第九章 萃取过程与设备
萃取操作是利用物质溶解于某种液体的一种提取方法。将选定的某种溶剂加入到混合物中，因混合物中的各组分在同种溶剂中的溶解度不同，因此就可将所需提取的组分加以分离出来，这个操作过程叫做萃取。
在生物合成工业上，萃取是一个重要的提取方法和分离混合物的单元操作。这是因为萃取法具有：①传质速度快、生产周期短，便于连续操作、容易实现自动控制；②分离效率高、生产能力大等一系列优点，所以应用相当普遍；③能量消耗较少，设备投资费用不高；④采用多级萃取可使产品达到较高纯度，便于下一步处理，减少以后工序的设备和操作费用。
若萃取的混合物料是液体，则此过程是液—液萃取。至于哪些产品可以采用萃取方法来提取，主要是根据物料的理化性质来决定：首先应该了解需要提取的产品是极性化合物还是非极性化合物，如果水溶液是极性化合物，一般可以采用离子交换方法提取较为有利；非极性的化合物，可以采用萃取法提取；非水溶性化合物或既能溶于水又能溶于溶剂的极性化合物，也可以采用萃取法提取。常用的萃取方法有溶媒萃取法、双水相萃取法和超临界萃取法。
如果被处理的物料是固体，则此过程称为液—固萃取（也称为提取或浸取），即应用溶液将固体原料中的可溶组分提出来的操作。进行浸取的原料，多数情况下是溶质与不溶性固体所组成的混合物。溶质是浸取所需的可溶组分。对于在溶剂中不溶解的固体，称为载体或惰性物质。液－固萃取广泛应用于生物质原料中有效成分的提取中。进行提取的生物质原料大多是植物，由于植物组织的复杂、多样性，使提取过程很复杂，其中包括溶剂将湿润原料，可溶性物质溶解，物质在原料内部扩散，物质从原料表面向溶液扩散等。
超临界萃取过程是介于蒸馏和液－液萃取过程之间的分离过程。蒸馏是物质在流动的气体中，利用不同的蒸汽压进行蒸发分离；液－液萃取是利用溶质在不同的溶液中溶解能力的差异进行分离；而超临界流体萃取是利用临界或超临界状态的流体，使被萃取的物质在不同的蒸汽压力下所具有的不同化学亲和力和溶解能力进行分离、纯化的操作，即此过程同时利用了蒸馏和萃取的现象——蒸汽压和相分离均在起作用。
第一节 液—液萃取分离过程与设备
一、液-液萃取分类
溶媒萃取法是用一种溶剂将物质从另一种溶剂中提取出来的方法，这两种溶剂不能互溶或只部分互溶，能形成便于分离的两相，利用混合物中不同组分在同种溶剂中的溶解度不同，而将所需要的组分分离出来。溶剂萃取法又分为物理萃取和化学萃取。物理萃取的理论基础是分配定律，而化学萃取服从相律及一般化学反应的平衡规律。
（一）物理萃取
在溶剂萃取中，被提取的溶液称为料液，其中欲提取的物质称为溶质，而用以进行萃取的溶剂称为萃取剂。经接触分离后，大部分溶质转移到萃取剂中，得到的溶液称为萃取液，而被萃取除溶质以后的料液称为萃余液。将萃取剂和料液放在萃取器中，经充分振荡，静置待分层形成两相，即萃余相和萃取相，进行萃取的体系是多相多组分体系。在一个多组分两相体系中，溶质自动地从化学位大的一相转移到化学位小的一相，其过程是自发进行的。
分配定律的应用条件：①必须是稀溶液；②溶质对溶剂的互溶度没有影响；③溶质在两相中必须是同一种分子类型，即不发生缔合或离解。
（二）化学萃取
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分子间的作用力与分子间的混合熵相比占主要地位，即决定混合的结果。
两种聚合物分子间如有斥力存在，同种分子会集聚在一起，而排斥异种分子，在达到平衡时，则有可能分成两相，两种分子分别进入不同的相，即前面所述的不相容现象。如果两种聚合物间存在引力，而且引力很强，如带有相反电荷的两种聚电解质之间，则会相互结合 存在于共同的相中。若两种聚合物之间不存在较强的斥力或引力，两者则能相互混合。发现某些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混合时，只要浓度达到一定范围，也会形成两相，有人认为是盐析作用，如聚乙二醇（PEG ）与碱性磷酸盐或硫酸盐之间形成的两相。
