生物工程学报
ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎｃｊｂ＠ｉｍ．ａｃ．ｃｎ
ＣｈｉｎＪＢｉｏｔｅｃｈ２００８。Ｊａｎｕａｒｙ
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
２５；２４（１）：６８－７３
ＩＳＳＮ１０００－３０６１
０２００８ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＡＳ＆ＣＳＭ，Ａｌｌｒｉｇｈｔｓｒｅｓｅｒｖｅｄ．
肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
王淑静１，２，３，刘兴汉４，季宇彬１，陈宁３
１哈尔滨商业大学药物研究所，哈尔滨１５００７６２东北农业大学兽医学博士后流动站。哈尔滨１５００３０３哈尔滨商业大学药学院，哈尔滨１５００７６
４黑龙江省生物医药工程重点实验室一省部共建国家重点实验室培育基地，哈尔滨
１５００８１
摘要：肿瘤抑素抗肿瘤相关肽．１９肽是由肿瘤抑素１８５—２０３位氨基酸组成，具有直接抑制黑色素瘤细胞生长作用，但其对肝癌细胞增殖和凋亡是否有影响，对肝癌是否具有治疗作用还需进一步研究。本研究中采用基因工程技术将合成１９肽基因与载体ｐＴＹＢ２重组后进行蛋白表达、纯化获得１９肽。通过ＭＴＴ法、生长曲线观察１９肽对人肝癌细胞生长抑制作用：ＴＵＮＥＬ标记法．流式细胞仪细胞周期检测法，透射电镜观察１９肽对肝癌细胞凋亡的影响；小鼠Ｈ２２腹水型转移型肝癌实体瘤抑瘤实验证明其体内的抑瘤作用。ＭＴＴ实验和生长曲线实验表明随着１９肽浓度的增加肝癌细胞的存活率下降。在相同１９肽浓度下，随着作用时间延长存活细胞逐渐减少．电镜观察治疗组细胞出现明显凋亡，流式细
胞仪可检测到前Ｇ１峰，ＴＵＮＥＬ标记法也证实治疗组可见明显的凋亡细胞，体内１９肽作用的小鼠Ｈ２２腹水型转移型肝
癌的抑瘤率达４８．４６％．可见，肿瘤抑素１９肽可抑制肝癌细胞生长，促进肝癌细胞凋亡，对肝癌具有一定的治疗作用．关键词：肿瘤抑素，细胞增殖，细胞凋亡，肿瘤治疗
ＥｆｆｅｃｔｏｆＴｕｍｓｔａｔｉｎＡｎｔｉ－ｔｕｍｏｒＰｅｐｔｉｄｅＡｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＨｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａＣｅｌｌ
ＳｈｕｊｉｎｇＷａｎ９１’２＇３，Ｘｉｎｇｈａｎ
１
ｏｎ
Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄ
Ｌｉｕ４，ＹｕｂｉｎＪｉｌ，ａｎｄＮｉｎｇＣｈｅｎ３
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００７６，Ｃｈｉｎａ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｈａ而ｉｎ
Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ
２ＰｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌＳｔａｔｉｏｎ
ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００３０，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ
３Ｐｋｒ’Ｍｃｏｌｏｇｉｃ口ｔ
４
Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈａ而ｉｎ
Ｋｅｙ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ
１５００７６，Ｃｈｉｎａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。Ｈａ曲ｉｎＭｅｄｉａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｈａｒｂｉｎ１５００８６，
Ｂｉｏ－ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＨｅｉｌｏｎｇｄｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ—ＩｎｃｕｂａｔｏｒｏｆＳｔｕｔｅＫｅｙ
劭ｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｂａｓｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ１９ｐｅｐｆｉｄｅｗｅｒｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄａｎｄｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｖｅｃｔｏｒｐＴＹＢ２．Ａｆｔｅｒｂｅｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｅｄｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙ３－【４，
５・ｄｉｍｅｈｙｌ一２一ｔｈｉａｚｏｌｙｌ］一２，５・ｄｉｐｈｅｎｙｌ一２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）ａｓｓａｙａｎｄｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅ．ＴｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｅｘＷａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｕｓｉｎｇＴｄＴ－ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ），ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅＯ＇ＥＭ）．Ｉｔｓａｎｄ—ｔｕｍｏｒ
ａｎｄ
ｐｕｒｉｆｉｅｄ，ｔｈｅ
ｓｏｌｕｂｌｅ
１９ｐｅｐｔｉｄｅｗａｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ
ｅｆｆｅｃｔ
ｏｎ
ａｃｔｉｖｉｔｙ／ｎｖｉｖｏ
ＷａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｉｎＨ２２ａｓｃｉｔｉｃｆｌｕｉｄｔｒａｎｓｆｅｖｅｎｔｈｅｐａｔｏｃａｒｅｉｎｏｍａｏｆｍｉｃｅ．３－【４，５－ｄｉｍｅｈｙｌ一２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ］－２，５－ｄｉ—
Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：Ｍａｘｃｈ２６，２００７；Ａｃｃｅｐｔｅｄ：Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ１７，２００７．ＳｕｐｐｏＳｅｄｂｙ：ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ
