大肠杆菌耐药性研究进展
教郁，高维凡，胡彩光
(沈阳农业大学，辽宁省沈阳市，110000)
摘要：大肠杆菌是典型的革兰氏阴性杆菌，其引起的大肠杆菌病是一种常见疾病，在治疗过程中容易产生耐药性，且耐药谱广，耐药机制复杂，给养鸡业预防和治疗该病带来很大困难。大肠杆茵对抗生素的耐药问题是当前国内外研究的热点。本文对大肠杆菌耐药的现状以及产生耐药性机制的研究进行了综述，以便正确理解大肠杆菌耐药性的特点及其规律，从而为防治大肠杆菌耐药性的产生及合理用药提供理论依据。
关键词：大肠杆菌；耐药性；作用机制
The research progress on mechanism of
Drg-resistance of Escherichia coli
Abstract: E.coli is gram-negative bacteria, colibacillosis is a kind of common disease. Escherichia coli strains showed high levels of resistance, resistance spectrum to expand, and multiple drug resistance. The drug resistant gene is complex and diverse. So the prevention and treatment of the disease bring a lot of difficulties. Antibiotic resistance is the current domestic and international research hot spot. The advances on mechanism of resistance and the present situation of E coli resistance are summarized．Thus the trend of the drug-resistance on the E coli resistance can be understood better and the basis for preventing the production of the resistant stains and using drugs reasonablely can be furtherly provided．
Keywords: Eescherichia coli; resistance; resistance mechanism
致病性大肠杆菌为医学和兽医学临床感染中最常见的病原菌之一。从发病情况看，大肠杆菌病发病率在细菌病引发的疾病中居世界首位。兽医临床上大肠杆菌造成的危害十分严重，它一年四季均可致病，一直是困扰养殖业发展的常见病、多发病，给养禽业造成了严重的经济损失；大肠杆菌病的主要防治措施是应用疫苗及抗生素。国内外已研制出多种疫苗对大肠杆菌病进行预防，但因大肠杆菌具有多种血清型，仅国内报导就有80余种，应用疫苗对大肠杆菌病进行防治尚不能满足对该病的防治要求。抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着不可替代的作用，但是随着抗生素的广泛、持续及不当使用，大肠杆菌耐药谱不断扩大和耐药水平不断提高，大肠杆菌耐药及多重耐药现象已十分严重。虽然新型抗生素不断问世，但抗生素的研制速度远远低于耐药菌的产生速度。因此了解大肠杆菌耐药状况，掌握大肠杆菌耐药趋势，研究大肠杆菌耐药机理，对控制耐药菌株的蔓延具有十分重要的意义。
1.大肠杆菌耐药性现状
近年来，随着抗生素及各种化学合成药物在我国畜牧业生产中的广泛应用，大量的抗生素、消毒剂等不断进入水、土壤、河流、沉积物等各种环境中。使得大肠杆菌耐药谱不断扩大和耐药水平不断提高，给我国畜牧业的持续发展和人类健康带来潜在的危害。国内外各地均分离得到耐药家畜源性大肠杆菌，并对这些病原菌进行了耐药谱系的检测。梅姝等[1]报道分离得到的长春地区127株鹿源大肠杆菌对5种抗菌药物呈现不同
程度的耐药性，且大多数菌株呈多重耐药性，对阿莫西林、卡耐霉素较为敏感。宋立等
