２００７年第４３卷第２１期
ＲｅｖｉｅｗＰａｐｅｒｓ・综述
实时定量ＰＣＲ技术在瘤胃微生物定量分析
中的研究应用
刘大程１，２＊，张
迪１，卢德勋２，高
民２，孙海洲２
（１．内蒙古农业大学动物科学与医学学院，内蒙古呼和浩特
０１００１８；
２．内蒙古畜牧科学院，内蒙古呼和浩特
摘
０１００３０）
要：随着对瘤胃微生物研究的逐步深入，一些以分子生物学技术为基础的定量分析方法对瘤胃微生物的研究方
兴未艾。本文简要介绍了实时定量ＰＣＲ技术的原理、操作程序以及该技术在反刍动物瘤胃微生物定量分析中的应用现状、取得的成果和前景展望。
关键词：Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ；瘤胃微生物；综述；定量中图分类号：Ｓ８１６．３
文献标识码：Ａ
文章编号：０２５８－７０３３（２００７）２１－００５１－０３
反刍动物在长期的进化过程中形成了独特的瘤胃发酵系统，瘤胃内寄居的大量微生物构成了一个复杂的微生物群落。由于瘤胃微生物生长需要复杂的营养条件和严格的厌氧环境，且共生依赖性强，早期的传统定量方法已不能满足研究发展的要求［１］。因此，一些以分子技术为基础的定量方法应运而生。Ｓｔａｈｌ等［２］首先以１６ＳｒＲＮＡ序列的寡核苷酸为探针利用分子杂交法对一些瘤胃微生物进行了相对定量以及动态监测。然而分子杂交法定量不稳定，结果重复性不好，因此在定量研究中仍然不够理想。Ｍｕｙｚｅｒ［３］和Ｚｏｅｔｅｎｄａｌ［４］又将变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）技术应用在微生物定量和多样性研究中。但此方法只能粗略定量，不能精确反映微生物的数量变化。２０世纪９０年代后有关定量ＰＣＲ的文献和方法才有报道出现。定量ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
后，模板扩增产物的量与荧光信号的强度之间存在正比关系，即模板的Ｃｔ值（每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，Ｃｔ值越小。如今常用的荧光标记有ＳＹＢＲ荧光染料和ＴａｑＭａｎ荧光探针［５］。因此，利用已知起始拷贝数的标准品做出标准曲线，横坐标代表起始拷贝数，纵坐标代表Ｃｔ值，只要获得未知模板的Ｃｔ值，通过与标准曲线比对，即可得出未知模板的起始拷贝数。
１．２１．２．１
定量方法
荧光域值（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）的设定
ＰＣＲ反应的前１５
个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是３～１５个循环的荧光信号的标准偏差的１０倍。
ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技术是传统ＰＣＲ技术的进一步延伸，而新近兴起的实时定量ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，
１．２．２标准曲线的制作ｍＲＮＡ定量常用的制作标准
曲线的方法是在质粒载体上用Ｔ７或ＳＰ６ＲＮＡ聚合酶的启动子来亚克隆复制子，然后用ＤＮａｓｅ消化样品，同时对ＲＮＡ精确定量。用光密度扫描仪测定ＲＮＡ的浓度并转换成每毫克ＲＮＡ有多少拷贝数。然后对
ＲＴ－ＰＣＲ）就是在ＰＣＲ反应体系中加入荧光标记物质，当荧光标记物与新合成的双链ＤＮＡ嵌和后，就可根据荧光信号的累积实时监测整个ＰＣＲ进程。ＲＴ－ＰＣＲ技术的应用使传统定量方法中存在的一些弊端能够得到有效的解决。因此，ＲＴ－ＰＣＲ技术在瘤胃微生态的研究中有着得天独厚的优势。
ＲＮＡ进行梯度稀释，并分别进行实时定量ＰＣＲ测定其最后以Ｃｔ值为纵坐标，以ＲＮＡ模板拷贝数的对Ｃｔ值。
数为横坐标绘制出标准曲线。
１ＲＴ－ＰＣＲ技术精确定量的理论基础１．１
定量原理
在ＰＣＲ反应体系中加入荧光标记物
———————————————————————————
收稿日期：２００６－０７－１４；修回日期：２００６－０９－２２基金项目：国家自然科学基金（３０４６００９５、３０５６０１０５）作者简介：刘大程（１９６８－），男，副教授，博士
