胃蛋白酶分离纯化技术研究进展

ChinaFoodAdditives

胃蛋白酶分离纯化技术研究进展

王莹,张丽萍

(黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆　163319)

　　摘　要:本文阐述了以胃黏膜为原料生产胃蛋白酶的多种先进分离纯化技术和方法,分析比较了不同技术方法的特点,根据不同方法和特点,提出了进一步的技术研究思考。

关键词:胃蛋白酶;激活;纯化

中图分类号:Q53917　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-2513(2008)01-0110-04

Progressinseparationandpurification

technologyofsiWYg

(JiangAugustFirstLandReclamation

University,Daqing　163319)

Abstract:Reviewedtheseparationandpurificationofpepsinfromgastricmucosa.Andthepossibletechnologyarementionedaccordingtothemethodandthecharacteristicwhichiscomparedintheessay.Keywords:pepsin;activity;purified

胃蛋白酶(pepsin)属于天冬氨酸蛋白水解酶类,是胃消化蛋白水解酶,相对分子量为

3136KD

[1]

1　胃蛋白酶的分离技术

目前国内对胃蛋白酶的分离技术主要是应用有机溶剂提取法、盐析法、或底物亲和法进行粗分离后,得到混合的胃酶(包括胃蛋白酶A、B、C、D),但应用到生产中的只有有机溶剂提取法和盐析法。国外则对此研究较早,主要集中在20世纪六七十年代,经盐析得到了商业结晶胃蛋白酶。111　有机溶剂沉淀法

有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩,通常使用的有机溶剂有乙醇和丙酮。此种方法是利用生化物质在不同浓度的有机溶剂中溶解

[3]

度的差异而实现分离的。

,其前体是胃蛋白酶原,胃蛋白酶原在成

年脊椎动物胃黏膜中合成,由胃主细胞分泌,在胃液的酸性条件下转换成胃蛋白酶。不同动物来源的胃蛋白酶含量多少主要依动物的食性而改变:草食性动物>肉食和杂食性动物,最低是反刍类动物。胃蛋白酶被作为优良的消化药广泛应用,主要剂型有含糖胃蛋白酶、胃蛋白酶片、与胰酶和淀粉酶配伍制成多酶片。在工业上,胃蛋白酶广泛应用于方便食品,如奶酪、口香糖的加工。近年来,该酶在啤酒、果酒等澄清方面也显示了应用潜力

[2]

。

收稿日期:2007-10-10

作者简介:王莹(1981-),女,在读硕士,研究方向:畜产品加工。

110

ChinaFoodAdditives

1955年美国专利(2,701,228)记载了有

过程中加入一定量的有机溶剂,减少硫酸铵的用量,将是今后工艺改进的重点。

胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法,其主要目的是将酶液进行浓缩、除盐及小分子物质。此法常配合盐析使用,以缩短提取时间113　底物亲和法

[5]

机溶剂法提取胃酶和胃酶素的联产工艺方法。其

方法的核心主要是将胃黏膜用酸性溶液浸提后加入乙醇或丙酮,使其比重达01

940196先沉淀胃膜素,继续加入乙醇或丙酮,使其比重达01

890191沉淀胃蛋白酶。此法生产的粗胃蛋白酶活力为10000倍,得率为218%310%。

我国生产胃蛋白酶的主要工艺是应用有机溶剂沉淀法,得到的是混合的胃酶。此法的特点是有机溶剂的分辨力相对较高,溶剂易于除去回收,但反复萃取会增加溶剂消耗,也会造成酶部分失活,影响得率。112　盐析法

蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度,以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液,。同时,发生改变,,更加导使蛋白质分子之间聚集而沉[4]

淀。

美国专利(2,701,228)改进后,用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇(或酮)在50%55%、pH在51

0512时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀,沉淀物为胃酶的锌盐,然后用金属鳌合剂除去锌盐,得

1500016000倍活力的胃酶,收得率为510%515%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。

