染终浓度即siRNA终浓度为100nmol/L。 13.3 侵袭小室的制备 :将Matrigel原液置于冰上，于冰箱内4℃冰浴过夜使融化，用预冷的Tip头使其混匀。
用融化的Matrigel原液和预冷无血清MEM培养液配制Transwell chamber上室凝胶液(0.8μg/μl) (1:15)，以每孔100μl包被transwell上室，37℃放置2-4h使其成胶。
13.4 胰酶消化已转染和未转染的Hep3B细胞并收集计数，用无血清MEM稀释成1×106 /ml细胞悬液，每孔transwell上室加入100μl细胞悬液（1X105个细胞/well），下室加入600μl条件培养基（300μl含10％FBS已用于培养NIH3T3细胞的MEM上清和300μl含10％FBS的新鲜MEM），置于5％CO2培养箱培养36h～48h。
13.5 从双室培养板中取出transwell小室，吸弃液体，用2根棉签檫净基底膜胶，PBS漂洗后立即4％甲醛固定15 min，PBS漂洗2min，1×Giemsa染色30min，ddH2O漂洗数秒钟，200倍镜下观察，选取上中下左右5个视野计数并拍照。
14. 运动实验
步骤基本同上述侵袭实验，但省略侵袭小室的制备，细胞铺入Transwell小室后培养24h～36h后进行染色，固定前也要用棉签擦拭上室面，目的是去除未穿过的细胞。