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第２８卷第１期
２０１０年２月
实验与
ＡＮＤ
检验医学
ＭＥＤＩＣＩＮＥ
Ｖ０１．２８Ｎｏ．１Ｆｅｂ．２０１０
ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
・论著・
人诱导性多能干细胞的培养及鉴定
冯年花１，２，谢安，，娄远蕾，，阮琼芳，，郭菲，，吴珏１，２，邓志锋３，汪泱ｐ
（１、南昌大学泌尿外科研究所；２、南昌大学研究生院医学部；３、南昌大学第二附属医院神经外科，江西南昌３３０００６）
摘要：目的建立稳定的人诱导性多能干细胞（ｉＰｓ细胞）培养体系。方法取第３。５代的小鼠胚胎成纤维细胞，丝裂霉素Ｃ处理后用作饲养层。人ｉＰＳ细胞接种于饲养层上生长，胶原酶消化或机械法传代。倒置显微镜下观察ｉＰｓ细胞生长状态；观察拟胚体形成能力；ＲＴ－ＰＣＲ检测ｉＰＳ细胞多能性基因的表达情况。结果（１）小鼠胚胎成纤维细胞（ＭＥｎ为贴壁生长细胞，星梭形或多角形。细胞增殖旺盛。（２）生长在饲养层上的人ｉＰｓ细胞呈典型的克隆状生长。克隆呈圆形或椭圆形，边界清晰。克隆内细胞排列紧密。细胞体积小，核大，细胞核／质比高。ＲＴ．ＰＣＲ结果显示人ｉＰＳ细胞强表达多能性基因Ｏｃｔ４，Ｎａｎｏｇ，Ｓｏｘ２；去除饲养层后悬浮培养能形成拟胚体（ＥＢ）。结论本实验的培养体系适合人ｉＰＳ细胞的培养，人ｉＰＳ细胞能稳定增殖，保持自我更新及分化潜能。
关键词：人诱导性多能干细胞：细胞培养：饲养层中图分类号Ｒ４４６．１１＋，３，Ｑ８１３．１＋１．Ｒ３９２—３３
ｄ堕；！Ｑ：圣窆６９益』！！垫１６１垒＝！１２９．２Ｑ！Ｑ！Ｑ１．ｏＱ３
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文献标识码Ａ
文章编号１６７４一１１２９（２０１０）０１一Ｏ００６—０３
ＦＥＮＧＮｉａｎｈｕａ，ＸＩＥＡｎ，ＬＯＵＹｕａｎｌｅｉ，
０１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＵｒｏｌｏｇｙｏｆＮａｎｃｈａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ３３０００６，Ｃｈｉｎａ
ａ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈ
ｓｔａｂｌｅｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｏｆｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｆｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍ
ｅｅｌｌｓ（ｉＰＳ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｓｏｆ３－５ｔｈｐａｓｓａｇｅｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙｍｉｔｏｍｙｃｉｎＣａｎｄｐｒｅｐａｒｅｄ鹪ｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒｓ．ｉＰＳｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｐｌａｔｅｄ
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【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄ诱导性多能干细胞ｆｉｎｄｕｃｅｄ
ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；Ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｓ
ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍ
细胞稳定培养体系的建立是其用于基础研究及临床疾病治疗的基础，具有重要的意义。本实验旨在建立稳定的ｉＰＳ细胞培养体系．为ｉＰＳ细胞的基础研究及临床应用奠定基础。
ｃｅｌｌｓ。ｉＰＳ细胞１是一种通过成体细胞重编程建立的多能干细胞．具有胚胎千细胞的特性．表达胚胎干细胞相关的多能性基因．能分化为三个胚层的细胞．移植到裸鼠体内能形成畸胎瘤【１’习。由于可取自成体细胞．因此ｉＰＳ细胞的使用可避免胚胎干细胞面临的伦理及免疫排斥问题。具有广泛的应用前景１２１。ｉＰＳ
基金项目：国家自然科学基金（３０９６０３８５）；江西省自然科学基金（２００７ＧＺＹｌ４７０）
作者简介：冯年花，女，江西吉安人。１９８７年１月出生，南昌大学医学院硕士研究生。
・通讯作者：汪泱，女，江西高安人，研究员，博士生导师．主要研究方向为干细胞与再生医学。
材料与方法
１材料
１．１实验动物及细胞系来源清洁级孕１２．５天Ｂａｌｂ／ｃ小鼠由南昌大学医学院动科部提供；人诱导性多能干细胞系ｉＰｓ—Ｓ由中科院上海生化细胞所肖磊课题组惠赠【３ｌ。
１．２试剂ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭＤＭＥＭ培养基、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ俐血清替代物ｆＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、高糖ＤＭＥＭ培养