２２．１
利用ＲＴ－ＰＣＲ方法对瘤胃微生物定量的基本程序
ＤＮＡ的提取由于瘤胃内古细菌、细菌、真菌和
原生动物等的细胞组成有着很大的不同，其适宜的细胞破碎方法也各不相同。提取出的ＤＮＡ经过纯化，测定其ＯＤ２６０／２８０，保证其ＯＤ值在１．７～１．９之间。
＊通讯作者
２．２靶核酸片断的选定目前在分类鉴定中主要选
中国畜牧杂志
综述・ＲｅｖｉｅｗＰａｐｅｒｓ
２００７年第４３卷第２１期
择的靶片段是１６Ｓ／１８ＳｒＲＮＡ，也可以是其相应的ｒＤ－但是，有些情况下，１６Ｓ／１８ＳｒＲＮＡ并不能满足实验ＮＡ。
的需求，则需要寻找新的满足要求的特殊基因序列，例如ＩＴＳ序列。
方法来确定瘤胃液及十二指肠液中２类主要原虫的数量。试验所提供的日粮为含２１％或１６％的中性洗涤纤维日粮。２组针对瘤胃原虫的特异性探针分别为Ｐ．
ＳＳＵ－５４ｆ，５′－ＣＡＹＧＴＣＴＡＡＧＴＡＴＡＡＡＴＡＡＣＴＡＣ－３；Ｐ．
首先，要在ＧｅｎＢａｎｋ上查找
；Ｐ．ＳＳＵ－１７４７ｒ，５′－ＣＴＣＴＡＧＧＴＧＡＴＷＷＧＲＴＴＴＡＣ－３′；Ｐ．ＳＳＵ－ＳＳＵ－３１６ｆ，５′－ＧＣＴＴＴＣＧＷＴＧＧＴＡＧＴＧＴＡＴＴ－３′；２组特异性探５３９ｒ，５′－ＣＴＴＧＣＣＣＴＣＹＡＡＴＣＧＴＷＣＴ－３′针利用传统ＰＣＲ分别扩增出约１６９３ｂｐ和２２３ｂｐ的２个片段，用于做ＲＴ－ＰＣＲ的标准品，从瘤胃原虫ＲＴ－
由于定量ＰＣＲ直接测
２．３引物与探针的设计
目标微生物的１６ＳｒＤＮＡ序列或其特有的基因序列，然后寻找出其保守序列区域，在这段保守序列区域内设计引物和探针。当对某一特定菌株定量时，只要求所设计的引物具有特异性就够了。
２．４目标片段拷贝数的确定ＰＣＲ分析结果可知，在２种中性洗涤纤维含量不同的日粮基础上，瘤胃原虫氮占瘤胃细菌氮的比例分别为
得的是目标片段的拷贝数。因此，如果要知道一定体积的样品中某种微生物的确切数量，那么就必须知道每个此种细菌中用来设计引物和探针的序列片段的拷贝数。现如今，用于确定目标片段拷贝数的方法有很多，例如荧光原位杂交，细胞原位杂交，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交等。其中，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交最后通过硝酸纤维素膜上的杂交印记来确定目标基因的拷贝数，该法操作简单，费用较低，较为常用。
４．８％和１２．７％，而排向十二直肠处的瘤胃细菌氮占５．９％和１１．９％。Ｌｕｃｙ等［８］也以编码１８ＳｒＲＮＡ的基因为靶基因，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术对瘤胃内毛虫属纤毛虫和密毛虫属纤毛虫进行定量分析。结果表明，内毛虫属纤毛虫占瘤胃总原虫数量的９８％，对于同一种类的羊这个数值相对恒定，而对于不同种类的羊其差异较大。
赵玉华等［９］利用ＲＴ－ＰＣＲ技术，在日粮精粗比分别为４∶６和６∶４条件下，以甲酸甲烷杆菌的１６Ｓ／１８ＳｒＤＮＡ序列和马氏甲烷八叠球菌特有的ＩＴＳ序列为靶序列分别对其进行了定量分析。结果表明，利木赞肉牛与荷斯坦黑白花奶牛每毫升瘤胃液中分别有１．３１×１０６个和２．３４×（Ｐ＜１０５个甲酸甲烷杆菌，两者差异极显著
３ＲＴ－ＰＣＲ技术在瘤胃微生物研究中的应用
鉴于ＲＴ－ＰＣＲ技术在定量分析中的多种优势，越来越多的研究者将此技术应用到瘤胃微生物的定量分析中来，并取得了较好的定量结果。Ｔａｊｉｍａ等［６］根据瘤胃内若干种微生物设计成多种探针，当试验牛的日粮由干草转变为谷物时，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术对瘤胃内多种微生物进行了定量分析。在干草日粮条件下占优势的产琥珀酸丝状杆菌在日粮转变后的第３天，其ＤＮＡ的数量减少了２０倍，第２８天降低了５７倍，生黄瘤胃球菌ＤＮＡ的浓度也呈下降趋势，这些结果与早期以体外培养法所获得的结果相吻合。栖瘤胃普雷沃氏菌和乳酸普雷沃氏菌ＤＮＡ的增加量分别为７倍和２６３倍。在第２８天时，栖瘤胃普雷沃氏菌ＤＮＡ的量同以干草为日粮时相比减少了３倍。然而，乳酸普雷沃氏菌