赵永芳(1993)等人将用pH713的磷酸盐缓冲溶液浸提的猪胃黏膜匀浆、过滤后,将滤液用10%80%的硫酸氨分级盐析,低温离心收集沉

[5、6]

淀,溶解后激活为胃蛋白酶。张继平(2004)在分离暗纹东方纯胃蛋白酶时,预先用5mL匀浆液体测定硫酸铵盐析曲线,而且采用在匀浆液中加入1%的无水乙醇,然后选择20%40%硫酸

[7]

铵进行沉淀,经透析、离心后获得粗酶制剂。

盐析法最大程度地保留了胃蛋白酶的活性,如再加入有机溶剂配合使用,较单独使用盐析得到的胃蛋白酶的活力要高,回收率大。但实际生产中此方法还未见报道。盐析过程带来的盐离子越多,会给后续工艺除盐带来障碍,所以在盐析

。

底物亲合法是利用酶(胃蛋白酶)与其底物(酪蛋白)的亲和性,从胃黏膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH215的乳酸缓冲液中充分结合,然后调pH至410(底物的等电点)沉淀底物和酶的结合物,随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中,添加低浓度的SDS将底物和酶分离,得到酶-SDS复合物,再进一步分离纯化。陈躬端(2001),,为后续的纯,同[9]

。

2　胃蛋白酶的纯化技术

为了满足工业、制药或科研的需要,初分离的胃蛋白酶(主要是胃蛋白酶A、B、C、D及杂蛋白和小分子物质)要通过凝胶过滤、层析进行纯化。211　凝胶过滤

凝胶过滤主要是利用凝胶的多孔性,当样品溶液通过凝胶柱时相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔,而只是沿着凝胶颗粒的孔隙随着溶剂首先流出层析柱

[10]

。

美国在20世纪60年代研究结晶为蛋白酶的生产工艺时,是将75mg的胃蛋白酶原样本溶解在8mL的蒸馏水中(pH51

0610),在14℃±1℃,pH210下,保持20min激活(胃蛋白酶原在

此pH时自动转化为胃蛋白酶的过程)。然后用磺乙基SephadexG-25柱层析,最后用羟基磷灰石进行色谱层析。结果表明用层析法得到的胃蛋白酶为单一物质纯品

[5]

。

随着亲和层析技术的应用,Nevaldine和Kas2sell(1971)应用亲和层析(聚-L-赖氨酸共价

[8]

连接Sepharose4B)方法纯化了羊胃蛋白酶。此法将粗提所得固体用醋酸钠缓冲液溶解,聚-111

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L-赖氨酸亲和层析(24cm×116cm)提纯,缓

μmol/(min・mg)[7]。7113

基于以上对胃蛋白酶的分离纯化技术的比较

分析可以看出,长期以来分离提取技术一直没有取得较大的突破,用有机溶剂、盐析等技术得到的天然胃蛋白酶产品,纯度、生物活性愈将不能满足医药品和工业日益增长的需要。随着分离科学技术的不断发展,采用新型分离技术分离胃蛋白酶已势在必行。因此,笔者认为以下几种技术是胃蛋白酶分离纯化的方向。21311　有机溶剂与盐析共沉淀

冲液流速为50mL/h,收集层析后活性部分,然

后用SephadexG-100凝胶过滤,得到羊胃蛋白酶pH11

0415,20℃,24h不失活,然而猪胃蛋白酶pH715,20℃下1min就失活,40℃30s活性完全丧失。此法在分离和纯化后都用到了透析及冷冻干燥,大大缩短了提取时间。

赵永芳(1993)利用聚-L-赖氨酸-琼脂糖亲和色谱介质分离猪胃蛋白酶,得酶活为16480U。首先用pH512的0115mol/LNaCl

00101mol/L醋酸盐缓冲液将激活的胃蛋白酶溶液

透析,测定酶活性及蛋白量。将合成的亲和色谱介质装柱(115×1415cm),依次用011mol/LNaHCO3、015mol/LNaCl溶液洗涤,再用pH512的0115mol/LNaCl