万方数据
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第２８卷第１期
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实验与检验医学
ＭＥＤＩＣＩＮＥ
Ｖ０１．２８Ｎｏ．１
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基、非必需氨基酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ一谷氨酰胺（Ｌ—Ｇｌｕ．ｔａｍｉｎ）、一２一巯基乙醇（Ｂ—ＭＥ）、碱性成纤维生长因子（ｂ—ＦＧｆ’）、Ⅳ型胶原酶，以上均购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司：胎牛血清（ＦＢＳ）购自杭州四季青生物有限公司：丝裂霉素Ｃ（ＭＭＣ）：乖【Ｉ明胶（ｇｅｌａｔｉｎｅ）购自美国Ｓｉｇ－ｍａ公司：逆转录及ＰＣＲ试剂盒购自美国Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司。２方法
２。１培养基的配制ｉＰＳ细胞培养基：ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ
ＤＭＥＭ＋２０％ＳＲ＋１％ＮＥＡＡ＋ｌｍＭＬ－ｇｌｕ＋Ｏ．１ｍＭ
３－
ＭＥ＋４ｎｇ／ｍｌ
ｂ－ＦＧＦ：小鼠胚胎成纤维细胞（ＭＥＦ）培养
基：高糖ＤＭＥＭ培养基＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭＬ一谷氨酰胺。
２．２小鼠胚胎成纤维细胞（ＭＥＦ）的原代提取将健康成年Ｂａｌｂ／ｃ小鼠按照雄性和雌性１：２比例合笼，次日观察阴道栓。见栓当１３记为孕Ｏ。５天（Ｅ０．５ｄ）。取妊娠１２．５ｄ的孕鼠。无菌条件取出胚胎．剥离羊膜，去除头、四肢和内脏。用无菌ＰＢＳ洗净血迹．眼科剪剪碎．加入０．１２５％ＥＤＴＡ胰蛋白酶３７℃水浴消化３。５ｍｉｎ后，轻轻吹散细胞．加入含血清培养基终止，静置。取上清，重复数次；收集上清，１２００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ．取沉淀．以ｌ（Ｐ／ｎｄ的密度接种
于伐５的细胞培养瓶中，３７℃、含５％ＣＯ：条件下培
养。取状态良好的细胞冻存备用。
２．３饲养层的制备取第３．５代的ＭＥＦ细胞．换上含１０１ｘｇ／ｍｌ丝裂霉素Ｃ的新鲜培养液继续孵育１．５。３ｈ，用无菌ＰＢＳ洗５遍，胰酶消化，以５～ｌＯｘｌＯＳ／ＩＩｌｌ接种于预先用０．１％的明胶处理１．２ｈ的ｒＩ＇２５塑料培养瓶中。一周内使用。２．４人ｉＰｓ细胞的传代培养
２．４．１复苏取出冻存的ｉＰＳ细胞．放于３７℃温水。使冰晶快速融化．逐滴加入１０倍体积的ｉＰＳ细胞培养基。轻轻吹打混匀。８００ｄｍｉｎ离心３ｍｉｎ。弃上清，加入５ｍｌ新鲜ｉＰＳ细胞培养基．再次离心，洗净冻存液中的ＤＭＳＯ和血清．用ｉＰＳ细胞培养基重悬后接种于预先制备的饲养层上。每天换液。
２．４．２传代（１）Ⅳ型胶原酶消化传代法：待集落长满饲养层．用ｌｍｇ／ｎｄ的Ⅳ型胶原酶消化１５～２０ｍｉｎ．将集落吹下．加入３。５ｍｌ培养液．轻轻吹散成小集落，均匀接种于饲养层细胞上，３７℃、含５％ＣＯ：条件下培养；（２）机械传代法：传代前在倒置相差显微镜下将要分离的克隆做好标记．无菌条件下用无菌巴氏管挑取标记好的克隆。机械分离至合适大小，挑
万方数据
至离心管中８００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ。收集细胞沉淀．新鲜培养基重悬。接种于预先制备的饲养层上，每天换液。
２．４．３冻存将消化下来的ｉＰｓ细胞集落转移至离心管中。轻轻吹打至合适大小．８００ｒｐｍ离心３ｍｉｎ，弃上清。加入预先配好的冻存液ｆ７０％培养基＋２０％血清＋１０％ＤＭＳＯ）．混匀，转移至冻存管。标记好名称、日期和代数。于冻存盒中一８０℃过夜。次１３转移至一１９６。Ｃ液氮罐中保存。２．５人ｉＰＳ细胞的鉴定
２．５．１
ＲＴ—ＰＣＲ检测多能性基因的表达取状态
良好的人ｉＰＳ细胞克隆，Ｔｒｉｚｏｌ法提取总ＲＮＡ，ＲＴ—ＰＣＲ检测多能性基因Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ的表达。使用Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ逆转录试剂盒．随机引物逆转录合成ｃＤＮＡ后进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ反应条件如下：９４℃预变性５ｒａｉｎ，９４℃变性３０ｓ，退火３０ｓ，７２℃３０ｓ，７２℃延伸１０ｍｉｎ，扩增３０个循环。Ｂ—ａｃｔｉｎ做内参。各引物序列及产物长度如下：Ｏｃｔ４：上游引物：ＣＧＡＡＧＡ．ＧＡＡＡＧＣＧＡＡＣＣＡＧＴＡＴＣ，下游引物：ＡＧＡＡＣＣＡＣ—
ＡＣＴＣＧＧＡＣＣＡＣ
ＡＴＣ；Ｎａｎｏｇ：上游引物：ＧＣＡＡ—
ＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣ。下游引物：ｃｃｒＩ＇ｑ＇ＣＴ＿
ＧＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＴＴＧ：Ｓｏｘ２：
上游引物：ＣＣＣＣＣＧ－
