细菌胞外多糖的生物合成与基因控制

生物技术通报

综述与专论

BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N

2010年第11期

细菌胞外多糖的生物合成与基因控制

王正荣

生吉萍

申琳

(中国农业大学食品科学与营养工程学院, 北京100083)

摘要: 细菌胞外多糖是指细菌在生长发育过程中合成并分泌到细胞外的长链, 高分子糖类聚合物。细菌胞外多糖的生物合成途径涉及装配、多聚化及运输三个过程, 是多种酶和转运系统的结果, 其发生的部位包括胞内和胞外, 有些合成过程会发生在细胞壁上, 对于胞外多糖合成相关基因的报道, 发现控制胞外多糖合成是一大类基因簇, 不同的菌株其基因簇的数量和种类各不相同。这些研究的不断更新为将来胞外多糖的应用提供了更加广阔的前景。

关键词: 细菌

胞外多糖

生物合成

基因簇

Biosynthesis of Bacteri al Exopolysacchari des and Gene C l uster

W ang Zhengrong

Sheng Jipi ng

Shen L in

(Colle ge of Food Scie nce and Nutriti onalEngineering , China Agric ult ural Universit y, B eiji ng 100083)

Abstrac:t Bacter i a l exopolysaccha ri des a re mu ltif uncti ona l and can be div i ded i nto i ntracell ular polysaccha ri des , struc t ura l po l y

sacchar i des and ex trace ll ular po l y sacchar i des or exopo l ysaccharides (EPS). Extrace ll u l a r poly m er ic substances (EPS), secreted out of ce l, l have been of t op i ca l research i nterest . B i osynthes i s of bacter i a l ex opo l ysacchari des , i nvo l ved i n processes o f asse m bly , po l ym eriza ti on and transl ocation , i s the result o fm ulti enzym e and different transport syste m. It i s repo rted that some gene c l usters i nvo lved i n b i o synthesis o f exopolysacchar i des have been characte rized , wh i ch cou l d put mo re pro sperous appli cation about exopo lysacchar i de .

K ey words : Bacter i a l Exopo l ysaccharides

B i o syn t hesis G ene c l usters

近年来随着对天然多聚物工业需求的与日俱增, 人们对微生物胞外多糖的兴趣逐渐增强, 细菌多糖作为一种新的、工业化的重要多聚物与植物所产

生的天然树胶有同样经济利用价值。胞外多糖是指细菌在生长发育过程中合成并分泌到细胞外的一类多糖, 是一种长链, 高分子质量聚合物, 其独特的物理学和流变学特性以及使用安全性, 使它在食品和非食品工业倍受青睐, 同时在医药领域所具有的巨大应用潜能正日愈引起人们的广泛关注。细菌胞外多糖的生物合成一直是人们所关心的焦点之一, 它关系到能被工业化利用的胞外多糖的产量问题

[1]

细菌胞外多糖在其结构上与脂多糖(LPS) 和荚膜多糖(CPS) 具有相似之处, 均有相同的寡糖重复单元组成, 尽管不同的多糖具有不同的重复单元, 组成单糖的种类和数量也不同, 糖苷键的连接方式也不尽相同, 但是他们的生物合成途径却很相似, 甚至与一些LPS 和CPS 的合成途径也很相似。这3种类型的大分子物质的合成过程都是通过糖基转移酶(G lycosyltransferase , GTF) 将单糖从核苷酸糖顺序性转移而装配到脂类载体上形成重复单元, 随后是这些重复单元的聚合和输出, 形成细胞表面多糖, 这些多糖的合成过程大部分发生在细胞膜上, 然后被运输到指定的地点, 而果聚糖、alter m ans 以及左旋糖苷的合成则发生在胞外

[5]

。

1 细菌胞外多糖的生物合成

细菌胞外多糖的生物合成的产量受外部因素的影

响, 其中包括培养基如碳源、氮源、碳氮比、生长因子等, 环境因素如p H 、温度、通气量和接菌量的影响

[2-4]

。以下对两种不同位点

的合成途径进行分别介绍。

。

收稿日期:2010 05 17

基金项目:国家自然科学基金项目(30671471, 30972065), 公益性行业(农业) 科技专项(200803033) 作者简介:王正荣, 女, 博士研究生, 研究方向:食品微生物学; E m ai:l w anzheron @hot m ai. l co m 通讯作者:申琳, 男, 副教授, 博士生导师, 从事果蔬采后病理与农副产品资源综合利用研究; E m ai:l s hen5000@g m ai. l co m