[2]报道分离到禽源大肠杆菌241株，耐药性非常严重，以多重耐药为主，耐10～19种药物的菌株占50%以上，总体上耐药率最高的是萘啶酸（88.1%），其它依次为四环素85.7%、磺胺甲基异恶唑81.0%、复方新诺明77.1%、氨苄西林76.2%、阿莫西林74.3%、链霉素66.2%、氟喹诺酮类57.1%～66.7%、氯霉素52.9%、庆大霉素39.0%、卡那霉素36.2%。细菌对氟苯尼考、奥格门丁、头孢曲松、头孢噻吩、阿米卡星普遍敏感，耐药率仅为0～19.5%。Zafer cantekin等[3]报道200个致病性大肠杆菌分离株的耐药性表型为青霉素（94%）、萘啶酮酸（85.5%）、磺胺甲基异恶唑（70%）、甲氧氨苄嘧啶/磺胺甲基异恶唑（69%）、氨苄青霉素（63%）、甲氧苄氨嘧啶（57%）、链霉素（45%）、恩诺沙星（39%）、头抱菌素（37%）、卡那霉素（33%）、氯霉素（20%）、新霉素（11%）、头抱吠辛（2%）、阿莫西林-克拉维酸（2%），另外43%的分离株呈现四环素药敏试验阳性，用PCR检测发现分离株中带tetA和tetB基因的分别占48%和32%,同时带有tetA和tetB基因的分离株占13%。郑朝朝等[4]报道分离的23株鸡源、14株猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药菌株检出率分别为62%和58%，不同动物源floR基因同源性为99.8%，与GenBank报道的floR基因比较存在3个氨基酸替代，鸡源floR基因在开放阅读框的第439，479，683等位存在点突变，猪源floR基因在开放阅读框的第439，683，1100等位出现点突变。杨汉春等[5]报道71株鸡源大肠杆菌都对四环素有耐药性，耐药率为100%，对氨苄西林、磺胺、头孢噻吩、三甲氧苄氨嘧啶/磺胺存在高度的耐药性，耐药率分别为76%、79%、77%、75%；对氯霉素和庆大霉素有中度的耐药性，耐药率分别为30%和32%；所有菌株对头孢曲松和头孢噻呋都敏感。在71株鸡源大肠杆菌临床分离菌株中，对4种以上抗菌药物有耐药性的占86%(61/71),其中8耐和9耐菌株占66%（47/71），2耐和3耐菌株占14%（10/71），表现多重耐药特性。叶满玉等报道根据药敏结果80株大肠杆菌对β-内酞胺类药物耐药率，氨节青霉素87.5%（70/80）、头孢噻吩27.5%（22/80）、头孢西丁3.75%（3/80）、头孢他啶8.25%（66/80）、头孢曲松2.5%（2/80）、头孢噻肟82.5%（66/80）、亚胺培南0%（0/80）、氨曲南2.5%（2/80）、头孢噻夫3.75%（3/80）、头孢吡肟0%（0/80）、头孢泊肟7.5%(6/80)。杜向党等[6]对豫北地区临床分离的102株鸡源大肠杆茵进行了MICS值测定及氟苯尼考耐药基因floR的检测。结果显示对头孢喹肟、阿米卡星和氟苯尼考的敏感率分别为93.1%、59.8%和54.9%，而对复方新诺明的耐药率达到100%，此外对四环素、多西环素、氨苄西林、恩诺沙星和沙拉沙星的耐药率为78.4%～94.1%。氟苯尼考耐药基因的分子检测显示，有45.1%的菌株显示floR基因阳性。刘雅妮等[7]对2009年分离自上海3个鸡饲养场的172株大肠杆菌进行了13种抗菌药物药敏试验，其中耐药率在90%以上的有恩诺沙星（96.5%）、四环素（94.8%）、氨苄西林（94.2%）、庆大霉素（93.6%）、复方新诺明（91.3%）；80%以上的有阿米卡星（85.5%）、阿莫西林（82.0%）、氟苯尼考（80.2%）；70%以上的磺胺异口恶唑（75.0%）、氧氟沙星（73.8%）；50%以上的有头孢唑啉（52.3%）；40%以上的有头孢噻呋（41.9%），而对粘杆菌素几乎全部敏感（99.4%）。孙金福等[8]对自辽宁地区分离的27株禽源大肠杆菌进行耐药谱检测，结果表明氨苄青霉素、安灭菌、青霉素G和四环素的耐药菌株率高达100%，利福平的耐药菌株率达96.3%，氯霉素、红霉素的耐药菌株为70.4%，卡那霉素、环丙沙星、氟哌酸的耐药菌株率为59.3%，链霉素的耐药菌株达到63.0%。氨苄西林／舒巴坦复方制剂、复达欣、庆大霉素和磷霉素的高敏菌株率分别为100%、77.8%、74.1%和51.9%。
、氨基糖苷抗性基因aadA1、aacA4和aph（3）—Ⅱ的阳性率分别是44.4%、27.8%和55.6%，
aadB未捡出。孙慧等[9]报道由山东地区采集并分离出禽源大肠杆菌共110株，对其进行5种氨基糖昔类抗菌药的敏感性的测定，并采用二重PCR法扩增耐氨基糖苷类药物的aac（3、）-Ib和ant（3、）-Ia基因。结果表明，大肠杆菌分离株对链霉素耐药率达92.7%，
其次是卡那霉素52.7%，相对敏感的是阿米卡星,耐药率只占19.10%。PCR扩增结果显
、、示ant（3）-Ia的检出率为54.55%，aac（6）-Ib的检出率为16.34%，二者同时检出率