ＧＣＧＧＣＡＡＴＡＧＣＡ。下游引物：ＴＣＧＧＣＧＣＣＧＧＧＧＡ．ＧＡＴＡＣＡＴ；Ｂ—ａｃｔｉｎ：上游弓ｌ物：ＴＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣ
ＣＡＣＧＡＡＡＣＴ．下游引物：ＧＡＡＧＣＡ兀ＴＧＣＧＧＴＧ－
ＧＡＣＧＡＴ。
２．５．２拟胚体（ＥＢ）形成能力将消化下来的ｉＰＳ细胞集落移至一培养皿中，差速贴壁３０ｒａｉｎ，去除剩余的饲养层细胞．收集悬浮细胞集落。用不含ｂＦＧＦ的ｉＰＳ细胞培养基蕈悬。吹打至合适大小的细胞团．接种于低黏附的细菌培养皿中悬浮培养，隔天换液。
结果
１原代ＭＥＦ的生长状态小鼠胚胎成纤维细胞为贴壁生长细胞．消化后２～３小时即贴壁并完全伸展，细胞呈梭形或多角形．胞浆饱满，立体感强，细胞核清晰。培养第二天可见培养液中漂浮较多的死亡细胞。细胞增殖旺盛，镜下可见较多圆形透亮的新生分裂细胞（图Ａ）。一般２。３天细胞完全融合。以１：２～３传代。取第３。５代状态良好的细胞用于饲养层的制备。
２人ｉＰｓ细胞的生长状况及鉴定ｉＰｓ细胞呈典型的克隆状生长。克隆呈圆形或椭圆形，边界清晰，折光性好，高倍镜下形似鸟巢（图Ｂ）。克隆内细胞排
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列紧密．细胞体积较小，细胞核大、核仁清晰，细胞核／质比高。细胞增殖旺盛．一般每５—６ｄ传代。ＲＴ—ＰＣＲ结果显示体外多次传代的ｉＰＳ细胞仍高表达多能性基因Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ（［酮Ｃ）。消化后的ｉＰＳ细胞集落在低黏附培养板中悬浮培养能聚集成球生长。形成拟胚体。拟胚体内细胞间黏附紧密，各拟胚体边界清楚。胚体饱满，折光性好，悬浮生长于培养液中（图Ｄ）。
附图Ａ：贴壁生长的ＭＥＦ细胞；Ｂ：生长在饲养层上的呈克隆状生长；Ｃ：体外多次传代的人ｉＰＳ细胞仍高表达多能性基因Ｏｃｔ４。Ｓｏｘ２．Ｎａｎｏｇ；Ｄ：去除饲养层后悬浮培养．人ｉＰＳ细胞集落能聚集形成拟胚体。＠对＝５０Ｉ＾脚）
讨论
随着再生医学的兴起，干细胞成为研究的热点。ｉＰＳ技术的建立是干细胞领域的又一重大突破．具有里程碑式的意义。稳定的ｉＰＳ细胞体外培养体系是其应用于基础研究及临床疾病治疗的前提。本实验室培养的人ｉＰＳ细胞具有和ＥＳ细胞类似的生长特性。传至３５代仍能稳定增殖并保持未分化状态。强表达多能性基因Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ，在去除饲养层之后能形成拟胚体．表现出干细胞的聚集生长特性。说明本实验的培养体系适合ｉＰＳ细胞的稳定生长。
胶原酶消化法和机械传代法是两种常用的胚胎干细胞传代方法［４１，胶原酶适合消化生长状态良好．分化较少的克隆；机械法适合于克隆的纯化优选。前者操作方便，适合大批量扩增培养，但消化后集落的大小不易控制；后者工作量较大，时间较长．不适合大批量扩增培养，但能控制集落的大小。实际操作中可将二者结合，在不同阶段使用不同的方法进行传代。
在ｉＰＳ细胞培养体系中。合适的饲养层细胞是
万方数据
维持其生长的必要条件。饲养层细胞是经过灭活处理的不再增殖的细胞．可以分泌一些生长因子．促进细胞增殖。抑制分化．从而保持干细胞的自我更新及高度未分化状态闱．不同的饲养层分泌生长因子的能力不同１６ｌ。饲养层细胞的好坏直接影响ｉＰＳ细胞的生长状态。制备饲养层细胞最关键的步骤是灭活。比较常用的有两种方法．一种是射线照射法，另一种是丝裂霉素Ｃ处理法。处理的浓度和时间主要根据细胞的状态、密度进行调整［７１。本实验中采用丝裂霉素Ｃ处理法．一般ｉＯｌ山ｇ／ｍｌ处理１．５．３小时。我们曾将经１０ｔＬｇ／ｍｌ的丝裂霉素Ｃ处理２、２．５、３小时的饲养层进行比较．发现处理２．５小时比较合适。此时ＭＣ对细胞的毒性最低．同时又达到最佳的灭活效果。饲养层细胞的密度对ｉＰＳ的生长状态亦有影响［７，ｓ１．细胞密度太高导致ｉＰＳ细胞堆积生长．克隆中部细胞容易营养缺乏而死亡：密度太低易使ｉＰＳ细胞分化，一般Ｔ２５的培养瓶种植５～８ｘ１０５细胞。此外．不同种属的饲养层细胞对ｉＰＳ细胞的维持能力也不同ｆ９’ｉＯｌ：饲养层细胞传代次数越多。其对ｉＰＳ细胞的维持能力则越低…Ｊ。
目前．多家实验室已成功建立ｉＰＳ细胞系．但各实验室之间的培养体系存在些许差异．这在一定程度上影响了实验的重复性及稳定性。因此。建立稳
定规范的ｉＰＳ细胞培养体系有助于提供高质量细胞系，提高实验的真实性和准确性。
（致谢：感谢中科院上海生物化学与细胞生物学研究所肖磊课题组提供ｉＰＳ细胞系１。
参考文献
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Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４）：６６３－－６７６．［２１ＢｏｌａｎｄＭＪ，Ｈａ∞ｎＪＬ’ＮａｚｏｒＫ
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ａ
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ｏｆｓｉｘｕ－ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＣｅｌｌＲｅｓ，２００８，１８（５）：６００－
６０３．
【４】ＲｉｃｈａｒｄｓＭ。ＢｏｎｇｓｏＡ．Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎ
ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
