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大豆磷脂微生物限度检测方法验证
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目 录
1适用范围 ....................................................................................................................... - 1 - 2目的 ............................................................................................................................... - 1 - 3概述 ............................................................................................................................... - 1 - 4验证所需要的仪器设备及文件 ................................................................................... - 1 - 5可接受的限度范围标准 ............................................................................................... - 2 - 6测试方法 ....................................................................................................................... - 5 - 7异常情况处理 ............................................................................................................. - 15 - 8测试结果 ..................................................................................................................... - 15 - 9结论 ............................................................................................................................. - 15 - 10再验证周期 ............................................................................................................... - 16 - 11附表 ........................................................................................................................... - 16 -
1适用范围
本验证方案适用于大豆磷脂微生物限度检查法的验证。
2目的
建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的完整性，保证检验结果的可靠性。
3概述
3.1按《中国药典》2010年版附录Ⅺ J《微生物限度检查法方法》的“供试品的制备”项下制备方法2（固体、半固体或黏稠液供试品，取供试品10g ，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀, 作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀）制备。 按“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法1平皿法进行细菌，霉菌及酵母菌的计数方法验证。按控制菌的检查法进行控制菌检查法验证。验证试验使用一批产品进行三次独立平行试验。
3.2验证时间： 年 月 日 到 年 月 日
3.3验证产品批号：
4验证所需要的仪器设备及文件
4.1验证需用仪器设备
4.2验证所需要的文件及存放地方
5可接受的限度范围标准
5.1大豆磷脂微生物限度检查质量标准
5.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判断
在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌；若任一次试验中实验组的菌回收率低于70%，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
5.3控制菌检查方法验证结果判断
若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。
5.4大肠埃希菌检查结果判断
如MUG 阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG 阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG 阳性、靛基质阴性，或MUG 阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24h 。
若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，判定供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与下表所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。
当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验M U G 呈阳性，供试品M U G 阳性、靛基质阳性，报告lg 或l m l供试品检出大肠埃希菌。M U G 阴性、靛基质阴性，报告lg 或l m l供试品未检出大肠埃希菌。
M U G 阳性、靛基质阴性、I M V i C试验为一+ ——、革兰阴性杆菌，报告lg 或l m l供试品检出大肠埃希菌;M U G 阴性、靛基质阳性、I M V i C试验为+ + — —、革兰阴性杆菌，报告l g或l m l供试品检出大肠埃希菌。
供试品培养物检查不符合二项中的任一项，报告l g或l m l 供试品未检出大肠埃希菌。
当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠埃希菌，不能做出检验报告。
5.5沙门菌检查结果判断
供试品培养物为革兰阴性杆菌，三糖铁琼脂反应及生化反应符合沙门菌属反应，沙门菌属0 多价1 血清凝集试验阳性反应(含待检培养物经100℃30min 处理后凝集试验为阳性反应），报告10g 或10ml 供试品检出沙门菌。
供试品培养物三糖铁琼脂反应或生化反应不符合沙门菌属反应及沙门菌属0 多价1 血清凝集试验为阴性反应(含待检培养物经100℃30min 处理后凝集试验为阴性反应），报告lg 或lml 供试品未检出沙门菌。
供试品培养物出现下列情况应继续鉴定或保留菌种送交有关单位进一步鉴定后，再作报告。
供试品培养物生化反应符合沙门菌属反应，沙门菌属0 多价1 血清凝集试验阴性反应。
供试品培养物生化反应不符合沙门菌属反应，沙门菌属0 多价
1 血清凝集反应呈阳性反应。
对已检出沙门菌的供试品分离菌种，有条件者，应进一步作菌型鉴定。根据检出菌的特性, 推断可能菌型，增加生化试验项目及沙门菌单因子血清“0”及“H ”凝集试验进行鉴定。
5.6铜绿假单胞菌检查结果判断
供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者，即报告lg 或lml 供试品检出铜绿假单胞菌。
供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培养物，绿脓菌素试验阴性时，其硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验及明胶液化试验皆为阳性时，亦报告lg 或lml 供试品检出铜绿假单胞菌。
凡与以上两种结果不符时，报告lg 或lml 供试品未检出铜绿假单胞菌。
5.7金黄色葡萄球菌检查结果判断
如果革兰染色镜检结果清晰可靠(必要时加做已知革兰染色镜检结果的细菌进行染色质量控制），凝固酶试验阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验呈阳性结果，供试品培养物按下列情况报告或处理：
疑似菌革兰染色镜检呈阳性球菌, 血浆凝固酶试验阳性反应者，报告lg 或lml 供试品检出金黄色葡萄球菌(少许菌株可能不是金黄色葡萄球菌而是葡萄球菌属的其他菌种）。
革兰染色镜检镜检不是革兰阳性球菌, 或血浆凝固酶试验阴性反应，报告lg 或lml 供试品禾检出金黄色葡萄球菌。
阴性对照有菌生长，试验结果无效。
阳性对照试验呈阴性结果，应当加做验证试验，考察检品是否有抑菌活性。
6测试方法
6.1供试品
大豆磷脂，批号 。
