※生物工程食品科学
2010, Vol. 31, No. 01177
补料分批发酵生产谷胱甘肽的研究
潘亚磊，贺小贤，陈 珊
(陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西 西安 710021)
摘 要： 考察5L 发酵罐中分批补加葡萄糖对发酵生产谷胱甘肽(GSH)的影响。采用20g/L初糖质量浓度，在发酵12h 至27h 每隔3h 分别补加22、24、24、24、24g/L和22g/L葡萄糖，可以使酿酒酵母在发酵33h 时GSH 质量浓度达到72.49mg/L，细胞干质量浓度达到28.52g/L，分别为初糖20g/L分批培养方式的2.86倍和4.93倍。补料分批发酵可以明显促进酿酒酵母生长和提高GSH 的合成。关键词：分批补料；发酵；谷胱甘肽
Fed-batch Fermentation of Glutathione
,
(College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi an 710021, China)Abstract ：In order to obtain high glutathione (GSH) yield and dry cell weight, fed-batch fermentation in a 5 L fermentor wasadopted for glutathione production by a DL-ethionine, zinc chloride-resistant mutant of Saccharomyces cerevisiae. Strategy forfed-batch feeding of glucose at an initial concentration of 20 g/L was investigated. Results showed that the fed-batch feeding strategyof adding 22, 24, 24, 24, 24 g/L and 22 g/L glucose at intervals of 3 h from 12 to 27 h of fermentation resulted in 72.49 mg/L GSHconcentration and 28.52 g/L dry cell weight, which was 2.86 times and 4.93 times as high as those obtained by single batchfermentation. This meant that fed-batch fermentation could remarkably promote strain growth and enhance GSH production.Key words：fed-batch ；fermentation ；glutathione
中图分类号：Q93.335 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)01-0177-04
PAN Ya-lei，HE Xiao-xian，CHEN Shan
谷胱甘肽(glutathione，GSH) ，即γ-L -谷氨酰-L -半胱氨酰甘氨酸，是由L -谷氨酸、L -半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的生物活性三肽化合物。GSH 在生物体内具有多种重要的生理功能，特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境具有重要意义[1]。 酵母菌培养合成GSH 时采用流加葡萄糖的方式可以抑制副产物乙醇的生成，使丙酮酸顺利进入TCA 循环进而生成谷氨酸，从而增强了合成谷胱甘肽的代谢途径。童群义等[2]比较了恒速流加、指数流加和恒pH 值流加3种补糖策略对酵母菌培养合成GSH 的影响。卫功元等[3]研究了重复补料、恒速流加和指数流加等不同培养方式对GSH 发酵生产的影响。但关于补料分批发酵生产谷胱甘肽的详细研究尚较少。本研究主要考察分批补加葡萄糖对发酵生产谷胱甘肽(GSH)的影响，以期进一步促进酿酒酵母生长和提高GSH 的合成。１
材料与方法
1.11.1.1
材料
菌种
r
抗氯化锌抗乙硫氨酸突变株酿酒酵母Y F(ZnCl 2，
Et h r ) ，本院生物工程研究室保藏。
培养基