表9-2列举了各种典型的双水相系统。其中Ａ类为两种非离子型聚合物；Ｂ类为其中一 种带电荷的聚电解质；Ｃ类为两种均是聚电解质；Ｄ类为一种聚合物，另一种是无机盐。
用于生物物质分离的体系有PEG/葡聚糖和PEG/无机盐，这两种聚合物是无毒性的，它们的多元醇或多糖结构还能使高分子稳定。
表9-2 几种典型的双水相系统
类型
聚合物1
聚合物2或盐 聚乙二醇
聚丙二醇
A
聚乙二醇
聚乙烯醇 葡聚糖 聚乙烯醇 葡聚糖 聚乙烯吡咯烷酮
C
羧甲基葡聚糖钠盐
羧甲基纤维素钠
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T ——温度，K 。
Z 与K Z 不相等时，就会产生电当一种盐的正、负离子对两相有不同的亲和力，即K A
B
+
-
位差，正、负离子的离子价之和愈大，此电位差就愈小。电位差的变化，也会对分配系数产生影响。
综合以上两种影响分配系数的主要因素，可用Gerson 提出的下列公式表示：
-lg K
=a ∆γ+δ∆ϕ+β （9-13）
式中 α——表面积；
∆γ——两相表面自由能之差；
——电荷数；
∆ϕ——电位差；
β——由标准化学位和活度系数等组成的常数。
从上式可见，分配系数和表面自由能与电位差成指数关系。由于影响分配系数的因数很多，加上各因素间又互有影响，因此目前尚不能定量地关联分配系数与能独立测定的蛋白质的一些分子性质之间的关系。最佳的操作条件，还得靠实验来得到。
（三）影响物质分配的因素
影响物质分配的因素主要有：聚合物及成相盐的种类及浓度、聚合物的平均分子量、体系的pH 值及其他盐的种类及浓度、菌体或细胞的种类及含量、体系温度等。通过最适条件选择，可以达到较高的分配系数和选择性，从而分离和纯化了产物，包括直接从细胞破碎匀浆液中萃取蛋白质而无需将细胞碎片分离。改变体系的pH 和电解质浓度可进行反萃取。
1．聚合物及其分子量的影响
不同聚合物，水相系统显示不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性依下列次序递增：葡萄糖硫酸盐＜甲基葡萄糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚糖＜甲基纤维素＜聚乙烯醇＜聚乙二醇＜丙三醇，这种疏水性的差别对目的产物与相的相互作用是重要的。
同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的方向，若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于PEG 聚合物，应降低它的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白质收率则平均分子量应增加。如双水相萃取糖化酶的结果（见表9-3）表明，PEG 平均分子量增大，分配系数减少。当分子量为400时，K ＞１，酶主要分布于上相，当分子量大于400时，Ｋ＜１，酶主要分布于下相。主要原因是随着PEG 分子量的增大，其端基数目减小，因而疏水性增加，使糖化酶在上相的表面张力增大，而入＜0（见公式9－11）从而转入下相，为了使酶分布于上相，应选用分子量为400的PEG 。
表9-3 PEG 平均分子量对分配平衡的影响 系统
PEG1000（21.77%）-（NH 4）2SO 4（12.76%） PEG4000（12.67%）-（NH 4）2SO 4（12.14%） PEG6000（15.76%）-（NH 4）2SO 4（12.34%）
K 0.26 0.30 0.03
R 3.0 4.1 1.2
Y ，% 43.5 59.8 2.1
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相图中系线长度由组成的总浓度决定。在临界点附近，系线长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此，分配系数应该是１，随着聚合物和成相盐浓度增大，系线长度增加，上相和下相相对组成的差别就增大，产物如酶在两相中的表面张力差别也增大，这将会极大地影响分配系数，使酶富集于上相。