6.2培养基及菌种
6.2.1采用符合中国药典规定的干燥培养基，中国药品生物制品检定所制。
6.2.2 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、
大肠埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、
黑曲霉CMCC(F)98003、乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094、
铜绿假单胞菌CMCC(B)10104
6.3菌液制备
6.3.1细菌、霉菌及酵母菌检查的菌液制备
6.3.1.1取新鲜的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，经30～35℃培养18～24h ，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为50～100cfu 的菌悬液，做活菌计数备用。
6.3.1.2取新鲜的白色念珠菌的培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，经23～28℃培养24～48h ，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为50～100cfu 的菌悬液，做活菌计数备用。
6.3.1.3取新鲜的黑曲霉培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基，经23～28℃培养5～7d ，加入3～5ml 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将霉菌孢子洗脱。然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为50～100cfu 的菌悬液，做活菌计数备用。
6.3.2控制菌检查的菌液的制备
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌培养物少许，接种至10 ml营养肉汤培养基内，置30〜35℃培养18〜24h ，取均匀培养物lml, 用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每lml 含菌10〜lOOcfu 的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。
6.3.3供试品制备
取供试品10g ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ，制成1：10的供试液。
6.4验证试验方法
细菌、霉菌及酵母菌检验方法验证采用上述供试品，进行3次平行试验，分别人工
污染上述5种代表试验菌株。控制菌检验方法验证采用上述批供试品进行实验。
6.4.1细菌、霉菌及酵母菌的计数方法验证试验
6.4.1.1试验分组
6.4.1.1.1供试品对照组：
取上述供试液1ml ，按菌落计数方法测定供试品本底细菌数；
取上述供试液1ml ，按菌落计数方法测定供试品本底霉菌和酵母菌数；
6.4.1.1.2菌液组：
分别取上述5种试验菌悬液1ml ，按菌落计数方法测定所加试验菌数。
6.4.1.1.3试验组：
取1：10供试液1ml 注入无菌平皿，分别加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液各1ml ，按平皿法测定其菌数。
取1：10供试液1ml 注入无菌平皿，分别加入白色念珠菌和黑曲霉悬液各1ml ，按平皿法测定霉菌数。
6.4.1.1.4稀释剂对照组：
取实验用的稀释液1ml 代替供试品，加入实验菌，按菌落计数方法测定所加的试验菌数。
6.4.1.2验证试验操作
6.4.1.2.1取供试品10g ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ，制成1：10的供试液。取上述供试液1ml ，注入无菌平皿中，注入15〜20ml 不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。
6.4.1.2.2阴性对照试验
取实验用的稀释液1ml ，注入无菌平皿中，注入15〜20ml 不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养，均不得有菌生长。
6.4.1.2.3培养和计数 细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至5～7天进行菌落计数报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级别两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠培养基用于霉菌及酵母菌计数；
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌，细菌菌落数。然后将营养琼脂上的霉菌和酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上细菌数与玫瑰红钠琼脂培养基上的霉菌和酵母菌或营养琼脂培养基上的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌落数为计数结果。
6.4.1.3菌数报告规则
以相当于1g 供试品的菌落数报告菌数；若无菌落生长，以
6.4.1.4计算公式
试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数试 验组的菌回 收率 % ×100% 菌液组的平均菌落数
6.4.2控制菌的检查验证试验
6.4.2.1大肠埃希菌
试验组：取1：10供试液10ml 和大肠埃希菌悬液1ml ，接种至100ml 胆盐乳糖
培养基中。
供试品组：取1：10供试液10ml ，接种至100ml 胆盐乳糖培养基中。
阳性对照试验：取大肠埃希菌悬液1ml ，同供试品的控制菌检查法检查。 阳性对照试验应检出大肠埃希菌。
阴性对照试验：取稀释液10ml ，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴
性对照应无菌生长。
大肠埃希菌的试验：
按上述分组接种至100ml 胆盐乳酸培养基中，30～35℃培养18～24小时，必要时可延长至48h 。取上述培养物0.2ml ，接种至含5mlMUG 培养基的试管中，培养，于5h 、24h 在366nm 紫外线下观察，同时用未接种的MUG 培养基作为本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG 阳性；不呈现荧光，为MUG 阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG 阴性和靛基质阴性。
如呈现M U G 阳性、綻基质阴性或M U G 阴性、靛基质阳性时，应将上述供试品B L 增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1〜2 环培养液划线于E M B 或麦康凯琼脂平板上，培养18〜24h 。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1 所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。当阳性对照的平板
呈典型菌落生长时，若E M B 或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列菌落形态特征相符或疑似者，应挑取可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和I M V i C 试验，确认是否为大肠埃希菌。
如E M B 或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1 所列特征相符或疑似者， 以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2〜3 个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面, 培养18〜24h, 作以下检査。如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于E M B 琼脂平板，培养18〜24h ，再挑选单个疑似菌落，纯培养, 作以下检查。
革兰染色镜检、镜检
以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均勻涂片，自然或微温，再通过火焰2〜3 次干燥使固定。 滴加结晶紫染液，染色lmin, 水洗。
滴加碘液, 媒染lmin, 水洗，以滤纸吸干余水。
滴加9 5 % 乙醇, 脱色20〜30s, 至流出液无色, 水洗。
滴加沙黄染液，复染lmin ，待干后，镜检。
染色结果
革兰阳性菌呈蓝紫色; 革兰阴性菌呈红色。
大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。
生化试验
乳糖发酵试验取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24〜48h ，观察产酸(指示剂为酸性品红者为红色; 指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气(小倒管内有气泡，气泡无论大小都是产气）。