０．０１），这与肉牛日粮中粗料比例较高有关。对甲酸甲烷杆菌采用ＲＴ－ＰＣＲ方法测得的数量低于采用传统最大或然数法测得的数量，但两者之间具有很高的相关性（ｒ＝０．９５７，Ｐ＜０．０１），说明采用ＲＴ－ＰＣＲ的方法能够如实反映瘤胃微生物数量的变化。试验中以马氏甲烷八叠球菌特有的ＩＴＳ序列为靶序列，采用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ
Ｉ荧光染料ＲＴ－ＰＣＲ法进行了定量检测，与甲酸甲烷杆菌相比，其扩增效率较差，但仍能满足ＲＴ－ＰＣＲ对扩增效率的要求。
Ｋｏｉｋｅ等［１０］利用ＲＴ－ＰＣＲ技术对瘤胃内３种纤维分解菌进行定量分析，进而研究这些纤维分解菌对纤维的附着能力。试验用尼龙袋包裹干草茎经瘤胃瘘管投放，将瘤胃内容物分为固相和液相两相进行采集，分别进行ＲＴ－ＰＣＲ定量分析。结果表明，所用干草茎在瘤胃内投放５ｍｉｎ后，附着于植物纤维上的产琥珀酸丝状杆菌的数量达到１０５／ｇＤＭ，另外两种瘤胃球菌（生黄瘤胃球菌和白色瘤胃球菌）的数量为１０４／ｇＤＭ。１０ｍｉｎ后，其数量增长１０倍。３种纤维分解菌的数量一般在投放后２４ｈ（产琥珀酸丝状杆菌为１０９／ｇＤＭ，生黄瘤胃球
ＤＮＡ的量却增加了１０倍。牛链球菌ＤＮＡ在日粮转变初期增加了６７倍，此后，在第２８天其ＤＮＡ量同日粮未转变时相比却减少了。同样，反刍兽新月形单胞菌的
ＤＮＡ开始时增加了８倍，到第２８天保持在２倍的增长量。
由于缺乏一种精确的、可重复的标记物来区分瘤胃原虫氮和瘤胃细菌氮，所以限制了在活体水平上对瘤胃原虫的定量分析。Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ等［７］应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，以编码１８ＳｒＲＮＡ的基因为靶基因设计发展了一种
中国畜牧杂志
２００７年第４３卷第２１期
ＲｅｖｉｅｗＰａｐｅｒｓ・综
［４］
述
菌为１０７／ｇＤＭ）或４８ｈ（白色瘤胃球菌为１０６／ｇＤＭ）达到峰值。
ＺｏｅｔｅｎｄａｌＥＧ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｆｅｃａｌｓａｍｐｌｅｓｒｅｖｅａｌｓｓｔａｂｌｅａｎｄｈｏｓｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｍｍｕ－ｎｉｔｉｅｓｏｆａｃｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．ＪＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，６４（１０）：
４结论
［５］
３８５４－３８５９．
ＨｅｉｄＣＡ，ＳｔｅｖｅｎｓＪ，ＬｉｖａｋＫＪ．ＲｅａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ［Ｊ］．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ，１９９６，６：９８６－９９４．［６］
ＴａｊｉｍａＫ，ＡｍｉｎｏｖＲＩ，ＮａｇａｍｉｎｅＴ．Ｄｉｅｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｈｉｆｔｉｎｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｕｍｅｎｒｅｖｅａｌｅｄｗｉｔｈｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００１，６７（６）：２７６６－２７７４．
［７］ＳｙｌｖｅｓｔｅｒＪＴ，ＫａｒｎａｔｉＳＫＲ，ＹｕＺ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎａｓｓａｙｔｏｑｕａｎ－
ｔｉｆｙｒｕｍｅｎｃｉｌｉａｔｅｐｒｏｔｏｚｏａｌｂｉｏｍａｓｓｉｎｃｏｗｓｕｓｉｎｇｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ［Ｊ］．ＪＮｕｔｒ，２００４，１３４：３３７８－３３８４．