保藏培养基(g/L) ：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母膏10、琼脂2%、pH 值自然，0.1MPa ，灭菌15min 。
种子培养基(g/L) ：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母膏10、p H 值自然，0.1M Pa ，灭菌15m in 。
摇瓶发酵培养基(g/L)：(NH4) 2SO 4 6、葡萄糖35、K 2HPO 4・3H 2O 3、KH 2PO 4 0.5、酵母粉11、MnSO 40.1、KCl 0.1、FeSO 4 0.1、MgSO 4・7H 2O 0.1。
发酵罐初始培养基(g/L) ：(NH 4) 2SO 4 6、葡萄糖20、K 2HPO 4・3H 2O 3、KH 2PO 4 0.5、酵母粉11、MnSO 40.1、KCl 0.1、FeSO 4 0.1、MgSO 4・7H 2O 0.1。1.1.3
仪器与设备
1.1.2
收稿日期：2009-03-13
基金项目：陕西省教育厅自然科学基金项目(08JK233)
作者简介：潘亚磊(1984—) ，男，硕士研究生，研究方向为生物反应工程。E-mail ：[email protected]
178 2010, Vol. 31, No. 01
食品科学※生物工程
BIOF-6005A 5L全自动发酵罐 上海高机生物工程有限公司；Easyferm225PH 电极、Oxyferm225溶氧电极 瑞士Hamilton 公司；SBA-40C 生物传感分析仪 山东农科院；GT10-1高速台式离心机 北京时代北利离心机有限公司；FA2104S 电子天平 上海天平仪器厂。1.2方法
1.2.1
种子培养
突变株酿酒酵母YF 菌种分别用接种环划线接种在保藏培养基的固体平板上，30℃培养24h ，即得所需种子。1.2.2
摇瓶发酵培养
250mL 三角瓶内装30mL 液体培养基，10%的接种量，150r/min，30℃培养30h ，培养基初始pH7.0。1.2.3
发酵罐培养
5L 发酵罐内装3L 初始培养基，接种量20%，搅拌转速150r/min，通气量250L/h，pH6.0，30℃培养。1.3
分析测定方法
取一定发酵液，离心后收集菌体用去离子水洗两次后，于105℃烘干至恒重，计算细胞的干质量浓度。谷胱甘肽的测定用四氧嘧啶法[4]；葡萄糖含量的测定：用酶膜法，利用生物传感分析仪测定。２结果与分析2.1
分批培养采用葡萄糖初始质量浓度为20g/L进行分批发酵。发酵过程结果如图1所示。当发酵12h 时，葡萄糖基本消耗完。当发酵16h 时细胞干质量浓度达到最大，为6.01g/L，而在发酵20h 时GSH 质量浓度和GSH 含量都达到最大，分别为25.34mg/L和0.43%。
)
L 22/g 20(/18
76度16浓145量124质1083糖642细胞干质量浓度萄葡210
00
/(g/L)
[1**********]8
时间/h
)
281.0L /240.9g m 20b
0.8(/0.7度160.6GSH
浓120.5量0.4质84GSH 0.30
GSH 质量浓度含量
0.2S H G 0.10
4
8
12
16
20
24
28
时间/h
图１ 分批培养发酵过程曲线
Fig.1 Time courses of glucose consumption, cell growth and GSH
production during single batch fermentation
细胞干质量浓度达到最大值和谷胱甘肽质量浓度及含量达到最大值时的时间并不相同，说明GSH 的合成较细胞的生长有所延迟。从分批发酵的结果可以看出GSH 的浓度及含量都很低，为了提高GSH 浓度可以采用补料分批发酵的方法。2.2
补料方式的初步探索
采用初始葡萄糖浓度为20g/L，分别在当发酵罐培养发酵到12、15、18、21h 补加10、12、15、13g/L葡萄糖，总糖质量浓度为70g/L，结果如图2所示。从图2可以看出，发酵45h 时，细胞干质量浓度达到最大，为19.18g/L，而在发酵42h 时，GSH 质量浓度和GSH 含量分别达到最大，为64.79mg/L和0.35%。
)
201822L /20g 16(18/度1416浓1214量1012质86108糖46细胞干质量浓度萄24葡0
[***********]4
/(g/L)
时间/h
)
700.40L /60b
g 0.35m 0.30(/50度400.25GSH
浓0.20量30质20GSH 0.15GSH 质量浓度含量