仍以PEG －（NH 4）2SO 4系统双水相萃取糖化酶为例，在（NH 4）2SO 4浓度固定不变的条件下，增加PEG400的浓度有利于酶在上相的分配，当PEG400浓度在25％~27％时，分配系数高达47.3，浓度过高则不利于酶的分配；在PEG400浓度固定为26％时，增加（NH 4）2SO 4的浓度，糖化酶的分配系数也增大，这主要是由于（NH 4）2SO 4盐析作用影响增强的缘故，最适浓度为16％，过高也不好，酶蛋白会因盐析作用过强而产生沉淀。
3．离子环境对分配的影响
在双水相聚合物系统中，加入电解质时，首先阴阳离子会有不同的分配，见表9-4。
表9-4 一些正负离子的分配系数
离子 K + Na + NH 4+ Li +
LgK + -0.084 -0.076 -0.036 -0.015
离子 I - Br - Cl - F -
LgK - +0.151 +0.083 +0.051 +0.040
同时，由于电中性的约束，因而两相间存在一穿过相界面的电位差，它是影响电荷大分子如蛋白质和核酸等在两相系统中分配的主要因素。例如，在PEG/Dextran系统中加入NaCl 或KI ，可增加上相对带电物质的亲和效应，并迫使带负电的物质进入下相。若加入LiPO 4，则获得与上述效应相反的结果。故只要设法改变界面电势，就能控制蛋白质等电荷大分子转入某一相。例如，加入pH ＞7的磷酸缓冲液，由于HPO 42-离子在PEG ／Dextran 系统中分配系数相当低，磷酸缓冲液能很方便地改变电位差（或界面电势），而使带负电荷的蛋白质转入富PEG 的相中。
4．温度的影响
分配系数对温度的变化不敏感，这是由于成相聚合物对蛋白质有稳定化作用，所以室温操作活性收率依然很高，而且粘度较冷却（4℃）时低，有助于相的分离并节省了能源开支。
可见，双水相萃取中，影响分配的主要参数有聚合物的分子质量和浓度、pH 、盐的种类和浓度、操作温度等。聚合物分子质量低时，生物大分子易分配于富含该聚合物的相中，当远离临界点（相图中两相混合为一相时的点）时，双水相萃取本身受温度的影响较小。大规模生产总是在常温下操作，－则可节约制冷费用，再则聚合物在常温下对蛋白质有稳定作用，不会引起损失，同时温度高时，黏度低，有利于相的分离操作。因此，确定适宜的操作条件，可达到较高的分配系数和选择性。双水相萃取的一个重要优点是可直接从细胞破碎浆液中萃取蛋白质而无需将细胞碎片分离，－步操作可达到固液分离和纯化两个目的。
（四）双水相萃取技术的应用
双水相萃取技术可用于多种生物物质的分离和纯化（表9-5），多应用于蛋白质、酶、核酸、人生长激素、干扰素等的分离纯化，它将传统的离心、沉淀等液-固分离转化为液-液分离，工业化的高效液-液分离设备为此奠定了基础。双水相系统平衡时间短，含水量高，界面张力低，为生物活性物质提供了温和的分离环境。双水相萃取操作简便、经济省时、易于放大，如系统可从10ml 直接放大到1m 3规模（105倍），而各种试验参数均可按比例放大，产物收率并不降低，这种易于放大的优点在工程中是罕见的。
现在已知的胞内酶数千种，但因提取困难，投入生产的很少。胞内酶提取的第一步是破
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生物物质种类
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素 细胞组织
典型例子 过氧化氢酶 有活性的DNA 人生长激素 脊髓病毒和线病毒
β-干扰素 含有胆碱受体的细胞
相体系 PEG/Dextran PEG/Dextran PEG/盐
PEG/NaDS（硫酸葡聚糖）
PEG-磷酸酯/盐 三甲胺-PEG/Dextran
分配系数 2.95 6.4 630 3.64
收率，% 81 60 90 97 57