ｓｔｅｍｃｅｌｌ，
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ａ１．ＦＧＦ２ｓｅｃｒｅｔｉｎｇｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｂ－
ｌａｓｔｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｓ：ａｎｏｖｅｌｃｕｌｔｕｒｅ
ｓｙｓｔｅｍｆｏｒ
ｈｕｍａｎ
ｅｍｂｒｙｏｍｃ
ｓｔｅｍ
ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＭｏｌＲｅｐｒｏｄＤｅｖ，２００８，７５（１０）：１５２３—１５３２．
［６１ＥｉｓｅｌｌｃｅｖａＬ’Ｐｅｔｅｒｋｏｖａ１，ＮｅｒａｄｉｌＪ，ｅｌａ１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｆ
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ｃｅｌｌｓｆｏｒｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｍｃ
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【７】ＺｈｏｕＤ，ＬｉｕＴ＇Ｚｈｏｕ）【，ｅｔａｉ．Ｔｈｒｅｅｋｅｙ
ｖａｒｉａｂｌｅｓ（下转第１５页）
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实验与检
验医
学
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ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬＡＮＤＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
生，影响ＲＡ预后和严蓖程度。ＨＬＡ—ＤＲ抗原主要存在于Ｂ淋巴细胞、单核细胞及内皮细胞的细胞膜上。ＨＬＡ—ＤＲ分子为二聚体结构．有非多态性的ＤＲａ链和多态性的ＤＲＢ链的可变区，可识别并结合抗原或自身抗原．刺激Ｔ细胞活化。进而诱发自身免疫反应。通过家系调查发现，ＲＡ发病有家族聚集趋向。ＨＬＡ—ＤＲ位于人类第６号染色体短臂上，其中ＨＬＡ一Ⅱ类基因具有高度多态性．是参与机体特异性识别和免疫应答的主要成分阎。ＨＬＡ等位基因多态性决定了个体免疫反应的表型．通过对Ｔ细胞的自身调节，影响抗原递呈过程。ＨＬＡ—ＤＲ染色体有两个表达ＤＲＢ的基因座位．一个座位是ＤＲＢｌ．另一个是ＤＲＢ３，ＤＲＢ４或ＤＲＢ５。单型ＤＲ５３含有ＤＲＢＩ座位基因，其特异性为ＤＲ４．ＤＲ７，和ＤＲ９基因阐。关于ＲＡ患者诊断指标。一直是风湿病学家最关注的研究项目．而ＭＨＣ类抗原中ＨＬＡ—ＤＲ作为ＲＡ预后判断的重要有效指标．ＨＬＡ—ＤＲ４作为ＲＡ的易感基因可成为新型的预后判断指标．易感基因对启动疾病发生与发展有重要作用。ＲＡ患者ＨＬＡ—ＤＲ４和ＨＬＡ—ＤＲ５３等位基因发生的频率数分别为４４％和５６％．与对照组比较均Ｐ＜０．０１，结果有非常显著性意义。其ＤＲ基因与ＲＡ的相对危险率分别为３．７０和２．６４．ＨＬＡ—ＤＲ４高于ＨＬＡ—ＤＲ５３。与张红卫等用基本相近。
本研究发现ＨＬＡ—ＤＲ４携带使患者ＲＦ值升高，使ＲＡ病情复杂化．给联合治疗带来阑难，表现在控制症状及恢复正常值的时间上．ＨＬＡ—ＤＲ４阳
清和滑液中ＲＦ的检测国外多采用比浊法、ＥＵＳＡ和ＲＩＡ法．国内普遍采用比浊法的定量检测和乳胶凝集法的定性检测，从而指导对ＲＡ病人的疗效观察。本文采用比浊法与乳胶法同时检测７５例类风湿关节炎患者血清ＲＦ．结果显示比浊法明显优于乳胶法，两法检测结果组间比较俨＜０．０１），有非常显著性差异。比浊法明显优于乳胶凝集法。７５例类风湿关节炎患者中比浊法有５９例阳性．乳胶法只有４４例阳性，乳胶法阳性率低与ＲＦ的Ｉｇ类型及隐性类风湿因子【９，１０Ｉ有关。
综上所述．ＲＡ患者其ＨＬＡ—ＤＲ基因与ＲＡ的发生易感性明显有关．为临床诊断和鉴别诊断提供依据。
．
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ｎ屯砒－
性组比ＨＬＡ—ＤＲ４阴性组显著延迟。在ＲＦ值恢复
正常方面．ＨＬＡ—ＤＲ４阳性组比ＨＬＡ—ＤＲ４阴性组病例显著减少．上述两方面与ＲＡ预后密切相关，认为ＨＬＡ—ＤＲ４可作为判断ＲＡ治疗的重要预后指标。与吴轰等ｆ８ｌ基本一致。因此。对于ＲＡ相关基因的研究．对ＲＡ患者进行诊断分析．对揭示ＲＡ的发病机制．早期诊断和防治具有深远的意义。
嘶ｎｔ
ｏｆａｕｔｏｉｍｍｔｍｅ
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ｆｉ－
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ｓｔｅｎｌ
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ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
ｃｅｌｌｓｆｏｒ
ｍｏ啪ｅｍｂｒｙｏｍｅ
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｌｉｎｅｓｓｕｐｐｏｒｔｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
ｔｇ．ｅｍｃｅｌｌ