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1 1 细菌胞外多糖的胞内合成途径

参与胞外多糖的合成相关的酶, 分别定位在微生物细胞的不同位点, 具体可分为以下4种不同的类型。

1 1 1 类型一

定位在胞内, 参与细胞内许多其它

影响, 但是到目前为止, 对于脂质载体的鉴定还没有进展。值得关注的是, 在嗜热乳酸菌如L. lactis 其胞外多糖的合成受到了异戊二烯醇磷酸盐的抑制, 但是对嗜热链球菌和其它嗜热乳酸菌的研究中发现胞外多糖的产生并不受到抑制, 这一现象表明, 这些菌株可能是用到了另外可以替代的载体分子

[11-14]

的代谢过程, 其中之一为己糖激酶, 主要参与糖的磷酸化, 当然在合成多糖的最初阶段, 都需要糖底物(单糖或二糖等) 被运输到细胞质内的过程, 而起到这一作用的转运系统是细菌磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PEP PTS)

[6]

。

1 1 4 类型四定位在细胞膜外和细胞壁上, 这一

类型的酶可能参与胞外多糖的聚合, 聚合完成后被运送到指定的位点形成粘液或者细胞周围的多糖

[15]

。PEP PTS 系统包括两。然而关于胞外多糖的运输, 聚合以及粘膜的

大类蛋白, 负责糖底物的结合, 跨膜转运和磷酸化。

其中一类蛋白包括组氨酸磷酸基载体蛋白和糖特定透酶复合体系, 这些酶负责提供磷酸化的糖。另外一类蛋白负责营养物质获取的调控, 这些调控蛋白不仅进行复杂PEP PTS 系统的激活和抑制, 还负责

[7, 8]

调控non PTS 摄取系统。另外一个是变位酶, 可以将葡萄糖 6 磷酸(Glc 6 P) 转化为葡萄糖 1 磷酸(G lc 1 P), 葡萄糖 6 磷酸被认为是在糖代谢过程中被大量消耗的物质, 但是葡萄糖 1 磷酸却可以用来合成胞外多糖, 在对变位酶的大部分研究工作中, 认为变位酶在转化成葡萄糖 1 磷酸过程中起到了重要作用, 但也有人认为变位酶也可能是葡萄糖 6

[9]

磷酸到葡萄糖 1 磷酸的反向过程中起到了作用。1 1 2 类型二

同样位于细胞内, 如尿苷酰二磷葡

萄糖焦磷酸化酶(UDP g l u cose), 它能催化胞外多糖合成途径中的一个关键分子uri d i n e diphosphate g l u cose (UDP G lc), 这一分子在单糖互换和来源上起到重要的作用, 另外差向异构酶起到糖核苷之间的互换的催化作用, 如在嗜热链球菌中, 差向异构酶催化UDP 半乳糖和UDP 葡萄糖之间的互换, 同时这个酶也是半乳糖代谢过程中的重要组成部分

[10]

机制了解的非常少。对于E scherichia co li 的研究表

明, 一个60kD 的周质蛋白可能负责多糖的运输, 而另外一个关于E scherich i a coli 报道是通过200-400贝尔结合的秘密区域, 同时也是外膜的重要作用。有报道称胞外多糖的运输与O 抗原有相似性, 在O 抗原中有3个基因负责其聚合和转运, 其中一个基因编码的蛋白负责脂质结合物质的运输, 一个基因编码的蛋白具有催化聚合酶的功能, 还有一个基因编码的蛋白控制聚合链的延长, 通过生物信息学的比对发现, 胞外多糖的聚合和转运需要一个跳跃酶(flippase , 负责转运脂质结合重复单元), 一个聚合酶催化重复单元的耦合和负责脂质结合重复单元的聚合酶这3种不同蛋白的参与。通过氨基酸序列的分析方法表明, 参与到胞外多糖的聚合、转运和膜形成的酶与O 抗原中的酶具有很高的同源性, 这一现象表明多糖的运输和聚合以及膜形成可能具有与O 抗原同样的机制, 但这只是一个假说, 需要进一步试验验证

[16, 17]