00101mol/L醋酸盐缓冲液平衡柱,待基线平稳后,开始上样,控制流速为20mL/h。上样完毕后,采用梯度洗脱,pH512的0101mol/L01

15测蛋白峰,。212　离子交换法一直以来都是酶生产所常用的方法。它是一项利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术。具有简便、高效、成本低,且可自动化连续操作的优点。

陈躬瑞(2001)等人在纯化蘄蛇胃蛋白酶时将SDS沉淀后的上清液上样到预先用0105mol/L乙酸缓冲液(pH510)平衡的DEAE-TOYOPE2ARL离子交换色谱柱(416mm×100mm)上,用

0125mo1/LNaCl梯度洗脱,流速为1mL/min。

[11]

[6]

有机溶剂和盐析法都是分离纯化胃蛋白酶的

传统方法,有其各自的特点。如果将有机溶剂和盐析配合使用,不仅可以降低盐的用量,而且可,。此法,。分离膜是一种特殊的、具有选择性透过功能的薄层物质,能利用分子大小实现分离,从而起

[12]

到浓缩和分离纯化的作用。由于其可在维持原生物体系环境的条件下实现分离,并可高效地浓缩、富集产物,有效地去除杂质,加之操作简单,结构紧凑、能耗低,过程简化,无一次污染,也将成为胃蛋白酶分离纯化工艺的研究方向。21313　等电点沉淀与底物亲和法

胃蛋白酶具有极低的等电点(如猪胃蛋白pH110),但胃蛋白酶的分离纯化技术中等电点沉淀法未见报道,如果此方法可实现,那将大大缩短分离纯化的时间。底物亲和法是分离纯化胃蛋白酶的新亮点,但其工艺条件还不成熟,尤其是在分离底物和酶的复合物时,SDS的添加量有待研究。

随着生物制药技术的迅速发展,高效的胃蛋白酶分离纯化工艺、技术和设备的出现,人们必将开发出高效的胃蛋白酶提取工艺。这对于提高功能性胃蛋白酶产品、提高生产率、降低生产成本和改善人民生活水平起着举足轻重的作用。而胃蛋白酶单一组分的制备分离,可为胃蛋白酶的研究开发提供标准品,同时能为后期胃蛋白酶单一组分生理活性的研究提供必要的物质保障。

得到的酶在50℃30min有较高的活性,有望应用

[9]

于高温食品加工中。213　双重层析配合法

为了获得高活力的胃蛋白酶,还常将两种层析方法配合使用。张继平(2004)对暗纹东方鲀胃蛋白酶的纯化时,采用CM-Cellulose柱纯化(215cm×30cm),洗脱液为0105mol/LpH510柠檬酸缓冲液,

0110mol/LNaCl直线梯度洗脱,流速为0125mL/min,部分收集,每管收集约4mL,合并活力峰,再经SephadexG-75(215cm×60cm)层析柱,获得胃蛋白酶比活为112

ChinaFoodAdditives

参考文献:

[1]童耕雷.实用生物化学与分子生物学词典[M],科学出版

(24):293-295

[7]张继平,郭照良,唐冬生等.暗纹东方纯胃蛋白酶的分离纯

社,2003,9:588-589

[2]Nielsen,P.,andfoltmann,B.,PurificationandCharacteriza2

tionofPorcinePepsinogenBandPepsinB,ArchBiochemBio2phys,1995,322,417

[3]辛秀兰.生物分离与纯化技术[M],科学出版社,2005,

8:64-65

[4]郭勇.现代生化技术[M]科学出版社,2005,2:9-13[5]T.G.Rajagopalan,StanfordMoore,andWillinm.H.

BovinePepsinogenandPepsin,RiologicalChevistry.241:4940-4950

[6]赵永芳、赵涛、张拥军等.聚-L-赖氨酸-琼脂糖亲和色

Stein.J1966,

化及部分性质研究[J],湖南农业大学学报,2004(30):

526-529[8]PatrickF.