ｃｅｌｌｓ［／］．ＺｈｏｎｇｇｕｏＹｉＸｕｅＫｅｇｒｏｗＵｄＪｌ．ＣｌｏｎｉｎｇＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，２００９，１１（３）：４５３－４６２．
万方数据
・
６
・
第２８卷第１期
２０１０年２月
实验与
ＡＮＤ
检验医学
ＭＥＤＩＣＩＮＥ
Ｖ０１．２８Ｎｏ．１Ｆｅｂ．２０１０
ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
・论著・
人诱导性多能干细胞的培养及鉴定
冯年花１，２，谢安，，娄远蕾，，阮琼芳，，郭菲，，吴珏１，２，邓志锋３，汪泱ｐ
（１、南昌大学泌尿外科研究所；２、南昌大学研究生院医学部；３、南昌大学第二附属医院神经外科，江西南昌３３０００６）
摘要：目的建立稳定的人诱导性多能干细胞（ｉＰｓ细胞）培养体系。方法取第３。５代的小鼠胚胎成纤维细胞，丝裂霉素Ｃ处理后用作饲养层。人ｉＰＳ细胞接种于饲养层上生长，胶原酶消化或机械法传代。倒置显微镜下观察ｉＰｓ细胞生长状态；观察拟胚体形成能力；ＲＴ－ＰＣＲ检测ｉＰＳ细胞多能性基因的表达情况。结果（１）小鼠胚胎成纤维细胞（ＭＥｎ为贴壁生长细胞，星梭形或多角形。细胞增殖旺盛。（２）生长在饲养层上的人ｉＰｓ细胞呈典型的克隆状生长。克隆呈圆形或椭圆形，边界清晰。克隆内细胞排列紧密。细胞体积小，核大，细胞核／质比高。ＲＴ．ＰＣＲ结果显示人ｉＰＳ细胞强表达多能性基因Ｏｃｔ４，Ｎａｎｏｇ，Ｓｏｘ２；去除饲养层后悬浮培养能形成拟胚体（ＥＢ）。结论本实验的培养体系适合人ｉＰＳ细胞的培养，人ｉＰＳ细胞能稳定增殖，保持自我更新及分化潜能。
关键词：人诱导性多能干细胞：细胞培养：饲养层中图分类号Ｒ４４６．１１＋，３，Ｑ８１３．１＋１．Ｒ３９２—３３
ｄ堕；！Ｑ：圣窆６９益』！！垫１６１垒＝！１２９．２Ｑ！Ｑ！Ｑ１．ｏＱ３
Ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ
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文献标识码Ａ
文章编号１６７４一１１２９（２０１０）０１一Ｏ００６—０３
ＦＥＮＧＮｉａｎｈｕａ，ＸＩＥＡｎ，ＬＯＵＹｕａｎｌｅｉ，
０１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＵｒｏｌｏｇｙｏｆＮａｎｃｈａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ３３０００６，Ｃｈｉｎａ
ａ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈ
ｓｔａｂｌｅｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｏｆｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｆｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍ
ｅｅｌｌｓ（ｉＰＳ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｓｏｆ３－５ｔｈｐａｓｓａｇｅｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙｍｉｔｏｍｙｃｉｎＣａｎｄｐｒｅｐａｒｅｄ鹪ｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒｓ．ｉＰＳｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｐｌａｔｅｄ
ｏｎ
ｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒｓａｎｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｉｎｖｅｒｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ｉＰＳｃｌｏｎｅｓｗａｓｐａｓ－
ｏｒ
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ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｍｅｔｈｏｄ．ＴｏｔａｌｍＲＮＡｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ—
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅｓ
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ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙ
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ｓｐｉｎｄｌｅｐｏｌｙｇｏｎ
ｓｈａｐｅ．（２）ｉＰＳ
ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｍａｉｎｔａｉｎｅｄ
ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒ
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ｎｕｃｌｅｉ．ＡｌｌｉＰＳｃｅｌｌｓｓｔｒｏｎｇｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄＯｃｔ４，ＮａｎｏｇａｎｄＳｏｘ２．Ｗｈｅｎｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｓｗｅｒｅｒｅｍｏｖｅｄ，ｉＰＳ
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ｅｍｂｒｙｏｉｄ
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【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄ诱导性多能干细胞ｆｉｎｄｕｃｅｄ
ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；Ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｓ
ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍ
细胞稳定培养体系的建立是其用于基础研究及临床疾病治疗的基础，具有重要的意义。本实验旨在建立稳定的ｉＰＳ细胞培养体系．为ｉＰＳ细胞的基础研究及临床应用奠定基础。
ｃｅｌｌｓ。ｉＰＳ细胞１是一种通过成体细胞重编程建立的多能干细胞．具有胚胎千细胞的特性．表达胚胎干细胞相关的多能性基因．能分化为三个胚层的细胞．移植到裸鼠体内能形成畸胎瘤【１’习。由于可取自成体细胞．因此ｉＰＳ细胞的使用可避免胚胎干细胞面临的伦理及免疫排斥问题。具有广泛的应用前景１２１。ｉＰＳ
基金项目：国家自然科学基金（３０９６０３８５）；江西省自然科学基金（２００７ＧＺＹｌ４７０）
作者简介：冯年花，女，江西吉安人。１９８７年１月出生，南昌大学医学院硕士研究生。
・通讯作者：汪泱，女，江西高安人，研究员，博士生导师．主要研究方向为干细胞与再生医学。
材料与方法
１材料
１．１实验动物及细胞系来源清洁级孕１２．５天Ｂａｌｂ／ｃ小鼠由南昌大学医学院动科部提供；人诱导性多能干细胞系ｉＰｓ—Ｓ由中科院上海生化细胞所肖磊课题组惠赠【３ｌ。
１．２试剂ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭＤＭＥＭ培养基、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ俐血清替代物ｆＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、高糖ＤＭＥＭ培养
万方数据
・
７
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第２８卷第１期
２０１０年２月
实验与检验医学
ＭＥＤＩＣＩＮＥ
Ｖ０１．２８Ｎｏ．１
ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬＡＮＤＩＡＢＯＲＡＴＯＲＹＦｅｂ．２０１０
基、非必需氨基酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ一谷氨酰胺（Ｌ—Ｇｌｕ．ｔａｍｉｎ）、一２一巯基乙醇（Ｂ—ＭＥ）、碱性成纤维生长因子（ｂ—ＦＧｆ’）、Ⅳ型胶原酶，以上均购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司：胎牛血清（ＦＢＳ）购自杭州四季青生物有限公司：丝裂霉素Ｃ（ＭＭＣ）：乖【Ｉ明胶（ｇｅｌａｔｉｎｅ）购自美国Ｓｉｇ－ｍａ公司：逆转录及ＰＣＲ试剂盒购自美国Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司。２方法
２。１培养基的配制ｉＰＳ细胞培养基：ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ
ＤＭＥＭ＋２０％ＳＲ＋１％ＮＥＡＡ＋ｌｍＭＬ－ｇｌｕ＋Ｏ．１ｍＭ
３－
ＭＥ＋４ｎｇ／ｍｌ
ｂ－ＦＧＦ：小鼠胚胎成纤维细胞（ＭＥＦ）培养
基：高糖ＤＭＥＭ培养基＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭＬ一谷氨酰胺。
２．２小鼠胚胎成纤维细胞（ＭＥＦ）的原代提取将健康成年Ｂａｌｂ／ｃ小鼠按照雄性和雌性１：２比例合笼，次日观察阴道栓。见栓当１３记为孕Ｏ。５天（Ｅ０．５ｄ）。取妊娠１２．５ｄ的孕鼠。无菌条件取出胚胎．剥离羊膜，去除头、四肢和内脏。用无菌ＰＢＳ洗净血迹．眼科剪剪碎．加入０．１２５％ＥＤＴＡ胰蛋白酶３７℃水浴消化３。５ｍｉｎ后，轻轻吹散细胞．加入含血清培养基终止，静置。取上清，重复数次；收集上清，１２００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ．取沉淀．以ｌ（Ｐ／ｎｄ的密度接种
于伐５的细胞培养瓶中，３７℃、含５％ＣＯ：条件下培
养。取状态良好的细胞冻存备用。
２．３饲养层的制备取第３．５代的ＭＥＦ细胞．换上含１０１ｘｇ／ｍｌ丝裂霉素Ｃ的新鲜培养液继续孵育１．５。３ｈ，用无菌ＰＢＳ洗５遍，胰酶消化，以５～ｌＯｘｌＯＳ／ＩＩｌｌ接种于预先用０．１％的明胶处理１．２ｈ的ｒＩ＇２５塑料培养瓶中。一周内使用。２．４人ｉＰｓ细胞的传代培养