。

另外许多胞外多糖都具有酰基团, 这些基团的加入需要乙酰基, 丙酮酸基, 琥珀酸基, 磷酸基和硫酸基的激活形式。通过对54种来自K lebsiella pneu m oniae 的乙酰化多糖的研究, 发现乙酰基的加入来自乙酰辅酶A, 而丙酮基的前体来自于磷酸烯丙酮, 磷酸基团可能来自于ATP , 通过一个磷酸化反应, 也有很多报道磷酸基团很可能来自于糖苷酸。另外, 甲基化多糖的甲基来自于蛋氨酸, 或者是S 腺苷基甲硫氨酸, 但是关于甲基化基团的加入机制目前还不是很清楚, 另外关于硫酸基团的来源和加入的机制目前还未见报道。

。

1 1 3 类型三定位于细胞周质膜上, 如糖基转移酶, 它的作用在于将UDP G lc 或UDP Ga l 和(或) UDP G lc A 转移到糖基脂质载体上的糖重复单元, 其中糖基脂质载体被鉴定为一种类异戊二烯醇磷酸盐, 通过焦磷酸键连接单糖残基。在细菌胞外多糖的合成过程中起到重要的作用, 同时在多肽糖, 磷酸质和脂肪酸的形成过程中也是不可缺少的, 在对嗜热链球菌的研究过程中发现, 如果异戊二烯醇磷酸,

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型的过程, 其中合成糖核苷的前体, 糖基磷酸化酶将糖基磷酸化, 糖基转移酶将单糖加入多糖合成的单元中, 多糖长链的聚合等过程都是耗能的过程

[18, 19]

对于胞外多糖的合成是复杂的, 多酶系统结合的过程, 根据目前已知的信息, 其合成的过程可以用图1

来概括。

。

虚线表示目前还未研究清楚

图1 细菌胞外多糖生物合成途径

1 2 胞外多糖的胞外合成

以果聚糖, alteran 和左旋糖苷为例, 左旋糖苷作为一种同多糖, 其分子量在15-20000kD 之间, 左, 糖从蔗糖转运到左旋糖苷的延长链上, 其反应如下:

Sucr ose dex tran +D fr uctose

而果聚糖是通过果聚糖蔗糖转移酶来进行合成

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Sucrose levan +D g lucose

另外一种多聚糖是alter nan , 由Leuconostoc m es enteroides 菌株合成, alter nan 类似于葡聚糖, 其合成过程中酶作为一种合成酶, 其主要催化过程和反应

如下:

Sucrose a lternan +fructose

[20]

目前, 对于xanthan 的生物合成的途径和合成机理研究的相对比较清楚, 如图2

所示。首先是核

图2 Xanthan 合成途径

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苷酸糖的合成, 然后在葡萄糖基转移酶(GumD ) 的作用下, 将葡萄糖磷酸连接到脂质载体上, 糖基核苷酸糖在特异性糖基转移酶(Gum M, GumH, GumK 和Gum I) 的作用下连接到脂质连接载体上, 随后, GumF 和GumC 将乙酰基加入, GumL 在外部甘露糖参与下加入丙酮基, 重复单元在还原端输出和聚合, 形成xanthan , 此过程需要Gu m B , GumC 和GumE 的

[20]

参与。

用, 而alg K 基因可能会阻断多糖的合成和运输

[22, 23]

。对于甲基菌胞外多糖合成相关基因的研

究中, 利用Tn5转座子突变技术共发现了24个ORFs , 21个胞外多糖合成的相关基因, 分别为ep

[24]

s ABCDEFGH IJ KL MNOPQRSTU , 根据同源性分析显示epsE 和epsFG 的基因产物与W za 和W zc 转运蛋白有一定的同源性, 上述提到的W za 和W zc 蛋白是参与到胞外多糖转运系统的通道蛋白, 另外基于同源性分析epsB J NOP 和eps R 的基因产物可能作为糖基转移酶参与到多糖的转运过程中, eps M 和eps H 的基因产物类似于聚合酶的功能。尽管对于epsI 基因缺失的研究发现, 该基因的缺失并不能导致胞外多糖的完全消失, 但是研究仍然认为该基因编码的产物是很可能定位于周质上参与到多糖的运输过程, 由于未得到eps L 基因缺失突变体, 该基因的功能还并不完全清楚。eps OS 和eps T 的基因产物很可能作为酶参与到单糖的激活过程中, Eps Q 和Eps T 可能分别通过己糖 1 磷酸和NTP 来合成GDP 甘露糖和UDP 葡萄糖, EpsS 预测作为一种差向异构酶将UDP 葡萄糖转化为UDP 半乳糖, Eps C 可能具有该菌株合成胞外多糖的过程, 但具体的作用还需要进一步研究, EpsD 具有结合PPIs 的结合蛋白, Eps A 可能参与胞外多糖的转录调控过程中, Eps K 也可能作为一种调控蛋白参与到胞外多糖的合成过程中。H alo m onas maura 菌中发现有5个胞

