实验十三 土壤和植物中铁的测定
(邻菲罗啉比色法)
植物中铁的测定
一、方法原理
先用盐酸羟胺(或对苯二酚、亚硫酸钠等) 将溶液中的Fe 3+还原为Fe 2+，然后在pH2 ~ 9范围内与邻菲罗啉作用生成红色络合物，在0.1~ 6ppm 范围内，含铁量与色深成正比，可比色测定。
反应式：
4Fe 3+ + 2NH20H → 4Fe2+ + N20 + H20+4H+
Fe 2+ + 3C12H 8N 2 → Fe[C12H 3N 2]32+
测定波长为508nm ，该法灵敏度高，稳定性好。
二、实验试剂
1．10％盐酸羟胺：10g 盐酸羟胺(NH20H ·HCl) 溶于100ml 水中，此溶
液可稳定几天。
2．0.2％2，4—二硝基酚：0.2g 2，4—二硝基酚溶于100ml 水。
3．1mol/LNaOH: 40g NaOH溶于1000ml 水中。
4．0.1mol/LHCl：8.3ml ．浓HCl 稀释为1000ml 。
5．1％邻菲罗啉：1g 邻菲罗啉(C12H 8N 2·H 20) 溶于100ml 水中；可温热
助溶，贮于暗处，如变色，要重配(也可取1g 溶于100ml 95％乙醇中) 。
6. 铁标准溶液：取纯铁粉0.1000g(或优级纯硫酸亚铁铵
[Fe(NH4) 2(SO4) 2·6H 20]0.7022g)，溶于20ml 1mol/LHCl，移入1000ml
容量瓶，水定容，此为含Fe 100ppm的铁标准溶液。
取10ml 此液，稀释定容为100ml ，此为10ppmFe 标准溶液。
三、实验仪器
分光光度计、振荡机。
四、操作步骤
4.1样品前处理：植物组织样品的采集、制备和保存
植物组织样品的采集首先是选定有代表性的株样。如同土壤样品的采集方法，在田间按照一定的路线多点采取组成平均样品。株样数目应视植物的种类、株间变异程度、种植密度、株样大小或生育期以及所要求的准确度而定，一般为10-50株。从大田或实验区采样要注意群体的密度、长势、生育期的一致。如果为了某一特定的目的，例如缺素诊断采样时，则应注意株样的典型性，并且要同时在附近地块选取有对比意义的正常典型株样，使分析结果能通过比较说明问题。用于营养诊断测定样品还要特别注意植株的采集部位的组织器官及采样的时间。
采样的植株如需要分不同的器官测定，需要立即将其剪开，以免养分运转。剪碎的样品太多时，可在混匀后用四分法缩分至所需要量。用于营养诊断分析的样品还应尽可能立即称量鲜重。
采集的植株样品是否需要洗涤应视样品的清洁程度和分析要求而定。一般微量元素的分析和肉眼明显看得见或明知受到施肥污染的样品需要洗涤。植物样品应在刚采集的新鲜状态冲洗，否则一些易溶性养分很容易从已经死亡的组织中洗出。一般可以用湿棉布（必要时可
沾一些很稀的如1mg/L的有机洗涤剂）擦净表面的污染物，然后用蒸馏水或去离子水淋洗1-2次即可。
一般测定不容易起变化的组分用干燥样品较方便。新鲜样品应该立即干燥，减少体内呼吸作用和霉菌活动引起的生化变化。植株样品的干燥通常分两部分：先将鲜样在80-90℃烘箱中鼓风烘15-30min （松软组织15min ，致密组织烘30min ），然后降温到60-70℃，逐尽水分。
干样品可用研钵或带柄刀片或齿状（用于种子样品）的磨碎机粉碎，并过筛。分析样品的细度应视称量的多少而定，通常可用圆孔直径为0.5-1mm 筛，称量少于1g 的样品最好过0.25mm 甚至0.1mm 筛。过筛后应充分混匀，保存于磨口的广口瓶中，内外各贴一样的标签。样品瓶应置于洁净、干燥处。若样品可能需要保存很常时间，应进行灭菌（如γ射线），然后置于聚乙烯或袋中封口保存。
样品在粉碎和储藏过程中，又会吸收空气中的水分。所以，在精密分析称样前，还必须将粉碎的样品在65℃（12-24h ）或90℃（2h ）再次烘干，一般常规分析则不必。称样时应充分混匀后多点采样，这在称样量少而样品相对较粗时更应特别注意。
用于微量元素分析的样本采集与制备应特别注意要防止可能引起的污染。例如在干燥箱中烘干时，应该防止金属粉末的污染。用于样品采集和粉碎样品的研钵设备应该采用不锈钢器具和塑料网筛。如要准确分析铁，最好在玛瑙研钵上研磨。
4.2植物样品处理：
方法一干灰化法：称取过0.5mm 筛孔的烘干植物样品0.5-1.0000g ，置于石英坩埚中，在电炉上加热炭化，再移入高温电炉500°2-3h ，灰化后冷却。准确加入1:1硝酸溶液5ml ，溶解灰分，溶解后无损转移入50ml 容量瓶中，用水定容。用干滤纸过滤，滤液收集在干塑料瓶内。
方法二盐酸浸提法：用蒸馏水将正常叶片洗干净，在105°下“杀青”，然后放在室内晾干，用瓷研钵或不锈钢粉磨机磨碎过0.5mm 筛。分析前放在70°干燥箱内烘干4-6h ，称取样品0.5-1.0000g 加入盐酸溶液（浓度为1:50）的量按照1:50的含量.