0.10S H 100.05G 00
6
12
18
24
30
36
42
48
54
时间/h
图２ 总糖质量浓度为70g/L分批补料培养方式下的发酵过程曲线Fig.2 Time courses of glucose consumption, cell growth and GSH production during fed-batch fermentation with total amount of
added glucose of 70 g/L
细胞干质量浓度最大时，胞内的GSH 含量并非最大，而且略有降低，可能的原因是补加糖量较低，不能满足菌体积累GSH 所需。菌体的生长曲线与未补糖相比对数生长期明显变长。从图2还可以看出，在发酵24h 时糖基本消耗完，可以考虑增加补加次数。因此，确定正确的补加时间和补加量尤为重要。
2.3补料时间
分别采用在发酵罐培养发酵12、15、18、21、24、27h 补加15、15、15、17、15、15g/L的葡萄糖，总糖质量浓度为112g/L；以及采用12h 到36h 每隔3h ，每次补加16g/L葡萄糖，总糖质量浓度为164g/L的9次补糖方式。结果分别如图3、4所示。从图3可以看出，在发酵40h 时，菌体细胞干质量浓度达到最大，为24.42g/L，而GSH 质量浓度和含量在发酵36h 时达到65.37mg/L和0.29%。
※生物工程
食品科学
2010, Vol. 31, No. 01
179
)
20L /g 18a
2624(/162214葡萄糖质量浓度20度12细胞干质量浓度
18浓16量1014812质610糖48细胞干质量浓度萄624葡0
2/(g/L)
[**************]54
时间/h
)
80
L /g 70b
0.500.45m (600.40/度500.35400.30GSH
浓0.25量300.20质20GSH GSH 质量浓度含量
0.15S H 100.10G 0
0.050
6
12
18
24
30
36
42
48
54
时间/h
图３ 总糖质量浓度为１１２ｇ／Ｌ分批补料培养方式下的发酵过程曲线Fig.3 Time courses of glucose consumption, cell growth and GSH production during fed-batch fermentation with total amount of
added glucose of 112 g/L
)
22葡萄糖质量浓度
L /2018a
细胞干质量浓度
22g 20( /1618度
1416浓1214量1012质810糖68萄46细胞干质量浓度4葡20248 54
/(g/L)
0 6 12 18 24 30 36 42 时间 /h
)
60L /b
0.5g m 500.4(/度400.3GSH
浓30量0.2质200.1S H 10GSH GSH 质量浓度
含量G 00
6
12
18
24
30
36
42
48
54
时间 /h
图４ 总糖质量浓度为１６４ｇ／Ｌ分批补料培养方式下的发酵过程曲线Fig.4 Time courses of glucose consumption, cell growth and GSH production during fed-batch fermentation with total amount of
added glucose of 164 g/L
从图4可以看出，发酵30h 后补加的3次葡萄糖虽
然每次都被菌体利用，但菌体细胞干质量浓度及GSH 的含量和浓度都比图3中没有增多，相反略有减少。可能的原因是葡萄糖及其分解代谢产物抑制了菌体的生长和产物的合成，因此，补加到27h 即可。27h 之后的葡萄糖被消耗用于菌体稳定期维持细胞生存了，这些补加对谷胱甘肽生产是无意义的，因而，采用12h 到27h 的6次补加葡萄糖较好。2.4
补加量
)
L 24a
32/g 28
( /20度浓16
葡萄糖质量浓度24细胞干质量浓度20
量1216质糖812细胞干质量浓度萄48葡40
/(g/L)
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54
时间 /h
)
80L /70b
0.5g m 600.4( /度500.3GSH
浓40量300.2
质20GSH S H 10GSH 质量浓度
含量
0.1G 00
6
12
18
24
30
36
42
48
54时间/h