[22, 25]

外多糖合成相关基因eps ABCDJ 。该基因簇包括了5个ORFs , 其中ORF1编码Eps A 与胞外多糖的运输蛋白有47%

左右的同源性。

2 细菌胞外多糖相关基因的研究

细菌胞外多糖的合成需要一系列的基因的参

与, 这些基因簇控制着单糖的添加, 糖的酰基化, 将单糖装载到脂质载体上, 重复单元的聚合以及多糖的分泌, 一般来说, 多糖的合成需要大约12-17kb 长度的基因序列。

近年来, 越来越多的细菌中胞外多糖合成相关的基因簇被克隆和鉴定, 由X antho m onas camp estris pv . C a m pestris 参与xanthan 合成的基因簇是一个16kb 的基因序列, 它位于染色体上, 其基因簇如图3所示

[21]

, 其中GumC , Gu mM 和Gum I , Gu mH 作为单

糖的转移酶能形成多糖的单元结构, 而GumL 作为

一种激酶能够添加丙酮酰基, Gu m F 是一个酰基酶, GumE 作为一种聚合酶与另外的一些基因和转运相关。另外关于P. aer ug inosa 合成藻盐酸多糖调控的基因簇包括alg A, a l g D, algC , algE 和alg K 基因, alg A 基因具有解码磷酸基因酶和GDP 甘露糖焦磷酸酶的作用, alg D 基因能够编码GDP 甘露糖脱氢酶, a l g E 基因能够编码一种膜蛋白可能参与到多糖的运输过程中, a l g 基因编码phospho m anno m utase 的作

箭头表示转录方向

图3 X anth an 合成的基因簇

由于乳酸菌产生的胞外多糖在食品工业中的广泛应用, 因而关于乳酸菌胞外多糖合成相关基因方面的研究屡见报道, Lactococcu s Lactis stra i n N I ZOB40胞外多糖的产生包含了14个基因, 分别为eps ABC DEFG IJ K, 其中E psD 是能引发糖基转移酶, 将葡萄

糖 1 磷酸从UDP 葡萄糖连接到脂质载体上, Eps E 和epsF 负责将葡萄糖从UDP 葡萄糖连接到脂质载体的葡萄糖上, EpsG 将半乳糖从UDP 半乳糖连接到与脂质载体连接的纤维二糖上, EpsJ 可能作为半

[26, 27]

乳糖磷酸转移酶参与到胞外多糖的合成中。

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[28]

最近, Lebeer 等将Lactobacillus rham nosus GG 菌人推测胞外多糖产量的变化可能与中心代谢的酶活以及前提的合成有关系

[28, 29]

株的胞外多糖合成相关的基因簇进行鉴定并结合生物信息学的方法对各基因的ORFs 进行了功能性分析, 其分析结果如表1所示。在2005年, 通过对Lactobacillus rham nosus 4个不同的菌株的胞外多糖合成相关基因的比较发现, 编码胞外多糖合成的基因簇包括了18 5kb 的染色体DNA 区域, 有17个ORFs , 在这4种菌株中表现出很大的相似性, 但值得注意的是, 这4个不同菌株的胞外多糖产量却表现出不同, 其产量从61到1611m g /L区间变化, 有

。由雀巢研究中心组

织的关于Strep tococcus ther m ophilus S fi 6菌的基因簇的研究, 利用Tn916转座子突变, 并通过生物信息学的方法, 克隆并鉴定了13个胞外多糖合成和分泌的相关基因eps(A -M ), 利用同源性比较, 发现除了epsJ , epsL 和eps M 外其它基因的蛋白表达与之前的发现有一定的同源性, 并通过外源表达, 进一步验证了该基因簇的功能

[30]

。

表1 L . rhamn osu s GG 基因簇鉴定

Bes t BLASTx h it (登录号)

ORFs

长度(bp)

