贵州农业科学 2000,28(5):24～25
GuizhouAgriculturalSciences
木瓜蛋白酶的生产工艺研究
乙 引1,谭爱娟2,刘 宁1,王利民1
(1.贵州师范大学生物科学技术系,贵阳550001;2.贵州大学生物技术学院食品科学系,贵阳550006) [摘 要]研究了木瓜蛋白酶生产工艺中的几个重要环节。品产量,又可保持产品质量;,对照提高2.39倍;提取过程中用抗坏血酸、EDTAN。
[关键词]木瓜蛋白酶;生产工艺;[中图分类号]S661.6;S.5[]100123601(2000)0520024202
,它能有效地分解明胶、酪蛋白、谷蛋白、弹性蛋白、球,、啤酒澄清、明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等工业,
[1]。木瓜蛋白酶的生产以番木瓜未成熟果实的新鲜乳汁为原料,但因番木瓜种植区
主要分布在经济不发达地区,所以蛋白酶生产工艺相对落后,很多地区仍采用太阳暴晒的方式生产木瓜蛋白酶。按此法生产的产品质量不稳定,多数产品达不到质量要求[2]。因此,如何改进生产工艺、提高产品质量已成为当前急需解决的课题。本文就木瓜蛋白酶生产工艺中的几个重要环节进行了研究,试图找到一个保护酶活性的新方法,为生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料 新鲜番木瓜乳汁采自贵州三都水族自治县。
1.2 木瓜蛋白酶的制备方法 方法1(烘干法):将番木瓜乳汁3000rpm离心20min,上清液于60℃烘箱中鼓风干燥,磨碎后得酶制品。方法2(丹宁沉淀法):将番木瓜乳汁3000rpm离心20min,于上清液中缓慢加入已溶解的丹宁溶液,不断搅拌,至溶液中丹宁浓度达到0.1%。静置,沉淀丹宁2酶复合物,用盐酸调pH值至3.4,3500rpm离心20min,沉淀用真空干燥,得酶制品。方法3:工艺流程同方法2。只是在番木瓜乳汁和所有溶液中均加入0.1‰EDTANa2和0.3‰NaCl。如无说明,表示酶的制备方法为方法3。
1.3 酶活性测定 酶活性测定按乙引等[3]方法进行,以酪蛋白为底物。酶活性单位:U g。
2 结果与讨论
2.1 几种分离方法对木瓜蛋白酶制备效果的影响
虽然木瓜蛋白酶是一种相对稳定的蛋白质,但由于提取工艺的不同往往导致其质量的巨大差异。由表1可知,用烘干法制备的木瓜蛋白酶,其得率最高,但比活非常低。因为长时间的高温会降低酶活力;此外,存在于番木瓜乳汁中的杂质不仅影响酶纯度,而且在高温下也可能抑制酶活力。方法2采用蛋白沉淀剂将蛋白与杂质分离,同时改用真空干燥,使酶比活大幅度上升,但酶的得率却下降很多。方法3在提取液中加入了少量
表1 各种制备方法木瓜蛋白酶质量比较鳌合剂、金属盐类和还原剂,进一步提高了酶比活,在酶
的得率上与方法2基本相同。从经济效益上看,虽然方法方 法方法1方法2方法31简单、易操作,但方法3却能得到更多的酶活力,分别是0.161.483.53蛋白酶活性(×105U g)方法1和方法2的7.0倍和2.5倍。因此,在制备木瓜蛋白
酶得率(%)23.107.407.30酶的过程中,要提高酶的质和量,必须加入酶活性保护
剂,去除杂质,同时干燥过程中温度不宜过高。
2.2 还原剂对木瓜蛋白酶活性的影响
木瓜蛋白酶是巯基蛋白酶,其活性中心含有2SH。由于2SH极易被氧化成2S2S2,从而导致酶活性降低或失活。因此,在制备过程中,加入适量的还原剂不仅可以保持巯基的活性状态,而且可使氧化态的二硫键还原 [收稿日期] 1999209230;2000202225修回
[基金项目] 贵州省教委基金资助项目(96017)