方法三湿消化法：用蒸馏水将正常叶片洗干净，在105°下“杀青”，然后放在室内晾干，用瓷研钵或不锈钢粉磨机磨碎过0.5mm 筛。分析前放在70°干燥箱内烘干4-6h ，称取样品0.5g 左右样品放入聚四氟乙烯烧杯内加入5ml 的浓硝酸，盖好，放置过夜，次日再向烧杯中加入4ml 浓硝酸和1ml 高氯酸，控制电热板温度在180°下消解5h ，去盖。将溶液缓缓加热至干。稍事冷却，将溶液及不溶性颗粒全部转移至50ml 容量瓶中。过滤后使用滤液用AAS 法测试。
4.3植物样品测试：
按照以上的三种方法获得澄清滤液
1．取澄清的土壤(或植物) 样品待测液5 ~ 10ml呻25ml 容量瓶中；
2．加2滴2，4一二硝基酚溶液，用1mol/LNaOH调至溶液显黄色，再加0.1N HCl至黄色刚褪去。
3. 加10％盐酸羟胺溶液2ml ，摇匀，放几分钟。
4．加邻菲罗啉lml ，用水定容。
5．放30min 后比色测定，1cm 比色皿，510nm 波长。
由标准曲线查取溶液Fe 浓度。
标准曲线：
分别取10ppmFe 标准溶液0、1、2、3、4、5ml → 25ml容量瓶中，同上操作步骤进行显色测定，所得标准系列含Fe 分别为0、0.4、0.8、
1.2、1.6、2.0ppm ，以Fe 浓度对吸光度A 作标准曲线。
五、结果计算
样品含Fe(ppm) =(查曲线得ppm x V2 x 25)/(W x V1)
式中：W(g)—样品重
V1(ml)—测定时吸取样品待测液ml 数(5 ~ 10m1)。
V2(ml)—样品待测总体积(m1)。
六、注意事项
1. 不同资料中盐酸羟胺和邻菲罗啉的浓度有不同，盐酸羟胺作用是还原Fe 3+，用量能保证还原完全即可，邻菲罗啉有用0.1％、0.5％及
1.5％等浓度，为使络合完全，含铁较高的样品应该用较高浓度的邻菲罗啉，本实验用1％。
2．含Fe 高的样品溶液测定时应减少吸取量(吸1 ~ 2m1)，也可以增加标准溶液浓度至5 ~ 6ppm(显色定容后) ，扩展标准曲线。
3. 必须先加盐酸羟胺，后加显色剂，所加试剂体积应随比色体积不同而增减，以保证其浓度一定。
4．反应酸度要求为pH2~ 9，一般控制在pH5 ~ 6，pH
显色慢；pH>9，可能生成沉淀(氢氧化物等沉淀) 。加还原剂前应调pH5左右，使得加试剂后溶液pH 在适宜范围内，也有的通过加缓冲溶液，如10％ NaOAc 5 ~ 10ml，来调节和控制溶液的pH 范围。
5．比色波长可为490 ~ 530nm。
6．样品处理、测定过程中都可能存在较多的铁污染，要做空白试验；注意防止污染。该法受高氯酸干扰，植物样品不宜用HCl04消化处理，
如用HN03-HclO 4消化样品，最后必须加热至近干，去除多余的
HN03·HCl04。
七、思考题
1．邻菲罗啉法测铁的原理，反应式和应用范围?
2．加试剂的顺序不能颠倒，为什么?
3．为什么待测溶液必须先调节到中性偏酸? 请自行设计几种调节和控制溶液pH 的方法 (如果没有2，4一二硝基酚溶液，如何办)?
4．如用此法测含铁很高的土壤全铁量，应如何做? 请设计实验步骤。
5．如果待测液中含HCl04，对测定会有什么影响?
