摘要：研究了镉对金鱼藻（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｍｅｒｓｕｍ Ｌ．）植株生长和抗氧化酶活性的影响，用不同浓度的氯化镉溶液（镉离子浓度分别为０、２、５、１０ μｍｏｌ／Ｌ）处理金鱼藻植株，并分别于处理后１、２、４、８ ｄ测定金鱼藻植株的生物量和抗氧化酶活性。结果表明，低浓度镉促进金鱼藻的生长，而高浓度镉抑制金鱼藻的生长，且随着时间的延长，胁迫程度加重，镉离子浓度为１０ μｍｏｌ／Ｌ的处理最终导致植株死亡；抗氧化酶系统对镉胁迫具有应激反应，当镉离子浓度小于５ μｍｏｌ／Ｌ时，超氧化物歧化酶（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）活性和过氧化氢酶（Ｃａｔａｌａｓｅ，ＣＡＴ）活性均上升，而当镉离子浓度达到１０ μｍｏｌ／Ｌ时，二者酶活性均下降。因此，当镉离子浓度小于５ μｍｏｌ／Ｌ时，可以诱导金鱼藻抗氧化酶活性增加，抵御氧化胁迫，使植株不受伤害。
关键词：镉；金鱼藻（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｍｅｒｓｕｍ Ｌ．）；生长；抗氧化酶
中图分类号：Ｓ６８２．３２；Ｑ９４５．７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）05－0977-04
Ｃａｄｍｉｕｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
ｉｎ Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｍｅｒｓｕｍ Ｐｌａｎｔ
ＣＨＥＮ Ｈｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇ，ＦＡＮＧ Ｙｕａｎ－ｐｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｊｕａｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｈｅ Ｃｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｍｅｒｓｕｍ Ｌ． ｐｌａｎｔ were studied． Ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣｄＣｌ２ （０， 2， ５， １０ μｍｏｌ／Ｌ）， ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ １， ２， ４， ８ ｄ ａｆｔｅｒ Ｃｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ of Ｃｄ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ， ｗｈｉｌｅ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ of Ｃｄ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ． Ａｓ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ， ａ Ｃｄ2+ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ of １０ μｍｏｌ／Ｌ ｗｉｌｌ ｌｅａｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｐｌａｎｔ， tｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｓｈｏｗｅｄ ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｄ. Ｐｌａｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ａｎｄ ｃａｔａｌａｓｅ when the concentration of Cd2+ was lower than 5 μｍｏｌ／Ｌ， ａｔ １０ μｍｏｌ／Ｌ ｅｘｐｏｓｕｒｅ， both ｅｎｚｙｍｅs' ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｄｅｃｌｉｎｅｄ． Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｐｐｅａｒｓ ｔｏ ｈｅｌｐ ｐｌａｎｔｓ ｔｏｌｅｒａｔｅ the ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｄ2+ with concentration lower than ５ μｍｏｌ／Ｌ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃａｄｍｉｕｍ； Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｍｅｒｓｕｍ Ｌ．； ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ
镉（Ｃｄ）不仅对人体有致癌作用［１］， 对植物的生长也有很多不利的影响［２］。由于Ｃｄ与巯基有很强的亲和力，与蛋白质其他侧链及磷酸盐也有较强的亲和力，通过与蛋白质结合或改变蛋白质的构象而导致蛋白质活性受到抑制或失活［３］。Ｃｄ还可以干扰植物体内营养元素和细胞的氧化还原态势的平衡、诱导活性氧的产生［４，５］。随着研究的深入，Ｃｄ在细胞水平上对植物的毒害机理逐渐成为学者们研究的热点。目前越来越多的研究证明，Ｃｄ对植物的毒害首先是作用于细胞内的氧化还原系统，导致氧化还原失衡，活性氧大量积累［６］，造成氧化胁迫，如膜脂过氧化、蛋白质氧化、酶活性受到抑制以及ＤＮＡ和ＲＮＡ损伤等，从而导致植物细胞受损甚至死亡［７］。
植物体内的活性氧清除系统如超氧化物歧化酶（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）、过氧化氢酶（Ｃａｔａｌａｓｅ，ＣＡＴ）可以清除活性氧，这些酶在细胞各部位都有分布［７］，对维持细胞氧自由基的平衡非常重要［８］。金鱼藻（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｍｅｒｓｕｍ Ｌ．）属金鱼藻科金鱼藻属，是一种多年生沉水草本植物，广泛分布于静水池塘、湖泊和小溪等处，其对Ｃｄ有很好的积累特性［９］，是研究植物耐受Ｃｄ胁迫过程中活性氧清除机制的良好材料。本实验通过研究Ｃｄ对金鱼藻生长和抗氧化酶活性的影响，探讨金鱼藻抗氧化酶系统对Ｃｄ毒性的响应机制，以期为重金属Ｃｄ污染水体的生物治理提供一定的理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料及处理
实验用金鱼藻采集于湖北省鄂州市梁子湖，样品采集后先在金鱼缸中用曝气自来水预培养１０ ｄ，选取生长健壮的植株，截取长约１０ ｃｍ的顶枝部分，然后用１０％ Ｈｏａｇｌａｎｄ培养液在Ｆｏｒｍａ培养箱内继续培养１周，光照度２ ０００ ｌｘ，光暗比１４ ｈ∶１０ ｈ，温度１８～２５ ℃。以１０％ Ｈｏａｇｌａｎｄ培养液作为溶剂，配制０、２、５、１０ μｍｏｌ／Ｌ共４个浓度梯度的ＣｄＣｌ２溶液，分别置于５００ ｍＬ的塑料杯中，无Ｃｄ处理作为对照，每个处理设置３个重复，每个重复选取１０株大小一致的植株，植株重（４．０±０．１） ｇ，每２ ｄ换1次溶液，分别于胁迫开始后的１、２、４、８ ｄ取样测定各生理参数。
１．２ 生物量的测定
植物样采集后先放在冰水中清洗，再用去离子水冲洗干净，然后迅速用滤纸吸干植株表面水分，在电子天平上称量其鲜重，用直尺量其株高。
１．３ 抗氧化酶活性的测定
１．３．１ 粗酶液的提取 称取植物鲜样４ ｇ，加入８．０ ｍＬ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．８的磷酸缓冲液（４ ℃下预冷，含０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ-Na2、质量分数为０．３％的Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００和质量分数为１％的ＰＶＰ），冰浴研磨至匀浆，４ ℃下１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，取上清液（粗酶液）保存备用。
１．３．２ ＳＯＤ活性的测定 在盛２．８ ｍＬ反应液［含５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．８的磷酸缓冲液，１４．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＬ－甲硫氨酸，７５ μｍｏｌ／Ｌ的氮蓝四唑（ＮＢＴ），０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ－Ｎａ２，２．０ μｍｏｌ／Ｌ的核黄素，用前配制，避光放置］的试管中加入２００ μＬ粗酶液，混合后放在透明的试管架上，于光照培养箱内光照１０ ｍｉｎ后立即测定５６０ ｎｍ处的光密度值，对照用缓冲液代替粗酶液，以１ ｇ鲜样抑制５０％的ＮＢＴ光还原所需的酶量定义为１个酶活单位（Ｕ）［１０］，计算ＳＯＤ活性（Ｕ／ｇ）。