图５ 总糖质量浓度为１６０ｇ／Ｌ分批补料培养方式下的发酵过程曲线Fig.5 Time courses of glucose consumption, cell growth and GSHproduction during fed-batch fermentation with total amount of
added glucose of 160 g/L
)
L 4532/g 40a
(28 /35度24浓3020量2516质20糖1512萄10葡萄糖质量浓度8细胞干质量浓度葡5细胞干质量浓度
40
/(g/L)
6
12
18
24
30
36
42
48
54
时间/h
)
50L /b
0.5g m 400.4( /度300.3GSH
浓量200.2质10GSH 0.1S H G 0
GSH 质量浓度
含量
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54
时间 /h
图６ 总糖质量浓度为２１０ｇ／Ｌ分批补料培养方式下的发酵过程曲线Fig.6 Time courses of glucose consumption, cell growth and GSHproduction during fed-batch fermentation with total amount of
added glucose of 210 g/L分别在12h 至27h 每隔3h 分别补加22、24、24、24、24g/L和22g/L的葡萄糖，总糖为160g/L；以及继续提高每次补加糖的量，总糖达到210g/L。结果分别如图5、6所示。从图5可以看出，在发酵21h 时胞内GSH 的含量达到0.3%，发酵至33h 时GSH 的质量浓度浓度达到72.49mg/L，细胞干质量浓度为28.52g/L，分别为初糖20g/L的分批培养方式的2.86倍和4.93倍。
图6与图5相比细胞干质量浓度几乎没有变化，最
180 2010, Vol. 31, No. 01
食品科学
※生物工程
大GSH 质量浓度则下降到44.98mg/L，而菌体最大的GSH 含量也下降到0.26%。这可能是由于葡萄糖的质量浓度过大抑制了菌体的生长和GSH 的合成。
综合分析图1～6可以看出，补料分批培养方式与分批培养相比，除总糖质量浓度210g/L过高产生了抑制作用外，其他考察的补料方式生产GSH 的细胞干质量浓度、GSH 质量浓度、GSH 对葡萄糖产率、细胞生产强度、GSH 生产强度等参数都相对于分批培养有了不同程度的提高，其中细胞干质量浓度和GSH 质量浓度增加显著。由于恒速补料存在前期葡萄糖过量，后期葡萄糖不足的缺点[2-3]
；指数流加方式存在后期葡萄糖充足适合菌体生长但不利于GSH 的合成的缺点[2]。所以分批补料与以上连续补料相比具有以下优点：补加量容易控制，有
利于前期菌体生长和后期GSH 合成；补加时间可以根据发酵周期进行灵活控制。
本实验中补料分批发酵与分批培养相比虽然细胞干质量浓度和GSH 质量浓度增加显著，但绝对值仍远低于国内先进水平，且细胞对葡萄糖产率和GSH 含量有所下降，这可能是由于只补加葡萄糖，造成菌体细胞在生长过程中其他营养缺乏所致，下一步研究可以采用碳源和氮源同时补加或补加前体氨基酸的方式[5]
，以进一步
提高GSH 的含量和浓度。３
结 论
分批培养发酵生产GSH 由于葡萄糖不能满足菌体生长需求，所以GSH 的质量浓度和含量较低。采用合适的补加时间和补加量进行补料分批发酵生产GSH 可以明显促进酿酒酵母生长和提高GSH 的合成。补料分批发酵具有补加量容易控制和补加时间可以灵活控制的优点，是一种实现GSH 高产的有效方式，为GSH 的工业化生产提供了指导。
参考文献：
[1]PENNINCKX M. An overview on glutathione in Saccharomyces versusnon-conventional yeasts[J]. FEMS Yeast Research, 2002(2): 295-305.[2]童群义, 王国成, 堵国成, 等. 补料方式对酵母菌生产谷胱甘肽的影响[J]. 工业微生物, 2003, 33(3): 19-22.
[3]卫功元, 李演, 堵国成, 等. 产朊假丝酵母流加发酵法生产谷胱甘肽[J]. 过程工程学报, 2005, 5(6): 327-331.
[4]赵少欣, 贺小贤. 还原型谷胱甘肽简便测定法[J]. 食品科技, 2007(9):219-220.
[5]
张文燕, 堵国成, 陈坚. 流加发酵及添加L -半胱氨酸对产朊假丝酵母高密度培养合成谷胱甘肽的影响[J]. 应用与环境生物学报, 2007,13(2): 261-264.