为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5 % 乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于2 4 h出现阳性。或适当延长培养时间。
靛基质试验(I)取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24〜4 8h，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98% 的大肠埃希菌靛基质试验为阳性。一般2 4 h即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1 或2 m l 培养液进行检查，如錠基质是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养2 4h，作靛基质试验。
甲基红试验( M ) 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培
养48士2 h，于培养液中加人甲基红指示液2 〜3 滴（约每m l 培养液加指示液1 滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。 乙酿甲基甲醇生成试验( V - P )取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h ，于2 m l 培养液中加入cr 萘酚乙醇试液lml, 混匀，再加4 0 %氢氧化钾试液0.4ml, 充分振摇，在4h(通常在30min) 内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。
枸橼酸盐利用试验（C ) 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2 〜4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性, 培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性。 6.4.2.2沙门菌
试验组：取1：10供试液10ml 和沙门菌悬液1ml ，接种至200ml 营养肉汤培养
基中。
供试品组：取1：10供试液10ml ，接种至200ml 营养肉汤培养基中。 阳性对照试验：取沙门菌悬液1ml ，同供试品的控制菌检查法检查。 阳性对照试验应检出沙门菌。
阴性对照试验：取稀释液10ml ，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。 沙门菌的试验：
按上述分组，30〜35℃培养18〜24 h后观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长。轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照瓶，分别吸取lml 接种于1管含10ml 四硫磺酸钠亮绿培养基的试管中，培养18〜24h 。轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照瓶，分别以接种环沾取1〜2 环培养液接种于胆盐硫乳琼脂(DHL)或沙门菌志贺菌琼脂(SS)平板及曙红亚甲蓝（EMB) 琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养24〜48h ，必要时延长至40〜48h 。检查平板上有无疑似沙门菌菌落。 初步鉴别试验
从每个供试品的分离平板上挑取2〜3 个疑似菌落(菌落形态特征与表3 所列的形态特征相符或疑似) 分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面(或者克氏双糖铁琼脂斜面) 并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养18〜24h ，观察结果。
疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应为：①斜面红色（产碱），底层黑色（产H2S) 并显示黄色(产酸）；②斜面红色，底层黄色; ③斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，斜面未见红色底层未见黄色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。 将疑似沙门菌的三糖铁琼脂或营养琼脂斜面培养物作生化试验，血清凝集试验及革兰染色镜检, 镜检。沙门菌应为革兰阴性杆菌。 生化试验
靛基质试验用接种环沾取少许培养物，接种到蛋白胨水培养基中，照大肠杆菌 检査法靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应。
脲酶试验用接种环沾取少许培养物，划线接种于脲琼脂斜面，培养2 4 h ,观察结果。斜面变为红色为阳性反应, 沙门菌属为阴性反应。
氰化钾试验将培养物先接种至营养肉汤培养基中培养20〜24h ，用接种环沾取 培养液1 环，接种至氰化钾培养基内，另取一环培养液接种于不含氰化钾的同样培养基内作对照管，接种后即以橡胶塞塞紧，培养24〜48h ，观察结果。对照管内有菌生长（混浊），而试验管也有菌生长为阳性反应；对照管有菌生长（混浊）而试验管无菌生长（清亮）为阴性反应。沙门菌应为阴性反应。 本试验应十分注意密封管口，夏天分装培养基宜在冰浴中进行，防止氰化钾分解，产生氢氰酸逸出，致使培养基内氰化钾浓度降低，不能抑制细菌生长，造成假阳性。氰化钾为剧毒品、操作时须谨慎，切勿用口吸液。用后的培养基每管加数粒硫酸亚铁和20%氢氧化钾0.5ml 去毒。然后再灭菌、洗涤。
赖氨酸脱羧酶试验用接种环沾取少许培养物，接种在赖氨酸脱竣酶培养基中， 同时接种一支不含赖氨酸的同样培养基作为对照管，培养24〜4 8 h 观察结果。对照管黄色(产酸），试验管呈紫色为阳性反应(赖氨酸脱羧产碱）；试验管黄色为阴性反应。沙门菌应为阳性反应。
动力试验用接种针沾取培养物, 穿刺接种于半固体营养琼脂管中，培养24h, 观 察结果。有动力的细菌能在穿刺线以外的培养基内扩散生长使培养基呈混浊现象; 无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，不向外扩散，培养基仍呈清晰透明状; 无动力表现的培养物，应在室温保留2 〜3 天后，再行观察。沙门菌除鸡雏沙门菌及无动力的变种外，均具有周身鞭毛，能运动，动力试验阳性。沙门菌生化反应的初步鉴别见下表。
针对三糖铁琼脂上的反应，+ 产酸(黄色），阳性，阳性率,> 9 0 % ; —产碱(红色），阴性，阴性率，> 9 0 % ; + / —多数阳性、少数阴性；+ S 产生少量气体; + 阳性，阳性率,> 9 0 % 广阴性，阴性率，> 9 0 % ; + / - 多数阳性、少数阴性，一/ + 多数阴性、少数阳性（本表依据何晓青卫生防疫细菌检验，参考第八版《美国临床微生物手册》）；反应序号1 除典型反应外，脲酶、氰化钾试验、赖氨酸脱羧酶试验三项中有一项异常；反应序号2仅靛基质阳性; 可结合血清学凝集试验，或加做部分生化试验, 判定是否为沙门菌, 其他情况可排除沙门菌。
血清学凝集试验
准备1 片洁净的灭菌载玻片，在近中央的一端，以直径3mm 接种环沾取沙门菌属0 多价1 血清2〜3 环制成与玻片横径相垂直的条形涂抹，长约1.5cm ，宽约0.5cm 。另一端用生理盐水代替血清同法操作，作为阴性对照。
用接种环分别挑取三糖铁琼脂斜面或营养琼脂斜面的新鲜培养物少许，在血清和盐水中混匀。菌量要适当，勿过浓。
将玻片前后倾斜数次，以暗色背景衬底，在良好的照明条件下进行观察，阴性对照不出现凝集现象，试验组任何程度的凝集现象都是阳性反应。阳性反应通常在3min 内发生。有时因血清效价低、反应迟缓时，应将玻片置培养皿内，
并放一个湿棉球在旁边，盖上皿盖，经约20min ，再观察结果。如果仍然没有出现凝集，应取斜面培养物，置含少量生理盐水的试管中，制成浓菌悬液，在100°C 水浴中保温30min ，以除去可能存在的V i抗原，待冷，再做凝集试 验，如出现凝集, 仍判为阳性反应; 如不出现凝集现象，则为阴性反应。 如对照试验出现凝集现象为非特异反应，须对该菌株培养物进行处理后再作凝集试验。 6.4.2.3铜绿假单胞菌
试验组：取1：10供试液10ml 和铜绿假单胞菌悬液1ml ，接种至100ml 胆盐乳
糖培养基中。
供试品组：取1：10供试液10ml ，接种至100ml 胆盐乳糖培养基中。 阳性对照试验：取铜绿假单胞菌悬液1ml ，同供试品的控制菌检查法检查。 阳性对照试验应检出铜绿假单胞菌。
阴性对照试验：取稀释液10ml ，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。 铜绿假单胞菌的试验：
按上述分组，于30〜35℃培养18〜24h(必要时可延至48h) 。阴性对照菌应无菌生长。轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取1〜2环培养液（如有菌膜应挑取之），划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板，于30〜35℃培养18〜24h 。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象, 在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色，但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗糙型和黏液型等，应注意挑选。 纯培养