[作者简介] 乙 引(1967-),男,南京大学植物学学士和生态学硕士,中国科学院上海植物生理研究所植物生理学博
士,副教授,现在主要从事植物生理和生物化学的研究和教学工作。
第5期乙 引等 木瓜蛋白酶的生产工艺研究・25・成2SH。由表2可以看出,所有还原剂均能不同程度地提高酶活性,但还原剂的混合使用可得到更好的效果。其中,“硫代硫酸钠+半胱氨酸”组合效果最好,它能使酶活性平均增加0.61倍。
表2 还原剂对木瓜蛋白酶活性的影响
还 原 剂蛋白酶活性(×105U g)增量(%)2.3 硫代硫酸钠和半胱氨酸对酶活性的影响硫代硫酸钠和半胱氨酸的加入可有效地保护木瓜蛋
白酶活力,其最佳浓度组合见表3和表4。当硫代硫酸钠对 照3.53-浓度不变时,随着半胱氨酸浓度的升高,酶活性逐步增硫代硫酸钠3.801.08加。在半胱氨酸浓度为0.08mmol L时,酶活性达到最大连二亚硫酸钠3.941.125值,为7.85×10U g,是对照的2.18倍;进一步增加半胱抗坏血酸4.041.14
氨酸浓度,酶活性开始下降。抗坏血酸+硫代硫酸钠4.081.16
硫代硫酸钠+半胱氨酸5.671.610.08mmol L,l L增加到
5硫代硫酸钠+连二亚硫酸钠4.221.200.06 L时,.U8.62×
5 注:对照不加任何还原剂,其它所有处理还原剂总浓10U42倍但代钠浓度在
度为0.04mmol 。Ll,。由此可知,0.06mmol L硫代硫酸钠和0.08lL,它为对照的2.39倍。
表3半胱氨酸(酶比活(×105U增量(0.04.060.080.10表4 硫代硫酸钠对酶活性的影响硫代硫酸钠(mmol L)CK酶比活(×105U g)增量(0.020.040.060.080.103.605.146.437.057.857.626.077.337.948.628.548.47 注:硫代硫酸钠浓度0.04mmol L,实验步骤参见材料与方法。 注:半胱氨酸浓度为0.08mmol L,实验步骤参见材料与方法。
2.4 蛋白质沉淀剂对酶质量的影响
丹宁是蛋白质沉淀剂,其用量影响蛋白质沉淀效率。用量过少,酶产量不高;用量过多,又会增加成本。同时,丹宁本身也会影响木瓜蛋白酶的活性。本研究结果表明(表5),当丹宁浓度为0.02%～0.2%时,酶产量
表5 丹宁对酶活性的影响与丹宁用量成正相关,在丹宁浓度为0.2%时达到最
大值,酶制品得率为17%;当丹宁浓度在0.02%～丹宁(%)0.020.040.060.080.100.200.08%范围内递增时,酶产品活性也呈上升趋势,酶产量(酶重 鲜重)0.040.060.070.100.130.17但如果继续增加丹宁浓度,酶活性又会下降。因此,5酶活性(×10生产上丹宁用量应控制在0.08%～0.1%。
综上所述,木瓜蛋白酶虽然是一种相对比较稳定的酶,但粗放的工业化生产往往使酶制品达不到质量标准,因此,有必要在工艺上做改进。本研究结果表明,EDTA钠盐和NaCl的存在可降低产品中某些金属离子的含量,有利于产品质量的提高;硫代硫酸钠和半胱氨酸共同使用,对酶活性有较大的保护作用,其最适浓度分别为0.06mmol L和0.08mmol L。此外,酶粉的制备不能用烘干的方法,应采用真空干燥法进行,而且干燥时间越短越好。
[参 考 文 献]
[1] 沈家柏.木瓜蛋白酶简介[J].广西亚热带作物,1989,4:51257.
[2] BeckerB.Theproductionofpapain2anagriculturalindustryfortropicalamerica[J].Econ.Bot.1958,62279.
[3] 乙 引,陈 平,王 茜,王明勇.木瓜蛋白酶应用开发的性质研究[J].贵州师范大学学报,1998,16(4):17220.