ｔｈｅＲｅｓｅａｒｃｈ
ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｎｏ．３０４７２０３５）．Ｎａｔｕｒａｌ
ＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆ１５１１
ＨｅｉｌｏｎｇｉｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（Ｎｏ．ＴＤ２００５—２１）ａｎｄ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
１０４）．ｐｒｏｊｅｃｔＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（Ｎｏ．１
ａｕｔｈｏｒ：ＳｈｕｊｉｎｇＷａｎｇ．Ｔｅｌ：＋８６—４５１—８４８３８２０７；Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｉｓｓｗｓｊ＠１６３．ｃｏｍ
ｆｒｏｍＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎｏｆ
国家自然基金资助项目（Ｎｏ．３０４７２０３５），黑龙江省自然科学基金资助项目（Ｎｏ．ＴＤ２００５—２１）。黑龙江省教育厅自然基金资助项目（Ｎｏ．１１５１１１０４）．
王淑静等：肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
ｐｈｅｎｙｌ・２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ（Ｍａｎａｓｓａｙａｎｄｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ
ｃｕｒｖｅ
ｓｈｏｗｅｄｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｄｅｃｒｅａｓｅｗｉｔｈｔｈｅ１９ｐｅｐｆｉｄｅ．Ｓｕｒｖｉｖａｌｈｅｐａ－
ｔｏｅａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｉｍｅ．Ｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ，ｏｂｖｉｏｕｓｃｈａｎｇｅｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｔｈｅｂｒｏｗｎｃｅｌｌｓｗｅｒｅ
ｓＰＡ：ｎ
ａｐｐｅａｒａｎｃｅ
ｏｆｓｕｂ—Ｇ１ｐｈａｓｅ
ａｎｄｄｙｅｄ
ｂｙ
ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ
ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＴＥＭ），ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＴｄＴ－ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ
ａ
（ＴＵＮＥＬ），Ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ｒａｔｅ
ｏｆｍｏｕｓｅＨ２２ａｓｃｉｔｉｃｆｌｕｉｄｔｒａｎｓｆｅｖｅｎｔｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｇｒｏｗｔｈｗａｓ４８．４６％．Ａｓ
ｗｈｏｌｅ，１９ｐｅｐｔｉｄｅ
ｃｏｕｌｄｄｉｒｅｃｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｕｍｓｔａｆｉｎ，ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ。ｔｕｍｏｒｔｈｅｒａｐｙ
肿瘤抑素（Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ）是胶原蛋白ＩＶａ３链的非胶原区，８０年代作为肺．肾出血综合症的自身抗原被发现【¨。２０００年，Ｋａｍｐｈａｕｓ及其同伴发现它有两个不同的抗肿瘤活性区，执行直接和间接的抗肿瘤作用１２Ｊ。一个是具有直接抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡作用的靠近Ｃ端的１８５．２０３位氨基酸所组成的１９肽，另一个是具有抑制肿瘤血管生成、发挥间接抗肿瘤作用的接近Ｎ端７４—９８位氨基酸所组成的Ｔ７肽（２５肽）。目前，对于肿瘤抑素抗血管生成活性研究比较多，而对于其直接抗肿瘤活性研究较少，其直接抗肿瘤机制还不明确。另外，肿瘤抑素虽然具有较强的抗肿瘤活性，但肿瘤抑素因其分子量较大（２８ｋＤ），含有肺．肾出血综合征的自身抗原，提取较为困难并对机体具有副作用而影响其进一步的研究应用。再者，１９肽虽然具有直接抗肿瘤作用，但影响功能的发挥【３】。因此，为了获得分子量小，可溶一步明确其抗肿瘤作用机制。我们采用基因工程技术获得了肿瘤抑素１９肽，通过体内外实验研究其对肝癌细胞生长和凋亡的影响，这将对肝癌等肿瘤的临床治疗具有重要意义。１
材料和方法
Ｉ．Ｉ材料
Ｉ．Ｉ．１菌种翻暖粒
大肠杆菌ＪＭｌ０９和ＢＬ一２１（ＤＥ３）购自Ｐｒｏｍｅｇａ１．１。２细胞和动物
小鼠Ｈ２２肝癌细胞由哈尔滨医科大学免疫教研室提供：人肝癌细胞由哈尔滨医科大学组胚教研室限制性内切酶Ｎｄｅ
Ｉ、ＳｍａＩ、Ｘｈｏ
Ｉ、几丁质亲
和层析树脂购自ＮＥＢ公司；ＲＰＭｌｌ６４０细胞培养基、胰酶购自Ｓｉｇｍａ公司；胎牛血清购自灏洋生物公司；ＴＵＮＥＬ试剂盒购自武汉博士德生物公司。１．２方法
、。２．１
１９呔基因Ｉ程菌的构建以及表达．纯化根据肿瘤抑素１８５—２０３位氨基酸所对应的碱基
序列，采用大肠杆菌偏爱密码子，设计合成肿瘤抑素１９肽的碱基序列。将合成的１９肽基因磷酸化、退火成为双链后与载体ｐＴＹＢ２进行重组转化到大肠杆菌ＢＬ．２１（ＤＥ３）中，０，１
ｍｍｏｌ／Ｌ
ＩＰＴＧ，２８℃诱导表
达６ｈ后，取菌体沉淀进行裂解、超声后用几丁质亲和层析柱进行１９肽的纯化，具体方法参照以往发表的文献１４，５１。１９肽碱基序列如下：
５’！鱼匹鱼ＧＣＴＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣ１：ＩＡＧＡＡＴＧＴ
ＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＣＡＡＡＣＴＣＣ３
７
３’ＡＣＣＧＡＴＣＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡ
ＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧ５’１．２。２
ＭＴＴ眈色实验
取经过１６４０培养基培养的生长状态良好的人
肝癌细胞，０．２５％胰酶溶液消化，制备细胞悬液，用细胞计数板调整细胞浓度为５×１０４个／ｍＬ，每孔１００“Ｌ加入９６孔板，待细胞培养２４ｈ贴壁后加入不
同浓度１９肽，每个浓度设定６个复孔。对照组加入同等体积的ＰＢＳ。１９肽终浓度梯度为：０峙／ｍＬ，４４
ｌｌｇ／ｍＬ，８８
Ｉ．ｔｇ／ｍＬ，１３２Ｉｔｇ／ｍＬ，１７６
１１９／ｍＬ，２２０
Ｉ．ｔｇ／ｍＬ。培养４８ｈ后。于每孔加入５
ｍｇ／ｍＬＭＴＦ２０
ｐＬ，４
ｈ后弃培养液，加入１００止，ＤＭＳＯ，培养板振