供试品分离平板生长典型菌落或呈疑似菌落时，以接种计轻轻接触单个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取2〜3 个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面, 培养，作以下检查。 革兰染色镜检
铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列。 生化试验
可用铜绿假单胞菌〔C M C C (B) 10104〕做生化试验的阳性对照株。 氧化酶试验
取一小块白色洁净的滤纸置平皿内，以无菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸上，随即滴加1 滴新配制的1 % 二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30S 内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应。 本试验应注意：
( 1 )试验菌落(苔) 必须新鲜，陈旧培养物反应结果不可靠。
( 2 )试验避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种计（环）（白金材料除外）挑取菌（苔），否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒。
( 3 )试剂宜新鲜配制，放置过久, 二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用。 ( 4 )反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴性反应。
( 5 ) 麦康凯、S S培养基等含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验，因为糖分解产酸抑制氧化酶活性。 绿脓菌素试验
取营养琼脂斜面培养物接种于绿脓菌素测定用培养基（P D P )斜面上，30〜35°C 培、养24h 后，观察斜面有无色素，如有色素, 在试管内加三氯甲烷3 〜5 m l，以无菌玻棒搅碎培养基并充分振摇。使培养物中的色素完全萃取在三氯甲烷内。静置片刻，待三氯甲烷分层，用吸管将三氯甲烷移至另一试管中，加入盐酸试液（lmol/L)约1ml ，振摇后静置片刻，如在盐酸液层内出现粉红色、即为阳性反应，无粉红色出现为阴性反应。本试验可用未接种的P D P 琼脂培养基斜面作阴性对照，阴性对照试验应当呈阴性。如培养基斜面无色素产生，应于室温培养1〜2天再按上法试验。凡经再次检验，绿脓菌素试验仍为阴性者应继续以下试验。 硝酸盐还原产气试验
以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物接种于硝酸盐胨水培养基中，置30〜35°C 培养24h ，观察结果。如果在培养基内的小倒管中有气体产生，即为阳性反应，表明该培养物能还原硝酸盐, 并将亚硝酸盐分解产生氮气。小倒管内无气泡者为阴性反应。 42°C 生长试验
以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物于0 . 9 %无菌氯化钠溶液中，制成菌悬液。然后将菌悬液划线接种于营养琼脂斜面上，立即置41°C 士1°C 的恒
温水浴箱内，务使整个斜面浸没在水浴中，培养24〜48h, 斜面如有菌苔生长者为阳性反应; 无菌苔生长为阴性反应。 明胶液化试验
以接种计沾取营养琼脂斜面培养物少许，穿刺接种于明胶培养基中，穿刺深度应接近培养基的底部，于30〜35°C 培养24h 。取出放入0〜4°C 冰箱内10〜30min 。如培养基呈溶液状，即为明胶液化试验阳性反应; 如明胶呈凝固状，为阴性反应。 本试验应注意：
( 1 )本试验接种前，培养基应为固态，否则需将培养基置冰箱内使之凝固后，再穿刺接种。
( 2 )试验应同时设未接种细菌的阴性对照管，与试验管同时培养并观察结果。 6.4.2.3金黄色葡萄球菌
试验组：取1：10供试液10ml 和金黄色葡萄球菌悬液1ml ，接种至100ml 营养
肉汤培养基中。
供试品组：取1：10供试液10ml ，接种至100ml 营养肉汤培养基中。 阳性对照试验：取金黄色葡萄球菌悬液1ml ，同供试品的控制菌检查法检查。 阳性对照试验应检出金黄色葡萄球菌。
阴性对照试验：取稀释液10ml ，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。 金黄色葡萄球菌的试验：
按上述分组，置30〜35℃培养18〜24h(必要时可延至48h) 。阴性对照应无菌生长。 将上述供试品增菌培养液，以接种环沾取1〜2环培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置30〜35℃培养24〜72h 。当供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于金黄色葡萄球菌特征，可报告为lg 或lml 供试品未检出金黄色葡萄球菌。 纯培养
当供试品分离平板生长菌落与表1 所列菌落特征相似或疑似时，应选取2 〜3 个以上菌落，分别用接种针，轻轻沾取菌落中心表面培养物，接种于营养琼脂斜面上，于30〜35°C 培养18〜24h ，取营养琼脂斜面培养物作革兰染色、镜检及接种营养琼脂肉汤于30〜35°C 培养18〜2 4 h做血浆凝固酶试验。 革兰染色、镜检
金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌, 无芽孢，一般不产生荚膜。排列呈不规则 的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。 血浆凝固酶试验
试管法:取无菌试管（l O m m X 1 0 0 m m ) 3支，各加人血浆和0. 9 % 无菌氯化钠溶液（1 : 1)0. 5ml, 1 支加入琼脂斜面培养物菌悬液(或被检菌的营养肉汤培养液>0. 5 m l，其余2 支作对照管：1 支加入金黄色葡萄球菌[ C M C C ( B ) 2 6 0 0 3 ]培养物菌悬液或营养肉汤培养液0. 5 ml作为阳性对照; 另一支加入营养肉汤或0. 9 % 无菌氯化钠溶液0. 5 m l 作阴性对照。三管同时置37°C 水浴或恒温培养箱，3 h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h 。检査时，轻轻将试管倾斜（动作勿大），仔细观察，阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管血浆呈凝固状，试验管呈凝固者为阳性反应; 不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。 7异常情况处理
严格按照《微生物限度检查法SOP 》操作，如在检测中出现不符合要求的情况出现，分析问题原因后，决定是否需对本方案中设定的大豆磷脂的微生物限度检查方法进行修改，并重新进行验证。 8测试结果
8.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果见附表1。 8.2控制菌的检查方法验证结果见附表2～5。
8.3按确定的验证方法检验三批产品微生物限度检查结果见附表6。 9结论
9.1按照《大豆磷脂检验操作规程》，我们设定了该产品的微生物限度检验方法， 对 批次大豆磷脂进行了微生物方法学验证，结果各项指标 标准规定，证明该标准操作规程 检验需要， GMP要求， 使用。 9.2通过检验，各项指标的回收率均大于70%，说明大豆磷脂用平皿法检验无抑菌性，故适用于大豆磷脂的微生物检验。确定大豆磷脂微生物限度检查法如下：
质量负责人： 审核人： 检验人 10再验证周期
10.1大豆磷脂的处方发生变动或其它因素变更导致大豆磷脂的物料性质改变时，需要对本方案进行调整后作方法学再验证。
10.2国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证。
11附表
实验日期： 报告日期： 检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期：
附表2：大肠埃希菌检查方法的验证结果
品名：大豆磷脂 批号：
实验日期： 报告日期： 检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期：
- 1 -
附表3：沙门菌检查方法的验证结果
品名：大豆磷脂 批号：
实验日期： 报告日期： 检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期：
附表4：铜绿假单胞菌检查方法的验证结果
品名：大豆磷脂 批号：
实验日期： 报告日期： 检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期：
附表5：金黄色葡萄球菌检查方法的验证结果
品名：大豆磷脂 批号：
实验日期： 报告日期： 检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期：
附表6：按确定的验证方法检验三批产品微生物限度检查结果
品名：大豆磷脂