２．４．１复苏取出冻存的ｉＰＳ细胞．放于３７℃温水。使冰晶快速融化．逐滴加入１０倍体积的ｉＰＳ细胞培养基。轻轻吹打混匀。８００ｄｍｉｎ离心３ｍｉｎ。弃上清，加入５ｍｌ新鲜ｉＰＳ细胞培养基．再次离心，洗净冻存液中的ＤＭＳＯ和血清．用ｉＰＳ细胞培养基重悬后接种于预先制备的饲养层上。每天换液。
２．４．２传代（１）Ⅳ型胶原酶消化传代法：待集落长满饲养层．用ｌｍｇ／ｎｄ的Ⅳ型胶原酶消化１５～２０ｍｉｎ．将集落吹下．加入３。５ｍｌ培养液．轻轻吹散成小集落，均匀接种于饲养层细胞上，３７℃、含５％ＣＯ：条件下培养；（２）机械传代法：传代前在倒置相差显微镜下将要分离的克隆做好标记．无菌条件下用无菌巴氏管挑取标记好的克隆。机械分离至合适大小，挑
万方数据
至离心管中８００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ。收集细胞沉淀．新鲜培养基重悬。接种于预先制备的饲养层上，每天换液。
２．４．３冻存将消化下来的ｉＰｓ细胞集落转移至离心管中。轻轻吹打至合适大小．８００ｒｐｍ离心３ｍｉｎ，弃上清。加入预先配好的冻存液ｆ７０％培养基＋２０％血清＋１０％ＤＭＳＯ）．混匀，转移至冻存管。标记好名称、日期和代数。于冻存盒中一８０℃过夜。次１３转移至一１９６。Ｃ液氮罐中保存。２．５人ｉＰＳ细胞的鉴定
２．５．１
ＲＴ—ＰＣＲ检测多能性基因的表达取状态
良好的人ｉＰＳ细胞克隆，Ｔｒｉｚｏｌ法提取总ＲＮＡ，ＲＴ—ＰＣＲ检测多能性基因Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ的表达。使用Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ逆转录试剂盒．随机引物逆转录合成ｃＤＮＡ后进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ反应条件如下：９４℃预变性５ｒａｉｎ，９４℃变性３０ｓ，退火３０ｓ，７２℃３０ｓ，７２℃延伸１０ｍｉｎ，扩增３０个循环。Ｂ—ａｃｔｉｎ做内参。各引物序列及产物长度如下：Ｏｃｔ４：上游引物：ＣＧＡＡＧＡ．ＧＡＡＡＧＣＧＡＡＣＣＡＧＴＡＴＣ，下游引物：ＡＧＡＡＣＣＡＣ—
ＡＣＴＣＧＧＡＣＣＡＣ
ＡＴＣ；Ｎａｎｏｇ：上游引物：ＧＣＡＡ—
ＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣ。下游引物：ｃｃｒＩ＇ｑ＇ＣＴ＿
ＧＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＴＴＧ：Ｓｏｘ２：
上游引物：ＣＣＣＣＣＧ－
ＧＣＧＧＣＡＡＴＡＧＣＡ。下游引物：ＴＣＧＧＣＧＣＣＧＧＧＧＡ．ＧＡＴＡＣＡＴ；Ｂ—ａｃｔｉｎ：上游弓ｌ物：ＴＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣ
ＣＡＣＧＡＡＡＣＴ．下游引物：ＧＡＡＧＣＡ兀ＴＧＣＧＧＴＧ－
ＧＡＣＧＡＴ。
２．５．２拟胚体（ＥＢ）形成能力将消化下来的ｉＰＳ细胞集落移至一培养皿中，差速贴壁３０ｒａｉｎ，去除剩余的饲养层细胞．收集悬浮细胞集落。用不含ｂＦＧＦ的ｉＰＳ细胞培养基蕈悬。吹打至合适大小的细胞团．接种于低黏附的细菌培养皿中悬浮培养，隔天换液。
结果
１原代ＭＥＦ的生长状态小鼠胚胎成纤维细胞为贴壁生长细胞．消化后２～３小时即贴壁并完全伸展，细胞呈梭形或多角形．胞浆饱满，立体感强，细胞核清晰。培养第二天可见培养液中漂浮较多的死亡细胞。细胞增殖旺盛，镜下可见较多圆形透亮的新生分裂细胞（图Ａ）。一般２。３天细胞完全融合。以１：２～３传代。取第３。５代状态良好的细胞用于饲养层的制备。
２人ｉＰｓ细胞的生长状况及鉴定ｉＰｓ细胞呈典型的克隆状生长。克隆呈圆形或椭圆形，边界清晰，折光性好，高倍镜下形似鸟巢（图Ｂ）。克隆内细胞排
・
８
・
第２８卷第１期
２０１０年２月
实验与
ＡＮＤ
检验医学
ＭＥＤｌＣＩＮＥ
Ｖ０１．２８Ｎｏ．１
Ｆｅｂ．２０１０
ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ
ＬＡＢＯＲＡ７ｒ０ＲＹ
列紧密．细胞体积较小，细胞核大、核仁清晰，细胞核／质比高。细胞增殖旺盛．一般每５—６ｄ传代。ＲＴ—ＰＣＲ结果显示体外多次传代的ｉＰＳ细胞仍高表达多能性基因Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ（［酮Ｃ）。消化后的ｉＰＳ细胞集落在低黏附培养板中悬浮培养能聚集成球生长。形成拟胚体。拟胚体内细胞间黏附紧密，各拟胚体边界清楚。胚体饱满，折光性好，悬浮生长于培养液中（图Ｄ）。
附图Ａ：贴壁生长的ＭＥＦ细胞；Ｂ：生长在饲养层上的呈克隆状生长；Ｃ：体外多次传代的人ｉＰＳ细胞仍高表达多能性基因Ｏｃｔ４。Ｓｏｘ２．Ｎａｎｏｇ；Ｄ：去除饲养层后悬浮培养．人ｉＰＳ细胞集落能聚集形成拟胚体。＠对＝５０Ｉ＾脚）
讨论
随着再生医学的兴起，干细胞成为研究的热点。ｉＰＳ技术的建立是干细胞领域的又一重大突破．具有里程碑式的意义。稳定的ｉＰＳ细胞体外培养体系是其应用于基础研究及临床疾病治疗的前提。本实验室培养的人ｉＰＳ细胞具有和ＥＳ细胞类似的生长特性。传至３５代仍能稳定增殖并保持未分化状态。强表达多能性基因Ｏｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ，在去除饲养层之后能形成拟胚体．表现出干细胞的聚集生长特性。说明本实验的培养体系适合ｉＰＳ细胞的稳定生长。
