研究报告
生命科学仪器 ２００７ 第５卷／ ６月刊
基于质谱的ＴＯＰ－ＤＯＷＮ蛋白质组学技术用于微生物鉴定
Ｐｌａｍｅｎ Ａ． Ｄｅｍｉｒｅｖ
摘要 采用新型的质谱软电离方法，如基体辅助激光解吸电离（ＭＡＬＤＩ）和／或者电喷雾离子化（ＥＳＩ），可获得微生物的质谱图。当微生物经过纯化、分级、富集和色谱分离后，可将ＥＳＩ与多种质量分析器相结合，进行大规模的不同微生物的蛋白质组学研究。相反，ＭＡＬＤＩ对盐和其他杂质的耐受能力高，因此，在只对样品进行简单处理的情况下，ＭＡＬＤＩ可被用作快速检测和鉴定完整微生物的质谱传感器平台的离子源。
传统技术对于微生物的检测和鉴定往往很慢
（数天时间），并且灵敏度低，特异性差。很多领域，从医学诊断到国土安全，都将得益于可进行天然以及生物工程微生物快速、可靠检测和鉴定的新型分子水平技术的发展。近期快速发展起来的质谱（ＭＳ）凭借其诸多优点已成为这样一种技术［１，２］。一个微生物的质谱鉴定实验，包括样品的采集和制备，整个过程不到１０ｍｉｎ。此外，质谱还是一种通用技术，它可以检测到所有类型的病原体，即病毒、植物细菌、真菌及其孢子，寄生原生动物，并且需要样品量很少，可少于１０４
个微生物。目前采用质谱检测和鉴定微生物主要基于
质谱图中是否存在特异性的生物标记物的分子离子。因此，不同微生物具有不同的质谱图，即微生物指纹图谱（图１［３］）。
采用新型的质谱软电离方法，如基体辅助激光解吸电离（ＭＡＬＤＩ）和／或者电喷雾离子化（ＥＳＩ），可获得微生物的质谱图。当微生物经过纯化、分级、富集和色谱分离后，可将ＥＳＩ与多种质量分析器相结合，进行大规模的不同微生物的蛋白质组学研究。相反，ＭＡＬＤＩ对盐和其他杂质的耐受能力高，因此，在只对样品进行简单处理的情况下，ＭＡＬＤＩ可被用作快速检测和鉴定完整微生物的质谱传感器平台的离子源［１］。在ＭＡＬＤＩ技术中，在完整的微生物（病毒、孢子、植物细菌等）中添加少量的酸性基质溶液有助于细胞裂解和生物标记物的原位提取（在ＭＡＬＤＩ探针上）。脉冲激光照射到固体样品／基质混合物上可产生特异性的微生物生物标记物离子。这些离子可通过飞行时间质谱（ＴＯＦ ＭＳ）进行进一步的分析。
完整微生物的ＭＡＬＤＩ ＭＳ结果受诸多实验因素的影响，如蛋白生物标记物的提取和溶解性、由于培养时间和基质差异导致的生物标记物蛋白表达水平的多样性、不同生物标记物分子的离子化效率（和基质／生物标记物蛋白的比例有关）、激光脉冲能量的变化以及不同仪器间检测效率的差异。为了鉴定微生物，可将实验得到的质谱图与已被编入质谱指纹图库中的已知微生物的指纹图谱进行比对。然而，为了使该方法更加有效，必须把大量的微生物质谱数据编入指纹图库中。该方法的另一个局限性就是图库中缺乏新的、刚出现的或者高致病性的微生物谱图。
图１ 完整的杆状菌孢子的正离子基质辅助激光解吸附离子化飞行时间（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ）质谱图。将从孢子悬浮水溶液中沉淀到的大约３×１０５个完整孢子和ＭＡＬＤＩ 的基质混合（少于１μＬ）。利用ＭＳ可以区分具有不同氨基酸序列的两种微生物的生物标记物（经许可选自［３］）。这些 ＭＳ指纹数据可以通过实验得到（从各种条件下大量微生物的质谱图中获
得），
或者通过生物计量学方法推出。
作者简介：Ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｓ ａｒｅ ｗｉｔｈ Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐ， ４４５ Ｌａｋｅｓｉｄｅ Ｄｒ．， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ ９４０８８， Ｕ．Ｓ．Ａ．；
ｔｅｌ．： ４０８－４８１－４５３４； ｆａｘ： ４０８－７３２－２００７； ｅ－ｍａｉｌ： Ｓｒｉｎｉｖａｓａ． Ｒａｏ＠ｄｉｏｎｅｘ．ｃｏｍ． Ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｓ ｗｏｕｌｄ ｌｉｋｅ ｔｏ ｔｈａｎｋ Ｄｒ． Ｍａｒｋ Ｔｒａｃｙ， Ｄｒ． ＴｅｒｒｙＳｈｅｅｈａｎ， ａｎｄ Ｄｒ． Ｊｅｆｆ Ｒｏｈｒｅｒ ｆｒｏｍ Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐ． ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ．
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生命科学仪器 ２００７ 第５卷／ ６月刊
研究报告