荡１０～２０ｍｉｎ。空白对照调零，选择４９０ｌｌｍ波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值（Ａ值），绘制１９肽浓度与细胞存活率曲线图。细胞存活率＝实验组吸光值，对照组吸光值Ｘ１００％。
１．２．３生长曲线
取生长状态良好的人肝癌细胞，采用常规方法
Ｊｏｕｍａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎ
作为肿瘤抑素整体的一部分时，并不显示抗肿瘤活性，可能是此活性区域被掩盖，阻碍与受体结合，性高，提取方便，使用安全的直接抗肿瘤活性肽，进公司，ｐＴＹＢ２载体购自ＮＥＢ公司。提供。昆明小鼠购自哈尔滨医科大学附属三院。、．１．３试韵及试剂盒
７０
ＩＳＳＮｌ０００－３０６１ＣＮｌｌ－１９９８／（２
消化细胞，调整细胞浓度至５×１０４个／ｍＬ。在２４孔板各孔中准确接种４００ＩｌＬ细胞悬液，继续培养
２４
ｈ。吸弃培养液，向各孔重新加入４００ＩｌＬ培养液。
１９肽组各孔加入终浓度为４４ｐｇ／ｍＬ的１９肽。对照组各：ｆＬａｉｌ入同等体积的ＰＢＳ。每天每组各取３孔，充分消化后，经台盘蓝染色，细胞计数板计数，测出每孔细胞浓度，求出平均值，持续６ｄ。绘制细胞浓度．时间曲线。
１．２，４
凋亡细跑露位末端标记试验ｑＵＮＥＵ
取生长状态良好的人肝癌细胞，采用一般方法消化细胞，制备成细胞悬液。计数，调整其浓度至５ｘ１０４个／ｎｉＬ。将处理好的盖玻片放入６孔板各孔中。在６孔板各孔中准确接种１ｍＬ细胞悬液，培养２４ｈ。１９肽组各孔加入终浓度为４４Ｉ．ｔｇ／ｍＬ的１９肽，对照组各孔加入同等体积的ＰＢＳ，继续培养２４ｈ。上述片子经空气干燥后，用新制备的４％多聚甲醛溶液固定２０－３０ｍｉｎ。内源性过氧化物酶阻断和细胞通透后，加５０“ＬＴＵＮＥＬ反应混合液标记，荧光显微镜下分析结果。然后再加入５０¨Ｌ的转化剂ＰＤＢ和
５０－１００ＩｌＬ
ＤＡＢ底物溶液，冲洗，封片，在光镜下分
析结果。同时可在光镜下随机取１０个视野进行凋亡细胞计数，得到细胞凋亡率。
１．２。５
流式细瞻仪细咆圈期试验
取培养状态良好的人肝癌细胞，调整细胞浓度
至２ｘ１０５个／ｍＬ。分两组，对照组加入ＰＢＳ，实验组加入１９肽使之终浓度为４４Ｉ．ｔｇ／ｍＬ。３７℃培养２４
ｈ
后，将正常组和实验组细胞用ＰＢＳ洗２次，去除坏死细胞和凋亡细胞碎片，０．２５％的胰酶消化，制成单细胞悬液，１０００ｇ离心１０ｍｉｎ，弃上清，ＰＢＳ洗２次。每管加入１—１．５ｍＬＴ０％的冰乙醇，每个样品的细胞浓度至少为０．５ｘ１０６１．０ｘ１０６个／ｍＬ，轻轻混匀，使之呈单细胞悬液，４＂Ｃ固定２４ｈ。用ＣｙｃｌｅＴＥＳＴＴＭ
ＰＬＵＳＤＮＡＲｅａｇｅｎｔ
Ｋｉｔ进行流式细胞仪检测细胞在
不同周期的细胞数。１．２。６透射电镜观察
．
取对数生长期人肝癌细胞，调整细胞浓度至
２ｘ
１０５个／ｍＬ。分两组，对照组加入ＰＢＳ，实验组加
入１９肽使之终浓度为４４Ｉ．ｔｇ／ｍＬ。培养２４ｈ。０．２５％
胰酶消化，１５００
ｇ，１５
ｍｉｎ离心，弃上清，ＰＢＳ冲洗，
４℃戊二醛固定２４ｈ，经过包埋、固定、制成超薄
Ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎ
Ｊａｎｕａｒｙ２５，２００８
Ｖ０１．２４ＮＯ．１
切片（５０—８０ｎｍ）后进行透射电镜观察。
、２＾
动物活性检溺
将建立的小鼠腹水型转移型肝癌模型体重在
１８—２２
ｇ的２４只雄性昆明小鼠随机分成２组：对照
组，１９肽组。待到小鼠皮下可触及到皮下结节时开始给药。对照组：１００ＩｌＬ生理盐水；１９肽组：４．８８ｐｇ，ｋｇ的１９肽，每日注射１次，连续给药７ｄ后，将小鼠处死，称其瘤重并进行统计学分析。同时将小鼠肿瘤切成组织块、经固定、包埋、切片、Ｈ．Ｅ染色后，显微镜观察，进行病理分析。２
结果
２．１
１９肽获得
１９肽基因与载体ｐＴＹＢ２重组后经酶切验证和
基因测序后，结果与设计的完全一致，１９肽重组质粒在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行诱导表达、几丁质亲和层析柱亲和层析后，就可得到１９肽，经高效液相检测纯度可达９０％以上。具体结果参照以往文献报道Ｉ
５１。
２．２细胞活性检测
２．２．１
ＭＴＴ眈色实验
ＭＴＴ实验结果表明（图１），根据存活率一浓度
曲线，１９肽对人肝癌细胞生长具有抑制作用，随着１９肽浓度的增加，肝癌细胞存活率明显下降，表现为剂量依赖性。不同１９肽浓度与细胞对照组相比。差异均有显著性意义（Ｐ＜０．０５）。
ｌ４
ｌ２
ｌＯ
Ｏ８Ｏ６Ｏ４Ｏ２
０
０
０．０４４
０．０８８０．１３２０．ｔ７６０．２２
１９
ｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（Ｉｔｇ／ｇＬ）
图１
１９肽对人肝癌细胞生长的抑制作用
Ｆｉｇ．１
Ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆ１９ｐｅｐｔｉｄｅＯｉｌ
ｈｕｍａｎ
ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｌｎｏｍａｃｅｌｌ
乇淑静等：肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
７１
２．２．２生长／／／／线
与对照组相比，１９肽对人肝癌细胞有抑制作用，随着１９肽对肝癌细胞作用时问的增加，其细胞浓度明显降低，细胞生长抑制明显，存在时间依赖性，肝癌细胞在１９肽用药后的第ｉ天细胞密度接近０，无法计数（图２）。
２２３
细胞凋亡原位末端标记检灏
正常肝细胞呈淡蓝色圆形，１９肽作用后的肝癌
细胞经ＴＵＮＥＬ染色有大量凋亡细胞存在，荧光显微镜下实验组有大量的强荧光，光镜下实验组百ｒ见一些细胞的周围出现类似凋亡小体的凸起小泡，细胞形态变化较明显，部分细胞裂解。光镜下随机取１０个视野进行凋亡细胞计数，细胞凋亡率可达
３３．９％±３．４８％（图３）。
如加
ｍ一３【×一
０砷
２。２。４
流式细胞仪细瞧圈朝检溺
流式细胞仪细胞周期检测发现１９肽作用的肝癌
一
细胞在Ｇ１期前有一凋亡峰，细胞凋亡率为１０．０７％±１．７５％。与对照组比较其ＧＯ．Ｇ１、Ｇ２．Ｍ期细胞所占的比例明显增多，而Ｓ期细胞数量减少（尸＜０．０５）。
图２人肝癌细胞生长曲线
进一步证明１９肽可引起肝癌细胞Ｇ０／Ｇ１阻滞。具有抑制肝癌细胞的分裂增殖。促进肝癌细胞凋亡的作用。
Ｆｉｇ．２
Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈ
ｃｕｒｖｅ
ｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌ
图３
Ｆｉｇ．３
凋亡细胞原位末端标记法观察人肝癌细胞形态改变
ｃｅｌｌ
ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｕｓｉｎｇＴＵＥＮＥＬａｓｓａｙ
（Ａ）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；（Ｂ）Ｃｏｎｔｒｏｌｕｎｄｅｒｏｐｔｉｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；（ｃ）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｕｎｄｅｒｏｐｔｉｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