［８］ＬｕｃｙＣＳ，ＡｎｄｒｅｗＦ，ＴｏｏｖｅｙＡＪ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎ
ｏｆａｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄｔｏｑｕａｎｔｉｆｙｒｕｍｅｎｐｒｏｔｏｚｏａａｎｄｅｘａｍｉｎａ－ｔｉｏｎｏｆｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｅｎｔｏｄｉｎｉｕｍｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｉｎｓｈｅｅｐｏｆｆｅｒｅｄａｈａｙ－ｂａｓｅｄｄｉｅｔ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂ，２００６，７２（１）：２００－２０６．［９］
赵玉华，王加启．利用实时定量ＰＣＲ对瘤胃甲酸甲烷杆菌定量方法的建立与应用［Ｊ］．中国农业科学，２００６，３９（１）：１６１－１６９．
Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ技术不仅实现了ＰＣＲ从定性到定快速等特点量的飞跃，而且在保持了传统ＰＣＲ灵敏、
的基础上，还具有特异性强，定量准确，重复性好，不存在ＰＣＲ过程后处理的污染问题等优点，发展极为迅速。在微生物定量分析的实际应用中，ＲＴ－ＰＣＲ技术已显示出了巨大的潜力，随着技术的进一步完善ＲＴ－高效率的定量方法。ＰＣＲ必将成为一种广泛应用的、
参考文献：
［１］ＲｕｓｓｅｌｌＪＢ，ＲｙｃｈｌｉｋＪＬ．Ｆａｃｔｏｒｓｔｈａｔａｌｔｅｒｒｕｍｅｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｙ
［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２：１１１９－１１２２．［２］
ＳｔａｈｌＤＡ，ＦｌｅｓｈｅｒＢ．ＵｓｅｏｆＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉａｌｌｙｂａｓｅｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｂｅｓｆｏｒｓｔｕｄｉｅｓｏｆｒｕｍｉｎａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，５４（５）：１０７９－１０８４．
［３］ＭｕｙｚｅｒＧ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）ａｎｄ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＴＧＧＥ）ｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏ－ｇｙ［Ｊ］．ＡｎｔｏｎＶａｎＬｅｅｕｗ，１９９８，７３：１２７－１４１．
［１０］ＫｏｉｋｅＳ，ＰａｎＪ，ＫｏｂａｙａｓｈｉＹ，ｅｔａｌ．ＫｉｎｅｔｉｃｓｏｆＩｎＳａｃｃｏＦｉｂｅｒ－Ａｔ－
ｔａｃｈｍｅｎｔｏｆＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅＲｕｍｉｎａｌＣｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃＢａｃｔｅｒｉａＭｏｎｉｔｏｒｅｄｂｙＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＰＣＲ［Ｄ］．ＪａｐａｎＳａｐｐｏｒｏ：ＨｏｋｋａｉｄｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｒａｄ－ｕａｔｅＳｃｈｏｏｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，０６０－８５８９．
ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＡｐｐｒｏａｃｈｆｏｒＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＲｕｍｉｎａｌＢａｃｔｅｒｉａＬＩＵＤａ－ｃｈｅｎｇ１，２＊，ＺＨＡＮＧＤｉ１，ＬＵＤｅ－ｘｕｎ２，ＧＡＯＭｉｎｇ２，ＳＵＮＨａｉ－ｚｈｏｕ２
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＡｎｉｍａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＭｏｎｇｏｌｉａＨｕｈｈｏｔ
０１００１８，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭｏｎｇｏｌｉａＨｕｈｈｏｔ０１００３０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈｔｈｅｓｔｕｄｙｉｎｇｏｆｒｕｍｉｎａｌｂａｃｔｅｒｉａｂｅｃｏｍｉｎｇｉｎｔｅｎｓｉｖｅｇｒａｄｕａｌｌｙ，ｓｏｍｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｒｅｉｎｔｈｅａｓｃｅｎｄａｎｔｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｒｕｍｅｎｍｉｃｒｏｂｅ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｉｌｌｕｓ－ｔｒａｔｅｄｔｈｅｔｈｅｏｒｙ，ｏｐｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄｉｔｓａｃｔｕａｌｉｔｙｏｆａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔｉｎｆｕｔｕｒｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ；ｒｕｍｉｎａｌｂａｃｔｅｒｉａ；ａｒｅｖｉｅｗ；ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! "
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讯
主编主编
刁其玉张春善
邮
３９元／本３８元／本
编：１０００９４
邮购地址：北京圆明园西路中国农大动科院动物营养学分会秘书组联系电话：０１０－６２７３１２９７
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中国畜牧杂志
２００７年第４３卷第２１期
ＲｅｖｉｅｗＰａｐｅｒｓ・综述
实时定量ＰＣＲ技术在瘤胃微生物定量分析
中的研究应用
刘大程１，２＊，张
迪１，卢德勋２，高
民２，孙海洲２
（１．内蒙古农业大学动物科学与医学学院，内蒙古呼和浩特
０１００１８；
２．内蒙古畜牧科学院，内蒙古呼和浩特
摘
０１００３０）
要：随着对瘤胃微生物研究的逐步深入，一些以分子生物学技术为基础的定量分析方法对瘤胃微生物的研究方
兴未艾。本文简要介绍了实时定量ＰＣＲ技术的原理、操作程序以及该技术在反刍动物瘤胃微生物定量分析中的应用现状、取得的成果和前景展望。
关键词：Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ；瘤胃微生物；综述；定量中图分类号：Ｓ８１６．３
文献标识码：Ａ
文章编号：０２５８－７０３３（２００７）２１－００５１－０３
反刍动物在长期的进化过程中形成了独特的瘤胃发酵系统，瘤胃内寄居的大量微生物构成了一个复杂的微生物群落。由于瘤胃微生物生长需要复杂的营养条件和严格的厌氧环境，且共生依赖性强，早期的传统定量方法已不能满足研究发展的要求［１］。因此，一些以分子技术为基础的定量方法应运而生。Ｓｔａｈｌ等［２］首先以１６ＳｒＲＮＡ序列的寡核苷酸为探针利用分子杂交法对一些瘤胃微生物进行了相对定量以及动态监测。然而分子杂交法定量不稳定，结果重复性不好，因此在定量研究中仍然不够理想。Ｍｕｙｚｅｒ［３］和Ｚｏｅｔｅｎｄａｌ［４］又将变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）技术应用在微生物定量和多样性研究中。但此方法只能粗略定量，不能精确反映微生物的数量变化。２０世纪９０年代后有关定量ＰＣＲ的文献和方法才有报道出现。定量ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