最近人们提出了一种基于生物信息学策略的微生物质谱鉴定方法［１，４］。当对应生物体的基因序列已知时，可根据可能表达的蛋白质序列来预测质谱图中是否存在蛋白生物标记物。蛋白质的序列可以从互联网上的蛋白质组数据库中获得。成功使用该生物信息学方法的条件和要求是数据库的完整性（要包含特殊微生物的基因序列）和真实性（可以预期／整合多种蛋白生物标记物的翻译后修饰状态）。目前（２００６年初），已有２８０多种基因序列已知并被公开的细菌基因组（见ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）。
无论是ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ还是ｔｏｐ－ｄｏｗｎ策略［５］均可用来进行微生物的质谱鉴定（图２）。这两种策略的区别在于是否应用化学（如微波辅助）或酶的方法将完整的蛋白酶解。在ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ蛋白质组学策略中，首先将蛋白酶解成多个肽段，然后根据酶解肽段的特异性，再辅助二级质谱技术和生物信息学，可以明确地鉴定出蛋白。无论采用ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ还是ｔｏｐ－ｄｏｗｎ蛋白质组学策略，利用二级质谱技术鉴定出一个或多个独特的蛋白生物标记物后，就可以鉴定出微生物。在二级质谱（ＭＳ－ＭＳ）实验中，前体蛋白或者肽离子经选取分离后，与中性气体分子、电子或者光子作用后被内部激发。随着前体离子内部能量的增加，将裂解成与前体离子氨基酸序列相关的特异性片段。原位进行完整的杆状菌生物标记物提取、酶解、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ－ＭＳ的肽段分析和蛋白质组数据库查询，可准确地鉴
定细菌的种类［６］。
最初人们利用ＥＳＩ结合傅立叶变换离子回旋共振（ＦＴＩＣＲ）或者四极杆离子阱质谱实现Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ蛋白质组策略［５，７］。Ｍｏｒｔｚ ｅｔ ａｌ．率先利用ＦＴＩＣＲ ＭＳ－ＭＳ通过推断氨基酸序列和蛋白质组数据库搜索实现了对完整蛋白的鉴定［７］。样品经提取、分级和处理后，采用该方法，利用高分辨率的二级ＦＴＩＣＲ质谱分析，找到了利用ＭＡＬＤＩ ＭＳ从完整的Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ Ｔ孢子中发现的主要生物标记蛋白［１］。经过蛋白质组数据库序列相似性搜索，这些生物标记物被确定为小的酸溶性孢子蛋白（ＳＡＳＰ）。
利用二级质谱技术鉴定完整的蛋白生物标记物往往需要复杂的仪器（如ＥＳＩ／ＦＴＩＣＲ）。近期二级ＴＯＦ质谱仪器的发展（如ＵｌｔｒａｆｌｅｘⅡＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ［Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ］），使得通过ＭＡＬＤＩＭＳ进行快速、高置信度的完整Ｂａｃｉｌｌｕｓ孢子种类鉴定成为可能［３］。采用该方法，完整微生物产生的大相对分子质量（＞５ ｋＤａ）的前体离子被选择进入第一级ＴＯＦ分析器中，并在其无场区域经激光诱导裂解（ＬＩＤ）产生碎片离子。碎片离子在加速后于高分辨率的回旋分析器——第二级ＴＯＦ／ＴＯＦ装置中得到检测。不同于基于ＥＳＩ／ＦＴＩＣＲ的Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ蛋白质组学策略，采用ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳ，在分析前不
需要对蛋白标记物进行富集、纯化和分离，可直接
图３ 根据ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ获得的生物标记物的分子离子质谱图，采用Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ蛋白质组策略鉴定孢子。ａ）完整的Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ和Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ孢子二元混合物的前体离子谱图。ｂ）分开的ｍ／ｚ ６ ７１２和７ ３３４两个前体离子碎片谱图。分别来于Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ和Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ的两个ＳＡＳＰ蛋白被认为是最可能的前体，随机匹配的可能性仅为１．８×１０－３０和８．１×１０－
图２ 用于微生物鉴定的基于ＭＡＬＤＩ ＭＳ的Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ（无