图４
Ｆｉｇ．４
流式细胞仪细胞周期实验检测１９肽对肝癌细胞周期的影响
ｏｎ
Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ１９ｐｅｐｔｉｄｅｃｅｌｌｃｉｒｃｌｅｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｕｓｉｎｇＦＡＣ
Ｊｏｕｍａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎ
７２ＩＳＳＮｌ０００－３０６１ＣＮｌｌ－１９９８／ＱＣｈｉｎＪＢｉｏｔｅｃｈ
Ｊａｎｕａｗ２５．２００８
Ｖ０１．２４
Ｎｏ．１
２．２。５
透射电镜细魄形态学观察
电镜观察结果显示人肝癌细胞对照组的细胞呈
２．３动物活性检测
ｔ。３．１
小鼠盹瘤抑翩实验
用药后对照组与１９肽组小鼠肿瘤继续生长，但
圆形或多边形，绒毛丰富，核仁明显，细胞核表面有切际，核周细胞器发达。１９肽组细胞大小不一，形态不规则，坏死和凋亡细胞数量明显增多，凋亡细胞核崩解，核内染色质形成颗粒状，核膜清晰，部分细胞质膜含有细胞器脱落，内膜结构不清，细胞呈现凋亡状态。
１９肽组肿瘤明显小于对照组。经ｔ检验，１９肽组与对照组比较差异显著，Ｐ＜０．０５。抑瘤率可达４８．４６％（表１）。
１３２
小鼠肿瘤病理组织切片ｂ２Ｑ、
对照组肝癌细胞长势良好，组织无坏死。１９肽组
肿瘤组织出现大量坏死（图６）。
图５透射电镜检测肝癌细胞形态结构
Ｆｉｇ．５
ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｕｓｉｎｇＴＥＭ
表１
Ｔａｂｌｅ１
１９肽对Ｈ２２小鼠腹水转移性肝癌的影响
ｏｆ
Ｅｆｆｅｃｔｏｆ１９ｐｅｐｔｉｄｅｏｎＨ２２ａｓｃｉｔｉｃｆｌｕｉｄｔｒａｎｓｆｅｖｅｎｔｈｅｐａｔｏｍａ
ｍｉｃｅ
ｇｒｏｗｔｈ（牙！ｓ，脬＝１２）
图６
Ｆｉｇ．６
１９肽对小鼠腹水型转移性肝癌中癌组织的影响
ｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｉｎｍｕｒｉｎｅＨ２２ａｓｃｉｔｉｅｆｌｕｉｄｔｒａｎｓｆｅｖｅｎｔｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ
Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ１９ｐｅｐｔｉｄｅｏｎ
３
分析与讨论
目前，原发性肝癌的治疗仍采用以手术为主的
细胞。近年来通过抑制血管生成的抗肿瘤药物因具有抗瘤谱广、毒副作用小、没有抗药性等优点而受到人们的重视。但血管生成抑制剂只限制肿瘤组织中的血管生成，并不直接促进肿瘤细胞凋亡，用药
后肿瘤细胞因得不到血液供应而退回到原初状态，
综合治疗，包括放射治疗、化疗等，手术、放疗和化疗难以彻底消灭肿瘤细胞，同时又损伤正常组织和
Ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎ
王淑静等：肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
７３
潜伏下来，停药后这些肿瘤细胞还会重新生长。因此研究、开发直接抑制肿瘤细胞生长的治疗肝癌药物具有重要意义。肿瘤抑素１９肽被发现具有直接抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的直接抗肿瘤特性，因其具有分子量小，可溶性高，副作用低，使用安全而受到关注。
文献报道，１９肽对黑色素瘤细胞具有强抑制作用，可能与其一ＳＮＳ一序列有关【６】。此序列是抑制黑色素瘤细胞粘附和增生所必需的。我们在以往的实验中证实了肿瘤抑素１９肽对黑色素瘤作用的敏感性【５】，但其是否对其它肿瘤细胞有作用，对肿瘤细胞作用有无特异性ｒ７１，文献上还没有明确的报导，迄今为止，国内外研究也没有具体报道其对肝癌细胞影响，为此，我们设计了体内外实验来初步研究其对肝癌的治疗作用。
ＭＴＴ法和细胞生长曲线法分别检测同一时间、不同浓度的１９肽和同一浓度、在不同时间１９肽对肝癌细胞增殖抑制作用的整体趋势。结果显示随着１９肽浓度的增加，肝癌细胞的存活率下降，表现为剂量依赖性，与空白对照组比较均有明显差异。当１９肽浓度为４４［ｔｇ／ｍＬ时，肝癌细胞的生长在加药后逐渐被抑制，大约２—３ｄ，细胞就无法计数，结果与我们曾经做过的１９肽对黑色素瘤细胞抑制作用较为接近，可初步说明肿瘤抑素１９肽对肝癌细胞和黑色素瘤细胞的增殖都具有较强的抑制作用。ＴＵＮＥＬ试验、电镜、流式的细胞周期试验都说明了１９肽促人肝癌细胞凋亡作用较明显，通过电子显微镜观察，肿瘤抑素作用后肝癌细胞凋亡崩解，核偏于一侧，细胞体积缩小，核内染色质形成颗粒状，部分细胞质膜含有细胞器脱落，内膜结构不清，证明细胞以凋亡为主。流式细胞仪细胞周期结果和ＴＵＮＥＬ实验也证明１９肽对肝癌细胞具有明显的抑制生长和促凋亡作用，并引起肝癌细胞一定程度的Ｇ０／Ｇ１期阻滞。同时，体内试验也证实了１９肽对肝癌的抑制作用，１９肽属于内源性的小分子多肽，序列保守，人鼠间相同，我们选用小鼠腹水转移性肝
癌实体瘤模型进行动物体内的抑瘤实验，１９肽对小鼠的腹水转移性肝癌抑瘤作用明显，抑瘤率可达４８．４６％，病理切片上可见肝癌组织内细胞大量坏死，与体外试验结果相一致。
这些结果进一步说明１９肽对非黑色素瘤细胞．肝癌细胞具有抑制作用，它可通过抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡达到治疗肝癌的目的。同时也说明其对肿瘤治疗具有一定的广谱性，这将对今后１９肽的开发应用和肿瘤的治疗具有重要意义。
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肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
作者：作者单位：
王淑静， 刘兴汉， 季宇彬， 陈宁， Shujing Wang， Xinghan Liu， Yubin Ji， Ning Chen
王淑静,Shujing Wang(哈尔滨商业大学药物研究所,哈尔滨,150076;东北农业大学兽医学博士后流动站,哈尔滨,150030;哈尔滨商业大学药学院,哈尔滨,150076)， 刘兴汉,XinghanLiu(黑龙江省生物医药工程重点实验室一省部共建国家重点实验室培育基地,哈尔滨
,150081) ， 季宇彬,Yubin Ji(哈尔滨商业大学药物研究所,哈尔滨,150076)， 陈宁,NingChen(哈尔滨商业大学药学院,哈尔滨,150076)生物工程学报
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY2008,24(1)2次
刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_swgcxb200801011.aspx
生物工程学报
ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎｃｊｂ＠ｉｍ．ａｃ．ｃｎ
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ＩＳＳＮ１０００－３０６１
０２００８ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＡＳ＆ＣＳＭ，Ａｌｌｒｉｇｈｔｓｒｅｓｅｒｖｅｄ．
肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
王淑静１，２，３，刘兴汉４，季宇彬１，陈宁３
１哈尔滨商业大学药物研究所，哈尔滨１５００７６２东北农业大学兽医学博士后流动站。哈尔滨１５００３０３哈尔滨商业大学药学院，哈尔滨１５００７６
４黑龙江省生物医药工程重点实验室一省部共建国家重点实验室培育基地，哈尔滨
１５００８１
摘要：肿瘤抑素抗肿瘤相关肽．１９肽是由肿瘤抑素１８５—２０３位氨基酸组成，具有直接抑制黑色素瘤细胞生长作用，但其对肝癌细胞增殖和凋亡是否有影响，对肝癌是否具有治疗作用还需进一步研究。本研究中采用基因工程技术将合成１９肽基因与载体ｐＴＹＢ２重组后进行蛋白表达、纯化获得１９肽。通过ＭＴＴ法、生长曲线观察１９肽对人肝癌细胞生长抑制作用：ＴＵＮＥＬ标记法．流式细胞仪细胞周期检测法，透射电镜观察１９肽对肝癌细胞凋亡的影响；小鼠Ｈ２２腹水型转移型肝癌实体瘤抑瘤实验证明其体内的抑瘤作用。ＭＴＴ实验和生长曲线实验表明随着１９肽浓度的增加肝癌细胞的存活率下降。在相同１９肽浓度下，随着作用时间延长存活细胞逐渐减少．电镜观察治疗组细胞出现明显凋亡，流式细
胞仪可检测到前Ｇ１峰，ＴＵＮＥＬ标记法也证实治疗组可见明显的凋亡细胞，体内１９肽作用的小鼠Ｈ２２腹水型转移型肝
癌的抑瘤率达４８．４６％．可见，肿瘤抑素１９肽可抑制肝癌细胞生长，促进肝癌细胞凋亡，对肝癌具有一定的治疗作用．关键词：肿瘤抑素，细胞增殖，细胞凋亡，肿瘤治疗
ＥｆｆｅｃｔｏｆＴｕｍｓｔａｔｉｎＡｎｔｉ－ｔｕｍｏｒＰｅｐｔｉｄｅＡｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＨｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａＣｅｌｌ
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３Ｐｋｒ’Ｍｃｏｌｏｇｉｃ口ｔ
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Ｋｅｙ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ
１５００７６，Ｃｈｉｎａ
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劭ｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｂａｓｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ１９ｐｅｐｆｉｄｅｗｅｒｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄａｎｄｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｖｅｃｔｏｒｐＴＹＢ２．Ａｆｔｅｒｂｅｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｅｄｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙ３－【４，
５・ｄｉｍｅｈｙｌ一２一ｔｈｉａｚｏｌｙｌ］一２，５・ｄｉｐｈｅｎｙｌ一２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）ａｓｓａｙａｎｄｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅ．ＴｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｅｘＷａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｕｓｉｎｇＴｄＴ－ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ），ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅＯ＇ＥＭ）．Ｉｔｓａｎｄ—ｔｕｍｏｒ
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ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ
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ｏｎ
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ＷａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｉｎＨ２２ａｓｃｉｔｉｃｆｌｕｉｄｔｒａｎｓｆｅｖｅｎｔｈｅｐａｔｏｃａｒｅｉｎｏｍａｏｆｍｉｃｅ．３－【４，５－ｄｉｍｅｈｙｌ一２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ］－２，５－ｄｉ—
Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：Ｍａｘｃｈ２６，２００７；Ａｃｃｅｐｔｅｄ：Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ１７，２００７．ＳｕｐｐｏＳｅｄｂｙ：ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ
ｔｈｅＲｅｓｅａｒｃｈ
ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｎｏ．３０４７２０３５）．Ｎａｔｕｒａｌ
ＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆ１５１１
ＨｅｉｌｏｎｇｉｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（Ｎｏ．ＴＤ２００５—２１）ａｎｄ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
１０４）．ｐｒｏｊｅｃｔＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（Ｎｏ．１
ａｕｔｈｏｒ：ＳｈｕｊｉｎｇＷａｎｇ．Ｔｅｌ：＋８６—４５１—８４８３８２０７；Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｉｓｓｗｓｊ＠１６３．ｃｏｍ
ｆｒｏｍＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎｏｆ
国家自然基金资助项目（Ｎｏ．３０４７２０３５），黑龙江省自然科学基金资助项目（Ｎｏ．ＴＤ２００５—２１）。黑龙江省教育厅自然基金资助项目（Ｎｏ．１１５１１１０４）．
王淑静等：肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
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ｓＰＡ：ｎ
ａｐｐｅａｒａｎｃｅ
ｏｆｓｕｂ—Ｇ１ｐｈａｓｅ
ａｎｄｄｙｅｄ
ｂｙ
ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ
ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＴＥＭ），ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＴｄＴ－ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ
ａ
（ＴＵＮＥＬ），Ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ｒａｔｅ
ｏｆｍｏｕｓｅＨ２２ａｓｃｉｔｉｃｆｌｕｉｄｔｒａｎｓｆｅｖｅｎｔｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｇｒｏｗｔｈｗａｓ４８．４６％．Ａｓ
ｗｈｏｌｅ，１９ｐｅｐｔｉｄｅ
ｃｏｕｌｄｄｉｒｅｃｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｕｍｓｔａｆｉｎ，ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ。ｔｕｍｏｒｔｈｅｒａｐｙ
肿瘤抑素（Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ）是胶原蛋白ＩＶａ３链的非胶原区，８０年代作为肺．肾出血综合症的自身抗原被发现【¨。２０００年，Ｋａｍｐｈａｕｓ及其同伴发现它有两个不同的抗肿瘤活性区，执行直接和间接的抗肿瘤作用１２Ｊ。一个是具有直接抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡作用的靠近Ｃ端的１８５．２０３位氨基酸所组成的１９肽，另一个是具有抑制肿瘤血管生成、发挥间接抗肿瘤作用的接近Ｎ端７４—９８位氨基酸所组成的Ｔ７肽（２５肽）。目前，对于肿瘤抑素抗血管生成活性研究比较多，而对于其直接抗肿瘤活性研究较少，其直接抗肿瘤机制还不明确。另外，肿瘤抑素虽然具有较强的抗肿瘤活性，但肿瘤抑素因其分子量较大（２８ｋＤ），含有肺．肾出血综合征的自身抗原，提取较为困难并对机体具有副作用而影响其进一步的研究应用。再者，１９肽虽然具有直接抗肿瘤作用，但影响功能的发挥【３】。因此，为了获得分子量小，可溶一步明确其抗肿瘤作用机制。我们采用基因工程技术获得了肿瘤抑素１９肽，通过体内外实验研究其对肝癌细胞生长和凋亡的影响，这将对肝癌等肿瘤的临床治疗具有重要意义。１
材料和方法
Ｉ．Ｉ材料
Ｉ．Ｉ．１菌种翻暖粒
大肠杆菌ＪＭｌ０９和ＢＬ一２１（ＤＥ３）购自Ｐｒｏｍｅｇａ１．１。２细胞和动物
小鼠Ｈ２２肝癌细胞由哈尔滨医科大学免疫教研室提供：人肝癌细胞由哈尔滨医科大学组胚教研室限制性内切酶Ｎｄｅ
Ｉ、ＳｍａＩ、Ｘｈｏ
Ｉ、几丁质亲
和层析树脂购自ＮＥＢ公司；ＲＰＭｌｌ６４０细胞培养基、胰酶购自Ｓｉｇｍａ公司；胎牛血清购自灏洋生物公司；ＴＵＮＥＬ试剂盒购自武汉博士德生物公司。１．２方法
、。２．１
１９呔基因Ｉ程菌的构建以及表达．纯化根据肿瘤抑素１８５—２０３位氨基酸所对应的碱基
序列，采用大肠杆菌偏爱密码子，设计合成肿瘤抑素１９肽的碱基序列。将合成的１９肽基因磷酸化、退火成为双链后与载体ｐＴＹＢ２进行重组转化到大肠杆菌ＢＬ．２１（ＤＥ３）中，０，１
ｍｍｏｌ／Ｌ
ＩＰＴＧ，２８℃诱导表
达６ｈ后，取菌体沉淀进行裂解、超声后用几丁质亲和层析柱进行１９肽的纯化，具体方法参照以往发表的文献１４，５１。１９肽碱基序列如下：
５’！鱼匹鱼ＧＣＴＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣ１：ＩＡＧＡＡＴＧＴ
ＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＣＡＡＡＣＴＣＣ３
７
３’ＡＣＣＧＡＴＣＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡ
ＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＣＡＣＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧ５’１．２。２
ＭＴＴ眈色实验
取经过１６４０培养基培养的生长状态良好的人
肝癌细胞，０．２５％胰酶溶液消化，制备细胞悬液，用细胞计数板调整细胞浓度为５×１０４个／ｍＬ，每孔１００“Ｌ加入９６孔板，待细胞培养２４ｈ贴壁后加入不
同浓度１９肽，每个浓度设定６个复孔。对照组加入同等体积的ＰＢＳ。１９肽终浓度梯度为：０峙／ｍＬ，４４
ｌｌｇ／ｍＬ，８８
Ｉ．ｔｇ／ｍＬ，１３２Ｉｔｇ／ｍＬ，１７６
１１９／ｍＬ，２２０
Ｉ．ｔｇ／ｍＬ。培养４８ｈ后。于每孔加入５
ｍｇ／ｍＬＭＴＦ２０
ｐＬ，４
ｈ后弃培养液，加入１００止，ＤＭＳＯ，培养板振
荡１０～２０ｍｉｎ。空白对照调零，选择４９０ｌｌｍ波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值（Ａ值），绘制１９肽浓度与细胞存活率曲线图。细胞存活率＝实验组吸光值，对照组吸光值Ｘ１００％。
１．２．３生长曲线
取生长状态良好的人肝癌细胞，采用常规方法
Ｊｏｕｍａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎ
作为肿瘤抑素整体的一部分时，并不显示抗肿瘤活性，可能是此活性区域被掩盖，阻碍与受体结合，性高，提取方便，使用安全的直接抗肿瘤活性肽，进公司，ｐＴＹＢ２载体购自ＮＥＢ公司。提供。昆明小鼠购自哈尔滨医科大学附属三院。、．１．３试韵及试剂盒
７０
ＩＳＳＮｌ０００－３０６１ＣＮｌｌ－１９９８／（２
消化细胞，调整细胞浓度至５×１０４个／ｍＬ。在２４孔板各孔中准确接种４００ＩｌＬ细胞悬液，继续培养
２４
ｈ。吸弃培养液，向各孔重新加入４００ＩｌＬ培养液。
１９肽组各孔加入终浓度为４４ｐｇ／ｍＬ的１９肽。对照组各：ｆＬａｉｌ入同等体积的ＰＢＳ。每天每组各取３孔，充分消化后，经台盘蓝染色，细胞计数板计数，测出每孔细胞浓度，求出平均值，持续６ｄ。绘制细胞浓度．时间曲线。
１．２，４
凋亡细跑露位末端标记试验ｑＵＮＥＵ
取生长状态良好的人肝癌细胞，采用一般方法消化细胞，制备成细胞悬液。计数，调整其浓度至５ｘ１０４个／ｎｉＬ。将处理好的盖玻片放入６孔板各孔中。在６孔板各孔中准确接种１ｍＬ细胞悬液，培养２４ｈ。１９肽组各孔加入终浓度为４４Ｉ．ｔｇ／ｍＬ的１９肽，对照组各孔加入同等体积的ＰＢＳ，继续培养２４ｈ。上述片子经空气干燥后，用新制备的４％多聚甲醛溶液固定２０－３０ｍｉｎ。内源性过氧化物酶阻断和细胞通透后，加５０“ＬＴＵＮＥＬ反应混合液标记，荧光显微镜下分析结果。然后再加入５０¨Ｌ的转化剂ＰＤＢ和
５０－１００ＩｌＬ
ＤＡＢ底物溶液，冲洗，封片，在光镜下分
析结果。同时可在光镜下随机取１０个视野进行凋亡细胞计数，得到细胞凋亡率。
１．２。５
流式细瞻仪细咆圈期试验
取培养状态良好的人肝癌细胞，调整细胞浓度
至２ｘ１０５个／ｍＬ。分两组，对照组加入ＰＢＳ，实验组加入１９肽使之终浓度为４４Ｉ．ｔｇ／ｍＬ。３７℃培养２４
ｈ
后，将正常组和实验组细胞用ＰＢＳ洗２次，去除坏死细胞和凋亡细胞碎片，０．２５％的胰酶消化，制成单细胞悬液，１０００ｇ离心１０ｍｉｎ，弃上清，ＰＢＳ洗２次。每管加入１—１．５ｍＬＴ０％的冰乙醇，每个样品的细胞浓度至少为０．５ｘ１０６１．０ｘ１０６个／ｍＬ，轻轻混匀，使之呈单细胞悬液，４＂Ｃ固定２４ｈ。用ＣｙｃｌｅＴＥＳＴＴＭ