FOX,JohnR.Whitaker,

IsolationandCharacter2

izationofSheepPepsin,Biochem.J.1977,161,389-398[9]陈躬瑞、柯李晶、赵恒裕等.底物亲和法分离纯化薪蛇胃蛋

白酶[J],中国食品学报,2001(1):50-55

[10]赵永芳.生物化学技术原理及应用[M],科学出版社,

2005,2:109-112

[11]叶勤等.现代生物技术原理及其应用[M],中国轻工业出

版社,2003,8:385-387

[12]刘铮等.生物分离过程科学[M],清华大学出版社,

2004,5:125-127

谱介质的研制及应用[J],中国医药工业杂志,1993

(上接第117页)

[1],.MA

.,2005,(4):256-257[2],.双歧杆菌的研究热点.中国乳

期明显延长,培养60h以后生长才进入稳定期,其最大OD600值高达1167,此时菌体浓度约为×10个/mL。,9,提高,最大L620(mg/100mL),这相对于小瓶培养和发酵罐不流加时的乳酸浓度有显著提高。

由上述研究可见,双歧杆菌在发酵罐上的流加培养对其生长代谢具有极大的促进作用,这一实验结果为双歧杆菌以后的工业化生产提供了重要的依据,具有十分重要的意义。

,2002,(3):24-27

[3]GoldinBR,GorbachSL.

Effectofantibioticsonincidenceof

ratintestinaltumorsinducedby1,2-dimethylhydrazinedi2hydro2chloride[J].JNatlCancerInst,1981,67(4):877-880

[4]MizutaniT,MitsukaT.

Inhibitoryeffectofsomeintestinalbacte2

riaonlivertumorigenesisingnotobioticC3HPHemalemice[J].CancerLetters,1980,11(2):89-95

[5]范秀容,李广武,沈萍.微生物学实验[M].北京:高等

教育出版社,1980

(上接第151页)

参考文献:

[1]杨剑锋,刘玉敏,常广庶,等.过程能力指数Cpm与合格

7　结束语

为了正确地计算过程能力指数,避免实际应

用中的误用,本文简单地介绍了过程能力指数的发展历程。在此基础上,提出了一种简易的计算非正态过程能力指数的方法,以期对实际工作者在应用过程能力指数、对过程性能进行评估时有所借鉴和帮助。

率的关系[J].工业工程,2006,9(5):1-5

[2][5]田志友,田澎,王浣尘.非正态过程能力指数研究中

的几个问题[J].工业工程,2005,8(1):29-32,44

[3]马义中,赵逢禹.过程能力指数的若干评述.中国质量

[J],2002,(12):2024

[4],[8]郑小林,郑希俊,余忠华.基于约翰逊曲线拟合的非

正态工序能力指数估算方法[J].机械科学与技术,2002,

21(6):878-880

[6]田志友,田澎,王浣尘.非正态过程能力指数估计及抽样方

案设计[J].工业工程,2005,8(4):86-89

[7]桂云苗,朱金福,白杨.一种非正态分布数据过程能力的计

算方法[J].商业研究,2005,(17):37-39

113

ChinaFoodAdditives

胃蛋白酶分离纯化技术研究进展

王莹,张丽萍

(黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆　163319)

关键词:胃蛋白酶;激活;纯化

中图分类号:Q53917　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-2513(2008)01-0110-04

Progressinseparationandpurification

technologyofsiWYg

(JiangAugustFirstLandReclamation

University,Daqing　163319)

胃蛋白酶(pepsin)属于天冬氨酸蛋白水解酶类,是胃消化蛋白水解酶,相对分子量为

3136KD

[1]

1　胃蛋白酶的分离技术

有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩,通常使用的有机溶剂有乙醇和丙酮。此种方法是利用生化物质在不同浓度的有机溶剂中溶解

[3]

度的差异而实现分离的。

,其前体是胃蛋白酶原,胃蛋白酶原在成

[2]