蛋白酶解过程）和ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ
蛋白质组策略。
１６。图中标出了产生大量碎片的部分切割位点序列（经许可
选自［３］）。
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分析完整的微生物，包括纯品和混合物。对前体蛋白离子进行ＬＩＤ可产生具有特殊序列的骨架断裂。从
主要碎片上丢失的两个中性分子（ＮＨ３／Ｈ２Ｏ）都可以被检测到。对于相对分子质量从３到９ ｋＤａ的前体蛋白，其各自碎片离子的数目在３０到１００之间（取决于前体离子强度、激光流量、基质等）。在ＬＩＤ图谱中的离子主要是在天冬氨酸或谷氨酸残基的Ｃ端断裂产生的（图３）。
为了鉴定各种生物标记物，需要将ＴＯＦ／ＴＯＦ实验得到的质谱图与计算机生成的蛋白质组数据库中在设定前体离子质量范围内所有蛋白质的二级质谱图进行对比，并对找到的匹配离子进行进一步的计算，
根据找到的一个在数据库中找到最可能的前体蛋白。
或多个特异性蛋白生物标记物，就可以鉴定出微生物
的来源。从图３可以看出，采用该方法鉴定出各自的生物标记物ＳＡＳＰ后，就可以在二元混合物中鉴别出完整的Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ和Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ孢子［３］。
［１］Ｆｅｎｓｅ１ａｕ， Ｃ， Ｄｅｍｉｒｅｖ Ｐ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎ－ｉｓｍｓ ｂｙ ＭＡＬＤＩ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ Ｒｅｖ， ２００１，２０： １５７－７１．
［２］［３］
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ ＭＳ． Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃ， Ｌａｙ Ｊ ， Ｅｄｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ： Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ２００５．
Ｄｅｍｉｒｅｖ Ｐ， Ｆｅｌｄｍａｎ Ａ， Ｋｏｗａｌｓｋｉ Ｐ， Ｌｉｎ Ｊ． Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００５， ７７： ７４５５－６１．
［４］Ｄｅｍｉｒｅｖ Ｐ， Ｆｅｌｄｍａｎ Ａ， Ｌｉｎ Ｊ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ－ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ ＡＰＬ Ｔｅｃｈ Ｄｉｇｅｓｔ， ２００４， ２５： ２７－３７．
［５］Ｂｏｇｄａｎｏｖ Ｂ， Ｓｍｉｔｈ Ｒ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｂｙ ＦＴＩＣＲ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ｔｏｐ ｄｏｗｎ ａｎｄ ｂｏｔｔｏｍ ｕｐ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ Ｒｅｖ， ２００５， ２４： １６８－２００．
［６］Ｗａｒｓｃｈｅｉｄ Ｂ， Ｆｅｎｓｅｌａｕ Ｃ． Ａ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｂｙ ＭＡＬＤＩ ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ２００４， ４： ２８７７－９２．
［７］Ｍｏｒｔｚ Ｅ， Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ Ｐ， Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ Ｐ， Ｋｅｌｌｅｈｅｒ Ｎ， Ｗｏｏｄ Ｔ，ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ Ｆ Ｗ， Ｍａｎｎ Ｍ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｄａｔａ ａｇａｉｎｓｔ ｓｅ－ｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９９６， ９３： ８２６４－７．
参考文献
ＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－Ｂａｓｅｄ