实验十三 土壤和植物中铁的测定
(邻菲罗啉比色法)
植物中铁的测定
一、方法原理
先用盐酸羟胺(或对苯二酚、亚硫酸钠等) 将溶液中的Fe 3+还原为Fe 2+，然后在pH2 ~ 9范围内与邻菲罗啉作用生成红色络合物，在0.1~ 6ppm 范围内，含铁量与色深成正比，可比色测定。
反应式：
4Fe 3+ + 2NH20H → 4Fe2+ + N20 + H20+4H+
Fe 2+ + 3C12H 8N 2 → Fe[C12H 3N 2]32+
测定波长为508nm ，该法灵敏度高，稳定性好。
二、实验试剂
1．10％盐酸羟胺：10g 盐酸羟胺(NH20H ·HCl) 溶于100ml 水中，此溶
液可稳定几天。
2．0.2％2，4—二硝基酚：0.2g 2，4—二硝基酚溶于100ml 水。
3．1mol/LNaOH: 40g NaOH溶于1000ml 水中。
4．0.1mol/LHCl：8.3ml ．浓HCl 稀释为1000ml 。
5．1％邻菲罗啉：1g 邻菲罗啉(C12H 8N 2·H 20) 溶于100ml 水中；可温热
助溶，贮于暗处，如变色，要重配(也可取1g 溶于100ml 95％乙醇中) 。
6. 铁标准溶液：取纯铁粉0.1000g(或优级纯硫酸亚铁铵
[Fe(NH4) 2(SO4) 2·6H 20]0.7022g)，溶于20ml 1mol/LHCl，移入1000ml
容量瓶，水定容，此为含Fe 100ppm的铁标准溶液。
取10ml 此液，稀释定容为100ml ，此为10ppmFe 标准溶液。
三、实验仪器
分光光度计、振荡机。
四、操作步骤
4.1样品前处理：植物组织样品的采集、制备和保存
植物组织样品的采集首先是选定有代表性的株样。如同土壤样品的采集方法，在田间按照一定的路线多点采取组成平均样品。株样数目应视植物的种类、株间变异程度、种植密度、株样大小或生育期以及所要求的准确度而定，一般为10-50株。从大田或实验区采样要注意群体的密度、长势、生育期的一致。如果为了某一特定的目的，例如缺素诊断采样时，则应注意株样的典型性，并且要同时在附近地块选取有对比意义的正常典型株样，使分析结果能通过比较说明问题。用于营养诊断测定样品还要特别注意植株的采集部位的组织器官及采样的时间。
采样的植株如需要分不同的器官测定，需要立即将其剪开，以免养分运转。剪碎的样品太多时，可在混匀后用四分法缩分至所需要量。用于营养诊断分析的样品还应尽可能立即称量鲜重。
采集的植株样品是否需要洗涤应视样品的清洁程度和分析要求而定。一般微量元素的分析和肉眼明显看得见或明知受到施肥污染的样品需要洗涤。植物样品应在刚采集的新鲜状态冲洗，否则一些易溶性养分很容易从已经死亡的组织中洗出。一般可以用湿棉布（必要时可
沾一些很稀的如1mg/L的有机洗涤剂）擦净表面的污染物，然后用蒸馏水或去离子水淋洗1-2次即可。
一般测定不容易起变化的组分用干燥样品较方便。新鲜样品应该立即干燥，减少体内呼吸作用和霉菌活动引起的生化变化。植株样品的干燥通常分两部分：先将鲜样在80-90℃烘箱中鼓风烘15-30min （松软组织15min ，致密组织烘30min ），然后降温到60-70℃，逐尽水分。
干样品可用研钵或带柄刀片或齿状（用于种子样品）的磨碎机粉碎，并过筛。分析样品的细度应视称量的多少而定，通常可用圆孔直径为0.5-1mm 筛，称量少于1g 的样品最好过0.25mm 甚至0.1mm 筛。过筛后应充分混匀，保存于磨口的广口瓶中，内外各贴一样的标签。样品瓶应置于洁净、干燥处。若样品可能需要保存很常时间，应进行灭菌（如γ射线），然后置于聚乙烯或袋中封口保存。
样品在粉碎和储藏过程中，又会吸收空气中的水分。所以，在精密分析称样前，还必须将粉碎的样品在65℃（12-24h ）或90℃（2h ）再次烘干，一般常规分析则不必。称样时应充分混匀后多点采样，这在称样量少而样品相对较粗时更应特别注意。
用于微量元素分析的样本采集与制备应特别注意要防止可能引起的污染。例如在干燥箱中烘干时，应该防止金属粉末的污染。用于样品采集和粉碎样品的研钵设备应该采用不锈钢器具和塑料网筛。如要准确分析铁，最好在玛瑙研钵上研磨。
4.2植物样品处理：
方法一干灰化法：称取过0.5mm 筛孔的烘干植物样品0.5-1.0000g ，置于石英坩埚中，在电炉上加热炭化，再移入高温电炉500°2-3h ，灰化后冷却。准确加入1:1硝酸溶液5ml ，溶解灰分，溶解后无损转移入50ml 容量瓶中，用水定容。用干滤纸过滤，滤液收集在干塑料瓶内。
方法二盐酸浸提法：用蒸馏水将正常叶片洗干净，在105°下“杀青”，然后放在室内晾干，用瓷研钵或不锈钢粉磨机磨碎过0.5mm 筛。分析前放在70°干燥箱内烘干4-6h ，称取样品0.5-1.0000g 加入盐酸溶液（浓度为1:50）的量按照1:50的含量.