。

收稿日期:2007-10-10

作者简介:王莹(1981-),女,在读硕士,研究方向:畜产品加工。

110

ChinaFoodAdditives

1955年美国专利(2,701,228)记载了有

过程中加入一定量的有机溶剂,减少硫酸铵的用量,将是今后工艺改进的重点。

胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法,其主要目的是将酶液进行浓缩、除盐及小分子物质。此法常配合盐析使用,以缩短提取时间113　底物亲和法

[5]

机溶剂法提取胃酶和胃酶素的联产工艺方法。其

方法的核心主要是将胃黏膜用酸性溶液浸提后加入乙醇或丙酮,使其比重达01

940196先沉淀胃膜素,继续加入乙醇或丙酮,使其比重达01

890191沉淀胃蛋白酶。此法生产的粗胃蛋白酶活力为10000倍,得率为218%310%。

淀。

美国专利(2,701,228)改进后,用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇(或酮)在50%55%、pH在51

0512时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀,沉淀物为胃酶的锌盐,然后用金属鳌合剂除去锌盐,得

1500016000倍活力的胃酶,收得率为510%515%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。

赵永芳(1993)等人将用pH713的磷酸盐缓冲溶液浸提的猪胃黏膜匀浆、过滤后,将滤液用10%80%的硫酸氨分级盐析,低温离心收集沉

[5、6]

[7]

铵进行沉淀,经透析、离心后获得粗酶制剂。

。

2　胃蛋白酶的纯化技术

为了满足工业、制药或科研的需要,初分离的胃蛋白酶(主要是胃蛋白酶A、B、C、D及杂蛋白和小分子物质)要通过凝胶过滤、层析进行纯化。211　凝胶过滤

[10]

。

美国在20世纪60年代研究结晶为蛋白酶的生产工艺时,是将75mg的胃蛋白酶原样本溶解在8mL的蒸馏水中(pH51

0610),在14℃±1℃,pH210下,保持20min激活(胃蛋白酶原在

此pH时自动转化为胃蛋白酶的过程)。然后用磺乙基SephadexG-25柱层析,最后用羟基磷灰石进行色谱层析。结果表明用层析法得到的胃蛋白酶为单一物质纯品

[5]

。

随着亲和层析技术的应用,Nevaldine和Kas2sell(1971)应用亲和层析(聚-L-赖氨酸共价

[8]

连接Sepharose4B)方法纯化了羊胃蛋白酶。此法将粗提所得固体用醋酸钠缓冲液溶解,聚-111

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L-赖氨酸亲和层析(24cm×116cm)提纯,缓

μmol/(min・mg)[7]。7113

基于以上对胃蛋白酶的分离纯化技术的比较

冲液流速为50mL/h,收集层析后活性部分,然

后用SephadexG-100凝胶过滤,得到羊胃蛋白酶pH11

0415,20℃,24h不失活,然而猪胃蛋白酶pH715,20℃下1min就失活,40℃30s活性完全丧失。此法在分离和纯化后都用到了透析及冷冻干燥,大大缩短了提取时间。

赵永芳(1993)利用聚-L-赖氨酸-琼脂糖亲和色谱介质分离猪胃蛋白酶,得酶活为16480U。首先用pH512的0115mol/LNaCl

00101mol/L醋酸盐缓冲液将激活的胃蛋白酶溶液

透析,测定酶活性及蛋白量。将合成的亲和色谱介质装柱(115×1415cm),依次用011mol/LNaHCO3、015mol/LNaCl溶液洗涤,再用pH512的0115mol/LNaCl

00101mol/L醋酸盐缓冲液平衡柱,待基线平稳后,开始上样,控制流速为20mL/h。上样完毕后,采用梯度洗脱,pH512的0101mol/L01

陈躬瑞(2001)等人在纯化蘄蛇胃蛋白酶时将SDS沉淀后的上清液上样到预先用0105mol/L乙酸缓冲液(pH510)平衡的DEAE-TOYOPE2ARL离子交换色谱柱(416mm×100mm)上,用