Ｔｏｐ－Ｄｏｗｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ
Ｐｌａｍｅｎ Ａ． Ｄｅｍｉｒｅｖ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｎｅｗｅｒ ｓｏｆｔ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ， ｉ．ｅ．， ＭＡＬＤＩ ａｎｄ／ｏｒ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ （ＥＳＩ）， ａｒｅ ｂｏｔｈ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ａｃｑｕｉｒｅ ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ． ＥＳＩ， ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｍａｓｓ ａｎａｌｙｚｅｒｓ， ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｆｔｅｒ ａ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ， ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ， ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｔｅｐｓ． Ｉｎ ｃｏｎｔｒａｓｔ， ＭＡＬＤＩ ｉｓｍｕｃｈ ｍｏｒｅ ｔｏｌｅｒａｎｔ ｔｏ ｓａｌｔｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ＭＡＬＤＩ ｉｓ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＭＳ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗｉｔｈ ｍｉｎｉｍａｌ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．
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基于质谱的ＴＯＰ－ＤＯＷＮ蛋白质组学技术用于微生物鉴定
Ｐｌａｍｅｎ Ａ． Ｄｅｍｉｒｅｖ
摘要 采用新型的质谱软电离方法，如基体辅助激光解吸电离（ＭＡＬＤＩ）和／或者电喷雾离子化（ＥＳＩ），可获得微生物的质谱图。当微生物经过纯化、分级、富集和色谱分离后，可将ＥＳＩ与多种质量分析器相结合，进行大规模的不同微生物的蛋白质组学研究。相反，ＭＡＬＤＩ对盐和其他杂质的耐受能力高，因此，在只对样品进行简单处理的情况下，ＭＡＬＤＩ可被用作快速检测和鉴定完整微生物的质谱传感器平台的离子源。
传统技术对于微生物的检测和鉴定往往很慢
（数天时间），并且灵敏度低，特异性差。很多领域，从医学诊断到国土安全，都将得益于可进行天然以及生物工程微生物快速、可靠检测和鉴定的新型分子水平技术的发展。近期快速发展起来的质谱（ＭＳ）凭借其诸多优点已成为这样一种技术［１，２］。一个微生物的质谱鉴定实验，包括样品的采集和制备，整个过程不到１０ｍｉｎ。此外，质谱还是一种通用技术，它可以检测到所有类型的病原体，即病毒、植物细菌、真菌及其孢子，寄生原生动物，并且需要样品量很少，可少于１０４
个微生物。目前采用质谱检测和鉴定微生物主要基于
质谱图中是否存在特异性的生物标记物的分子离子。因此，不同微生物具有不同的质谱图，即微生物指纹图谱（图１［３］）。
采用新型的质谱软电离方法，如基体辅助激光解吸电离（ＭＡＬＤＩ）和／或者电喷雾离子化（ＥＳＩ），可获得微生物的质谱图。当微生物经过纯化、分级、富集和色谱分离后，可将ＥＳＩ与多种质量分析器相结合，进行大规模的不同微生物的蛋白质组学研究。相反，ＭＡＬＤＩ对盐和其他杂质的耐受能力高，因此，在只对样品进行简单处理的情况下，ＭＡＬＤＩ可被用作快速检测和鉴定完整微生物的质谱传感器平台的离子源［１］。在ＭＡＬＤＩ技术中，在完整的微生物（病毒、孢子、植物细菌等）中添加少量的酸性基质溶液有助于细胞裂解和生物标记物的原位提取（在ＭＡＬＤＩ探针上）。脉冲激光照射到固体样品／基质混合物上可产生特异性的微生物生物标记物离子。这些离子可通过飞行时间质谱（ＴＯＦ ＭＳ）进行进一步的分析。
完整微生物的ＭＡＬＤＩ ＭＳ结果受诸多实验因素的影响，如蛋白生物标记物的提取和溶解性、由于培养时间和基质差异导致的生物标记物蛋白表达水平的多样性、不同生物标记物分子的离子化效率（和基质／生物标记物蛋白的比例有关）、激光脉冲能量的变化以及不同仪器间检测效率的差异。为了鉴定微生物，可将实验得到的质谱图与已被编入质谱指纹图库中的已知微生物的指纹图谱进行比对。然而，为了使该方法更加有效，必须把大量的微生物质谱数据编入指纹图库中。该方法的另一个局限性就是图库中缺乏新的、刚出现的或者高致病性的微生物谱图。