１．３．３ ＣＡＴ活性的测定 在３ ｍＬ的氧电极反应杯中加入３ ｍＬ粗酶液，２５ ℃下平衡后向反应杯内注入２０ μＬ １％Ｈ２Ｏ２，记录放氧速率［１１］，计算ＣＡＴ活性［μｍｏｌ／（ｍｉｎ・ｇ）］。
２ 结果与分析
２．１ 不同浓度和时间胁迫下Ｃｄ对金鱼藻生长的影响
金鱼藻的株高和鲜重随着生长时间的延长而增加（图１），但是随着Ｃｄ２＋浓度的升高，生物量呈现先上升后下降的趋势。当胁迫浓度为２ μｍｏｌ／Ｌ时，金鱼藻的株高和鲜重增长最快，处理８ ｄ后，株高和鲜重分别比对照增加１０．４％和１２．３％（Ｐ＜０．０５）；胁迫浓度为５ μｍｏｌ／Ｌ处理８ ｄ后，株高和鲜重与对照之间无显著差异（Ｐ＞０．０５），植株生长良好；１０ μｍｏｌ／Ｌ胁迫８ ｄ后，株高和鲜重分别比对照下降４３．９％和４１．９％（Ｐ＜０．０１），且１０ μｍｏｌ／Ｌ胁迫２０ ｄ后植株死亡。说明低浓度Ｃｄ２＋对金鱼藻的生长具有促进作用，而高浓度Ｃｄ２＋则抑制金鱼藻的生长，且随着时间的延长，胁迫程度加重。
２．２ 不同浓度和时间胁迫下Ｃｄ对金鱼藻ＳＯＤ和ＣＡＴ活性的影响
随着Ｃｄ２＋浓度的升高，ＳＯＤ和ＣＡＴ活性先升高后下降（图２）。胁迫浓度为５ μｍｏｌ／Ｌ处理４ ｄ 后，ＳＯＤ活性达到最大值，与对照相比增加１００％（Ｐ＜０．０１），在该胁迫浓度下处理８ ｄ ＳＯＤ活性仍极显著高于对照（Ｐ＜０．０１）；而胁迫浓度为１０ μｍｏｌ／Ｌ处理１ ｄ时，其ＳＯＤ活性增加，而后却迅速下降，至胁迫后第４天其ＳＯＤ活性已显著低于对照（Ｐ＜０．０５）。ＣＡＴ活性随着胁迫浓度的增加先升高，胁迫浓度为２ μｍｏｌ／Ｌ处理２ ｄ后，ＣＡＴ活性达到最大值，与对照相比增加４１．８％（Ｐ＜０．０１），随后活性下降并低于对照，５ μｍｏｌ／Ｌ处理４ ｄ，其ＣＡＴ活性已极显著低于对照，与对照相比下降２６．２％（Ｐ＜０．０１）。
３ 小结与讨论
金鱼藻具有富集重金属Ｃｄ的能力，可以作为水体Ｃｄ污染的生物修复材料［９］。但Ｃｄ并非植物的必需元素，它的积累势必引起植物体的代谢紊乱［１２］。前人认为，Ｃｄ主要是通过降低植物的光合速率、提高水解酶的活性和阻碍矿物质的吸收从而对植物体产生毒害作用［１３］。本研究表明，随着Ｃｄ胁迫浓度的增加，金鱼藻植株的生物量呈现先上升后下降的趋势。
Ｃｄ对植物机体的毒害机制之一是诱导活性氧产生［１４］，而活性氧会使细胞膜脂不饱和脂肪酸脱氢产生脂质自由基和活性醛基而造成膜脂过氧化，最终导致细胞膜的破坏和电解质的渗漏。抗氧化胁迫是解释植物自身抗逆机制的一种很好的途径［１５］，在正常情况下，为了控制活性氧水平，生物体内会存在一套活性氧清除系统或抗氧化酶系统，抗氧化酶系统包括专性的抗氧化酶类如超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶等。在氧化胁迫程度较轻时，植物体内的抗氧化酶系统受到活性氧的诱导，活性上升，参与清除自由基，可以认为抗氧化酶系统活性增加既是一种保护机制，同时也表明了植物已经受到胁迫，而长时间的胁迫会使植物抗氧化酶系统受到破坏，ＳＯＤ和ＣＡＴ等活性下降［１６］。本研究结果表明，低浓度的Ｃｄ胁迫可诱导ＳＯＤ和ＣＡＴ活性，表现为ＳＯＤ活性增加并可以及时将超氧自由基还原为Ｈ２Ｏ２，ＣＡＴ活性增加则可以进一步将Ｈ２Ｏ２分解。５ μｍｏｌ／Ｌ胁迫处理８ ｄ，其ＳＯＤ活性仍极显著高于对照，表明此时超氧自由基可以及时被清除；５ μｍｏｌ／Ｌ处理４ ｄ后，其ＣＡＴ活性已极显著低于对照，而此时金鱼藻的生物量并没有显著降低，可能是由于其他酶如ＰＯＤ等弥补了ＣＡＴ的不足［１７］，从而使植株不受伤害。胁迫浓度为１０ μｍｏｌ／Ｌ 处理２ ｄ后，其ＳＯＤ活性下降，ＣＡＴ活性也显著低于对照，与此同时，金鱼藻植株的生物量也下降，说明此时植物抗氧化酶系统受到破坏，植株生长受到抑制。
因此，当胁迫浓度小于５ μｍｏｌ／Ｌ时，Ｃｄ可以诱导金鱼藻抗氧化酶活性增加，抵御氧化胁迫，使植株不受伤害；随着Ｃｄ胁迫浓度的不断增加，金鱼藻抗氧化酶系统受到破坏，最终导致严重的氧化胁迫，当胁迫浓度为１０ μｍｏｌ／Ｌ时，Ｃｄ溶液处理的金鱼藻生物量显著下降，并最终死亡。
