实验六：放线菌的形态观察
姓名:戈奕文 学号：[1**********]2 系别：2010生物基地 组别：周一下午第一组 试验日期：2012年11月5日 同组成员：孟亚平 宋宁 褚鹏程
【摘要】
配制高氏I 号培养基用来培养青色链霉菌和弗式链霉菌，本实验运用插片法观察放线菌的形态，初步地了解放线菌的基本结构和形态。更直观的了解，基内菌丝、气生菌丝以及气生菌丝分化而成的孢子丝以及孢子。
【关键词】
青色链霉菌（Streptomyces glaucus ） 弗氏链霉菌（Streptomyces microflavus ）
高氏I 号培养基 插片法
【前言】
放线菌（actinomycetes ）是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。广泛存在于自然界中，土壤中最多，主要以孢子繁殖，至今发现的共有五六十属，它与人类的关系极为密切，根据1978年的统计，在当时已发现的5128种抗生素中，有3165种为各种放线菌所产生，链霉菌属又占放线菌中的首位（占放线菌产生的抗生素中的87.5％）；有的放线菌还可用于生产维生素、酶制剂等；少数会引起人类、动物、植物的疾病。链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群，其孢子丝的形态多样，而且性状较稳定，是对它们进行分类、鉴定的重要指示。因此学习如何培养和观察它们不仅对科学研究有很大的意义，对实际生活应用也有很大的帮助。本实验采用合成培养基进行培养，采用插片法取菌观察，不仅可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的放线菌形态，除此之外还可以采用玻璃纸法、印片法进行观察。链霉菌属（Streptomyces ）共约1，000多种，它们具有发育良好的菌丝体，也是实验中选取它们观察的重要原因。
一、 实验目的
1、掌握放线菌观察方法——插片法; 2、了解放线菌的基本形态。
二、 实验原理
1． 高氏I 号培养基
高氏I 号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀。因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将二种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。此外，合成培养基有的还要补加微量元素，如高氏I 号培养基中的FeSO 4•7H2O 的量只有0.00l ％，因此在配制培养基时需预先配成高浓度的 FeSO 4•H2O 贮备液，然后再按需加入一定的量到培养基中。
2． 放线菌
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝 （简称“基丝”），基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝 （简称“气丝”），并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。
在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。
图1
放
线菌形态
3． 插片法
将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。
图2 插片法
三、 实验材料
1. 菌种
青色链霉菌（Streptomyces glaucus）；弗式链霉菌(Streptomyces fradiae) 。 2. 培养基
灭菌的高氏Ⅰ号琼脂。
3. 仪器和用具
显微镜；酒精灯；载玻片；盖玻片；接种环；镊子；培养皿
四、 实验内容
1、高氏I 号培养基的制备（200ml ）
1) 按配方先称取可溶性溶粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉尽量溶解，再加
入沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶解。
2) 称取其他各成分依次溶解。由于条件限制，对于微量成分FeSO4·7H2O ，直接用
分析天平称量，加入即可。
3) 待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积，进行pH 调节到7.2～7.4。 4) 材料灭菌：将所配溶液装在三角烧瓶中并加棉塞，棉塞外包一层牛皮纸，并用麻
绳捆好，用记号笔标记组号。取十个培养基，用牛皮纸包好，用记号笔标记大小面。同理盖玻片也用牛皮纸包好，再在盖玻片上加盖一层牛皮纸纸，用牛皮纸包
好后，用记号笔标记，镊子也包好一起灭菌。将上述物品放入密封的加压灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌121℃、20分钟。
2、插片法进行链霉菌的观察
1) 倒平板：取融化并冷至大约50℃的高氏I 号培养基分装到6个培养皿中，
倒平板时尽量使培养基厚一些，凝固待用。
2) 接种：待培养基冷却凝固后，无菌操作，用接种环挑取菌种在平板上密
集划线接种。
3) 插片：以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约与培养基成45°角插入
平板内，并与划线垂直，每个平板至少插入3个盖玻片。 4) 培养：将平板倒置，28℃下培养7天。
5) 镜检：用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，将无菌面朝上放在载
玻片上，直接镜检。观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察，必要时可用油镜观察。