后，模板扩增产物的量与荧光信号的强度之间存在正比关系，即模板的Ｃｔ值（每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，Ｃｔ值越小。如今常用的荧光标记有ＳＹＢＲ荧光染料和ＴａｑＭａｎ荧光探针［５］。因此，利用已知起始拷贝数的标准品做出标准曲线，横坐标代表起始拷贝数，纵坐标代表Ｃｔ值，只要获得未知模板的Ｃｔ值，通过与标准曲线比对，即可得出未知模板的起始拷贝数。
１．２１．２．１
定量方法
荧光域值（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）的设定
ＰＣＲ反应的前１５
个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是３～１５个循环的荧光信号的标准偏差的１０倍。
ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技术是传统ＰＣＲ技术的进一步延伸，而新近兴起的实时定量ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，
１．２．２标准曲线的制作ｍＲＮＡ定量常用的制作标准
曲线的方法是在质粒载体上用Ｔ７或ＳＰ６ＲＮＡ聚合酶的启动子来亚克隆复制子，然后用ＤＮａｓｅ消化样品，同时对ＲＮＡ精确定量。用光密度扫描仪测定ＲＮＡ的浓度并转换成每毫克ＲＮＡ有多少拷贝数。然后对
ＲＴ－ＰＣＲ）就是在ＰＣＲ反应体系中加入荧光标记物质，当荧光标记物与新合成的双链ＤＮＡ嵌和后，就可根据荧光信号的累积实时监测整个ＰＣＲ进程。ＲＴ－ＰＣＲ技术的应用使传统定量方法中存在的一些弊端能够得到有效的解决。因此，ＲＴ－ＰＣＲ技术在瘤胃微生态的研究中有着得天独厚的优势。
ＲＮＡ进行梯度稀释，并分别进行实时定量ＰＣＲ测定其最后以Ｃｔ值为纵坐标，以ＲＮＡ模板拷贝数的对Ｃｔ值。
数为横坐标绘制出标准曲线。
１ＲＴ－ＰＣＲ技术精确定量的理论基础１．１
定量原理
在ＰＣＲ反应体系中加入荧光标记物
———————————————————————————
收稿日期：２００６－０７－１４；修回日期：２００６－０９－２２基金项目：国家自然科学基金（３０４６００９５、３０５６０１０５）作者简介：刘大程（１９６８－），男，副教授，博士
２２．１
利用ＲＴ－ＰＣＲ方法对瘤胃微生物定量的基本程序
ＤＮＡ的提取由于瘤胃内古细菌、细菌、真菌和
原生动物等的细胞组成有着很大的不同，其适宜的细胞破碎方法也各不相同。提取出的ＤＮＡ经过纯化，测定其ＯＤ２６０／２８０，保证其ＯＤ值在１．７～１．９之间。
＊通讯作者
２．２靶核酸片断的选定目前在分类鉴定中主要选
中国畜牧杂志
综述・ＲｅｖｉｅｗＰａｐｅｒｓ
２００７年第４３卷第２１期
择的靶片段是１６Ｓ／１８ＳｒＲＮＡ，也可以是其相应的ｒＤ－但是，有些情况下，１６Ｓ／１８ＳｒＲＮＡ并不能满足实验ＮＡ。
的需求，则需要寻找新的满足要求的特殊基因序列，例如ＩＴＳ序列。
方法来确定瘤胃液及十二指肠液中２类主要原虫的数量。试验所提供的日粮为含２１％或１６％的中性洗涤纤维日粮。２组针对瘤胃原虫的特异性探针分别为Ｐ．
ＳＳＵ－５４ｆ，５′－ＣＡＹＧＴＣＴＡＡＧＴＡＴＡＡＡＴＡＡＣＴＡＣ－３；Ｐ．
首先，要在ＧｅｎＢａｎｋ上查找
；Ｐ．ＳＳＵ－１７４７ｒ，５′－ＣＴＣＴＡＧＧＴＧＡＴＷＷＧＲＴＴＴＡＣ－３′；Ｐ．ＳＳＵ－ＳＳＵ－３１６ｆ，５′－ＧＣＴＴＴＣＧＷＴＧＧＴＡＧＴＧＴＡＴＴ－３′；２组特异性探５３９ｒ，５′－ＣＴＴＧＣＣＣＴＣＹＡＡＴＣＧＴＷＣＴ－３′针利用传统ＰＣＲ分别扩增出约１６９３ｂｐ和２２３ｂｐ的２个片段，用于做ＲＴ－ＰＣＲ的标准品，从瘤胃原虫ＲＴ－
由于定量ＰＣＲ直接测
２．３引物与探针的设计