1．酶的分离纯化
双水相系统的应用始于酶的分离纯化。由于PEG ／Dextran （精）体系价格昂贵，而粗的Dextran 黏度又过大，因此实际应用较多的是PEG ／盐体系。常用的实例见表9-6。
在这些体系中，酶主要分配在上相，菌体碎片在下相或界面上。料液中湿细胞含量可高达30％，酶的回收率在90％以上。如果条件选择得合适，不仅可将发酵液中的酶和菌体分开，而且还能将不同的酶分离开来。
表9-6 双水相系统分离胞内酶的示例（注：均为破碎的细胞中提取酶）
菌种 Candida Baidinii
酶 过氧化氢酶 甲醛脱氢酶 甲酸脱氢酶 甲酸脱氢酶 异丙醇脱氢酶
Sacchar om-gces cerecisiae
Escherichia coli
α-硫代葡萄糖苷酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 乙醇脱氢酶 己糖激酶 异亮氨酰-tRNA- 合成酶 延胡索酸酶 天门冬氨酸酶 青霉素酰化酶 β-半乳糖苷酶 亮氨酰-tRNA 合成酶 苯丙氨酰-tRNA 合成酶
PEG1550/磷酸钾盐 PEG1550/磷酸钾盐 PEG4000/粗Decxtran PEG/盐
PEG6000/磷酸钾盐 PEG6000/磷酸钾盐
25 25 20 12
3.2 5.7 1.7 6.2 0.8 1.7
93 96 90 87 75 86
相系统
PEG4000/粗Decxtran PEG4000/粗Decxtran PEG4000/粗Decxtran PEG1000/磷酸钾盐 PEG1000/磷酸钾盐 PEG4000/Decxtran T500 PEG1000/磷酸钾盐 PEG1000/磷酸钾盐 PEG1000/磷酸钾盐 PEG6000/磷酸钾盐
细胞浓度，% 分配系数
20 20 33 20 30 30 30 30 20
2.95 11.0 7.0 4.9 19 2.5 4.1 8.2 3.6
收率，% 81 94 91 90 98 95 91 96 92 93
2．核酸的分离纯化
分离核酸可采用PEG ／Dextran 体系。萃取时，盐组成的微小变化会引起分配系数的急剧变动（图9-14）。从图9-14中可见，有活性的DNA 与无活性DNA 的分配系数差别较大。这可能是因为双螺旋DNA 失活解链形成的单链DNA 有更多未配对的碱基暴露在外有关。有报
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肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 4.0 5.0 7.5×10-7
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一、超临界流体的性质
所谓超临界流体是指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有和液体同样的凝聚力、溶解力。然而其扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍，因此超临界流体萃取具有很高的萃取速度。另外该流体随着温度与压力的连续变化，对物质的萃取具有选择性，而且萃取后分离也很容易。表9-10例举了气体、超临界流体和液体的密度、粘度以及扩散系数三种性质。
表9-10 气体超临界流体和液体性质的比较
相态
性质
气体
密度，g ·cm -3 粘度，厘泊 扩散系数，cm 2s -1
10-3 10-3-10-2 10-1
超临界流体
0.7 10-2 10-3
液体 1.0 10-1 10-2
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表9-12 超临界流体萃取与液体溶剂萃取比较
1. 2. 3. 4.
稳定的物质
溶质、溶剂易于分离，改变压力温度即可
溶质与溶剂分离常用蒸馏法，存在对热稳定性问题
5. 6.