实验日期： 报告日期： 检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期：
验证文件
大豆磷脂微生物限度检测方法验证
起 草 人
起草日期
审 核 人
审核日期批 准 人
批准日期
文件编号
目 录
1适用范围 ....................................................................................................................... - 1 - 2目的 ............................................................................................................................... - 1 - 3概述 ............................................................................................................................... - 1 - 4验证所需要的仪器设备及文件 ................................................................................... - 1 - 5可接受的限度范围标准 ............................................................................................... - 2 - 6测试方法 ....................................................................................................................... - 5 - 7异常情况处理 ............................................................................................................. - 15 - 8测试结果 ..................................................................................................................... - 15 - 9结论 ............................................................................................................................. - 15 - 10再验证周期 ............................................................................................................... - 16 - 11附表 ........................................................................................................................... - 16 -
1适用范围
本验证方案适用于大豆磷脂微生物限度检查法的验证。
2目的
建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的完整性，保证检验结果的可靠性。
3概述
3.1按《中国药典》2010年版附录Ⅺ J《微生物限度检查法方法》的“供试品的制备”项下制备方法2（固体、半固体或黏稠液供试品，取供试品10g ，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀, 作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀）制备。 按“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法1平皿法进行细菌，霉菌及酵母菌的计数方法验证。按控制菌的检查法进行控制菌检查法验证。验证试验使用一批产品进行三次独立平行试验。
3.2验证时间： 年 月 日 到 年 月 日
3.3验证产品批号：
4验证所需要的仪器设备及文件
4.1验证需用仪器设备
4.2验证所需要的文件及存放地方
5可接受的限度范围标准
5.1大豆磷脂微生物限度检查质量标准
5.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判断
在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌；若任一次试验中实验组的菌回收率低于70%，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
5.3控制菌检查方法验证结果判断
若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。
5.4大肠埃希菌检查结果判断
如MUG 阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG 阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG 阳性、靛基质阴性，或MUG 阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24h 。
若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，判定供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与下表所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。
当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验M U G 呈阳性，供试品M U G 阳性、靛基质阳性，报告lg 或l m l供试品检出大肠埃希菌。M U G 阴性、靛基质阴性，报告lg 或l m l供试品未检出大肠埃希菌。
M U G 阳性、靛基质阴性、I M V i C试验为一+ ——、革兰阴性杆菌，报告lg 或l m l供试品检出大肠埃希菌;M U G 阴性、靛基质阳性、I M V i C试验为+ + — —、革兰阴性杆菌，报告l g或l m l供试品检出大肠埃希菌。
供试品培养物检查不符合二项中的任一项，报告l g或l m l 供试品未检出大肠埃希菌。
当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠埃希菌，不能做出检验报告。
5.5沙门菌检查结果判断
供试品培养物为革兰阴性杆菌，三糖铁琼脂反应及生化反应符合沙门菌属反应，沙门菌属0 多价1 血清凝集试验阳性反应(含待检培养物经100℃30min 处理后凝集试验为阳性反应），报告10g 或10ml 供试品检出沙门菌。
供试品培养物三糖铁琼脂反应或生化反应不符合沙门菌属反应及沙门菌属0 多价1 血清凝集试验为阴性反应(含待检培养物经100℃30min 处理后凝集试验为阴性反应），报告lg 或lml 供试品未检出沙门菌。
供试品培养物出现下列情况应继续鉴定或保留菌种送交有关单位进一步鉴定后，再作报告。
供试品培养物生化反应符合沙门菌属反应，沙门菌属0 多价1 血清凝集试验阴性反应。
供试品培养物生化反应不符合沙门菌属反应，沙门菌属0 多价
1 血清凝集反应呈阳性反应。
对已检出沙门菌的供试品分离菌种，有条件者，应进一步作菌型鉴定。根据检出菌的特性, 推断可能菌型，增加生化试验项目及沙门菌单因子血清“0”及“H ”凝集试验进行鉴定。
5.6铜绿假单胞菌检查结果判断
供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者，即报告lg 或lml 供试品检出铜绿假单胞菌。
供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培养物，绿脓菌素试验阴性时，其硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验及明胶液化试验皆为阳性时，亦报告lg 或lml 供试品检出铜绿假单胞菌。
凡与以上两种结果不符时，报告lg 或lml 供试品未检出铜绿假单胞菌。
5.7金黄色葡萄球菌检查结果判断
如果革兰染色镜检结果清晰可靠(必要时加做已知革兰染色镜检结果的细菌进行染色质量控制），凝固酶试验阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验呈阳性结果，供试品培养物按下列情况报告或处理：
疑似菌革兰染色镜检呈阳性球菌, 血浆凝固酶试验阳性反应者，报告lg 或lml 供试品检出金黄色葡萄球菌(少许菌株可能不是金黄色葡萄球菌而是葡萄球菌属的其他菌种）。
革兰染色镜检镜检不是革兰阳性球菌, 或血浆凝固酶试验阴性反应，报告lg 或lml 供试品禾检出金黄色葡萄球菌。
阴性对照有菌生长，试验结果无效。
阳性对照试验呈阴性结果，应当加做验证试验，考察检品是否有抑菌活性。
6测试方法
6.1供试品
大豆磷脂，批号 。
6.2培养基及菌种