※生物工程食品科学
2010, Vol. 31, No. 01177
补料分批发酵生产谷胱甘肽的研究
潘亚磊，贺小贤，陈 珊
(陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西 西安 710021)
摘 要： 考察5L 发酵罐中分批补加葡萄糖对发酵生产谷胱甘肽(GSH)的影响。采用20g/L初糖质量浓度，在发酵12h 至27h 每隔3h 分别补加22、24、24、24、24g/L和22g/L葡萄糖，可以使酿酒酵母在发酵33h 时GSH 质量浓度达到72.49mg/L，细胞干质量浓度达到28.52g/L，分别为初糖20g/L分批培养方式的2.86倍和4.93倍。补料分批发酵可以明显促进酿酒酵母生长和提高GSH 的合成。关键词：分批补料；发酵；谷胱甘肽
Fed-batch Fermentation of Glutathione
,
(College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi an 710021, China)Abstract ：In order to obtain high glutathione (GSH) yield and dry cell weight, fed-batch fermentation in a 5 L fermentor wasadopted for glutathione production by a DL-ethionine, zinc chloride-resistant mutant of Saccharomyces cerevisiae. Strategy forfed-batch feeding of glucose at an initial concentration of 20 g/L was investigated. Results showed that the fed-batch feeding strategyof adding 22, 24, 24, 24, 24 g/L and 22 g/L glucose at intervals of 3 h from 12 to 27 h of fermentation resulted in 72.49 mg/L GSHconcentration and 28.52 g/L dry cell weight, which was 2.86 times and 4.93 times as high as those obtained by single batchfermentation. This meant that fed-batch fermentation could remarkably promote strain growth and enhance GSH production.Key words：fed-batch ；fermentation ；glutathione
中图分类号：Q93.335 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)01-0177-04
PAN Ya-lei，HE Xiao-xian，CHEN Shan
谷胱甘肽(glutathione，GSH) ，即γ-L -谷氨酰-L -半胱氨酰甘氨酸，是由L -谷氨酸、L -半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的生物活性三肽化合物。GSH 在生物体内具有多种重要的生理功能，特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境具有重要意义[1]。 酵母菌培养合成GSH 时采用流加葡萄糖的方式可以抑制副产物乙醇的生成，使丙酮酸顺利进入TCA 循环进而生成谷氨酸，从而增强了合成谷胱甘肽的代谢途径。童群义等[2]比较了恒速流加、指数流加和恒pH 值流加3种补糖策略对酵母菌培养合成GSH 的影响。卫功元等[3]研究了重复补料、恒速流加和指数流加等不同培养方式对GSH 发酵生产的影响。但关于补料分批发酵生产谷胱甘肽的详细研究尚较少。本研究主要考察分批补加葡萄糖对发酵生产谷胱甘肽(GSH)的影响，以期进一步促进酿酒酵母生长和提高GSH 的合成。１
材料与方法
1.11.1.1
材料
菌种
r
抗氯化锌抗乙硫氨酸突变株酿酒酵母Y F(ZnCl 2，
Et h r ) ，本院生物工程研究室保藏。
培养基