为4.55%。金文杰等[10]对分离保存的216株禽致病性大肠杆菌进行氨基糖苷类药物耐药基因的分子流行病学检测，结果表明aadAl阳性率高达49.1%，strA和strB的阳性率分别为56%和65.7%，aph（3、）的阳性率为16.2%；近三分之二的被检菌株携带有2种以上氨基糖苷类药物耐药基因。药敏试验结果显示所有被检菌株对链霉素耐药率为68.9%，而对阿米卡星的耐药率为38.9%。
2.大肠杆菌耐药机制
大肠杆菌的耐药可以是天然固有的，也可以通过后天的基因突变、基因转移获得。固有耐药性（intrinsic resistance），即耐药性的产生并不依赖于抗菌药物的存在，而是细菌细胞所固有的，与细菌的遗传和进化密切相关。固有耐药性包括自发基因突变导致的耐药性和细胞膜药物外输作用引起的耐药性。获得性耐药性（acquired resistance)是指细菌在抗菌药物选择性压力存在下经过基因突变，或细菌在生长过程中由于移动耐药因子的转移而获得的一种表型。主要包括移动因子和抗菌药压力作用下引起基因突变所导致的耐药性。就目前的研究现状来看，大肠杆菌的耐药性机制主要有5种：①抗生素作用位点的改变或新作用位点的产生；②酶对抗生素的修饰和破坏；③增加抗生素从大肠杆菌向细胞外的主动排出作用；④细菌外膜通透性的改变；⑤质粒介导的耐药性。一种耐药机制可以对多种抗生素表现为抗性，同一种抗生素也常常出现多种耐药性机制共同抑制的现象。
2.1抗生素作用位点的改变或新作用位点的产生 大肠杆菌通过修饰抗生素作用的靶位或本身发生变异从而使靶位结构发生改变，使抗生素失效或活性减弱，从而导致对抗生素耐药。抗菌药物通过与细菌细胞的靶位点结合，干扰细菌正常的生理功能而导致细菌死亡。突变是导致大肠杆菌对抗生素耐药的主要原因。
2.1.1青霉素类 青霉素结合蛋白（penicillin-binding proteins, PBP）是一组位于细胞内膜具有催化作用的酶(转肽酶、羧肽酶和内肽酶)，参与细菌细胞壁的合成、形态维持和糖肽结构调整等功能，在细菌生长繁殖过程中起着重要作用。β-内酰胺类抗生素可专一性地与细菌细胞内膜上的靶位点（即PBP）结合，干扰细胞壁肽聚糖合成而导致细菌死亡。若PBP改变，则细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药，PBP的改变包括[11]：①PBP数量改变或缺失；②药物与PBP的亲和力降低；③细菌产生缓慢结合的PBP；④诱导性PBP的出现。耐药性一旦出现，同源的PBP染色体基因可部分转移到相关的菌株,在细菌中快速扩散而造成严重威胁。
2.1.2氟苯尼考类 氟苯尼考和氯霉素的抗性基因floR被发现是大肠杆菌特异性4284bp转座子TnfloR的一部分。TnfloR包括一个调节基因floR和转座酶基因tnpA。目前已有一种形式的TnfloR己被检测到，并且暗示出这个转座子的潜在转移性[12,13]。氟苯尼考是一种氯霉素氟化的类似物，氟苯尼考连接到细菌核糖体50S亚单位，可扰乱蛋白合成。大肠杆菌获得的抗性基因floR位于质粒上，表达了对氟苯尼考和氯霉素的抗性[14]。
2.1.3氨基糖苷类 如对链霉素耐药的突变株，就是由于耐药菌染色体上的str基因发生突变，使得核糖体305亚基上的S12蛋白的构型发生改变，而核糖体上的S12蛋白与链霉素和核糖体RNA复合体的形成有关，因而致使链霉素不能与核糖体结合，因此不能抑制蛋白质合成而产生耐药性。
2.1.4氟喹诺酮类 氟喹诺酮类药物作用位点一编码旋转酶的gyrA、gyrB基因、编码拓扑异构酶Ⅳ的parC、parE基因的点突变是大肠杆菌对喹诺酮类耐药的最
主要原因。主要的靶位在革兰阴性菌是螺旋酶，在革兰阳性菌是拓扑异构酶。gyrA的突变主要有4个位点，而且集中在较小的区域，将这一基因区段称为氟喹诺酮耐药决定区（Quinolone resistance-determining region,QRDR），即第199-318个碱
[15]基。Soussy C J等将敏感大肠杆菌的QRDR转入耐氟喹诺酮大肠杆菌，结果该菌对环丙沙星的MIC值下降为原来的1/4。将耐氟喹诺酮大肠杆菌（Ser83→Leu）的QRDR基因片段，转入敏感菌株后可使其对环丙沙星的MIC值上升为原来的4倍。充分证明QRDR的突变与细菌耐药有直接关系[16]。这些突变可以发生在主动外排改变的同时或之后,进一步增大喹诺酮类抗生素的MIC。目前研究表明可能由于DNA旋转酶对氟喹诺酮药物比拓朴异构酶Ⅳ更敏感，拓朴异构酶Ⅳ只是药物的从属靶位。因此只有在编码旋转酶的基因发生耐氟喹诺酮突变的基础上，才会出现parC、parE点突变。尽管喹诺酮抗性大多来自染色体突变，但是它也可被肠杆菌科家族膜上质粒编码的qnr基因调控，能够导致对喹诺酮类药物低水平耐药。