粘度小，扩散系数大，易达到相平衡 超临界相溶质浓度小
扩散系数小，有时粘度相当高 萃取相为液相，溶质浓度一般较高
超临界流体萃取法
可选择萃取挥发性小的物质，生成超临界相 萃取能力由T 、P 控制。夹带剂研究不多
在常温，高压（5~30MPa）下操作，可处理对热不
液体溶剂萃取法
在要分离的原料中加入溶剂形成二相 萃取能力由温度及混合溶剂浓度控制，压力无影响
都在常温、常压下进行
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第九章 萃取过程与设备
萃取操作是利用物质溶解于某种液体的一种提取方法。将选定的某种溶剂加入到混合物中，因混合物中的各组分在同种溶剂中的溶解度不同，因此就可将所需提取的组分加以分离出来，这个操作过程叫做萃取。
在生物合成工业上，萃取是一个重要的提取方法和分离混合物的单元操作。这是因为萃取法具有：①传质速度快、生产周期短，便于连续操作、容易实现自动控制；②分离效率高、生产能力大等一系列优点，所以应用相当普遍；③能量消耗较少，设备投资费用不高；④采用多级萃取可使产品达到较高纯度，便于下一步处理，减少以后工序的设备和操作费用。
若萃取的混合物料是液体，则此过程是液—液萃取。至于哪些产品可以采用萃取方法来提取，主要是根据物料的理化性质来决定：首先应该了解需要提取的产品是极性化合物还是非极性化合物，如果水溶液是极性化合物，一般可以采用离子交换方法提取较为有利；非极性的化合物，可以采用萃取法提取；非水溶性化合物或既能溶于水又能溶于溶剂的极性化合物，也可以采用萃取法提取。常用的萃取方法有溶媒萃取法、双水相萃取法和超临界萃取法。
如果被处理的物料是固体，则此过程称为液—固萃取（也称为提取或浸取），即应用溶液将固体原料中的可溶组分提出来的操作。进行浸取的原料，多数情况下是溶质与不溶性固体所组成的混合物。溶质是浸取所需的可溶组分。对于在溶剂中不溶解的固体，称为载体或惰性物质。液－固萃取广泛应用于生物质原料中有效成分的提取中。进行提取的生物质原料大多是植物，由于植物组织的复杂、多样性，使提取过程很复杂，其中包括溶剂将湿润原料，可溶性物质溶解，物质在原料内部扩散，物质从原料表面向溶液扩散等。
超临界萃取过程是介于蒸馏和液－液萃取过程之间的分离过程。蒸馏是物质在流动的气体中，利用不同的蒸汽压进行蒸发分离；液－液萃取是利用溶质在不同的溶液中溶解能力的差异进行分离；而超临界流体萃取是利用临界或超临界状态的流体，使被萃取的物质在不同的蒸汽压力下所具有的不同化学亲和力和溶解能力进行分离、纯化的操作，即此过程同时利用了蒸馏和萃取的现象——蒸汽压和相分离均在起作用。
第一节 液—液萃取分离过程与设备
一、液-液萃取分类
溶媒萃取法是用一种溶剂将物质从另一种溶剂中提取出来的方法，这两种溶剂不能互溶或只部分互溶，能形成便于分离的两相，利用混合物中不同组分在同种溶剂中的溶解度不同，而将所需要的组分分离出来。溶剂萃取法又分为物理萃取和化学萃取。物理萃取的理论基础是分配定律，而化学萃取服从相律及一般化学反应的平衡规律。
（一）物理萃取
在溶剂萃取中，被提取的溶液称为料液，其中欲提取的物质称为溶质，而用以进行萃取的溶剂称为萃取剂。经接触分离后，大部分溶质转移到萃取剂中，得到的溶液称为萃取液，而被萃取除溶质以后的料液称为萃余液。将萃取剂和料液放在萃取器中，经充分振荡，静置待分层形成两相，即萃余相和萃取相，进行萃取的体系是多相多组分体系。在一个多组分两相体系中，溶质自动地从化学位大的一相转移到化学位小的一相，其过程是自发进行的。
分配定律的应用条件：①必须是稀溶液；②溶质对溶剂的互溶度没有影响；③溶质在两相中必须是同一种分子类型，即不发生缔合或离解。
（二）化学萃取
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分子间的作用力与分子间的混合熵相比占主要地位，即决定混合的结果。
两种聚合物分子间如有斥力存在，同种分子会集聚在一起，而排斥异种分子，在达到平衡时，则有可能分成两相，两种分子分别进入不同的相，即前面所述的不相容现象。如果两种聚合物间存在引力，而且引力很强，如带有相反电荷的两种聚电解质之间，则会相互结合 存在于共同的相中。若两种聚合物之间不存在较强的斥力或引力，两者则能相互混合。发现某些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混合时，只要浓度达到一定范围，也会形成两相，有人认为是盐析作用，如聚乙二醇（PEG ）与碱性磷酸盐或硫酸盐之间形成的两相。
