(一) 酶标抗体的条件
1. 纯度高、含杂蛋白少, 用IgG 优于血清抗体，用Fab 优于IgG 。
2. 特异性强 即抗IgG 与IgG 在免疫电泳上只有一条沉淀线, 与IgG 的全血清也只有一条沉淀线, 这才算是特异性的单价抗体。
3. 效价高 一般琼脂扩散鉴定为1：64以上才算合格。
(二) 酶标记方法
1. 交联法 交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。
(1) 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万) ，酶分子量小(4万), 抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作：①抗IgG-AKP 的制备：将10mgAKP 溶于含有5mg 抗IgG 的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0) 中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml ，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛，4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱); ②抗IgG-HRP 的制备：将12mgHRP 溶于含5mg 抗IgG 的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中, 缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL ，置室温2h~3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。或冷冻干燥保存。
(2) 二步法：是先使酶与戊二醛反应, 除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作：将10mg 的酶溶于0.2ml 含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS 中室温放置18h ，充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml 然后加入1ml(含5mg) 的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混合后4℃冰箱放置24h ，加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸，置室温2h ，以0.15Mol/L
pH7.2 PBS 液充分透析，离心去沉淀，上清液即为酶结合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。AKP 一般不采用二步法, 而只用一步法。
改良HRP 二步标记法：取HRP10mg 溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入25%戊二醛0.1ml ，37℃温育2h 后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml ，2 500r/min离心沉淀10min~15min，倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入0.5ml~1ml 抗IgG 抗体溶液(含抗体15mg 左右) ，放在冰箱内过夜后，加KH2 PO4，使近中性即可应用。
2. 氧化法 采用过碘酸钠，过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP 的甘露糖部分(与酶活性无关的部分) 的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合, 形成酶标抗体。
(1)氧化法操作过程如下：将5mgHRP 溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液, 在室温中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4)，置室温中轻搅30min ，在溶液呈黄绿色时，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室温中放置1h ，使氧化反应中止，然后在4℃中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析，换液3次。在3ml HRP-醛基溶液中，加入5mg(溶于1ml 的碳酸盐缓冲液中) ，室温置2h~3h，加入5mg 氢化硼钠(NaBH4)，于4℃冰箱放置3h 或过夜，然后用PBS 液充分透析，离心去沉淀物。上清液即为酶结合物，纯化后使用。
(2)改良过碘酸钠法：①取5mg HRP 溶于0.5ml 双馏水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水+128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置4℃30min; ② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml ，室温放置30min; ③加入含5mg 纯化抗体的水溶液1ml ，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜) ，使之结合; ④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置4℃2h; ⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min ，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS 液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜; ⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得酶-抗体(HRP-IgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml; ⑦效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。
(一) 酶标抗体的条件
1. 纯度高、含杂蛋白少, 用IgG 优于血清抗体，用Fab 优于IgG 。
2. 特异性强 即抗IgG 与IgG 在免疫电泳上只有一条沉淀线, 与IgG 的全血清也只有一条沉淀线, 这才算是特异性的单价抗体。
3. 效价高 一般琼脂扩散鉴定为1：64以上才算合格。
(二) 酶标记方法
1. 交联法 交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。
(1) 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万) ，酶分子量小(4万), 抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作：①抗IgG-AKP 的制备：将10mgAKP 溶于含有5mg 抗IgG 的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0) 中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml ，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛，4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱); ②抗IgG-HRP 的制备：将12mgHRP 溶于含5mg 抗IgG 的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中, 缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL ，置室温2h~3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。或冷冻干燥保存。
(2) 二步法：是先使酶与戊二醛反应, 除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作：将10mg 的酶溶于0.2ml 含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS 中室温放置18h ，充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml 然后加入1ml(含5mg) 的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混合后4℃冰箱放置24h ，加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸，置室温2h ，以0.15Mol/L
pH7.2 PBS 液充分透析，离心去沉淀，上清液即为酶结合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。AKP 一般不采用二步法, 而只用一步法。
改良HRP 二步标记法：取HRP10mg 溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入25%戊二醛0.1ml ，37℃温育2h 后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml ，2 500r/min离心沉淀10min~15min，倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入0.5ml~1ml 抗IgG 抗体溶液(含抗体15mg 左右) ，放在冰箱内过夜后，加KH2 PO4，使近中性即可应用。
2. 氧化法 采用过碘酸钠，过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP 的甘露糖部分(与酶活性无关的部分) 的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合, 形成酶标抗体。
(1)氧化法操作过程如下：将5mgHRP 溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液, 在室温中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4)，置室温中轻搅30min ，在溶液呈黄绿色时，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室温中放置1h ，使氧化反应中止，然后在4℃中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析，换液3次。在3ml HRP-醛基溶液中，加入5mg(溶于1ml 的碳酸盐缓冲液中) ，室温置2h~3h，加入5mg 氢化硼钠(NaBH4)，于4℃冰箱放置3h 或过夜，然后用PBS 液充分透析，离心去沉淀物。上清液即为酶结合物，纯化后使用。
(2)改良过碘酸钠法：①取5mg HRP 溶于0.5ml 双馏水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水+128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置4℃30min; ② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml ，室温放置30min; ③加入含5mg 纯化抗体的水溶液1ml ，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜) ，使之结合; ④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置4℃2h; ⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min ，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS 液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜; ⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得酶-抗体(HRP-IgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml; ⑦效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。