2.2酶对抗菌药物的修饰和破坏 酶对抗菌药物的修饰和破坏是大肠杆菌常见的耐药机理之一，包括氨基糖苷类钝化酶、β-内酰胺酶、乙酰转移酶（耐氯霉素）和酯酶（耐大环内酯类）。
2.2.1氨基糖苷类钝化酶 大肠杆菌对氨基糖苷类耐药的主要原因是细菌产生钝化酶，通过N-乙酰转移酶和O-核苷转移酶，将氨基糖苷类抗生素的游离羧基磷酸化或核苷化，在使之不能与作用靶位相结合，从而产生耐药性。大肠杆菌对氨基糖苷类药物耐药的方式主要有3种：①细胞膜通透性改变，药物无法通过细胞膜进入细胞内部；②核蛋白体变异，药物无法作用于核蛋白体；③细菌产生灭活酶，使药物在到达靶位之前即失去活性。
2.2.2β-内酰胺酶 由于耐药菌产生β-内酰胺酶(包括主要作用于青霉素类的青霉素酶和主要作用于头孢菌素类的头孢菌素酶，以及作用于两者的中间类型)，β-内酰胺酶可水解该类药物的β-内酰胺环使酰胺键断裂而失去活性。
2.2.3乙酰转移酶 大肠杆菌对氯霉素耐药性是由于产生氯霉素乙酰转移酶，CAT催化了乙酰辅酶A(CoA)依赖位于C-3位羟基的乙酰化，使氯霉素生成了3-乙酰氯霉素，3-乙酰氯霉素经过非酶分子内重排产生了1-乙酰氯霉素，后者最终形成了1,3-二乙酰氯霉素。值得注意的是3-乙酰氯霉素即不能与细菌的核糖体结合，从而使氯霉素类抗生素转化为无抗菌活性的代谢产物。
2.2.4酯酶 在大肠杆菌中，ereA和ereB基因分别介导的红霉素I型和II型酯酶，产生了对大环内酯类抗生素的钝化作用，致使红霉素等大环内酯类抗生素对其作用失效而耐药。
2.3增加抗生素从大肠杆菌向细胞外的主动排出作用 主动外排系统是指大肠杆菌细胞内膜存在的能量依赖性蛋白质外排泵，通过主动外排作用可将药物从菌体内排出，使细菌产生对多种抗生素的耐药性。大肠杆菌的主动外排系统包括位于细胞内膜上的转运蛋白、外膜通道蛋白以及连接两者的膜融合蛋白（也称为辅助蛋白）。这种三联体结构必须正确组装在一起才能发挥主动外排功能。其中转运蛋白可分为5个不同的蛋白超家族[17]：抗性结节细胞分裂超家族（Resistance-nodulation-cell division super family,RND)、主要易化因子超家族（Major facilitator super family,MFS）、小基因多重药物抗性超家族（Small multidrug resistance super family,SMR）、ATP结合盒超家族（ATP binding cassette super family，ABC）和多重药物与毒物外排超家族（Multidrug and toxic compound extrusion super family,MATE）。
大肠杆菌至少具有37种与药物转运相关的转运体，其中NND类有7种、MFS类19种、SMR类3种、MATE类1种及ABC类7种。研究最早最深入的是AcrA-AcrB-TolC多重药物外排泵，属于RND家族。该家族的作用底物主要有四环素、氯霉素、氟喹诺酮类、β-内酰胺类、新生霉素、红霉素、利福平、溴化乙锭、吖啶黄、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸、结晶紫、吐温100、牛胆酸钠、丝裂霉素C、有机溶剂、放线菌素D、万古霉素、染料、氨基糖苷类、胆汁盐等
[18]。该系统包括药物转运蛋白AcrB、膜融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[19]。若系统失活，可导致菌株从多重耐药状态变为相对敏感状态。敲除acrAB或tolC基因后，大肠杆菌对药物的敏感性明显增加[20]。
2.4细菌外膜通透性的改变 药物进入菌体必须通过菌体外膜，因而菌体外膜的通透性直接影响药物通过菌体外膜。菌体外膜对药物的通透性下降，造成细菌内药物累积浓度降低，表现为耐药。大肠杆菌细胞壁的外面有一层由多种蛋白质组成的外膜，一方面起到屏障作用，使一些物质和某些药物不能通过外膜进入菌体，另一方面外膜蛋白构成的通道也是亲水性溶质、营养素、代谢产物进出细胞的通道，通过两个方面的调节来维持菌体正常的渗透性。当细菌发生突变而导致某种特异膜孔蛋白的丢失或膜孔蛋白发生结构或数量的改变后，使该孔蛋白通道关闭或消失，导致对不同种类抗生素的交叉耐药。大肠杆菌外膜上存在多种外膜蛋白(Omp)，主要有OmpA、OmpF、OmpC等，其中OmpF、OmpC与抗菌药物通透性关系密切，OmpF缺失，OmpC增加可以使细胞膜对抗生素的通透性下降，造成细菌对多种抗生素的敏感性降低产生多重耐药性。在膜耐药的同时，往往伴随外输泵活动加强，两者协同作用，使细菌对一系列结构不相关的抗生素、有机溶媒等产生抵抗。