ＰＬＵＳＤＮＡＲｅａｇｅｎｔ
Ｋｉｔ进行流式细胞仪检测细胞在
不同周期的细胞数。１．２。６透射电镜观察
．
取对数生长期人肝癌细胞，调整细胞浓度至
２ｘ
１０５个／ｍＬ。分两组，对照组加入ＰＢＳ，实验组加
入１９肽使之终浓度为４４Ｉ．ｔｇ／ｍＬ。培养２４ｈ。０．２５％
胰酶消化，１５００
ｇ，１５
ｍｉｎ离心，弃上清，ＰＢＳ冲洗，
４℃戊二醛固定２４ｈ，经过包埋、固定、制成超薄
Ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎ
Ｊａｎｕａｒｙ２５，２００８
Ｖ０１．２４ＮＯ．１
切片（５０—８０ｎｍ）后进行透射电镜观察。
、２＾
动物活性检溺
将建立的小鼠腹水型转移型肝癌模型体重在
１８—２２
ｇ的２４只雄性昆明小鼠随机分成２组：对照
组，１９肽组。待到小鼠皮下可触及到皮下结节时开始给药。对照组：１００ＩｌＬ生理盐水；１９肽组：４．８８ｐｇ，ｋｇ的１９肽，每日注射１次，连续给药７ｄ后，将小鼠处死，称其瘤重并进行统计学分析。同时将小鼠肿瘤切成组织块、经固定、包埋、切片、Ｈ．Ｅ染色后，显微镜观察，进行病理分析。２
结果
２．１
１９肽获得
１９肽基因与载体ｐＴＹＢ２重组后经酶切验证和
基因测序后，结果与设计的完全一致，１９肽重组质粒在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行诱导表达、几丁质亲和层析柱亲和层析后，就可得到１９肽，经高效液相检测纯度可达９０％以上。具体结果参照以往文献报道Ｉ
５１。
２．２细胞活性检测
２．２．１
ＭＴＴ眈色实验
ＭＴＴ实验结果表明（图１），根据存活率一浓度
曲线，１９肽对人肝癌细胞生长具有抑制作用，随着１９肽浓度的增加，肝癌细胞存活率明显下降，表现为剂量依赖性。不同１９肽浓度与细胞对照组相比。差异均有显著性意义（Ｐ＜０．０５）。
ｌ４
ｌ２
ｌＯ
Ｏ８Ｏ６Ｏ４Ｏ２
０
０
０．０４４
０．０８８０．１３２０．ｔ７６０．２２
１９
ｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（Ｉｔｇ／ｇＬ）
图１
１９肽对人肝癌细胞生长的抑制作用
Ｆｉｇ．１
Ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆ１９ｐｅｐｔｉｄｅＯｉｌ
ｈｕｍａｎ
ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｌｎｏｍａｃｅｌｌ
乇淑静等：肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
７１
２．２．２生长／／／／线
与对照组相比，１９肽对人肝癌细胞有抑制作用，随着１９肽对肝癌细胞作用时问的增加，其细胞浓度明显降低，细胞生长抑制明显，存在时间依赖性，肝癌细胞在１９肽用药后的第ｉ天细胞密度接近０，无法计数（图２）。
２２３
细胞凋亡原位末端标记检灏
正常肝细胞呈淡蓝色圆形，１９肽作用后的肝癌
细胞经ＴＵＮＥＬ染色有大量凋亡细胞存在，荧光显微镜下实验组有大量的强荧光，光镜下实验组百ｒ见一些细胞的周围出现类似凋亡小体的凸起小泡，细胞形态变化较明显，部分细胞裂解。光镜下随机取１０个视野进行凋亡细胞计数，细胞凋亡率可达
３３．９％±３．４８％（图３）。
如加
ｍ一３【×一
０砷
２。２。４
流式细胞仪细瞧圈朝检溺
流式细胞仪细胞周期检测发现１９肽作用的肝癌
一
细胞在Ｇ１期前有一凋亡峰，细胞凋亡率为１０．０７％±１．７５％。与对照组比较其ＧＯ．Ｇ１、Ｇ２．Ｍ期细胞所占的比例明显增多，而Ｓ期细胞数量减少（尸＜０．０５）。
图２人肝癌细胞生长曲线
进一步证明１９肽可引起肝癌细胞Ｇ０／Ｇ１阻滞。具有抑制肝癌细胞的分裂增殖。促进肝癌细胞凋亡的作用。
Ｆｉｇ．２
Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈ
ｃｕｒｖｅ
ｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌ
图３
Ｆｉｇ．３
凋亡细胞原位末端标记法观察人肝癌细胞形态改变
ｃｅｌｌ
ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｕｓｉｎｇＴＵＥＮＥＬａｓｓａｙ
（Ａ）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；（Ｂ）Ｃｏｎｔｒｏｌｕｎｄｅｒｏｐｔｉｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；（ｃ）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｕｎｄｅｒｏｐｔｉｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
图４
Ｆｉｇ．４
流式细胞仪细胞周期实验检测１９肽对肝癌细胞周期的影响
ｏｎ
Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ１９ｐｅｐｔｉｄｅｃｅｌｌｃｉｒｃｌｅｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｕｓｉｎｇＦＡＣ
Ｊｏｕｍａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎ
７２ＩＳＳＮｌ０００－３０６１ＣＮｌｌ－１９９８／ＱＣｈｉｎＪＢｉｏｔｅｃｈ
Ｊａｎｕａｗ２５．２００８
Ｖ０１．２４
Ｎｏ．１
２．２。５
透射电镜细魄形态学观察
电镜观察结果显示人肝癌细胞对照组的细胞呈
２．３动物活性检测
ｔ。３．１
小鼠盹瘤抑翩实验
用药后对照组与１９肽组小鼠肿瘤继续生长，但
圆形或多边形，绒毛丰富，核仁明显，细胞核表面有切际，核周细胞器发达。１９肽组细胞大小不一，形态不规则，坏死和凋亡细胞数量明显增多，凋亡细胞核崩解，核内染色质形成颗粒状，核膜清晰，部分细胞质膜含有细胞器脱落，内膜结构不清，细胞呈现凋亡状态。
１９肽组肿瘤明显小于对照组。经ｔ检验，１９肽组与对照组比较差异显著，Ｐ＜０．０５。抑瘤率可达４８．４６％（表１）。
１３２
小鼠肿瘤病理组织切片ｂ２Ｑ、
对照组肝癌细胞长势良好，组织无坏死。１９肽组
肿瘤组织出现大量坏死（图６）。
图５透射电镜检测肝癌细胞形态结构
Ｆｉｇ．５
ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｕｓｉｎｇＴＥＭ
表１
Ｔａｂｌｅ１
１９肽对Ｈ２２小鼠腹水转移性肝癌的影响
ｏｆ
Ｅｆｆｅｃｔｏｆ１９ｐｅｐｔｉｄｅｏｎＨ２２ａｓｃｉｔｉｃｆｌｕｉｄｔｒａｎｓｆｅｖｅｎｔｈｅｐａｔｏｍａ
ｍｉｃｅ
ｇｒｏｗｔｈ（牙！ｓ，脬＝１２）
图６
Ｆｉｇ．６
１９肽对小鼠腹水型转移性肝癌中癌组织的影响
ｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｉｎｍｕｒｉｎｅＨ２２ａｓｃｉｔｉｅｆｌｕｉｄｔｒａｎｓｆｅｖｅｎｔｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ
Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ１９ｐｅｐｔｉｄｅｏｎ
３
分析与讨论
目前，原发性肝癌的治疗仍采用以手术为主的