五、 实验结果
1、培养基中菌落形态观察：弗氏链霉菌为圆形，暗黄色，表面略凸 2、镜检结果：
表1. 显微镜下菌丝及孢子丝形态观察
弗氏链霉菌孢子丝直或柔曲。孢子椭圆形，长圆形，表面光滑。
附图：
图1 弗式链霉菌（10×40倍）
图2弗氏链霉菌（10*40） 图3弗氏链霉菌孢子丝（10*40）
图4 弗氏链霉菌（10*100油镜） 图5 弗氏链霉菌气生菌丝放大
基内菌丝 （明）
孢子丝（颗粒状）
气生菌丝（暗）
绘图：
六、 实验分析与讨论
1、由图可知，放线菌呈分枝丝状，分支较多交错在一起，由基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三部分组成，基内菌丝为透明，有较多的分枝；气生菌丝较暗。两种菌丝在不同的焦平面上，可以调节细准焦螺旋分别进行观察。
2、由菌落特征，放线菌的细胞有基内菌丝和气生菌丝的分化，气生菌丝到成熟时又会分化成孢子丝并产生成串的干粉状孢子，这些气生菌丝或孢子丝伸展在空气中，菌丝间一般都不存在毛细管水。这就使放线菌获得其特有的与细菌不同的菌落特征：干燥、不透明，表面呈紧密的丝绒状，菌落和培养基的连接紧密，难以挑取菌落。
七、 实验总结
1、接种时划线要密，插片时要有一定的角度且与划线相垂直，这样较容易使菌丝长在盖玻片上。
2、镜检时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察。菌面应该朝上，不然，菌体会被压扁，不好观察。
但是用油镜观察时，应使有菌面向下，否则会污染油镜镜头
3、链霉菌的孢子特征：孢子的形状多样，有球状、椭圆状、杆状、圆柱状、瓜子状、梭状和半月状等。孢子的颜色十分丰富，且与其表面的纹饰有关。孢子表面的纹饰在电子显微镜下清晰可见，除表面光滑者外，还有褶皱状、疣状、刺状、发状和鳞片状。刺又有粗细、大小、长短和疏密之分。目前发现，凡直或波曲的孢子丝，都产生表面光滑的孢子（尚未发现带刺或毛发状的），若孢子丝为螺旋状的，则其孢子表面会因种而异，有光滑、刺状或毛发状的。
八、 思考题
1. 镜检时如何区分放线菌基内菌丝、气生菌丝及孢子丝？
答：气生菌丝直生或分枝丝状，较基内菌丝粗，是指从基质伸向空气中的菌丝体。菌类的菌丝体多是匍匐在基质上，或是贯通基质而伸长的。真菌和放线菌的营养菌丝发育到一定时期，长出培养基外并伸向空间的菌丝称为气生菌丝。它叠生于营养菌丝上，以致可以覆盖整个菌落表面。在光学显微镜下，颜色较深，直径比营养菌丝粗，直形或弯曲，有的产生色素。有些气生菌丝发育到一定阶段分化成繁殖菌丝，产生孢子。
九、 参考文献
【1】沈萍、陈向东 《微生物学实验》高等教育出版社 第四版 P18～20 P70～73 P241
【2】沈萍、陈向东 《微生物学》 高等教育出版社 第二版P372～374
附表：高氏I 号培养基（200mL ）
实验六：放线菌的形态观察
姓名:戈奕文 学号：[1**********]2 系别：2010生物基地 组别：周一下午第一组 试验日期：2012年11月5日 同组成员：孟亚平 宋宁 褚鹏程
【摘要】
配制高氏I 号培养基用来培养青色链霉菌和弗式链霉菌，本实验运用插片法观察放线菌的形态，初步地了解放线菌的基本结构和形态。更直观的了解，基内菌丝、气生菌丝以及气生菌丝分化而成的孢子丝以及孢子。
【关键词】
青色链霉菌（Streptomyces glaucus ） 弗氏链霉菌（Streptomyces microflavus ）
高氏I 号培养基 插片法
【前言】
放线菌（actinomycetes ）是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。广泛存在于自然界中，土壤中最多，主要以孢子繁殖，至今发现的共有五六十属，它与人类的关系极为密切，根据1978年的统计，在当时已发现的5128种抗生素中，有3165种为各种放线菌所产生，链霉菌属又占放线菌中的首位（占放线菌产生的抗生素中的87.5％）；有的放线菌还可用于生产维生素、酶制剂等；少数会引起人类、动物、植物的疾病。链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群，其孢子丝的形态多样，而且性状较稳定，是对它们进行分类、鉴定的重要指示。因此学习如何培养和观察它们不仅对科学研究有很大的意义，对实际生活应用也有很大的帮助。本实验采用合成培养基进行培养，采用插片法取菌观察，不仅可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的放线菌形态，除此之外还可以采用玻璃纸法、印片法进行观察。链霉菌属（Streptomyces ）共约1，000多种，它们具有发育良好的菌丝体，也是实验中选取它们观察的重要原因。
一、 实验目的
1、掌握放线菌观察方法——插片法; 2、了解放线菌的基本形态。
二、 实验原理
1． 高氏I 号培养基
高氏I 号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀。因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将二种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。此外，合成培养基有的还要补加微量元素，如高氏I 号培养基中的FeSO 4•7H2O 的量只有0.00l ％，因此在配制培养基时需预先配成高浓度的 FeSO 4•H2O 贮备液，然后再按需加入一定的量到培养基中。
2． 放线菌