保藏培养基(g/L) ：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母膏10、琼脂2%、pH 值自然，0.1MPa ，灭菌15min 。
种子培养基(g/L) ：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母膏10、p H 值自然，0.1M Pa ，灭菌15m in 。
摇瓶发酵培养基(g/L)：(NH4) 2SO 4 6、葡萄糖35、K 2HPO 4・3H 2O 3、KH 2PO 4 0.5、酵母粉11、MnSO 40.1、KCl 0.1、FeSO 4 0.1、MgSO 4・7H 2O 0.1。
发酵罐初始培养基(g/L) ：(NH 4) 2SO 4 6、葡萄糖20、K 2HPO 4・3H 2O 3、KH 2PO 4 0.5、酵母粉11、MnSO 40.1、KCl 0.1、FeSO 4 0.1、MgSO 4・7H 2O 0.1。1.1.3
仪器与设备
1.1.2
收稿日期：2009-03-13
基金项目：陕西省教育厅自然科学基金项目(08JK233)
作者简介：潘亚磊(1984—) ，男，硕士研究生，研究方向为生物反应工程。E-mail ：[email protected]
178 2010, Vol. 31, No. 01
食品科学※生物工程
BIOF-6005A 5L全自动发酵罐 上海高机生物工程有限公司；Easyferm225PH 电极、Oxyferm225溶氧电极 瑞士Hamilton 公司；SBA-40C 生物传感分析仪 山东农科院；GT10-1高速台式离心机 北京时代北利离心机有限公司；FA2104S 电子天平 上海天平仪器厂。1.2方法
1.2.1
种子培养
突变株酿酒酵母YF 菌种分别用接种环划线接种在保藏培养基的固体平板上，30℃培养24h ，即得所需种子。1.2.2
摇瓶发酵培养
250mL 三角瓶内装30mL 液体培养基，10%的接种量，150r/min，30℃培养30h ，培养基初始pH7.0。1.2.3
发酵罐培养
5L 发酵罐内装3L 初始培养基，接种量20%，搅拌转速150r/min，通气量250L/h，pH6.0，30℃培养。1.3
分析测定方法
取一定发酵液，离心后收集菌体用去离子水洗两次后，于105℃烘干至恒重，计算细胞的干质量浓度。谷胱甘肽的测定用四氧嘧啶法[4]；葡萄糖含量的测定：用酶膜法，利用生物传感分析仪测定。２结果与分析2.1
分批培养采用葡萄糖初始质量浓度为20g/L进行分批发酵。发酵过程结果如图1所示。当发酵12h 时，葡萄糖基本消耗完。当发酵16h 时细胞干质量浓度达到最大，为6.01g/L，而在发酵20h 时GSH 质量浓度和GSH 含量都达到最大，分别为25.34mg/L和0.43%。
)
L 22/g 20(/18
76度16浓145量124质1083糖642细胞干质量浓度萄葡210
00
/(g/L)
[1**********]8
时间/h
)
281.0L /240.9g m 20b
0.8(/0.7度160.6GSH
浓120.5量0.4质84GSH 0.30
GSH 质量浓度含量
0.2S H G 0.10
4
8
12
16
20
24
28
时间/h
图１ 分批培养发酵过程曲线
Fig.1 Time courses of glucose consumption, cell growth and GSH
production during single batch fermentation
细胞干质量浓度达到最大值和谷胱甘肽质量浓度及含量达到最大值时的时间并不相同，说明GSH 的合成较细胞的生长有所延迟。从分批发酵的结果可以看出GSH 的浓度及含量都很低，为了提高GSH 浓度可以采用补料分批发酵的方法。2.2
补料方式的初步探索
采用初始葡萄糖浓度为20g/L，分别在当发酵罐培养发酵到12、15、18、21h 补加10、12、15、13g/L葡萄糖，总糖质量浓度为70g/L，结果如图2所示。从图2可以看出，发酵45h 时，细胞干质量浓度达到最大，为19.18g/L，而在发酵42h 时，GSH 质量浓度和GSH 含量分别达到最大，为64.79mg/L和0.35%。
)
201822L /20g 16(18/度1416浓1214量1012质86108糖46细胞干质量浓度萄24葡0
[***********]4
/(g/L)
时间/h
)
700.40L /60b
g 0.35m 0.30(/50度400.25GSH
浓0.20量30质20GSH 0.15GSH 质量浓度含量