2.5质粒介导的耐药性 质粒是指存在于细菌等微生物细胞内，由共价闭环双链DNA组成的自由粒子。它存在于细胞中，是独立于细菌染色体外，能够自我复制、稳定遗传的遗传单位。携带耐药基因的质粒称为耐药质粒。耐药质粒可以将大肠杆菌的耐药基因通过转化、转导和结合方式在菌间相互转移，从而使大肠杆菌的耐药性迅速传播[21]。耐药质粒根据其能否通过接合作用进行传递而分为两大类[22]：一类为接合性质粒，简称R质粒。它由耐药性传递因子（RTF）和耐药基因两部分组成。另一类称为非接合性质粒，简称r质粒。它具有耐药基因和维持它在细胞内独立存在的基因，无FTR。当它与R质粒共同存在于一个细菌细胞内时，在一定的条件下，可以被诱导形成共价整合体而随同R质粒一起进行传递。另外，一个耐药质粒可以携带多个耐药基因，故一次细菌间的传递，就可以使受体菌获得对多种抗菌药物的抗性，这也是导致抗生素药物疗效显著下降的一个重要原因。
3.小结
由于广谱抗菌药的滥用以及细菌间耐药基因的转导等因素，导致耐药菌增多，尤其是大肠杆菌对常用抗菌药物耐药的发展越来越令人担忧。本文对大肠杆菌耐药现状、耐药机制两方面的研究进行了综述，提供了大肠杆菌耐药特点及其规律的最新研究进展，从而为防治大肠杆菌耐药的产生及合理用药提供了理论依据。
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1.大肠杆菌耐药性现状
近年来，随着抗生素及各种化学合成药物在我国畜牧业生产中的广泛应用，大量的抗生素、消毒剂等不断进入水、土壤、河流、沉积物等各种环境中。使得大肠杆菌耐药谱不断扩大和耐药水平不断提高，给我国畜牧业的持续发展和人类健康带来潜在的危害。国内外各地均分离得到耐药家畜源性大肠杆菌，并对这些病原菌进行了耐药谱系的检测。梅姝等[1]报道分离得到的长春地区127株鹿源大肠杆菌对5种抗菌药物呈现不同
程度的耐药性，且大多数菌株呈多重耐药性，对阿莫西林、卡耐霉素较为敏感。宋立等
[2]报道分离到禽源大肠杆菌241株，耐药性非常严重，以多重耐药为主，耐10～19种药物的菌株占50%以上，总体上耐药率最高的是萘啶酸（88.1%），其它依次为四环素85.7%、磺胺甲基异恶唑81.0%、复方新诺明77.1%、氨苄西林76.2%、阿莫西林74.3%、链霉素66.2%、氟喹诺酮类57.1%～66.7%、氯霉素52.9%、庆大霉素39.0%、卡那霉素36.2%。细菌对氟苯尼考、奥格门丁、头孢曲松、头孢噻吩、阿米卡星普遍敏感，耐药率仅为0～19.5%。Zafer cantekin等[3]报道200个致病性大肠杆菌分离株的耐药性表型为青霉素（94%）、萘啶酮酸（85.5%）、磺胺甲基异恶唑（70%）、甲氧氨苄嘧啶/磺胺甲基异恶唑（69%）、氨苄青霉素（63%）、甲氧苄氨嘧啶（57%）、链霉素（45%）、恩诺沙星（39%）、头抱菌素（37%）、卡那霉素（33%）、氯霉素（20%）、新霉素（11%）、头抱吠辛（2%）、阿莫西林-克拉维酸（2%），另外43%的分离株呈现四环素药敏试验阳性，用PCR检测发现分离株中带tetA和tetB基因的分别占48%和32%,同时带有tetA和tetB基因的分离株占13%。郑朝朝等[4]报道分离的23株鸡源、14株猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药菌株检出率分别为62%和58%，不同动物源floR基因同源性为99.8%，与GenBank报道的floR基因比较存在3个氨基酸替代，鸡源floR基因在开放阅读框的第439，479，683等位存在点突变，猪源floR基因在开放阅读框的第439，683，1100等位出现点突变。杨汉春等[5]报道71株鸡源大肠杆菌都对四环素有耐药性，耐药率为100%，对氨苄西林、磺胺、头孢噻吩、三甲氧苄氨嘧啶/磺胺存在高度的耐药性，耐药率分别为76%、79%、77%、75%；对氯霉素和庆大霉素有中度的耐药性，耐药率分别为30%和32%；所有菌株对头孢曲松和头孢噻呋都敏感。在71株鸡源大肠杆菌临床分离菌株中，对4种以上抗菌药物有耐药性的占86%(61/71),其中8耐和9耐菌株占66%（47/71），2耐和3耐菌株占14%（10/71），表现多重耐药特性。