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝 （简称“基丝”），基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝 （简称“气丝”），并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。
在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。
图1
放
线菌形态
3． 插片法
将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。
图2 插片法
三、 实验材料
1. 菌种
青色链霉菌（Streptomyces glaucus）；弗式链霉菌(Streptomyces fradiae) 。 2. 培养基
灭菌的高氏Ⅰ号琼脂。
3. 仪器和用具
显微镜；酒精灯；载玻片；盖玻片；接种环；镊子；培养皿
四、 实验内容
1、高氏I 号培养基的制备（200ml ）
1) 按配方先称取可溶性溶粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉尽量溶解，再加
入沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶解。
2) 称取其他各成分依次溶解。由于条件限制，对于微量成分FeSO4·7H2O ，直接用
分析天平称量，加入即可。
3) 待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积，进行pH 调节到7.2～7.4。 4) 材料灭菌：将所配溶液装在三角烧瓶中并加棉塞，棉塞外包一层牛皮纸，并用麻
绳捆好，用记号笔标记组号。取十个培养基，用牛皮纸包好，用记号笔标记大小面。同理盖玻片也用牛皮纸包好，再在盖玻片上加盖一层牛皮纸纸，用牛皮纸包
好后，用记号笔标记，镊子也包好一起灭菌。将上述物品放入密封的加压灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌121℃、20分钟。
2、插片法进行链霉菌的观察
1) 倒平板：取融化并冷至大约50℃的高氏I 号培养基分装到6个培养皿中，
倒平板时尽量使培养基厚一些，凝固待用。
2) 接种：待培养基冷却凝固后，无菌操作，用接种环挑取菌种在平板上密
集划线接种。
3) 插片：以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约与培养基成45°角插入
平板内，并与划线垂直，每个平板至少插入3个盖玻片。 4) 培养：将平板倒置，28℃下培养7天。
5) 镜检：用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，将无菌面朝上放在载
玻片上，直接镜检。观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察，必要时可用油镜观察。
五、 实验结果
1、培养基中菌落形态观察：弗氏链霉菌为圆形，暗黄色，表面略凸 2、镜检结果：
表1. 显微镜下菌丝及孢子丝形态观察
弗氏链霉菌孢子丝直或柔曲。孢子椭圆形，长圆形，表面光滑。
附图：
图1 弗式链霉菌（10×40倍）
图2弗氏链霉菌（10*40） 图3弗氏链霉菌孢子丝（10*40）
图4 弗氏链霉菌（10*100油镜） 图5 弗氏链霉菌气生菌丝放大
基内菌丝 （明）
孢子丝（颗粒状）
气生菌丝（暗）
绘图：
六、 实验分析与讨论
1、由图可知，放线菌呈分枝丝状，分支较多交错在一起，由基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三部分组成，基内菌丝为透明，有较多的分枝；气生菌丝较暗。两种菌丝在不同的焦平面上，可以调节细准焦螺旋分别进行观察。
2、由菌落特征，放线菌的细胞有基内菌丝和气生菌丝的分化，气生菌丝到成熟时又会分化成孢子丝并产生成串的干粉状孢子，这些气生菌丝或孢子丝伸展在空气中，菌丝间一般都不存在毛细管水。这就使放线菌获得其特有的与细菌不同的菌落特征：干燥、不透明，表面呈紧密的丝绒状，菌落和培养基的连接紧密，难以挑取菌落。
七、 实验总结
1、接种时划线要密，插片时要有一定的角度且与划线相垂直，这样较容易使菌丝长在盖玻片上。
2、镜检时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察。菌面应该朝上，不然，菌体会被压扁，不好观察。
但是用油镜观察时，应使有菌面向下，否则会污染油镜镜头
3、链霉菌的孢子特征：孢子的形状多样，有球状、椭圆状、杆状、圆柱状、瓜子状、梭状和半月状等。孢子的颜色十分丰富，且与其表面的纹饰有关。孢子表面的纹饰在电子显微镜下清晰可见，除表面光滑者外，还有褶皱状、疣状、刺状、发状和鳞片状。刺又有粗细、大小、长短和疏密之分。目前发现，凡直或波曲的孢子丝，都产生表面光滑的孢子（尚未发现带刺或毛发状的），若孢子丝为螺旋状的，则其孢子表面会因种而异，有光滑、刺状或毛发状的。
八、 思考题
1. 镜检时如何区分放线菌基内菌丝、气生菌丝及孢子丝？
答：气生菌丝直生或分枝丝状，较基内菌丝粗，是指从基质伸向空气中的菌丝体。菌类的菌丝体多是匍匐在基质上，或是贯通基质而伸长的。真菌和放线菌的营养菌丝发育到一定时期，长出培养基外并伸向空间的菌丝称为气生菌丝。它叠生于营养菌丝上，以致可以覆盖整个菌落表面。在光学显微镜下，颜色较深，直径比营养菌丝粗，直形或弯曲，有的产生色素。有些气生菌丝发育到一定阶段分化成繁殖菌丝，产生孢子。
九、 参考文献
【1】沈萍、陈向东 《微生物学实验》高等教育出版社 第四版 P18～20 P70～73 P241
【2】沈萍、陈向东 《微生物学》 高等教育出版社 第二版P372～374
附表：高氏I 号培养基（200mL ）