图１ 完整的杆状菌孢子的正离子基质辅助激光解吸附离子化飞行时间（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ）质谱图。将从孢子悬浮水溶液中沉淀到的大约３×１０５个完整孢子和ＭＡＬＤＩ 的基质混合（少于１μＬ）。利用ＭＳ可以区分具有不同氨基酸序列的两种微生物的生物标记物（经许可选自［３］）。这些 ＭＳ指纹数据可以通过实验得到（从各种条件下大量微生物的质谱图中获
得），
或者通过生物计量学方法推出。
作者简介：Ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｓ ａｒｅ ｗｉｔｈ Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐ， ４４５ Ｌａｋｅｓｉｄｅ Ｄｒ．， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ ９４０８８， Ｕ．Ｓ．Ａ．；
ｔｅｌ．： ４０８－４８１－４５３４； ｆａｘ： ４０８－７３２－２００７； ｅ－ｍａｉｌ： Ｓｒｉｎｉｖａｓａ． Ｒａｏ＠ｄｉｏｎｅｘ．ｃｏｍ． Ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｓ ｗｏｕｌｄ ｌｉｋｅ ｔｏ ｔｈａｎｋ Ｄｒ． Ｍａｒｋ Ｔｒａｃｙ， Ｄｒ． ＴｅｒｒｙＳｈｅｅｈａｎ， ａｎｄ Ｄｒ． Ｊｅｆｆ Ｒｏｈｒｅｒ ｆｒｏｍ Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐ． ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ．
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生命科学仪器 ２００７ 第５卷／ ６月刊
研究报告
最近人们提出了一种基于生物信息学策略的微生物质谱鉴定方法［１，４］。当对应生物体的基因序列已知时，可根据可能表达的蛋白质序列来预测质谱图中是否存在蛋白生物标记物。蛋白质的序列可以从互联网上的蛋白质组数据库中获得。成功使用该生物信息学方法的条件和要求是数据库的完整性（要包含特殊微生物的基因序列）和真实性（可以预期／整合多种蛋白生物标记物的翻译后修饰状态）。目前（２００６年初），已有２８０多种基因序列已知并被公开的细菌基因组（见ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）。
无论是ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ还是ｔｏｐ－ｄｏｗｎ策略［５］均可用来进行微生物的质谱鉴定（图２）。这两种策略的区别在于是否应用化学（如微波辅助）或酶的方法将完整的蛋白酶解。在ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ蛋白质组学策略中，首先将蛋白酶解成多个肽段，然后根据酶解肽段的特异性，再辅助二级质谱技术和生物信息学，可以明确地鉴定出蛋白。无论采用ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ还是ｔｏｐ－ｄｏｗｎ蛋白质组学策略，利用二级质谱技术鉴定出一个或多个独特的蛋白生物标记物后，就可以鉴定出微生物。在二级质谱（ＭＳ－ＭＳ）实验中，前体蛋白或者肽离子经选取分离后，与中性气体分子、电子或者光子作用后被内部激发。随着前体离子内部能量的增加，将裂解成与前体离子氨基酸序列相关的特异性片段。原位进行完整的杆状菌生物标记物提取、酶解、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ－ＭＳ的肽段分析和蛋白质组数据库查询，可准确地鉴
定细菌的种类［６］。
最初人们利用ＥＳＩ结合傅立叶变换离子回旋共振（ＦＴＩＣＲ）或者四极杆离子阱质谱实现Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ蛋白质组策略［５，７］。Ｍｏｒｔｚ ｅｔ ａｌ．率先利用ＦＴＩＣＲ ＭＳ－ＭＳ通过推断氨基酸序列和蛋白质组数据库搜索实现了对完整蛋白的鉴定［７］。样品经提取、分级和处理后，采用该方法，利用高分辨率的二级ＦＴＩＣＲ质谱分析，找到了利用ＭＡＬＤＩ ＭＳ从完整的Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ Ｔ孢子中发现的主要生物标记蛋白［１］。经过蛋白质组数据库序列相似性搜索，这些生物标记物被确定为小的酸溶性孢子蛋白（ＳＡＳＰ）。