表9-2列举了各种典型的双水相系统。其中Ａ类为两种非离子型聚合物；Ｂ类为其中一 种带电荷的聚电解质；Ｃ类为两种均是聚电解质；Ｄ类为一种聚合物，另一种是无机盐。
用于生物物质分离的体系有PEG/葡聚糖和PEG/无机盐，这两种聚合物是无毒性的，它们的多元醇或多糖结构还能使高分子稳定。
表9-2 几种典型的双水相系统
类型
聚合物1
聚合物2或盐 聚乙二醇
聚丙二醇
A
聚乙二醇
聚乙烯醇 葡聚糖 聚乙烯醇 葡聚糖 聚乙烯吡咯烷酮
C
羧甲基葡聚糖钠盐
羧甲基纤维素钠
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T ——温度，K 。
Z 与K Z 不相等时，就会产生电当一种盐的正、负离子对两相有不同的亲和力，即K A
B
+
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位差，正、负离子的离子价之和愈大，此电位差就愈小。电位差的变化，也会对分配系数产生影响。
综合以上两种影响分配系数的主要因素，可用Gerson 提出的下列公式表示：
-lg K
=a ∆γ+δ∆ϕ+β （9-13）
式中 α——表面积；
∆γ——两相表面自由能之差；
——电荷数；
∆ϕ——电位差；
β——由标准化学位和活度系数等组成的常数。
从上式可见，分配系数和表面自由能与电位差成指数关系。由于影响分配系数的因数很多，加上各因素间又互有影响，因此目前尚不能定量地关联分配系数与能独立测定的蛋白质的一些分子性质之间的关系。最佳的操作条件，还得靠实验来得到。
（三）影响物质分配的因素
影响物质分配的因素主要有：聚合物及成相盐的种类及浓度、聚合物的平均分子量、体系的pH 值及其他盐的种类及浓度、菌体或细胞的种类及含量、体系温度等。通过最适条件选择，可以达到较高的分配系数和选择性，从而分离和纯化了产物，包括直接从细胞破碎匀浆液中萃取蛋白质而无需将细胞碎片分离。改变体系的pH 和电解质浓度可进行反萃取。
1．聚合物及其分子量的影响
不同聚合物，水相系统显示不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性依下列次序递增：葡萄糖硫酸盐＜甲基葡萄糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚糖＜甲基纤维素＜聚乙烯醇＜聚乙二醇＜丙三醇，这种疏水性的差别对目的产物与相的相互作用是重要的。
同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的方向，若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于PEG 聚合物，应降低它的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白质收率则平均分子量应增加。如双水相萃取糖化酶的结果（见表9-3）表明，PEG 平均分子量增大，分配系数减少。当分子量为400时，K ＞１，酶主要分布于上相，当分子量大于400时，Ｋ＜１，酶主要分布于下相。主要原因是随着PEG 分子量的增大，其端基数目减小，因而疏水性增加，使糖化酶在上相的表面张力增大，而入＜0（见公式9－11）从而转入下相，为了使酶分布于上相，应选用分子量为400的PEG 。
表9-3 PEG 平均分子量对分配平衡的影响 系统
PEG1000（21.77%）-（NH 4）2SO 4（12.76%） PEG4000（12.67%）-（NH 4）2SO 4（12.14%） PEG6000（15.76%）-（NH 4）2SO 4（12.34%）
K 0.26 0.30 0.03
R 3.0 4.1 1.2
Y ，% 43.5 59.8 2.1
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相图中系线长度由组成的总浓度决定。在临界点附近，系线长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此，分配系数应该是１，随着聚合物和成相盐浓度增大，系线长度增加，上相和下相相对组成的差别就增大，产物如酶在两相中的表面张力差别也增大，这将会极大地影响分配系数，使酶富集于上相。