ProducingTechnologyofPapain
1211YIYin,TANAi2juan,LIUNing,WANGLi2ming
(1.DepartmentofBiology,GuizhouNormalUniversity,Guiyang550001;2.Bio-technical
College,GuizhouUniversity,Guiyang550025,CHINA)
Abstract
Severalkeyprocesseswerestudied.Theresultsindicatedthatthebestconcentrationoftannicacidtoprecipitatepapainwas0.08%～0.1%,whichensurehighyieldandquality.0.06mmol Lsodiumhyposulfiteplus0.08mmol Lcysteinwasaneffectiveprotectorforenzymeactivitiesandraisedtheactivitiesby2.39fold.Theactivitiesandthequalityofpapaincouldbeimprovedeffectivelybyadditionofascorbicacid,
.EDTANa2andNaCl
Keywords:papain;producingtechnology;protector
贵州农业科学 2000,28(5):24～25
GuizhouAgriculturalSciences
木瓜蛋白酶的生产工艺研究
乙 引1,谭爱娟2,刘 宁1,王利民1
(1.贵州师范大学生物科学技术系,贵阳550001;2.贵州大学生物技术学院食品科学系,贵阳550006) [摘 要]研究了木瓜蛋白酶生产工艺中的几个重要环节。品产量,又可保持产品质量;,对照提高2.39倍;提取过程中用抗坏血酸、EDTAN。
[关键词]木瓜蛋白酶;生产工艺;[中图分类号]S661.6;S.5[]100123601(2000)0520024202
,它能有效地分解明胶、酪蛋白、谷蛋白、弹性蛋白、球,、啤酒澄清、明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等工业,
[1]。木瓜蛋白酶的生产以番木瓜未成熟果实的新鲜乳汁为原料,但因番木瓜种植区
主要分布在经济不发达地区,所以蛋白酶生产工艺相对落后,很多地区仍采用太阳暴晒的方式生产木瓜蛋白酶。按此法生产的产品质量不稳定,多数产品达不到质量要求[2]。因此,如何改进生产工艺、提高产品质量已成为当前急需解决的课题。本文就木瓜蛋白酶生产工艺中的几个重要环节进行了研究,试图找到一个保护酶活性的新方法,为生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料 新鲜番木瓜乳汁采自贵州三都水族自治县。
1.2 木瓜蛋白酶的制备方法 方法1(烘干法):将番木瓜乳汁3000rpm离心20min,上清液于60℃烘箱中鼓风干燥,磨碎后得酶制品。方法2(丹宁沉淀法):将番木瓜乳汁3000rpm离心20min,于上清液中缓慢加入已溶解的丹宁溶液,不断搅拌,至溶液中丹宁浓度达到0.1%。静置,沉淀丹宁2酶复合物,用盐酸调pH值至3.4,3500rpm离心20min,沉淀用真空干燥,得酶制品。方法3:工艺流程同方法2。只是在番木瓜乳汁和所有溶液中均加入0.1‰EDTANa2和0.3‰NaCl。如无说明,表示酶的制备方法为方法3。
1.3 酶活性测定 酶活性测定按乙引等[3]方法进行,以酪蛋白为底物。酶活性单位:U g。
2 结果与讨论
2.1 几种分离方法对木瓜蛋白酶制备效果的影响
虽然木瓜蛋白酶是一种相对稳定的蛋白质,但由于提取工艺的不同往往导致其质量的巨大差异。由表1可知,用烘干法制备的木瓜蛋白酶,其得率最高,但比活非常低。因为长时间的高温会降低酶活力;此外,存在于番木瓜乳汁中的杂质不仅影响酶纯度,而且在高温下也可能抑制酶活力。方法2采用蛋白沉淀剂将蛋白与杂质分离,同时改用真空干燥,使酶比活大幅度上升,但酶的得率却下降很多。方法3在提取液中加入了少量
表1 各种制备方法木瓜蛋白酶质量比较鳌合剂、金属盐类和还原剂,进一步提高了酶比活,在酶
的得率上与方法2基本相同。从经济效益上看,虽然方法方 法方法1方法2方法31简单、易操作,但方法3却能得到更多的酶活力,分别是0.161.483.53蛋白酶活性(×105U g)方法1和方法2的7.0倍和2.5倍。因此,在制备木瓜蛋白
酶得率(%)23.107.407.30酶的过程中,要提高酶的质和量,必须加入酶活性保护
剂,去除杂质,同时干燥过程中温度不宜过高。
2.2 还原剂对木瓜蛋白酶活性的影响
木瓜蛋白酶是巯基蛋白酶,其活性中心含有2SH。由于2SH极易被氧化成2S2S2,从而导致酶活性降低或失活。因此,在制备过程中,加入适量的还原剂不仅可以保持巯基的活性状态,而且可使氧化态的二硫键还原 [收稿日期] 1999209230;2000202225修回
[基金项目] 贵州省教委基金资助项目(96017)