6.2.1采用符合中国药典规定的干燥培养基，中国药品生物制品检定所制。
6.2.2 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、
大肠埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、
黑曲霉CMCC(F)98003、乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094、
铜绿假单胞菌CMCC(B)10104
6.3菌液制备
6.3.1细菌、霉菌及酵母菌检查的菌液制备
6.3.1.1取新鲜的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，经30～35℃培养18～24h ，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为50～100cfu 的菌悬液，做活菌计数备用。
6.3.1.2取新鲜的白色念珠菌的培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，经23～28℃培养24～48h ，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为50～100cfu 的菌悬液，做活菌计数备用。
6.3.1.3取新鲜的黑曲霉培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基，经23～28℃培养5～7d ，加入3～5ml 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将霉菌孢子洗脱。然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为50～100cfu 的菌悬液，做活菌计数备用。
6.3.2控制菌检查的菌液的制备
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌培养物少许，接种至10 ml营养肉汤培养基内，置30〜35℃培养18〜24h ，取均匀培养物lml, 用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每lml 含菌10〜lOOcfu 的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。
6.3.3供试品制备
取供试品10g ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ，制成1：10的供试液。
6.4验证试验方法
细菌、霉菌及酵母菌检验方法验证采用上述供试品，进行3次平行试验，分别人工
污染上述5种代表试验菌株。控制菌检验方法验证采用上述批供试品进行实验。
6.4.1细菌、霉菌及酵母菌的计数方法验证试验
6.4.1.1试验分组
6.4.1.1.1供试品对照组：
取上述供试液1ml ，按菌落计数方法测定供试品本底细菌数；
取上述供试液1ml ，按菌落计数方法测定供试品本底霉菌和酵母菌数；
6.4.1.1.2菌液组：
分别取上述5种试验菌悬液1ml ，按菌落计数方法测定所加试验菌数。
6.4.1.1.3试验组：
取1：10供试液1ml 注入无菌平皿，分别加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液各1ml ，按平皿法测定其菌数。
取1：10供试液1ml 注入无菌平皿，分别加入白色念珠菌和黑曲霉悬液各1ml ，按平皿法测定霉菌数。
6.4.1.1.4稀释剂对照组：
取实验用的稀释液1ml 代替供试品，加入实验菌，按菌落计数方法测定所加的试验菌数。
6.4.1.2验证试验操作
6.4.1.2.1取供试品10g ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ，制成1：10的供试液。取上述供试液1ml ，注入无菌平皿中，注入15〜20ml 不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。
6.4.1.2.2阴性对照试验
取实验用的稀释液1ml ，注入无菌平皿中，注入15〜20ml 不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养，均不得有菌生长。
6.4.1.2.3培养和计数 细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至5～7天进行菌落计数报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级别两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠培养基用于霉菌及酵母菌计数；
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌，细菌菌落数。然后将营养琼脂上的霉菌和酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上细菌数与玫瑰红钠琼脂培养基上的霉菌和酵母菌或营养琼脂培养基上的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌落数为计数结果。
6.4.1.3菌数报告规则
以相当于1g 供试品的菌落数报告菌数；若无菌落生长，以
6.4.1.4计算公式
试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数试 验组的菌回 收率 % ×100% 菌液组的平均菌落数
6.4.2控制菌的检查验证试验
6.4.2.1大肠埃希菌
试验组：取1：10供试液10ml 和大肠埃希菌悬液1ml ，接种至100ml 胆盐乳糖
培养基中。
供试品组：取1：10供试液10ml ，接种至100ml 胆盐乳糖培养基中。
阳性对照试验：取大肠埃希菌悬液1ml ，同供试品的控制菌检查法检查。 阳性对照试验应检出大肠埃希菌。
阴性对照试验：取稀释液10ml ，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴
性对照应无菌生长。
大肠埃希菌的试验：
按上述分组接种至100ml 胆盐乳酸培养基中，30～35℃培养18～24小时，必要时可延长至48h 。取上述培养物0.2ml ，接种至含5mlMUG 培养基的试管中，培养，于5h 、24h 在366nm 紫外线下观察，同时用未接种的MUG 培养基作为本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG 阳性；不呈现荧光，为MUG 阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG 阴性和靛基质阴性。
如呈现M U G 阳性、綻基质阴性或M U G 阴性、靛基质阳性时，应将上述供试品B L 增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1〜2 环培养液划线于E M B 或麦康凯琼脂平板上，培养18〜24h 。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1 所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。当阳性对照的平板
呈典型菌落生长时，若E M B 或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列菌落形态特征相符或疑似者，应挑取可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和I M V i C 试验，确认是否为大肠埃希菌。
如E M B 或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1 所列特征相符或疑似者， 以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2〜3 个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面, 培养18〜24h, 作以下检査。如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于E M B 琼脂平板，培养18〜24h ，再挑选单个疑似菌落，纯培养, 作以下检查。
革兰染色镜检、镜检
以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均勻涂片，自然或微温，再通过火焰2〜3 次干燥使固定。 滴加结晶紫染液，染色lmin, 水洗。
滴加碘液, 媒染lmin, 水洗，以滤纸吸干余水。
滴加9 5 % 乙醇, 脱色20〜30s, 至流出液无色, 水洗。
滴加沙黄染液，复染lmin ，待干后，镜检。
染色结果
革兰阳性菌呈蓝紫色; 革兰阴性菌呈红色。
大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。
生化试验
乳糖发酵试验取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24〜48h ，观察产酸(指示剂为酸性品红者为红色; 指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气(小倒管内有气泡，气泡无论大小都是产气）。