方法三湿消化法：用蒸馏水将正常叶片洗干净，在105°下“杀青”，然后放在室内晾干，用瓷研钵或不锈钢粉磨机磨碎过0.5mm 筛。分析前放在70°干燥箱内烘干4-6h ，称取样品0.5g 左右样品放入聚四氟乙烯烧杯内加入5ml 的浓硝酸，盖好，放置过夜，次日再向烧杯中加入4ml 浓硝酸和1ml 高氯酸，控制电热板温度在180°下消解5h ，去盖。将溶液缓缓加热至干。稍事冷却，将溶液及不溶性颗粒全部转移至50ml 容量瓶中。过滤后使用滤液用AAS 法测试。
4.3植物样品测试：
按照以上的三种方法获得澄清滤液
1．取澄清的土壤(或植物) 样品待测液5 ~ 10ml呻25ml 容量瓶中；
2．加2滴2，4一二硝基酚溶液，用1mol/LNaOH调至溶液显黄色，再加0.1N HCl至黄色刚褪去。
3. 加10％盐酸羟胺溶液2ml ，摇匀，放几分钟。
4．加邻菲罗啉lml ，用水定容。
5．放30min 后比色测定，1cm 比色皿，510nm 波长。
由标准曲线查取溶液Fe 浓度。
标准曲线：
分别取10ppmFe 标准溶液0、1、2、3、4、5ml → 25ml容量瓶中，同上操作步骤进行显色测定，所得标准系列含Fe 分别为0、0.4、0.8、
1.2、1.6、2.0ppm ，以Fe 浓度对吸光度A 作标准曲线。
五、结果计算
样品含Fe(ppm) =(查曲线得ppm x V2 x 25)/(W x V1)
式中：W(g)—样品重
V1(ml)—测定时吸取样品待测液ml 数(5 ~ 10m1)。
V2(ml)—样品待测总体积(m1)。
六、注意事项
1. 不同资料中盐酸羟胺和邻菲罗啉的浓度有不同，盐酸羟胺作用是还原Fe 3+，用量能保证还原完全即可，邻菲罗啉有用0.1％、0.5％及
1.5％等浓度，为使络合完全，含铁较高的样品应该用较高浓度的邻菲罗啉，本实验用1％。
2．含Fe 高的样品溶液测定时应减少吸取量(吸1 ~ 2m1)，也可以增加标准溶液浓度至5 ~ 6ppm(显色定容后) ，扩展标准曲线。
3. 必须先加盐酸羟胺，后加显色剂，所加试剂体积应随比色体积不同而增减，以保证其浓度一定。
4．反应酸度要求为pH2~ 9，一般控制在pH5 ~ 6，pH
显色慢；pH>9，可能生成沉淀(氢氧化物等沉淀) 。加还原剂前应调pH5左右，使得加试剂后溶液pH 在适宜范围内，也有的通过加缓冲溶液，如10％ NaOAc 5 ~ 10ml，来调节和控制溶液的pH 范围。
5．比色波长可为490 ~ 530nm。
6．样品处理、测定过程中都可能存在较多的铁污染，要做空白试验；注意防止污染。该法受高氯酸干扰，植物样品不宜用HCl04消化处理，
如用HN03-HclO 4消化样品，最后必须加热至近干，去除多余的
HN03·HCl04。
七、思考题
1．邻菲罗啉法测铁的原理，反应式和应用范围?
2．加试剂的顺序不能颠倒，为什么?
3．为什么待测溶液必须先调节到中性偏酸? 请自行设计几种调节和控制溶液pH 的方法 (如果没有2，4一二硝基酚溶液，如何办)?
4．如用此法测含铁很高的土壤全铁量，应如何做? 请设计实验步骤。
5．如果待测液中含HCl04，对测定会有什么影响?