[作者简介] 乙 引(1967-),男,南京大学植物学学士和生态学硕士,中国科学院上海植物生理研究所植物生理学博
士,副教授,现在主要从事植物生理和生物化学的研究和教学工作。
第5期乙 引等 木瓜蛋白酶的生产工艺研究・25・成2SH。由表2可以看出,所有还原剂均能不同程度地提高酶活性,但还原剂的混合使用可得到更好的效果。其中,“硫代硫酸钠+半胱氨酸”组合效果最好,它能使酶活性平均增加0.61倍。
表2 还原剂对木瓜蛋白酶活性的影响
还 原 剂蛋白酶活性(×105U g)增量(%)2.3 硫代硫酸钠和半胱氨酸对酶活性的影响硫代硫酸钠和半胱氨酸的加入可有效地保护木瓜蛋
白酶活力,其最佳浓度组合见表3和表4。当硫代硫酸钠对 照3.53-浓度不变时,随着半胱氨酸浓度的升高,酶活性逐步增硫代硫酸钠3.801.08加。在半胱氨酸浓度为0.08mmol L时,酶活性达到最大连二亚硫酸钠3.941.125值,为7.85×10U g,是对照的2.18倍;进一步增加半胱抗坏血酸4.041.14
氨酸浓度,酶活性开始下降。抗坏血酸+硫代硫酸钠4.081.16
硫代硫酸钠+半胱氨酸5.671.610.08mmol L,l L增加到
5硫代硫酸钠+连二亚硫酸钠4.221.200.06 L时,.U8.62×
5 注:对照不加任何还原剂,其它所有处理还原剂总浓10U42倍但代钠浓度在
度为0.04mmol 。Ll,。由此可知,0.06mmol L硫代硫酸钠和0.08lL,它为对照的2.39倍。
表3半胱氨酸(酶比活(×105U增量(0.04.060.080.10表4 硫代硫酸钠对酶活性的影响硫代硫酸钠(mmol L)CK酶比活(×105U g)增量(0.020.040.060.080.103.605.146.437.057.857.626.077.337.948.628.548.47 注:硫代硫酸钠浓度0.04mmol L,实验步骤参见材料与方法。 注:半胱氨酸浓度为0.08mmol L,实验步骤参见材料与方法。
2.4 蛋白质沉淀剂对酶质量的影响
丹宁是蛋白质沉淀剂,其用量影响蛋白质沉淀效率。用量过少,酶产量不高;用量过多,又会增加成本。同时,丹宁本身也会影响木瓜蛋白酶的活性。本研究结果表明(表5),当丹宁浓度为0.02%～0.2%时,酶产量
表5 丹宁对酶活性的影响与丹宁用量成正相关,在丹宁浓度为0.2%时达到最
大值,酶制品得率为17%;当丹宁浓度在0.02%～丹宁(%)0.020.040.060.080.100.200.08%范围内递增时,酶产品活性也呈上升趋势,酶产量(酶重 鲜重)0.040.060.070.100.130.17但如果继续增加丹宁浓度,酶活性又会下降。因此,5酶活性(×10生产上丹宁用量应控制在0.08%～0.1%。
综上所述,木瓜蛋白酶虽然是一种相对比较稳定的酶,但粗放的工业化生产往往使酶制品达不到质量标准,因此,有必要在工艺上做改进。本研究结果表明,EDTA钠盐和NaCl的存在可降低产品中某些金属离子的含量,有利于产品质量的提高;硫代硫酸钠和半胱氨酸共同使用,对酶活性有较大的保护作用,其最适浓度分别为0.06mmol L和0.08mmol L。此外,酶粉的制备不能用烘干的方法,应采用真空干燥法进行,而且干燥时间越短越好。
[参 考 文 献]
[1] 沈家柏.木瓜蛋白酶简介[J].广西亚热带作物,1989,4:51257.
[2] BeckerB.Theproductionofpapain2anagriculturalindustryfortropicalamerica[J].Econ.Bot.1958,62279.
[3] 乙 引,陈 平,王 茜,王明勇.木瓜蛋白酶应用开发的性质研究[J].贵州师范大学学报,1998,16(4):17220.
ProducingTechnologyofPapain
1211YIYin,TANAi2juan,LIUNing,WANGLi2ming
(1.DepartmentofBiology,GuizhouNormalUniversity,Guiyang550001;2.Bio-technical
College,GuizhouUniversity,Guiyang550025,CHINA)
Abstract
Severalkeyprocesseswerestudied.Theresultsindicatedthatthebestconcentrationoftannicacidtoprecipitatepapainwas0.08%～0.1%,whichensurehighyieldandquality.0.06mmol Lsodiumhyposulfiteplus0.08mmol Lcysteinwasaneffectiveprotectorforenzymeactivitiesandraisedtheactivitiesby2.39fold.Theactivitiesandthequalityofpapaincouldbeimprovedeffectivelybyadditionofascorbicacid,
.EDTANa2andNaCl
Keywords:papain;producingtechnology;protector