仍以PEG －（NH 4）2SO 4系统双水相萃取糖化酶为例，在（NH 4）2SO 4浓度固定不变的条件下，增加PEG400的浓度有利于酶在上相的分配，当PEG400浓度在25％~27％时，分配系数高达47.3，浓度过高则不利于酶的分配；在PEG400浓度固定为26％时，增加（NH 4）2SO 4的浓度，糖化酶的分配系数也增大，这主要是由于（NH 4）2SO 4盐析作用影响增强的缘故，最适浓度为16％，过高也不好，酶蛋白会因盐析作用过强而产生沉淀。
3．离子环境对分配的影响
在双水相聚合物系统中，加入电解质时，首先阴阳离子会有不同的分配，见表9-4。
表9-4 一些正负离子的分配系数
离子 K + Na + NH 4+ Li +
LgK + -0.084 -0.076 -0.036 -0.015
离子 I - Br - Cl - F -
LgK - +0.151 +0.083 +0.051 +0.040
同时，由于电中性的约束，因而两相间存在一穿过相界面的电位差，它是影响电荷大分子如蛋白质和核酸等在两相系统中分配的主要因素。例如，在PEG/Dextran系统中加入NaCl 或KI ，可增加上相对带电物质的亲和效应，并迫使带负电的物质进入下相。若加入LiPO 4，则获得与上述效应相反的结果。故只要设法改变界面电势，就能控制蛋白质等电荷大分子转入某一相。例如，加入pH ＞7的磷酸缓冲液，由于HPO 42-离子在PEG ／Dextran 系统中分配系数相当低，磷酸缓冲液能很方便地改变电位差（或界面电势），而使带负电荷的蛋白质转入富PEG 的相中。
4．温度的影响
分配系数对温度的变化不敏感，这是由于成相聚合物对蛋白质有稳定化作用，所以室温操作活性收率依然很高，而且粘度较冷却（4℃）时低，有助于相的分离并节省了能源开支。
可见，双水相萃取中，影响分配的主要参数有聚合物的分子质量和浓度、pH 、盐的种类和浓度、操作温度等。聚合物分子质量低时，生物大分子易分配于富含该聚合物的相中，当远离临界点（相图中两相混合为一相时的点）时，双水相萃取本身受温度的影响较小。大规模生产总是在常温下操作，－则可节约制冷费用，再则聚合物在常温下对蛋白质有稳定作用，不会引起损失，同时温度高时，黏度低，有利于相的分离操作。因此，确定适宜的操作条件，可达到较高的分配系数和选择性。双水相萃取的一个重要优点是可直接从细胞破碎浆液中萃取蛋白质而无需将细胞碎片分离，－步操作可达到固液分离和纯化两个目的。
（四）双水相萃取技术的应用
双水相萃取技术可用于多种生物物质的分离和纯化（表9-5），多应用于蛋白质、酶、核酸、人生长激素、干扰素等的分离纯化，它将传统的离心、沉淀等液-固分离转化为液-液分离，工业化的高效液-液分离设备为此奠定了基础。双水相系统平衡时间短，含水量高，界面张力低，为生物活性物质提供了温和的分离环境。双水相萃取操作简便、经济省时、易于放大，如系统可从10ml 直接放大到1m 3规模（105倍），而各种试验参数均可按比例放大，产物收率并不降低，这种易于放大的优点在工程中是罕见的。
现在已知的胞内酶数千种，但因提取困难，投入生产的很少。胞内酶提取的第一步是破
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生物物质种类
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素 细胞组织
典型例子 过氧化氢酶 有活性的DNA 人生长激素 脊髓病毒和线病毒
β-干扰素 含有胆碱受体的细胞
相体系 PEG/Dextran PEG/Dextran PEG/盐
PEG/NaDS（硫酸葡聚糖）
PEG-磷酸酯/盐 三甲胺-PEG/Dextran
分配系数 2.95 6.4 630 3.64
收率，% 81 60 90 97 57
1．酶的分离纯化
双水相系统的应用始于酶的分离纯化。由于PEG ／Dextran （精）体系价格昂贵，而粗的Dextran 黏度又过大，因此实际应用较多的是PEG ／盐体系。常用的实例见表9-6。