预期的编码功能

蛋白

Autophos phorylati ng t yrosine protei n k i nase

Auxiliary protei n for po l ys acchari de ex port and chai n l ength deter m inati on Rep eat un i t pol y m erase UDP gal actopyranose mu tase Rep eat un i t transporter G l ycos yltransferase G l ycos yltransferase G l ycos yltransferase G l ycos yltransferase G l ycos yltransferase

Undecap renyl phosph ate gal actos e phos photransferas e ; pri m i ng gl ycosyltrans f erase dTDP glucose pyroph osphory l ase Pu t ati ve tran s posase

dTDP 4 dehydro rha m nose 3, 5 ep i m e rase

dTDP D glucose 4, 6 dehyd rat ase T ranscri pti on al regulat or of po l ys accha ri d e b iosyn t hesis

Phos photyros i ne protei n phos phatase

组织

氨基酸相似度(%)

w ze 756W ze (AA W 22434) L. rham nosus ATCC 959572

wzd 920W zd (AAW22433) L. rham nosus ATCC 9595S t re p t ococc u s pneum oniae serot yp e 16a L. salivari u s UCC 118L. casei BL23L. re u teri 100-23L. plan t a rum W CFS1L. plan t a rum W CFS1L. re u teri F275Shigella dyse n teriae

w zy g l f w zx w el J w elI w eH l w el G w el F

[***********][1**********]8

W zy (CAI33441) G lf (YP_536435)W zx (YP_1988153) ZP_1274133NP_784849NP_784850YP_1271955W ff U (ACA24914)

[**************]8

w el E 669YP_1842290L. re u teri F27561

r m l A a orfl r m l C

7951494597

Rm l A (AA W 22443) YP_806463Rm l C (AAW22444)

L. rham nosus ATCC 9595L. casei ATCC 334L. rham nosus ATCC 9595

906298

r m l B 936Rm l B (AAW22445) L. rham nosus ATCC 959599

w zr 891W zr (AA W 22447) L. rham nosus ATCC 959597

w zb 765W zb (AAW22466) L. rhamnosus R W 6541M 100

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根瘤菌作为一种固氮菌, 其所产生的胞外多糖

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ang t 在共生和固氮方面发挥着重要的作用, 因此对于根瘤菌胞外多糖合成相关方面的研究显得尤为重要, 在根瘤菌中对R. m eliloti 菌株的研究发现了22个相关基因, 其中19个在其巨型质粒上

[31, 32]

。以根瘤

菌Rhizobiu m legum inos arum 为研究对象, 发现了

RosR 基因对胞外多糖的合成起到调控作用, Ros 蛋白作为一种转录调节因子, 属于Ros/M uc R 蛋白家族, 在C 末端具有Cys2H is2的锌指, rosR 上游区域具有-35到-10的启动子序列, 是两个保守的反向回文五聚体, 也是c AM P CRP 结合位点, r osR 基因的移码突变能够形成一个较干但是相对有皱的菌落, 可是并不能固氮

[33]

。另外一个pss A 基因也在

转录水平上对胞外多糖的合成起到控制作用, 而pss A 和ros R 在根瘤菌中的多拷贝均能增加胞外多糖的合成以及固定根瘤的形成

[34-36]

。

3 展望

细菌胞外多糖以其流变特性和物理特性被越来越多的研究者所关注, 细菌胞外多糖相比较植物多糖来说, 其优点在于其种类的多样性, 易培养, 易分离, 安全无毒等, 但是由于目前对于胞外多糖的认识的不足, 以及合成胞外多糖的成本巨大, 使得对胞外多糖的利用并未得到很好地开展, 而对胞外多糖的生物合成和基因控制方面的研究, 有助于对细菌胞外多糖进行深入的了解, 尤其是控制其合成基因的研究, 在提高胞外多糖产量方面有很好的效果。以乳酸菌为例, Ra m os 等研究了Lactococcus alctis 的胞外多糖产生菌和非产生菌与葡萄糖代谢的相互关系, 发现了胞外多糖合成的代谢关键物, 从而为研究寻找通过遗传操作提高EPS 产量的方法提供了线索

[37]

。但是到目前为止关于胞外多糖合成的机制

还存在很多未知, 例如, 它的合成到底是否需要模板, 其合成是如何终止的, 哪些因素影响了多糖的合成, 如何影响, 同时多糖的聚合的分子量是如何进行调控的等, 这些都需要我们不断的研究和探索

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