利用二级质谱技术鉴定完整的蛋白生物标记物往往需要复杂的仪器（如ＥＳＩ／ＦＴＩＣＲ）。近期二级ＴＯＦ质谱仪器的发展（如ＵｌｔｒａｆｌｅｘⅡＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ［Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ］），使得通过ＭＡＬＤＩＭＳ进行快速、高置信度的完整Ｂａｃｉｌｌｕｓ孢子种类鉴定成为可能［３］。采用该方法，完整微生物产生的大相对分子质量（＞５ ｋＤａ）的前体离子被选择进入第一级ＴＯＦ分析器中，并在其无场区域经激光诱导裂解（ＬＩＤ）产生碎片离子。碎片离子在加速后于高分辨率的回旋分析器——第二级ＴＯＦ／ＴＯＦ装置中得到检测。不同于基于ＥＳＩ／ＦＴＩＣＲ的Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ蛋白质组学策略，采用ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳ，在分析前不
需要对蛋白标记物进行富集、纯化和分离，可直接
图３ 根据ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ获得的生物标记物的分子离子质谱图，采用Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ蛋白质组策略鉴定孢子。ａ）完整的Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ和Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ孢子二元混合物的前体离子谱图。ｂ）分开的ｍ／ｚ ６ ７１２和７ ３３４两个前体离子碎片谱图。分别来于Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ和Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ的两个ＳＡＳＰ蛋白被认为是最可能的前体，随机匹配的可能性仅为１．８×１０－３０和８．１×１０－
图２ 用于微生物鉴定的基于ＭＡＬＤＩ ＭＳ的Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ（无
蛋白酶解过程）和ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ
蛋白质组策略。
１６。图中标出了产生大量碎片的部分切割位点序列（经许可
选自［３］）。
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生命科学仪器 ２００７ 第５卷／ ６月刊
分析完整的微生物，包括纯品和混合物。对前体蛋白离子进行ＬＩＤ可产生具有特殊序列的骨架断裂。从
主要碎片上丢失的两个中性分子（ＮＨ３／Ｈ２Ｏ）都可以被检测到。对于相对分子质量从３到９ ｋＤａ的前体蛋白，其各自碎片离子的数目在３０到１００之间（取决于前体离子强度、激光流量、基质等）。在ＬＩＤ图谱中的离子主要是在天冬氨酸或谷氨酸残基的Ｃ端断裂产生的（图３）。
为了鉴定各种生物标记物，需要将ＴＯＦ／ＴＯＦ实验得到的质谱图与计算机生成的蛋白质组数据库中在设定前体离子质量范围内所有蛋白质的二级质谱图进行对比，并对找到的匹配离子进行进一步的计算，
根据找到的一个在数据库中找到最可能的前体蛋白。
或多个特异性蛋白生物标记物，就可以鉴定出微生物
的来源。从图３可以看出，采用该方法鉴定出各自的生物标记物ＳＡＳＰ后，就可以在二元混合物中鉴别出完整的Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ和Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ孢子［３］。
［１］Ｆｅｎｓｅ１ａｕ， Ｃ， Ｄｅｍｉｒｅｖ Ｐ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎ－ｉｓｍｓ ｂｙ ＭＡＬＤＩ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ Ｒｅｖ， ２００１，２０： １５７－７１．
［２］［３］
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ ＭＳ． Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃ， Ｌａｙ Ｊ ， Ｅｄｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ： Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ２００５．