0.10S H 100.05G 00
6
12
18
24
30
36
42
48
54
时间/h
图２ 总糖质量浓度为70g/L分批补料培养方式下的发酵过程曲线Fig.2 Time courses of glucose consumption, cell growth and GSH production during fed-batch fermentation with total amount of
added glucose of 70 g/L
细胞干质量浓度最大时，胞内的GSH 含量并非最大，而且略有降低，可能的原因是补加糖量较低，不能满足菌体积累GSH 所需。菌体的生长曲线与未补糖相比对数生长期明显变长。从图2还可以看出，在发酵24h 时糖基本消耗完，可以考虑增加补加次数。因此，确定正确的补加时间和补加量尤为重要。
2.3补料时间
分别采用在发酵罐培养发酵12、15、18、21、24、27h 补加15、15、15、17、15、15g/L的葡萄糖，总糖质量浓度为112g/L；以及采用12h 到36h 每隔3h ，每次补加16g/L葡萄糖，总糖质量浓度为164g/L的9次补糖方式。结果分别如图3、4所示。从图3可以看出，在发酵40h 时，菌体细胞干质量浓度达到最大，为24.42g/L，而GSH 质量浓度和含量在发酵36h 时达到65.37mg/L和0.29%。
※生物工程
食品科学
2010, Vol. 31, No. 01
179
)
20L /g 18a
2624(/162214葡萄糖质量浓度20度12细胞干质量浓度
18浓16量1014812质610糖48细胞干质量浓度萄624葡0
2/(g/L)
[**************]54
时间/h
)
80
L /g 70b
0.500.45m (600.40/度500.35400.30GSH
浓0.25量300.20质20GSH GSH 质量浓度含量
0.15S H 100.10G 0
0.050
6
12
18
24
30
36
42
48
54
时间/h
图３ 总糖质量浓度为１１２ｇ／Ｌ分批补料培养方式下的发酵过程曲线Fig.3 Time courses of glucose consumption, cell growth and GSH production during fed-batch fermentation with total amount of
added glucose of 112 g/L
)
22葡萄糖质量浓度
L /2018a
细胞干质量浓度
22g 20( /1618度
1416浓1214量1012质810糖68萄46细胞干质量浓度4葡20248 54
/(g/L)
0 6 12 18 24 30 36 42 时间 /h
)
60L /b
0.5g m 500.4(/度400.3GSH
浓30量0.2质200.1S H 10GSH GSH 质量浓度
含量G 00
6
12
18
24
30
36
42
48
54
时间 /h
图４ 总糖质量浓度为１６４ｇ／Ｌ分批补料培养方式下的发酵过程曲线Fig.4 Time courses of glucose consumption, cell growth and GSH production during fed-batch fermentation with total amount of
added glucose of 164 g/L
从图4可以看出，发酵30h 后补加的3次葡萄糖虽
然每次都被菌体利用，但菌体细胞干质量浓度及GSH 的含量和浓度都比图3中没有增多，相反略有减少。可能的原因是葡萄糖及其分解代谢产物抑制了菌体的生长和产物的合成，因此，补加到27h 即可。27h 之后的葡萄糖被消耗用于菌体稳定期维持细胞生存了，这些补加对谷胱甘肽生产是无意义的，因而，采用12h 到27h 的6次补加葡萄糖较好。2.4
补加量
)
L 24a
32/g 28
( /20度浓16
葡萄糖质量浓度24细胞干质量浓度20
量1216质糖812细胞干质量浓度萄48葡40
/(g/L)
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54
时间 /h
)
80L /70b
0.5g m 600.4( /度500.3GSH
浓40量300.2
质20GSH S H 10GSH 质量浓度
含量
0.1G 00
6
12
18
24
30
36
42
48
54时间/h