目标微生物的１６ＳｒＤＮＡ序列或其特有的基因序列，然后寻找出其保守序列区域，在这段保守序列区域内设计引物和探针。当对某一特定菌株定量时，只要求所设计的引物具有特异性就够了。
２．４目标片段拷贝数的确定ＰＣＲ分析结果可知，在２种中性洗涤纤维含量不同的日粮基础上，瘤胃原虫氮占瘤胃细菌氮的比例分别为
得的是目标片段的拷贝数。因此，如果要知道一定体积的样品中某种微生物的确切数量，那么就必须知道每个此种细菌中用来设计引物和探针的序列片段的拷贝数。现如今，用于确定目标片段拷贝数的方法有很多，例如荧光原位杂交，细胞原位杂交，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交等。其中，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交最后通过硝酸纤维素膜上的杂交印记来确定目标基因的拷贝数，该法操作简单，费用较低，较为常用。
４．８％和１２．７％，而排向十二直肠处的瘤胃细菌氮占５．９％和１１．９％。Ｌｕｃｙ等［８］也以编码１８ＳｒＲＮＡ的基因为靶基因，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术对瘤胃内毛虫属纤毛虫和密毛虫属纤毛虫进行定量分析。结果表明，内毛虫属纤毛虫占瘤胃总原虫数量的９８％，对于同一种类的羊这个数值相对恒定，而对于不同种类的羊其差异较大。
赵玉华等［９］利用ＲＴ－ＰＣＲ技术，在日粮精粗比分别为４∶６和６∶４条件下，以甲酸甲烷杆菌的１６Ｓ／１８ＳｒＤＮＡ序列和马氏甲烷八叠球菌特有的ＩＴＳ序列为靶序列分别对其进行了定量分析。结果表明，利木赞肉牛与荷斯坦黑白花奶牛每毫升瘤胃液中分别有１．３１×１０６个和２．３４×（Ｐ＜１０５个甲酸甲烷杆菌，两者差异极显著
３ＲＴ－ＰＣＲ技术在瘤胃微生物研究中的应用
鉴于ＲＴ－ＰＣＲ技术在定量分析中的多种优势，越来越多的研究者将此技术应用到瘤胃微生物的定量分析中来，并取得了较好的定量结果。Ｔａｊｉｍａ等［６］根据瘤胃内若干种微生物设计成多种探针，当试验牛的日粮由干草转变为谷物时，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术对瘤胃内多种微生物进行了定量分析。在干草日粮条件下占优势的产琥珀酸丝状杆菌在日粮转变后的第３天，其ＤＮＡ的数量减少了２０倍，第２８天降低了５７倍，生黄瘤胃球菌ＤＮＡ的浓度也呈下降趋势，这些结果与早期以体外培养法所获得的结果相吻合。栖瘤胃普雷沃氏菌和乳酸普雷沃氏菌ＤＮＡ的增加量分别为７倍和２６３倍。在第２８天时，栖瘤胃普雷沃氏菌ＤＮＡ的量同以干草为日粮时相比减少了３倍。然而，乳酸普雷沃氏菌
０．０１），这与肉牛日粮中粗料比例较高有关。对甲酸甲烷杆菌采用ＲＴ－ＰＣＲ方法测得的数量低于采用传统最大或然数法测得的数量，但两者之间具有很高的相关性（ｒ＝０．９５７，Ｐ＜０．０１），说明采用ＲＴ－ＰＣＲ的方法能够如实反映瘤胃微生物数量的变化。试验中以马氏甲烷八叠球菌特有的ＩＴＳ序列为靶序列，采用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ
Ｉ荧光染料ＲＴ－ＰＣＲ法进行了定量检测，与甲酸甲烷杆菌相比，其扩增效率较差，但仍能满足ＲＴ－ＰＣＲ对扩增效率的要求。
Ｋｏｉｋｅ等［１０］利用ＲＴ－ＰＣＲ技术对瘤胃内３种纤维分解菌进行定量分析，进而研究这些纤维分解菌对纤维的附着能力。试验用尼龙袋包裹干草茎经瘤胃瘘管投放，将瘤胃内容物分为固相和液相两相进行采集，分别进行ＲＴ－ＰＣＲ定量分析。结果表明，所用干草茎在瘤胃内投放５ｍｉｎ后，附着于植物纤维上的产琥珀酸丝状杆菌的数量达到１０５／ｇＤＭ，另外两种瘤胃球菌（生黄瘤胃球菌和白色瘤胃球菌）的数量为１０４／ｇＤＭ。１０ｍｉｎ后，其数量增长１０倍。３种纤维分解菌的数量一般在投放后２４ｈ（产琥珀酸丝状杆菌为１０９／ｇＤＭ，生黄瘤胃球
ＤＮＡ的量却增加了１０倍。牛链球菌ＤＮＡ在日粮转变初期增加了６７倍，此后，在第２８天其ＤＮＡ量同日粮未转变时相比却减少了。同样，反刍兽新月形单胞菌的
ＤＮＡ开始时增加了８倍，到第２８天保持在２倍的增长量。