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摘要：研究了镉对金鱼藻（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｍｅｒｓｕｍ Ｌ．）植株生长和抗氧化酶活性的影响，用不同浓度的氯化镉溶液（镉离子浓度分别为０、２、５、１０ μｍｏｌ／Ｌ）处理金鱼藻植株，并分别于处理后１、２、４、８ ｄ测定金鱼藻植株的生物量和抗氧化酶活性。结果表明，低浓度镉促进金鱼藻的生长，而高浓度镉抑制金鱼藻的生长，且随着时间的延长，胁迫程度加重，镉离子浓度为１０ μｍｏｌ／Ｌ的处理最终导致植株死亡；抗氧化酶系统对镉胁迫具有应激反应，当镉离子浓度小于５ μｍｏｌ／Ｌ时，超氧化物歧化酶（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）活性和过氧化氢酶（Ｃａｔａｌａｓｅ，ＣＡＴ）活性均上升，而当镉离子浓度达到１０ μｍｏｌ／Ｌ时，二者酶活性均下降。因此，当镉离子浓度小于５ μｍｏｌ／Ｌ时，可以诱导金鱼藻抗氧化酶活性增加，抵御氧化胁迫，使植株不受伤害。
关键词：镉；金鱼藻（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｍｅｒｓｕｍ Ｌ．）；生长；抗氧化酶
中图分类号：Ｓ６８２．３２；Ｑ９４５．７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）05－0977-04
Ｃａｄｍｉｕｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
ｉｎ Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｍｅｒｓｕｍ Ｐｌａｎｔ
ＣＨＥＮ Ｈｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇ，ＦＡＮＧ Ｙｕａｎ－ｐｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｊｕａｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｈｅ Ｃｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｍｅｒｓｕｍ Ｌ． ｐｌａｎｔ were studied． Ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣｄＣｌ２ （０， 2， ５， １０ μｍｏｌ／Ｌ）， ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ １， ２， ４， ８ ｄ ａｆｔｅｒ Ｃｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ of Ｃｄ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ， ｗｈｉｌｅ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ of Ｃｄ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ． Ａｓ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ， ａ Ｃｄ2+ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ of １０ μｍｏｌ／Ｌ ｗｉｌｌ ｌｅａｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｐｌａｎｔ， tｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｓｈｏｗｅｄ ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｄ. Ｐｌａｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ａｎｄ ｃａｔａｌａｓｅ when the concentration of Cd2+ was lower than 5 μｍｏｌ／Ｌ， ａｔ １０ μｍｏｌ／Ｌ ｅｘｐｏｓｕｒｅ， both ｅｎｚｙｍｅs' ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｄｅｃｌｉｎｅｄ． Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｐｐｅａｒｓ ｔｏ ｈｅｌｐ ｐｌａｎｔｓ ｔｏｌｅｒａｔｅ the ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｄ2+ with concentration lower than ５ μｍｏｌ／Ｌ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃａｄｍｉｕｍ； Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｍｅｒｓｕｍ Ｌ．； ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ
镉（Ｃｄ）不仅对人体有致癌作用［１］， 对植物的生长也有很多不利的影响［２］。由于Ｃｄ与巯基有很强的亲和力，与蛋白质其他侧链及磷酸盐也有较强的亲和力，通过与蛋白质结合或改变蛋白质的构象而导致蛋白质活性受到抑制或失活［３］。Ｃｄ还可以干扰植物体内营养元素和细胞的氧化还原态势的平衡、诱导活性氧的产生［４，５］。随着研究的深入，Ｃｄ在细胞水平上对植物的毒害机理逐渐成为学者们研究的热点。目前越来越多的研究证明，Ｃｄ对植物的毒害首先是作用于细胞内的氧化还原系统，导致氧化还原失衡，活性氧大量积累［６］，造成氧化胁迫，如膜脂过氧化、蛋白质氧化、酶活性受到抑制以及ＤＮＡ和ＲＮＡ损伤等，从而导致植物细胞受损甚至死亡［７］。
植物体内的活性氧清除系统如超氧化物歧化酶（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）、过氧化氢酶（Ｃａｔａｌａｓｅ，ＣＡＴ）可以清除活性氧，这些酶在细胞各部位都有分布［７］，对维持细胞氧自由基的平衡非常重要［８］。金鱼藻（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｍｅｒｓｕｍ Ｌ．）属金鱼藻科金鱼藻属，是一种多年生沉水草本植物，广泛分布于静水池塘、湖泊和小溪等处，其对Ｃｄ有很好的积累特性［９］，是研究植物耐受Ｃｄ胁迫过程中活性氧清除机制的良好材料。本实验通过研究Ｃｄ对金鱼藻生长和抗氧化酶活性的影响，探讨金鱼藻抗氧化酶系统对Ｃｄ毒性的响应机制，以期为重金属Ｃｄ污染水体的生物治理提供一定的理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料及处理
实验用金鱼藻采集于湖北省鄂州市梁子湖，样品采集后先在金鱼缸中用曝气自来水预培养１０ ｄ，选取生长健壮的植株，截取长约１０ ｃｍ的顶枝部分，然后用１０％ Ｈｏａｇｌａｎｄ培养液在Ｆｏｒｍａ培养箱内继续培养１周，光照度２ ０００ ｌｘ，光暗比１４ ｈ∶１０ ｈ，温度１８～２５ ℃。以１０％ Ｈｏａｇｌａｎｄ培养液作为溶剂，配制０、２、５、１０ μｍｏｌ／Ｌ共４个浓度梯度的ＣｄＣｌ２溶液，分别置于５００ ｍＬ的塑料杯中，无Ｃｄ处理作为对照，每个处理设置３个重复，每个重复选取１０株大小一致的植株，植株重（４．０±０．１） ｇ，每２ ｄ换1次溶液，分别于胁迫开始后的１、２、４、８ ｄ取样测定各生理参数。
１．２ 生物量的测定
植物样采集后先放在冰水中清洗，再用去离子水冲洗干净，然后迅速用滤纸吸干植株表面水分，在电子天平上称量其鲜重，用直尺量其株高。
１．３ 抗氧化酶活性的测定
１．３．１ 粗酶液的提取 称取植物鲜样４ ｇ，加入８．０ ｍＬ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．８的磷酸缓冲液（４ ℃下预冷，含０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ-Na2、质量分数为０．３％的Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００和质量分数为１％的ＰＶＰ），冰浴研磨至匀浆，４ ℃下１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，取上清液（粗酶液）保存备用。
１．３．２ ＳＯＤ活性的测定 在盛２．８ ｍＬ反应液［含５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．８的磷酸缓冲液，１４．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＬ－甲硫氨酸，７５ μｍｏｌ／Ｌ的氮蓝四唑（ＮＢＴ），０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ－Ｎａ２，２．０ μｍｏｌ／Ｌ的核黄素，用前配制，避光放置］的试管中加入２００ μＬ粗酶液，混合后放在透明的试管架上，于光照培养箱内光照１０ ｍｉｎ后立即测定５６０ ｎｍ处的光密度值，对照用缓冲液代替粗酶液，以１ ｇ鲜样抑制５０％的ＮＢＴ光还原所需的酶量定义为１个酶活单位（Ｕ）［１０］，计算ＳＯＤ活性（Ｕ／ｇ）。