0125mo1/LNaCl梯度洗脱,流速为1mL/min。

[11]

[6]

有机溶剂和盐析法都是分离纯化胃蛋白酶的

[12]

得到的酶在50℃30min有较高的活性,有望应用

[9]

于高温食品加工中。213　双重层析配合法

0110mol/LNaCl直线梯度洗脱,流速为0125mL/min,部分收集,每管收集约4mL,合并活力峰,再经SephadexG-75(215cm×60cm)层析柱,获得胃蛋白酶比活为112

ChinaFoodAdditives

参考文献:

[1]童耕雷.实用生物化学与分子生物学词典[M],科学出版

(24):293-295

[7]张继平,郭照良,唐冬生等.暗纹东方纯胃蛋白酶的分离纯

社,2003,9:588-589

[2]Nielsen,P.,andfoltmann,B.,PurificationandCharacteriza2

tionofPorcinePepsinogenBandPepsinB,ArchBiochemBio2phys,1995,322,417

[3]辛秀兰.生物分离与纯化技术[M],科学出版社,2005,

8:64-65

[4]郭勇.现代生化技术[M]科学出版社,2005,2:9-13[5]T.G.Rajagopalan,StanfordMoore,andWillinm.H.

BovinePepsinogenandPepsin,RiologicalChevistry.241:4940-4950

[6]赵永芳、赵涛、张拥军等.聚-L-赖氨酸-琼脂糖亲和色

Stein.J1966,

化及部分性质研究[J],湖南农业大学学报,2004(30):

526-529[8]PatrickF.

FOX,JohnR.Whitaker,

IsolationandCharacter2

izationofSheepPepsin,Biochem.J.1977,161,389-398[9]陈躬瑞、柯李晶、赵恒裕等.底物亲和法分离纯化薪蛇胃蛋

白酶[J],中国食品学报,2001(1):50-55

[10]赵永芳.生物化学技术原理及应用[M],科学出版社,

2005,2:109-112

[11]叶勤等.现代生物技术原理及其应用[M],中国轻工业出

版社,2003,8:385-387

[12]刘铮等.生物分离过程科学[M],清华大学出版社,

2004,5:125-127

谱介质的研制及应用[J],中国医药工业杂志,1993

(上接第117页)

[1],.MA

.,2005,(4):256-257[2],.双歧杆菌的研究热点.中国乳

,2002,(3):24-27

[3]GoldinBR,GorbachSL.

Effectofantibioticsonincidenceof

ratintestinaltumorsinducedby1,2-dimethylhydrazinedi2hydro2chloride[J].JNatlCancerInst,1981,67(4):877-880

[4]MizutaniT,MitsukaT.

Inhibitoryeffectofsomeintestinalbacte2

riaonlivertumorigenesisingnotobioticC3HPHemalemice[J].CancerLetters,1980,11(2):89-95

[5]范秀容,李广武,沈萍.微生物学实验[M].北京:高等

教育出版社,1980

(上接第151页)

参考文献:

[1]杨剑锋,刘玉敏,常广庶,等.过程能力指数Cpm与合格

7　结束语

为了正确地计算过程能力指数,避免实际应

率的关系[J].工业工程,2006,9(5):1-5

[2][5]田志友,田澎,王浣尘.非正态过程能力指数研究中

的几个问题[J].工业工程,2005,8(1):29-32,44

[3]马义中,赵逢禹.过程能力指数的若干评述.中国质量

[J],2002,(12):2024

[4],[8]郑小林,郑希俊,余忠华.基于约翰逊曲线拟合的非

正态工序能力指数估算方法[J].机械科学与技术,2002,

21(6):878-880

[6]田志友,田澎,王浣尘.非正态过程能力指数估计及抽样方

案设计[J].工业工程,2005,8(4):86-89

[7]桂云苗,朱金福,白杨.一种非正态分布数据过程能力的计

算方法[J].商业研究,2005,(17):37-39

113

胃蛋白酶分离纯化技术研究进展

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