Ｄｅｍｉｒｅｖ Ｐ， Ｆｅｌｄｍａｎ Ａ， Ｋｏｗａｌｓｋｉ Ｐ， Ｌｉｎ Ｊ． Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００５， ７７： ７４５５－６１．
［４］Ｄｅｍｉｒｅｖ Ｐ， Ｆｅｌｄｍａｎ Ａ， Ｌｉｎ Ｊ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ－ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ ＡＰＬ Ｔｅｃｈ Ｄｉｇｅｓｔ， ２００４， ２５： ２７－３７．
［５］Ｂｏｇｄａｎｏｖ Ｂ， Ｓｍｉｔｈ Ｒ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｂｙ ＦＴＩＣＲ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ｔｏｐ ｄｏｗｎ ａｎｄ ｂｏｔｔｏｍ ｕｐ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ Ｒｅｖ， ２００５， ２４： １６８－２００．
［６］Ｗａｒｓｃｈｅｉｄ Ｂ， Ｆｅｎｓｅｌａｕ Ｃ． Ａ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｂｙ ＭＡＬＤＩ ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ２００４， ４： ２８７７－９２．
［７］Ｍｏｒｔｚ Ｅ， Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ Ｐ， Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ Ｐ， Ｋｅｌｌｅｈｅｒ Ｎ， Ｗｏｏｄ Ｔ，ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ Ｆ Ｗ， Ｍａｎｎ Ｍ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｄａｔａ ａｇａｉｎｓｔ ｓｅ－ｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９９６， ９３： ８２６４－７．
参考文献
ＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－Ｂａｓｅｄ
Ｔｏｐ－Ｄｏｗｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ
Ｐｌａｍｅｎ Ａ． Ｄｅｍｉｒｅｖ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｎｅｗｅｒ ｓｏｆｔ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ， ｉ．ｅ．， ＭＡＬＤＩ ａｎｄ／ｏｒ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ （ＥＳＩ）， ａｒｅ ｂｏｔｈ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ａｃｑｕｉｒｅ ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ． ＥＳＩ， ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｍａｓｓ ａｎａｌｙｚｅｒｓ， ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｆｔｅｒ ａ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ， ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ， ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｔｅｐｓ． Ｉｎ ｃｏｎｔｒａｓｔ， ＭＡＬＤＩ ｉｓｍｕｃｈ ｍｏｒｅ ｔｏｌｅｒａｎｔ ｔｏ ｓａｌｔｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ＭＡＬＤＩ ｉｓ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＭＳ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗｉｔｈ ｍｉｎｉｍａｌ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．
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