为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5 % 乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于2 4 h出现阳性。或适当延长培养时间。
靛基质试验(I)取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24〜4 8h，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98% 的大肠埃希菌靛基质试验为阳性。一般2 4 h即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1 或2 m l 培养液进行检查，如錠基质是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养2 4h，作靛基质试验。
甲基红试验( M ) 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培
养48士2 h，于培养液中加人甲基红指示液2 〜3 滴（约每m l 培养液加指示液1 滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。 乙酿甲基甲醇生成试验( V - P )取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h ，于2 m l 培养液中加入cr 萘酚乙醇试液lml, 混匀，再加4 0 %氢氧化钾试液0.4ml, 充分振摇，在4h(通常在30min) 内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。
枸橼酸盐利用试验（C ) 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2 〜4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性, 培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性。 6.4.2.2沙门菌
试验组：取1：10供试液10ml 和沙门菌悬液1ml ，接种至200ml 营养肉汤培养
基中。
供试品组：取1：10供试液10ml ，接种至200ml 营养肉汤培养基中。 阳性对照试验：取沙门菌悬液1ml ，同供试品的控制菌检查法检查。 阳性对照试验应检出沙门菌。
阴性对照试验：取稀释液10ml ，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。 沙门菌的试验：
按上述分组，30〜35℃培养18〜24 h后观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长。轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照瓶，分别吸取lml 接种于1管含10ml 四硫磺酸钠亮绿培养基的试管中，培养18〜24h 。轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照瓶，分别以接种环沾取1〜2 环培养液接种于胆盐硫乳琼脂(DHL)或沙门菌志贺菌琼脂(SS)平板及曙红亚甲蓝（EMB) 琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养24〜48h ，必要时延长至40〜48h 。检查平板上有无疑似沙门菌菌落。 初步鉴别试验
从每个供试品的分离平板上挑取2〜3 个疑似菌落(菌落形态特征与表3 所列的形态特征相符或疑似) 分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面(或者克氏双糖铁琼脂斜面) 并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养18〜24h ，观察结果。
疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应为：①斜面红色（产碱），底层黑色（产H2S) 并显示黄色(产酸）；②斜面红色，底层黄色; ③斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，斜面未见红色底层未见黄色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。 将疑似沙门菌的三糖铁琼脂或营养琼脂斜面培养物作生化试验，血清凝集试验及革兰染色镜检, 镜检。沙门菌应为革兰阴性杆菌。 生化试验
靛基质试验用接种环沾取少许培养物，接种到蛋白胨水培养基中，照大肠杆菌 检査法靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应。
脲酶试验用接种环沾取少许培养物，划线接种于脲琼脂斜面，培养2 4 h ,观察结果。斜面变为红色为阳性反应, 沙门菌属为阴性反应。
氰化钾试验将培养物先接种至营养肉汤培养基中培养20〜24h ，用接种环沾取 培养液1 环，接种至氰化钾培养基内，另取一环培养液接种于不含氰化钾的同样培养基内作对照管，接种后即以橡胶塞塞紧，培养24〜48h ，观察结果。对照管内有菌生长（混浊），而试验管也有菌生长为阳性反应；对照管有菌生长（混浊）而试验管无菌生长（清亮）为阴性反应。沙门菌应为阴性反应。 本试验应十分注意密封管口，夏天分装培养基宜在冰浴中进行，防止氰化钾分解，产生氢氰酸逸出，致使培养基内氰化钾浓度降低，不能抑制细菌生长，造成假阳性。氰化钾为剧毒品、操作时须谨慎，切勿用口吸液。用后的培养基每管加数粒硫酸亚铁和20%氢氧化钾0.5ml 去毒。然后再灭菌、洗涤。
赖氨酸脱羧酶试验用接种环沾取少许培养物，接种在赖氨酸脱竣酶培养基中， 同时接种一支不含赖氨酸的同样培养基作为对照管，培养24〜4 8 h 观察结果。对照管黄色(产酸），试验管呈紫色为阳性反应(赖氨酸脱羧产碱）；试验管黄色为阴性反应。沙门菌应为阳性反应。
动力试验用接种针沾取培养物, 穿刺接种于半固体营养琼脂管中，培养24h, 观 察结果。有动力的细菌能在穿刺线以外的培养基内扩散生长使培养基呈混浊现象; 无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，不向外扩散，培养基仍呈清晰透明状; 无动力表现的培养物，应在室温保留2 〜3 天后，再行观察。沙门菌除鸡雏沙门菌及无动力的变种外，均具有周身鞭毛，能运动，动力试验阳性。沙门菌生化反应的初步鉴别见下表。
针对三糖铁琼脂上的反应，+ 产酸(黄色），阳性，阳性率,> 9 0 % ; —产碱(红色），阴性，阴性率，> 9 0 % ; + / —多数阳性、少数阴性；+ S 产生少量气体; + 阳性，阳性率,> 9 0 % 广阴性，阴性率，> 9 0 % ; + / - 多数阳性、少数阴性，一/ + 多数阴性、少数阳性（本表依据何晓青卫生防疫细菌检验，参考第八版《美国临床微生物手册》）；反应序号1 除典型反应外，脲酶、氰化钾试验、赖氨酸脱羧酶试验三项中有一项异常；反应序号2仅靛基质阳性; 可结合血清学凝集试验，或加做部分生化试验, 判定是否为沙门菌, 其他情况可排除沙门菌。
血清学凝集试验
准备1 片洁净的灭菌载玻片，在近中央的一端，以直径3mm 接种环沾取沙门菌属0 多价1 血清2〜3 环制成与玻片横径相垂直的条形涂抹，长约1.5cm ，宽约0.5cm 。另一端用生理盐水代替血清同法操作，作为阴性对照。
用接种环分别挑取三糖铁琼脂斜面或营养琼脂斜面的新鲜培养物少许，在血清和盐水中混匀。菌量要适当，勿过浓。
将玻片前后倾斜数次，以暗色背景衬底，在良好的照明条件下进行观察，阴性对照不出现凝集现象，试验组任何程度的凝集现象都是阳性反应。阳性反应通常在3min 内发生。有时因血清效价低、反应迟缓时，应将玻片置培养皿内，
并放一个湿棉球在旁边，盖上皿盖，经约20min ，再观察结果。如果仍然没有出现凝集，应取斜面培养物，置含少量生理盐水的试管中，制成浓菌悬液，在100°C 水浴中保温30min ，以除去可能存在的V i抗原，待冷，再做凝集试 验，如出现凝集, 仍判为阳性反应; 如不出现凝集现象，则为阴性反应。 如对照试验出现凝集现象为非特异反应，须对该菌株培养物进行处理后再作凝集试验。 6.4.2.3铜绿假单胞菌
试验组：取1：10供试液10ml 和铜绿假单胞菌悬液1ml ，接种至100ml 胆盐乳
糖培养基中。
供试品组：取1：10供试液10ml ，接种至100ml 胆盐乳糖培养基中。 阳性对照试验：取铜绿假单胞菌悬液1ml ，同供试品的控制菌检查法检查。 阳性对照试验应检出铜绿假单胞菌。
阴性对照试验：取稀释液10ml ，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。 铜绿假单胞菌的试验：
按上述分组，于30〜35℃培养18〜24h(必要时可延至48h) 。阴性对照菌应无菌生长。轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取1〜2环培养液（如有菌膜应挑取之），划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板，于30〜35℃培养18〜24h 。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象, 在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色，但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗糙型和黏液型等，应注意挑选。 纯培养