图５ 总糖质量浓度为１６０ｇ／Ｌ分批补料培养方式下的发酵过程曲线Fig.5 Time courses of glucose consumption, cell growth and GSHproduction during fed-batch fermentation with total amount of
added glucose of 160 g/L
)
L 4532/g 40a
(28 /35度24浓3020量2516质20糖1512萄10葡萄糖质量浓度8细胞干质量浓度葡5细胞干质量浓度
40
/(g/L)
6
12
18
24
30
36
42
48
54
时间/h
)
50L /b
0.5g m 400.4( /度300.3GSH
浓量200.2质10GSH 0.1S H G 0
GSH 质量浓度
含量
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54
时间 /h
图６ 总糖质量浓度为２１０ｇ／Ｌ分批补料培养方式下的发酵过程曲线Fig.6 Time courses of glucose consumption, cell growth and GSHproduction during fed-batch fermentation with total amount of
added glucose of 210 g/L分别在12h 至27h 每隔3h 分别补加22、24、24、24、24g/L和22g/L的葡萄糖，总糖为160g/L；以及继续提高每次补加糖的量，总糖达到210g/L。结果分别如图5、6所示。从图5可以看出，在发酵21h 时胞内GSH 的含量达到0.3%，发酵至33h 时GSH 的质量浓度浓度达到72.49mg/L，细胞干质量浓度为28.52g/L，分别为初糖20g/L的分批培养方式的2.86倍和4.93倍。
图6与图5相比细胞干质量浓度几乎没有变化，最
180 2010, Vol. 31, No. 01
食品科学
※生物工程
大GSH 质量浓度则下降到44.98mg/L，而菌体最大的GSH 含量也下降到0.26%。这可能是由于葡萄糖的质量浓度过大抑制了菌体的生长和GSH 的合成。
综合分析图1～6可以看出，补料分批培养方式与分批培养相比，除总糖质量浓度210g/L过高产生了抑制作用外，其他考察的补料方式生产GSH 的细胞干质量浓度、GSH 质量浓度、GSH 对葡萄糖产率、细胞生产强度、GSH 生产强度等参数都相对于分批培养有了不同程度的提高，其中细胞干质量浓度和GSH 质量浓度增加显著。由于恒速补料存在前期葡萄糖过量，后期葡萄糖不足的缺点[2-3]
；指数流加方式存在后期葡萄糖充足适合菌体生长但不利于GSH 的合成的缺点[2]。所以分批补料与以上连续补料相比具有以下优点：补加量容易控制，有
利于前期菌体生长和后期GSH 合成；补加时间可以根据发酵周期进行灵活控制。
本实验中补料分批发酵与分批培养相比虽然细胞干质量浓度和GSH 质量浓度增加显著，但绝对值仍远低于国内先进水平，且细胞对葡萄糖产率和GSH 含量有所下降，这可能是由于只补加葡萄糖，造成菌体细胞在生长过程中其他营养缺乏所致，下一步研究可以采用碳源和氮源同时补加或补加前体氨基酸的方式[5]
，以进一步
提高GSH 的含量和浓度。３
结 论
分批培养发酵生产GSH 由于葡萄糖不能满足菌体生长需求，所以GSH 的质量浓度和含量较低。采用合适的补加时间和补加量进行补料分批发酵生产GSH 可以明显促进酿酒酵母生长和提高GSH 的合成。补料分批发酵具有补加量容易控制和补加时间可以灵活控制的优点，是一种实现GSH 高产的有效方式，为GSH 的工业化生产提供了指导。
参考文献：
[1]PENNINCKX M. An overview on glutathione in Saccharomyces versusnon-conventional yeasts[J]. FEMS Yeast Research, 2002(2): 295-305.[2]童群义, 王国成, 堵国成, 等. 补料方式对酵母菌生产谷胱甘肽的影响[J]. 工业微生物, 2003, 33(3): 19-22.
[3]卫功元, 李演, 堵国成, 等. 产朊假丝酵母流加发酵法生产谷胱甘肽[J]. 过程工程学报, 2005, 5(6): 327-331.
[4]赵少欣, 贺小贤. 还原型谷胱甘肽简便测定法[J]. 食品科技, 2007(9):219-220.
[5]
张文燕, 堵国成, 陈坚. 流加发酵及添加L -半胱氨酸对产朊假丝酵母高密度培养合成谷胱甘肽的影响[J]. 应用与环境生物学报, 2007,13(2): 261-264.