由于缺乏一种精确的、可重复的标记物来区分瘤胃原虫氮和瘤胃细菌氮，所以限制了在活体水平上对瘤胃原虫的定量分析。Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ等［７］应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，以编码１８ＳｒＲＮＡ的基因为靶基因设计发展了一种
中国畜牧杂志
２００７年第４３卷第２１期
ＲｅｖｉｅｗＰａｐｅｒｓ・综
［４］
述
菌为１０７／ｇＤＭ）或４８ｈ（白色瘤胃球菌为１０６／ｇＤＭ）达到峰值。
ＺｏｅｔｅｎｄａｌＥＧ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｆｅｃａｌｓａｍｐｌｅｓｒｅｖｅａｌｓｓｔａｂｌｅａｎｄｈｏｓｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｍｍｕ－ｎｉｔｉｅｓｏｆａｃｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．ＪＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，６４（１０）：
４结论
［５］
３８５４－３８５９．
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Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ技术不仅实现了ＰＣＲ从定性到定快速等特点量的飞跃，而且在保持了传统ＰＣＲ灵敏、
的基础上，还具有特异性强，定量准确，重复性好，不存在ＰＣＲ过程后处理的污染问题等优点，发展极为迅速。在微生物定量分析的实际应用中，ＲＴ－ＰＣＲ技术已显示出了巨大的潜力，随着技术的进一步完善ＲＴ－高效率的定量方法。ＰＣＲ必将成为一种广泛应用的、
参考文献：
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（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＡｎｉｍａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＭｏｎｇｏｌｉａＨｕｈｈｏｔ
０１００１８，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭｏｎｇｏｌｉａＨｕｈｈｏｔ０１００３０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈｔｈｅｓｔｕｄｙｉｎｇｏｆｒｕｍｉｎａｌｂａｃｔｅｒｉａｂｅｃｏｍｉｎｇｉｎｔｅｎｓｉｖｅｇｒａｄｕａｌｌｙ，ｓｏｍｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｒｅｉｎｔｈｅａｓｃｅｎｄａｎｔｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｒｕｍｅｎｍｉｃｒｏｂｅ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｉｌｌｕｓ－ｔｒａｔｅｄｔｈｅｔｈｅｏｒｙ，ｏｐｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄｉｔｓａｃｔｕａｌｉｔｙｏｆａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔｉｎｆｕｔｕｒｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ；ｒｕｍｉｎａｌｂａｃｔｅｒｉａ；ａｒｅｖｉｅｗ；ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! "
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刁其玉张春善
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