１．３．３ ＣＡＴ活性的测定 在３ ｍＬ的氧电极反应杯中加入３ ｍＬ粗酶液，２５ ℃下平衡后向反应杯内注入２０ μＬ １％Ｈ２Ｏ２，记录放氧速率［１１］，计算ＣＡＴ活性［μｍｏｌ／（ｍｉｎ・ｇ）］。
２ 结果与分析
２．１ 不同浓度和时间胁迫下Ｃｄ对金鱼藻生长的影响
金鱼藻的株高和鲜重随着生长时间的延长而增加（图１），但是随着Ｃｄ２＋浓度的升高，生物量呈现先上升后下降的趋势。当胁迫浓度为２ μｍｏｌ／Ｌ时，金鱼藻的株高和鲜重增长最快，处理８ ｄ后，株高和鲜重分别比对照增加１０．４％和１２．３％（Ｐ＜０．０５）；胁迫浓度为５ μｍｏｌ／Ｌ处理８ ｄ后，株高和鲜重与对照之间无显著差异（Ｐ＞０．０５），植株生长良好；１０ μｍｏｌ／Ｌ胁迫８ ｄ后，株高和鲜重分别比对照下降４３．９％和４１．９％（Ｐ＜０．０１），且１０ μｍｏｌ／Ｌ胁迫２０ ｄ后植株死亡。说明低浓度Ｃｄ２＋对金鱼藻的生长具有促进作用，而高浓度Ｃｄ２＋则抑制金鱼藻的生长，且随着时间的延长，胁迫程度加重。
２．２ 不同浓度和时间胁迫下Ｃｄ对金鱼藻ＳＯＤ和ＣＡＴ活性的影响
随着Ｃｄ２＋浓度的升高，ＳＯＤ和ＣＡＴ活性先升高后下降（图２）。胁迫浓度为５ μｍｏｌ／Ｌ处理４ ｄ 后，ＳＯＤ活性达到最大值，与对照相比增加１００％（Ｐ＜０．０１），在该胁迫浓度下处理８ ｄ ＳＯＤ活性仍极显著高于对照（Ｐ＜０．０１）；而胁迫浓度为１０ μｍｏｌ／Ｌ处理１ ｄ时，其ＳＯＤ活性增加，而后却迅速下降，至胁迫后第４天其ＳＯＤ活性已显著低于对照（Ｐ＜０．０５）。ＣＡＴ活性随着胁迫浓度的增加先升高，胁迫浓度为２ μｍｏｌ／Ｌ处理２ ｄ后，ＣＡＴ活性达到最大值，与对照相比增加４１．８％（Ｐ＜０．０１），随后活性下降并低于对照，５ μｍｏｌ／Ｌ处理４ ｄ，其ＣＡＴ活性已极显著低于对照，与对照相比下降２６．２％（Ｐ＜０．０１）。
３ 小结与讨论
金鱼藻具有富集重金属Ｃｄ的能力，可以作为水体Ｃｄ污染的生物修复材料［９］。但Ｃｄ并非植物的必需元素，它的积累势必引起植物体的代谢紊乱［１２］。前人认为，Ｃｄ主要是通过降低植物的光合速率、提高水解酶的活性和阻碍矿物质的吸收从而对植物体产生毒害作用［１３］。本研究表明，随着Ｃｄ胁迫浓度的增加，金鱼藻植株的生物量呈现先上升后下降的趋势。
Ｃｄ对植物机体的毒害机制之一是诱导活性氧产生［１４］，而活性氧会使细胞膜脂不饱和脂肪酸脱氢产生脂质自由基和活性醛基而造成膜脂过氧化，最终导致细胞膜的破坏和电解质的渗漏。抗氧化胁迫是解释植物自身抗逆机制的一种很好的途径［１５］，在正常情况下，为了控制活性氧水平，生物体内会存在一套活性氧清除系统或抗氧化酶系统，抗氧化酶系统包括专性的抗氧化酶类如超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶等。在氧化胁迫程度较轻时，植物体内的抗氧化酶系统受到活性氧的诱导，活性上升，参与清除自由基，可以认为抗氧化酶系统活性增加既是一种保护机制，同时也表明了植物已经受到胁迫，而长时间的胁迫会使植物抗氧化酶系统受到破坏，ＳＯＤ和ＣＡＴ等活性下降［１６］。本研究结果表明，低浓度的Ｃｄ胁迫可诱导ＳＯＤ和ＣＡＴ活性，表现为ＳＯＤ活性增加并可以及时将超氧自由基还原为Ｈ２Ｏ２，ＣＡＴ活性增加则可以进一步将Ｈ２Ｏ２分解。５ μｍｏｌ／Ｌ胁迫处理８ ｄ，其ＳＯＤ活性仍极显著高于对照，表明此时超氧自由基可以及时被清除；５ μｍｏｌ／Ｌ处理４ ｄ后，其ＣＡＴ活性已极显著低于对照，而此时金鱼藻的生物量并没有显著降低，可能是由于其他酶如ＰＯＤ等弥补了ＣＡＴ的不足［１７］，从而使植株不受伤害。胁迫浓度为１０ μｍｏｌ／Ｌ 处理２ ｄ后，其ＳＯＤ活性下降，ＣＡＴ活性也显著低于对照，与此同时，金鱼藻植株的生物量也下降，说明此时植物抗氧化酶系统受到破坏，植株生长受到抑制。
因此，当胁迫浓度小于５ μｍｏｌ／Ｌ时，Ｃｄ可以诱导金鱼藻抗氧化酶活性增加，抵御氧化胁迫，使植株不受伤害；随着Ｃｄ胁迫浓度的不断增加，金鱼藻抗氧化酶系统受到破坏，最终导致严重的氧化胁迫，当胁迫浓度为１０ μｍｏｌ／Ｌ时，Ｃｄ溶液处理的金鱼藻生物量显著下降，并最终死亡。
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