实验一、质粒DNA的提取及检测
【实验目的】
1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤
2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术
3、学会PCR操作的基本技术
第一部分 质粒DNA的提取
一、实验原理：
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂
1、仪器 恒温摇床、台式离心机
2、试剂 溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿
三、实验步骤
1、 将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19
质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、 取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置15min。
7、 12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，
将上清转移到另一离心管中。
9、 向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。12000r/min，离心5min。
倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
10、用1mL70℅乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干
燥。
11、加20μLTE缓冲液，其中含有20μg/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。
第二部分 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、实验原理：
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
二、仪器与试剂
1、仪器 琼脂糖凝胶电泳系统、紫外线透射仪、电炉子
2、试剂 5×TBE、凝胶加样缓冲液（6×）、琼脂糖、溴化乙锭溶液（EB）
三、实验步骤
（一） 制备琼脂糖凝胶
称取0.1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入10mL 0.5×TBE 缓冲液，加热至完全溶化（加EB），摇匀，则为1℅琼脂糖凝胶液。
（二） 胶板的制备
1、 取有机玻璃内槽，洗净，晾干。
2、 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。
3、 将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层
均匀的胶面（注意不要形成气泡）。
4、 待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。
5、 加入电泳缓冲液至电泳槽中。
（三） 加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录点样顺序及点样量）。
（四） 电泳
1、 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。
2、 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳。
四、实验结果
在紫外灯（254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带。
第三部分 PCR扩增制备目的基因
一、实验原理：
是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。经过变性—复性—延伸的n次循环后，DNA可被扩增2n倍。
二、仪器与试剂
1、仪器 PCR仪
2、试剂 模板DNA、Taq DNA聚合酶、引物、10×Buffer、DNA Marker
三、实验步骤
（1）加样：在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。
ddH2O 15.25μl
10×PCR buffer 2.5μl
dNTP（2.5mM） 3.0μl
10μmol/L Primer1（2μM） 1.0μl
10μmol/L primer2（2μM） 1.0μl
模板DNA（含质粒) 2.0μl
Taq酶（5U/μl ） 0.25μl
总体积 25μl
（2）将PCR反应体系混匀，按以下循环条件在基因扩增仪上进行PCR循环： 预变性 94℃ 5min
变性 94℃ 45s
退火 56℃ 45s
延伸 72℃ 45s
完全延伸 72℃ 3min
（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
四、实验结果：
实验一、质粒DNA的提取及检测
【实验目的】
1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤
2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术
3、学会PCR操作的基本技术
第一部分 质粒DNA的提取
一、实验原理：
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂
1、仪器 恒温摇床、台式离心机
2、试剂 溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿
三、实验步骤
1、 将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19
质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、 取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置15min。
7、 12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，
将上清转移到另一离心管中。
9、 向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。12000r/min，离心5min。
倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
10、用1mL70℅乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干
燥。
11、加20μLTE缓冲液，其中含有20μg/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。
第二部分 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、实验原理：
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
二、仪器与试剂
1、仪器 琼脂糖凝胶电泳系统、紫外线透射仪、电炉子
2、试剂 5×TBE、凝胶加样缓冲液（6×）、琼脂糖、溴化乙锭溶液（EB）
三、实验步骤
（一） 制备琼脂糖凝胶
称取0.1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入10mL 0.5×TBE 缓冲液，加热至完全溶化（加EB），摇匀，则为1℅琼脂糖凝胶液。
（二） 胶板的制备
1、 取有机玻璃内槽，洗净，晾干。
2、 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。
3、 将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层
均匀的胶面（注意不要形成气泡）。
4、 待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。
5、 加入电泳缓冲液至电泳槽中。
（三） 加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录点样顺序及点样量）。
（四） 电泳
1、 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。
2、 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳。
四、实验结果
在紫外灯（254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带。
第三部分 PCR扩增制备目的基因
一、实验原理：
是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。经过变性—复性—延伸的n次循环后，DNA可被扩增2n倍。
二、仪器与试剂
1、仪器 PCR仪
2、试剂 模板DNA、Taq DNA聚合酶、引物、10×Buffer、DNA Marker
三、实验步骤
（1）加样：在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。
ddH2O 15.25μl
10×PCR buffer 2.5μl
dNTP（2.5mM） 3.0μl
10μmol/L Primer1（2μM） 1.0μl
10μmol/L primer2（2μM） 1.0μl
模板DNA（含质粒) 2.0μl
Taq酶（5U/μl ） 0.25μl
总体积 25μl
（2）将PCR反应体系混匀，按以下循环条件在基因扩增仪上进行PCR循环： 预变性 94℃ 5min
变性 94℃ 45s
退火 56℃ 45s
延伸 72℃ 45s
完全延伸 72℃ 3min
（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
四、实验结果：