细胞。近年来通过抑制血管生成的抗肿瘤药物因具有抗瘤谱广、毒副作用小、没有抗药性等优点而受到人们的重视。但血管生成抑制剂只限制肿瘤组织中的血管生成，并不直接促进肿瘤细胞凋亡，用药
后肿瘤细胞因得不到血液供应而退回到原初状态，
综合治疗，包括放射治疗、化疗等，手术、放疗和化疗难以彻底消灭肿瘤细胞，同时又损伤正常组织和
Ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎ
王淑静等：肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
７３
潜伏下来，停药后这些肿瘤细胞还会重新生长。因此研究、开发直接抑制肿瘤细胞生长的治疗肝癌药物具有重要意义。肿瘤抑素１９肽被发现具有直接抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的直接抗肿瘤特性，因其具有分子量小，可溶性高，副作用低，使用安全而受到关注。
文献报道，１９肽对黑色素瘤细胞具有强抑制作用，可能与其一ＳＮＳ一序列有关【６】。此序列是抑制黑色素瘤细胞粘附和增生所必需的。我们在以往的实验中证实了肿瘤抑素１９肽对黑色素瘤作用的敏感性【５】，但其是否对其它肿瘤细胞有作用，对肿瘤细胞作用有无特异性ｒ７１，文献上还没有明确的报导，迄今为止，国内外研究也没有具体报道其对肝癌细胞影响，为此，我们设计了体内外实验来初步研究其对肝癌的治疗作用。
ＭＴＴ法和细胞生长曲线法分别检测同一时间、不同浓度的１９肽和同一浓度、在不同时间１９肽对肝癌细胞增殖抑制作用的整体趋势。结果显示随着１９肽浓度的增加，肝癌细胞的存活率下降，表现为剂量依赖性，与空白对照组比较均有明显差异。当１９肽浓度为４４［ｔｇ／ｍＬ时，肝癌细胞的生长在加药后逐渐被抑制，大约２—３ｄ，细胞就无法计数，结果与我们曾经做过的１９肽对黑色素瘤细胞抑制作用较为接近，可初步说明肿瘤抑素１９肽对肝癌细胞和黑色素瘤细胞的增殖都具有较强的抑制作用。ＴＵＮＥＬ试验、电镜、流式的细胞周期试验都说明了１９肽促人肝癌细胞凋亡作用较明显，通过电子显微镜观察，肿瘤抑素作用后肝癌细胞凋亡崩解，核偏于一侧，细胞体积缩小，核内染色质形成颗粒状，部分细胞质膜含有细胞器脱落，内膜结构不清，证明细胞以凋亡为主。流式细胞仪细胞周期结果和ＴＵＮＥＬ实验也证明１９肽对肝癌细胞具有明显的抑制生长和促凋亡作用，并引起肝癌细胞一定程度的Ｇ０／Ｇ１期阻滞。同时，体内试验也证实了１９肽对肝癌的抑制作用，１９肽属于内源性的小分子多肽，序列保守，人鼠间相同，我们选用小鼠腹水转移性肝
癌实体瘤模型进行动物体内的抑瘤实验，１９肽对小鼠的腹水转移性肝癌抑瘤作用明显，抑瘤率可达４８．４６％，病理切片上可见肝癌组织内细胞大量坏死，与体外试验结果相一致。
这些结果进一步说明１９肽对非黑色素瘤细胞．肝癌细胞具有抑制作用，它可通过抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡达到治疗肝癌的目的。同时也说明其对肿瘤治疗具有一定的广谱性，这将对今后１９肽的开发应用和肿瘤的治疗具有重要意义。
ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ【１】ＳａｎｓＪ，Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ
Ｊ，ＬａｎｇｅｖｅｌｄＪ
Ｐ，甜ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
ｔｈｅ
ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ
ａｎｔｉｇｅｎ
ａｓ
ｔｈｅａｌｐｈａ
３（ＩＶ）ｃｈａｉｎｏｆｃｏｌｌａ－
ｇｅｎＩＶ．．，Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ。１９８８。２６３（２６）：１３３７４－１３３８０．
【２】ＭａｅｓｈｉｍａＹ＇ＣｏｌｏｒａｄｏＰＣ，ＴｏｒｒｅＡ，ｅｔａ１．Ｄｉｓｔｉｎｃｔａｎｔｉ－
ｔｕｍｏｒｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ
ａ
ｔｙｐｅＩＶｃｏｌｌａｇｅｎｄｏｍａｉｎｄｅｒｉｖｅｄ
ｆｒｏｍｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅ．．，ＢｉｏｌＣｈｅｍ。２０００。２７５（２８）：
２１３４０－２１３４８．
【３】ＦｌｏｑｕｅｔＮ，ＰａｓｃｏＳ，ＲａｍｏｎｔＬ，ｅｔａｌ—Ｔｈｅａｎｔｉｔｕｍｏｒ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅａｌｐｈａ３（ＩＶ）・－（１８５・・２０３）ｐｅｐｔｉｄｅｆｒｏｍｔｈｅ
ＮＣＩｄｏｍａｉｎｏｆｔｙｐｅＩＶｃｏｌｌａｇｅｎ（ｔｕｍｓｔａｔｉｎ）ａｒｅｃｏｎｆｏｒ－ｍａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．ＪＢｉｏｌ
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ｏｎ
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ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｓｔｉｎｃｔ
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【７】ＭａｅｓｈｉｍａＹ’ＹｅｒｒａｍａｌｌａＵＬ，ＤｈａｎａｂａｌＭ，ｅｔａ１．Ｅｘ—
ｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ—ｄｅｒｉｖｅｄｐｅｐｔｉｄｅｂｉｎｄｓｔｏａｌｐｈａ（ｖ）ｂｅｔａ（３）
ｉｎｔｅｇｒｉｎ
ａｎｄ
ｉｎｈｉｂｉｔｓ
ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ
ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００１，
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肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
作者：作者单位：
王淑静， 刘兴汉， 季宇彬， 陈宁， Shujing Wang， Xinghan Liu， Yubin Ji， Ning Chen
王淑静,Shujing Wang(哈尔滨商业大学药物研究所,哈尔滨,150076;东北农业大学兽医学博士后流动站,哈尔滨,150030;哈尔滨商业大学药学院,哈尔滨,150076)， 刘兴汉,XinghanLiu(黑龙江省生物医药工程重点实验室一省部共建国家重点实验室培育基地,哈尔滨
,150081) ， 季宇彬,Yubin Ji(哈尔滨商业大学药物研究所,哈尔滨,150076)， 陈宁,NingChen(哈尔滨商业大学药学院,哈尔滨,150076)生物工程学报
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY2008,24(1)2次
刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_swgcxb200801011.aspx