叶满玉等报道根据药敏结果80株大肠杆菌对β-内酞胺类药物耐药率，氨节青霉素87.5%（70/80）、头孢噻吩27.5%（22/80）、头孢西丁3.75%（3/80）、头孢他啶8.25%（66/80）、头孢曲松2.5%（2/80）、头孢噻肟82.5%（66/80）、亚胺培南0%（0/80）、氨曲南2.5%（2/80）、头孢噻夫3.75%（3/80）、头孢吡肟0%（0/80）、头孢泊肟7.5%(6/80)。杜向党等[6]对豫北地区临床分离的102株鸡源大肠杆茵进行了MICS值测定及氟苯尼考耐药基因floR的检测。结果显示对头孢喹肟、阿米卡星和氟苯尼考的敏感率分别为93.1%、59.8%和54.9%，而对复方新诺明的耐药率达到100%，此外对四环素、多西环素、氨苄西林、恩诺沙星和沙拉沙星的耐药率为78.4%～94.1%。氟苯尼考耐药基因的分子检测显示，有45.1%的菌株显示floR基因阳性。刘雅妮等[7]对2009年分离自上海3个鸡饲养场的172株大肠杆菌进行了13种抗菌药物药敏试验，其中耐药率在90%以上的有恩诺沙星（96.5%）、四环素（94.8%）、氨苄西林（94.2%）、庆大霉素（93.6%）、复方新诺明（91.3%）；80%以上的有阿米卡星（85.5%）、阿莫西林（82.0%）、氟苯尼考（80.2%）；70%以上的磺胺异口恶唑（75.0%）、氧氟沙星（73.8%）；50%以上的有头孢唑啉（52.3%）；40%以上的有头孢噻呋（41.9%），而对粘杆菌素几乎全部敏感（99.4%）。孙金福等[8]对自辽宁地区分离的27株禽源大肠杆菌进行耐药谱检测，结果表明氨苄青霉素、安灭菌、青霉素G和四环素的耐药菌株率高达100%，利福平的耐药菌株率达96.3%，氯霉素、红霉素的耐药菌株为70.4%，卡那霉素、环丙沙星、氟哌酸的耐药菌株率为59.3%，链霉素的耐药菌株达到63.0%。氨苄西林／舒巴坦复方制剂、复达欣、庆大霉素和磷霉素的高敏菌株率分别为100%、77.8%、74.1%和51.9%。
、氨基糖苷抗性基因aadA1、aacA4和aph（3）—Ⅱ的阳性率分别是44.4%、27.8%和55.6%，
aadB未捡出。孙慧等[9]报道由山东地区采集并分离出禽源大肠杆菌共110株，对其进行5种氨基糖昔类抗菌药的敏感性的测定，并采用二重PCR法扩增耐氨基糖苷类药物的aac（3、）-Ib和ant（3、）-Ia基因。结果表明，大肠杆菌分离株对链霉素耐药率达92.7%，
其次是卡那霉素52.7%，相对敏感的是阿米卡星,耐药率只占19.10%。PCR扩增结果显
、、示ant（3）-Ia的检出率为54.55%，aac（6）-Ib的检出率为16.34%，二者同时检出率
为4.55%。金文杰等[10]对分离保存的216株禽致病性大肠杆菌进行氨基糖苷类药物耐药基因的分子流行病学检测，结果表明aadAl阳性率高达49.1%，strA和strB的阳性率分别为56%和65.7%，aph（3、）的阳性率为16.2%；近三分之二的被检菌株携带有2种以上氨基糖苷类药物耐药基因。药敏试验结果显示所有被检菌株对链霉素耐药率为68.9%，而对阿米卡星的耐药率为38.9%。
2.大肠杆菌耐药机制
大肠杆菌的耐药可以是天然固有的，也可以通过后天的基因突变、基因转移获得。固有耐药性（intrinsic resistance），即耐药性的产生并不依赖于抗菌药物的存在，而是细菌细胞所固有的，与细菌的遗传和进化密切相关。固有耐药性包括自发基因突变导致的耐药性和细胞膜药物外输作用引起的耐药性。获得性耐药性（acquired resistance)是指细菌在抗菌药物选择性压力存在下经过基因突变，或细菌在生长过程中由于移动耐药因子的转移而获得的一种表型。主要包括移动因子和抗菌药压力作用下引起基因突变所导致的耐药性。就目前的研究现状来看，大肠杆菌的耐药性机制主要有5种：①抗生素作用位点的改变或新作用位点的产生；②酶对抗生素的修饰和破坏；③增加抗生素从大肠杆菌向细胞外的主动排出作用；④细菌外膜通透性的改变；⑤质粒介导的耐药性。一种耐药机制可以对多种抗生素表现为抗性，同一种抗生素也常常出现多种耐药性机制共同抑制的现象。
2.1抗生素作用位点的改变或新作用位点的产生 大肠杆菌通过修饰抗生素作用的靶位或本身发生变异从而使靶位结构发生改变，使抗生素失效或活性减弱，从而导致对抗生素耐药。抗菌药物通过与细菌细胞的靶位点结合，干扰细菌正常的生理功能而导致细菌死亡。突变是导致大肠杆菌对抗生素耐药的主要原因。