胶原酶消化法和机械传代法是两种常用的胚胎干细胞传代方法［４１，胶原酶适合消化生长状态良好．分化较少的克隆；机械法适合于克隆的纯化优选。前者操作方便，适合大批量扩增培养，但消化后集落的大小不易控制；后者工作量较大，时间较长．不适合大批量扩增培养，但能控制集落的大小。实际操作中可将二者结合，在不同阶段使用不同的方法进行传代。
在ｉＰＳ细胞培养体系中。合适的饲养层细胞是
万方数据
维持其生长的必要条件。饲养层细胞是经过灭活处理的不再增殖的细胞．可以分泌一些生长因子．促进细胞增殖。抑制分化．从而保持干细胞的自我更新及高度未分化状态闱．不同的饲养层分泌生长因子的能力不同１６ｌ。饲养层细胞的好坏直接影响ｉＰＳ细胞的生长状态。制备饲养层细胞最关键的步骤是灭活。比较常用的有两种方法．一种是射线照射法，另一种是丝裂霉素Ｃ处理法。处理的浓度和时间主要根据细胞的状态、密度进行调整［７１。本实验中采用丝裂霉素Ｃ处理法．一般ｉＯｌ山ｇ／ｍｌ处理１．５．３小时。我们曾将经１０ｔＬｇ／ｍｌ的丝裂霉素Ｃ处理２、２．５、３小时的饲养层进行比较．发现处理２．５小时比较合适。此时ＭＣ对细胞的毒性最低．同时又达到最佳的灭活效果。饲养层细胞的密度对ｉＰＳ的生长状态亦有影响［７，ｓ１．细胞密度太高导致ｉＰＳ细胞堆积生长．克隆中部细胞容易营养缺乏而死亡：密度太低易使ｉＰＳ细胞分化，一般Ｔ２５的培养瓶种植５～８ｘ１０５细胞。此外．不同种属的饲养层细胞对ｉＰＳ细胞的维持能力也不同ｆ９’ｉＯｌ：饲养层细胞传代次数越多。其对ｉＰＳ细胞的维持能力则越低…Ｊ。
目前．多家实验室已成功建立ｉＰＳ细胞系．但各实验室之间的培养体系存在些许差异．这在一定程度上影响了实验的重复性及稳定性。因此。建立稳
定规范的ｉＰＳ细胞培养体系有助于提供高质量细胞系，提高实验的真实性和准确性。
（致谢：感谢中科院上海生物化学与细胞生物学研究所肖磊课题组提供ｉＰＳ细胞系１。
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ｌａｓｔｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｓ：ａｎｏｖｅｌｃｕｌｔｕｒｅ
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ｈｕｍａｎ
ｅｍｂｒｙｏｍｃ
ｓｔｅｍ
ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＭｏｌＲｅｐｒｏｄＤｅｖ，２００８，７５（１０）：１５２３—１５３２．
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Ｈ哪眙ａｎｄ
ｈｕｍａｎｆｅｅｄｅｒ
ｃｅｌｌｓｆｏｒｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｍｃ
ｓｔｅｍ
ｃｅｌｌｓ【Ｊ】．
ＩｎｔＪＤｅｖ
Ｂｉｄ，２００８，５２（４）：３５３－３６３．
【７】ＺｈｏｕＤ，ＬｉｕＴ＇Ｚｈｏｕ）【，ｅｔａｉ．Ｔｈｒｅｅｋｅｙ
ｖａｒｉａｂｌｅｓ（下转第１５页）
・１５・
第２８卷第１期
２０１０年２月
实验与检
验医
学
ＭＥＤＩＣＩＮＥ
Ｖ０１．２８Ｎｏ．１
Ｆｅｂ．２０１０
ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬＡＮＤＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
生，影响ＲＡ预后和严蓖程度。ＨＬＡ—ＤＲ抗原主要存在于Ｂ淋巴细胞、单核细胞及内皮细胞的细胞膜上。ＨＬＡ—ＤＲ分子为二聚体结构．有非多态性的ＤＲａ链和多态性的ＤＲＢ链的可变区，可识别并结合抗原或自身抗原．刺激Ｔ细胞活化。进而诱发自身免疫反应。通过家系调查发现，ＲＡ发病有家族聚集趋向。ＨＬＡ—ＤＲ位于人类第６号染色体短臂上，其中ＨＬＡ一Ⅱ类基因具有高度多态性．是参与机体特异性识别和免疫应答的主要成分阎。ＨＬＡ等位基因多态性决定了个体免疫反应的表型．通过对Ｔ细胞的自身调节，影响抗原递呈过程。ＨＬＡ—ＤＲ染色体有两个表达ＤＲＢ的基因座位．一个座位是ＤＲＢｌ．另一个是ＤＲＢ３，ＤＲＢ４或ＤＲＢ５。单型ＤＲ５３含有ＤＲＢＩ座位基因，其特异性为ＤＲ４．ＤＲ７，和ＤＲ９基因阐。关于ＲＡ患者诊断指标。一直是风湿病学家最关注的研究项目．而ＭＨＣ类抗原中ＨＬＡ—ＤＲ作为ＲＡ预后判断的重要有效指标．ＨＬＡ—ＤＲ４作为ＲＡ的易感基因可成为新型的预后判断指标．易感基因对启动疾病发生与发展有重要作用。ＲＡ患者ＨＬＡ—ＤＲ４和ＨＬＡ—ＤＲ５３等位基因发生的频率数分别为４４％和５６％．与对照组比较均Ｐ＜０．０１，结果有非常显著性意义。其ＤＲ基因与ＲＡ的相对危险率分别为３．７０和２．６４．ＨＬＡ—ＤＲ４高于ＨＬＡ—ＤＲ５３。与张红卫等用基本相近。
本研究发现ＨＬＡ—ＤＲ４携带使患者ＲＦ值升高，使ＲＡ病情复杂化．给联合治疗带来阑难，表现在控制症状及恢复正常值的时间上．ＨＬＡ—ＤＲ４阳
清和滑液中ＲＦ的检测国外多采用比浊法、ＥＵＳＡ和ＲＩＡ法．国内普遍采用比浊法的定量检测和乳胶凝集法的定性检测，从而指导对ＲＡ病人的疗效观察。本文采用比浊法与乳胶法同时检测７５例类风湿关节炎患者血清ＲＦ．结果显示比浊法明显优于乳胶法，两法检测结果组间比较俨＜０．０１），有非常显著性差异。比浊法明显优于乳胶凝集法。７５例类风湿关节炎患者中比浊法有５９例阳性．乳胶法只有４４例阳性，乳胶法阳性率低与ＲＦ的Ｉｇ类型及隐性类风湿因子【９，１０Ｉ有关。
综上所述．ＲＡ患者其ＨＬＡ—ＤＲ基因与ＲＡ的发生易感性明显有关．为临床诊断和鉴别诊断提供依据。
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