在这些体系中，酶主要分配在上相，菌体碎片在下相或界面上。料液中湿细胞含量可高达30％，酶的回收率在90％以上。如果条件选择得合适，不仅可将发酵液中的酶和菌体分开，而且还能将不同的酶分离开来。
表9-6 双水相系统分离胞内酶的示例（注：均为破碎的细胞中提取酶）
菌种 Candida Baidinii
酶 过氧化氢酶 甲醛脱氢酶 甲酸脱氢酶 甲酸脱氢酶 异丙醇脱氢酶
Sacchar om-gces cerecisiae
Escherichia coli
α-硫代葡萄糖苷酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 乙醇脱氢酶 己糖激酶 异亮氨酰-tRNA- 合成酶 延胡索酸酶 天门冬氨酸酶 青霉素酰化酶 β-半乳糖苷酶 亮氨酰-tRNA 合成酶 苯丙氨酰-tRNA 合成酶
PEG1550/磷酸钾盐 PEG1550/磷酸钾盐 PEG4000/粗Decxtran PEG/盐
PEG6000/磷酸钾盐 PEG6000/磷酸钾盐
25 25 20 12
3.2 5.7 1.7 6.2 0.8 1.7
93 96 90 87 75 86
相系统
PEG4000/粗Decxtran PEG4000/粗Decxtran PEG4000/粗Decxtran PEG1000/磷酸钾盐 PEG1000/磷酸钾盐 PEG4000/Decxtran T500 PEG1000/磷酸钾盐 PEG1000/磷酸钾盐 PEG1000/磷酸钾盐 PEG6000/磷酸钾盐
细胞浓度，% 分配系数
20 20 33 20 30 30 30 30 20
2.95 11.0 7.0 4.9 19 2.5 4.1 8.2 3.6
收率，% 81 94 91 90 98 95 91 96 92 93
2．核酸的分离纯化
分离核酸可采用PEG ／Dextran 体系。萃取时，盐组成的微小变化会引起分配系数的急剧变动（图9-14）。从图9-14中可见，有活性的DNA 与无活性DNA 的分配系数差别较大。这可能是因为双螺旋DNA 失活解链形成的单链DNA 有更多未配对的碱基暴露在外有关。有报
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肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 4.0 5.0 7.5×10-7
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一、超临界流体的性质
所谓超临界流体是指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有和液体同样的凝聚力、溶解力。然而其扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍，因此超临界流体萃取具有很高的萃取速度。另外该流体随着温度与压力的连续变化，对物质的萃取具有选择性，而且萃取后分离也很容易。表9-10例举了气体、超临界流体和液体的密度、粘度以及扩散系数三种性质。
表9-10 气体超临界流体和液体性质的比较
相态
性质
气体
密度，g ·cm -3 粘度，厘泊 扩散系数，cm 2s -1
10-3 10-3-10-2 10-1
超临界流体
0.7 10-2 10-3
液体 1.0 10-1 10-2
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表9-12 超临界流体萃取与液体溶剂萃取比较
1. 2. 3. 4.
稳定的物质
溶质、溶剂易于分离，改变压力温度即可
溶质与溶剂分离常用蒸馏法，存在对热稳定性问题
5. 6.
粘度小，扩散系数大，易达到相平衡 超临界相溶质浓度小
扩散系数小，有时粘度相当高 萃取相为液相，溶质浓度一般较高
超临界流体萃取法
可选择萃取挥发性小的物质，生成超临界相 萃取能力由T 、P 控制。夹带剂研究不多
在常温，高压（5~30MPa）下操作，可处理对热不
液体溶剂萃取法
在要分离的原料中加入溶剂形成二相 萃取能力由温度及混合溶剂浓度控制，压力无影响
都在常温、常压下进行
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