2.1.1青霉素类 青霉素结合蛋白（penicillin-binding proteins, PBP）是一组位于细胞内膜具有催化作用的酶(转肽酶、羧肽酶和内肽酶)，参与细菌细胞壁的合成、形态维持和糖肽结构调整等功能，在细菌生长繁殖过程中起着重要作用。β-内酰胺类抗生素可专一性地与细菌细胞内膜上的靶位点（即PBP）结合，干扰细胞壁肽聚糖合成而导致细菌死亡。若PBP改变，则细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药，PBP的改变包括[11]：①PBP数量改变或缺失；②药物与PBP的亲和力降低；③细菌产生缓慢结合的PBP；④诱导性PBP的出现。耐药性一旦出现，同源的PBP染色体基因可部分转移到相关的菌株,在细菌中快速扩散而造成严重威胁。
2.1.2氟苯尼考类 氟苯尼考和氯霉素的抗性基因floR被发现是大肠杆菌特异性4284bp转座子TnfloR的一部分。TnfloR包括一个调节基因floR和转座酶基因tnpA。目前已有一种形式的TnfloR己被检测到，并且暗示出这个转座子的潜在转移性[12,13]。氟苯尼考是一种氯霉素氟化的类似物，氟苯尼考连接到细菌核糖体50S亚单位，可扰乱蛋白合成。大肠杆菌获得的抗性基因floR位于质粒上，表达了对氟苯尼考和氯霉素的抗性[14]。
2.1.3氨基糖苷类 如对链霉素耐药的突变株，就是由于耐药菌染色体上的str基因发生突变，使得核糖体305亚基上的S12蛋白的构型发生改变，而核糖体上的S12蛋白与链霉素和核糖体RNA复合体的形成有关，因而致使链霉素不能与核糖体结合，因此不能抑制蛋白质合成而产生耐药性。
2.1.4氟喹诺酮类 氟喹诺酮类药物作用位点一编码旋转酶的gyrA、gyrB基因、编码拓扑异构酶Ⅳ的parC、parE基因的点突变是大肠杆菌对喹诺酮类耐药的最
主要原因。主要的靶位在革兰阴性菌是螺旋酶，在革兰阳性菌是拓扑异构酶。gyrA的突变主要有4个位点，而且集中在较小的区域，将这一基因区段称为氟喹诺酮耐药决定区（Quinolone resistance-determining region,QRDR），即第199-318个碱
[15]基。Soussy C J等将敏感大肠杆菌的QRDR转入耐氟喹诺酮大肠杆菌，结果该菌对环丙沙星的MIC值下降为原来的1/4。将耐氟喹诺酮大肠杆菌（Ser83→Leu）的QRDR基因片段，转入敏感菌株后可使其对环丙沙星的MIC值上升为原来的4倍。充分证明QRDR的突变与细菌耐药有直接关系[16]。这些突变可以发生在主动外排改变的同时或之后,进一步增大喹诺酮类抗生素的MIC。目前研究表明可能由于DNA旋转酶对氟喹诺酮药物比拓朴异构酶Ⅳ更敏感，拓朴异构酶Ⅳ只是药物的从属靶位。因此只有在编码旋转酶的基因发生耐氟喹诺酮突变的基础上，才会出现parC、parE点突变。尽管喹诺酮抗性大多来自染色体突变，但是它也可被肠杆菌科家族膜上质粒编码的qnr基因调控，能够导致对喹诺酮类药物低水平耐药。
2.2酶对抗菌药物的修饰和破坏 酶对抗菌药物的修饰和破坏是大肠杆菌常见的耐药机理之一，包括氨基糖苷类钝化酶、β-内酰胺酶、乙酰转移酶（耐氯霉素）和酯酶（耐大环内酯类）。
2.2.1氨基糖苷类钝化酶 大肠杆菌对氨基糖苷类耐药的主要原因是细菌产生钝化酶，通过N-乙酰转移酶和O-核苷转移酶，将氨基糖苷类抗生素的游离羧基磷酸化或核苷化，在使之不能与作用靶位相结合，从而产生耐药性。大肠杆菌对氨基糖苷类药物耐药的方式主要有3种：①细胞膜通透性改变，药物无法通过细胞膜进入细胞内部；②核蛋白体变异，药物无法作用于核蛋白体；③细菌产生灭活酶，使药物在到达靶位之前即失去活性。
2.2.2β-内酰胺酶 由于耐药菌产生β-内酰胺酶(包括主要作用于青霉素类的青霉素酶和主要作用于头孢菌素类的头孢菌素酶，以及作用于两者的中间类型)，β-内酰胺酶可水解该类药物的β-内酰胺环使酰胺键断裂而失去活性。
2.2.3乙酰转移酶 大肠杆菌对氯霉素耐药性是由于产生氯霉素乙酰转移酶，CAT催化了乙酰辅酶A(CoA)依赖位于C-3位羟基的乙酰化，使氯霉素生成了3-乙酰氯霉素，3-乙酰氯霉素经过非酶分子内重排产生了1-乙酰氯霉素，后者最终形成了1,3-二乙酰氯霉素。值得注意的是3-乙酰氯霉素即不能与细菌的核糖体结合，从而使氯霉素类抗生素转化为无抗菌活性的代谢产物。
2.2.4酯酶 在大肠杆菌中，ereA和ereB基因分别介导的红霉素I型和II型酯酶，产生了对大环内酯类抗生素的钝化作用，致使红霉素等大环内酯类抗生素对其作用失效而耐药。