供试品分离平板生长典型菌落或呈疑似菌落时，以接种计轻轻接触单个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取2〜3 个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面, 培养，作以下检查。 革兰染色镜检
铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列。 生化试验
可用铜绿假单胞菌〔C M C C (B) 10104〕做生化试验的阳性对照株。 氧化酶试验
取一小块白色洁净的滤纸置平皿内，以无菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸上，随即滴加1 滴新配制的1 % 二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30S 内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应。 本试验应注意：
( 1 )试验菌落(苔) 必须新鲜，陈旧培养物反应结果不可靠。
( 2 )试验避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种计（环）（白金材料除外）挑取菌（苔），否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒。
( 3 )试剂宜新鲜配制，放置过久, 二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用。 ( 4 )反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴性反应。
( 5 ) 麦康凯、S S培养基等含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验，因为糖分解产酸抑制氧化酶活性。 绿脓菌素试验
取营养琼脂斜面培养物接种于绿脓菌素测定用培养基（P D P )斜面上，30〜35°C 培、养24h 后，观察斜面有无色素，如有色素, 在试管内加三氯甲烷3 〜5 m l，以无菌玻棒搅碎培养基并充分振摇。使培养物中的色素完全萃取在三氯甲烷内。静置片刻，待三氯甲烷分层，用吸管将三氯甲烷移至另一试管中，加入盐酸试液（lmol/L)约1ml ，振摇后静置片刻，如在盐酸液层内出现粉红色、即为阳性反应，无粉红色出现为阴性反应。本试验可用未接种的P D P 琼脂培养基斜面作阴性对照，阴性对照试验应当呈阴性。如培养基斜面无色素产生，应于室温培养1〜2天再按上法试验。凡经再次检验，绿脓菌素试验仍为阴性者应继续以下试验。 硝酸盐还原产气试验
以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物接种于硝酸盐胨水培养基中，置30〜35°C 培养24h ，观察结果。如果在培养基内的小倒管中有气体产生，即为阳性反应，表明该培养物能还原硝酸盐, 并将亚硝酸盐分解产生氮气。小倒管内无气泡者为阴性反应。 42°C 生长试验
以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物于0 . 9 %无菌氯化钠溶液中，制成菌悬液。然后将菌悬液划线接种于营养琼脂斜面上，立即置41°C 士1°C 的恒
温水浴箱内，务使整个斜面浸没在水浴中，培养24〜48h, 斜面如有菌苔生长者为阳性反应; 无菌苔生长为阴性反应。 明胶液化试验
以接种计沾取营养琼脂斜面培养物少许，穿刺接种于明胶培养基中，穿刺深度应接近培养基的底部，于30〜35°C 培养24h 。取出放入0〜4°C 冰箱内10〜30min 。如培养基呈溶液状，即为明胶液化试验阳性反应; 如明胶呈凝固状，为阴性反应。 本试验应注意：
( 1 )本试验接种前，培养基应为固态，否则需将培养基置冰箱内使之凝固后，再穿刺接种。
( 2 )试验应同时设未接种细菌的阴性对照管，与试验管同时培养并观察结果。 6.4.2.3金黄色葡萄球菌
试验组：取1：10供试液10ml 和金黄色葡萄球菌悬液1ml ，接种至100ml 营养
肉汤培养基中。
供试品组：取1：10供试液10ml ，接种至100ml 营养肉汤培养基中。 阳性对照试验：取金黄色葡萄球菌悬液1ml ，同供试品的控制菌检查法检查。 阳性对照试验应检出金黄色葡萄球菌。
阴性对照试验：取稀释液10ml ，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。 金黄色葡萄球菌的试验：
按上述分组，置30〜35℃培养18〜24h(必要时可延至48h) 。阴性对照应无菌生长。 将上述供试品增菌培养液，以接种环沾取1〜2环培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置30〜35℃培养24〜72h 。当供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于金黄色葡萄球菌特征，可报告为lg 或lml 供试品未检出金黄色葡萄球菌。 纯培养
当供试品分离平板生长菌落与表1 所列菌落特征相似或疑似时，应选取2 〜3 个以上菌落，分别用接种针，轻轻沾取菌落中心表面培养物，接种于营养琼脂斜面上，于30〜35°C 培养18〜24h ，取营养琼脂斜面培养物作革兰染色、镜检及接种营养琼脂肉汤于30〜35°C 培养18〜2 4 h做血浆凝固酶试验。 革兰染色、镜检
金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌, 无芽孢，一般不产生荚膜。排列呈不规则 的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。 血浆凝固酶试验
试管法:取无菌试管（l O m m X 1 0 0 m m ) 3支，各加人血浆和0. 9 % 无菌氯化钠溶液（1 : 1)0. 5ml, 1 支加入琼脂斜面培养物菌悬液(或被检菌的营养肉汤培养液>0. 5 m l，其余2 支作对照管：1 支加入金黄色葡萄球菌[ C M C C ( B ) 2 6 0 0 3 ]培养物菌悬液或营养肉汤培养液0. 5 ml作为阳性对照; 另一支加入营养肉汤或0. 9 % 无菌氯化钠溶液0. 5 m l 作阴性对照。三管同时置37°C 水浴或恒温培养箱，3 h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h 。检査时，轻轻将试管倾斜（动作勿大），仔细观察，阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管血浆呈凝固状，试验管呈凝固者为阳性反应; 不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。 7异常情况处理
严格按照《微生物限度检查法SOP 》操作，如在检测中出现不符合要求的情况出现，分析问题原因后，决定是否需对本方案中设定的大豆磷脂的微生物限度检查方法进行修改，并重新进行验证。 8测试结果
8.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果见附表1。 8.2控制菌的检查方法验证结果见附表2～5。
8.3按确定的验证方法检验三批产品微生物限度检查结果见附表6。 9结论
9.1按照《大豆磷脂检验操作规程》，我们设定了该产品的微生物限度检验方法， 对 批次大豆磷脂进行了微生物方法学验证，结果各项指标 标准规定，证明该标准操作规程 检验需要， GMP要求， 使用。 9.2通过检验，各项指标的回收率均大于70%，说明大豆磷脂用平皿法检验无抑菌性，故适用于大豆磷脂的微生物检验。确定大豆磷脂微生物限度检查法如下：
质量负责人： 审核人： 检验人 10再验证周期
10.1大豆磷脂的处方发生变动或其它因素变更导致大豆磷脂的物料性质改变时，需要对本方案进行调整后作方法学再验证。
10.2国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证。
11附表
实验日期： 报告日期： 检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期：
附表2：大肠埃希菌检查方法的验证结果
品名：大豆磷脂 批号：
实验日期： 报告日期： 检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期：
- 1 -
附表3：沙门菌检查方法的验证结果
品名：大豆磷脂 批号：
实验日期： 报告日期： 检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期：
附表4：铜绿假单胞菌检查方法的验证结果
品名：大豆磷脂 批号：
实验日期： 报告日期： 检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期：
附表5：金黄色葡萄球菌检查方法的验证结果
品名：大豆磷脂 批号：
实验日期： 报告日期： 检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期：
附表6：按确定的验证方法检验三批产品微生物限度检查结果
品名：大豆磷脂
实验日期： 报告日期： 检 验 人： 复 核 人： 质量部QA: 统计日期：