2.3增加抗生素从大肠杆菌向细胞外的主动排出作用 主动外排系统是指大肠杆菌细胞内膜存在的能量依赖性蛋白质外排泵，通过主动外排作用可将药物从菌体内排出，使细菌产生对多种抗生素的耐药性。大肠杆菌的主动外排系统包括位于细胞内膜上的转运蛋白、外膜通道蛋白以及连接两者的膜融合蛋白（也称为辅助蛋白）。这种三联体结构必须正确组装在一起才能发挥主动外排功能。其中转运蛋白可分为5个不同的蛋白超家族[17]：抗性结节细胞分裂超家族（Resistance-nodulation-cell division super family,RND)、主要易化因子超家族（Major facilitator super family,MFS）、小基因多重药物抗性超家族（Small multidrug resistance super family,SMR）、ATP结合盒超家族（ATP binding cassette super family，ABC）和多重药物与毒物外排超家族（Multidrug and toxic compound extrusion super family,MATE）。
大肠杆菌至少具有37种与药物转运相关的转运体，其中NND类有7种、MFS类19种、SMR类3种、MATE类1种及ABC类7种。研究最早最深入的是AcrA-AcrB-TolC多重药物外排泵，属于RND家族。该家族的作用底物主要有四环素、氯霉素、氟喹诺酮类、β-内酰胺类、新生霉素、红霉素、利福平、溴化乙锭、吖啶黄、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸、结晶紫、吐温100、牛胆酸钠、丝裂霉素C、有机溶剂、放线菌素D、万古霉素、染料、氨基糖苷类、胆汁盐等
[18]。该系统包括药物转运蛋白AcrB、膜融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[19]。若系统失活，可导致菌株从多重耐药状态变为相对敏感状态。敲除acrAB或tolC基因后，大肠杆菌对药物的敏感性明显增加[20]。
2.4细菌外膜通透性的改变 药物进入菌体必须通过菌体外膜，因而菌体外膜的通透性直接影响药物通过菌体外膜。菌体外膜对药物的通透性下降，造成细菌内药物累积浓度降低，表现为耐药。大肠杆菌细胞壁的外面有一层由多种蛋白质组成的外膜，一方面起到屏障作用，使一些物质和某些药物不能通过外膜进入菌体，另一方面外膜蛋白构成的通道也是亲水性溶质、营养素、代谢产物进出细胞的通道，通过两个方面的调节来维持菌体正常的渗透性。当细菌发生突变而导致某种特异膜孔蛋白的丢失或膜孔蛋白发生结构或数量的改变后，使该孔蛋白通道关闭或消失，导致对不同种类抗生素的交叉耐药。大肠杆菌外膜上存在多种外膜蛋白(Omp)，主要有OmpA、OmpF、OmpC等，其中OmpF、OmpC与抗菌药物通透性关系密切，OmpF缺失，OmpC增加可以使细胞膜对抗生素的通透性下降，造成细菌对多种抗生素的敏感性降低产生多重耐药性。在膜耐药的同时，往往伴随外输泵活动加强，两者协同作用，使细菌对一系列结构不相关的抗生素、有机溶媒等产生抵抗。
2.5质粒介导的耐药性 质粒是指存在于细菌等微生物细胞内，由共价闭环双链DNA组成的自由粒子。它存在于细胞中，是独立于细菌染色体外，能够自我复制、稳定遗传的遗传单位。携带耐药基因的质粒称为耐药质粒。耐药质粒可以将大肠杆菌的耐药基因通过转化、转导和结合方式在菌间相互转移，从而使大肠杆菌的耐药性迅速传播[21]。耐药质粒根据其能否通过接合作用进行传递而分为两大类[22]：一类为接合性质粒，简称R质粒。它由耐药性传递因子（RTF）和耐药基因两部分组成。另一类称为非接合性质粒，简称r质粒。它具有耐药基因和维持它在细胞内独立存在的基因，无FTR。当它与R质粒共同存在于一个细菌细胞内时，在一定的条件下，可以被诱导形成共价整合体而随同R质粒一起进行传递。另外，一个耐药质粒可以携带多个耐药基因，故一次细菌间的传递，就可以使受体菌获得对多种抗菌药物的抗性，这也是导致抗生素药物疗效显著下降的一个重要原因。
3.小结
由于广谱抗菌药的滥用以及细菌间耐药基因的转导等因素，导致耐药菌增多，尤其是大肠杆菌对常用抗菌药物耐药的发展越来越令人担忧。本文对大肠杆菌耐药现状、耐药机制两方面的研究进行了综述，提供了大肠杆菌耐药特点及其规律的最新研究进展，从而为防治大肠杆菌耐药的产生及合理用药提供了理论依据。
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