综 述
食品工业科技Vol.28,No.10,2007
免疫分析标记技术研究进展
王 宇,沈玉栋,雷红涛,刘文字,王 弘,孙远明
(广东省高等学校食品质量安全重点实验室,华南农业大学食品质量安全研究所,广东广州510642)
＊
摘 要:较系统地综述了目前应用于免疫分析检测中的各种标记
技术:放射物标记、酶标记、发光标记、荧光标记、金标记和超顺磁粒子标记方法的原理、特点及免疫检测现状,同时对免疫分析标记技术的发展进行展望。
关键词:免疫分析,标记技术,研究进展
检测领域的免疫分析标记方法主要有放射物标记、
酶标记、荧光标记、化学发光标记、金标记外,还出现了超顺磁性粒子标记。
1 放射物标记分析
用放射物标记抗原或抗体发展的放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)是美国科学家Yalow和Berson于1959年创立的一种微量分析法,它是将具有高灵敏度的放射性核素示踪技术和特异性免疫化
[3]
学技术相结合而建立的新方法。该技术利用核素标记物的放大效应,改善了待测物的检测下限,同时以抗体或抗原作为结合试剂,大大提高了检测方法的特异性。
Abstract:Variouslabeledtechniquethathavebeenappliedin
immunoassaypresentlywasintroduced,includinglabeled
radiation,
labeled
enzyme,
labeled
luminophor,labeledfluorescein,labeledcolloidal-goldandlabeledparamagnetic-particlealongwiththeirprinciplecharacteristicandimmunoassay,
discussedinthispaper.
actualityof
andtheirprospectswerealso
1.1 标记物种类
一般来说,RIA中标记抗原或抗体所用的放射性
[1**********]
,H能放射出β射线,而核素,最常用的是Ⅰ、Ⅰ、H
121Ⅰ、Ⅰ能放射出γ射线,然后用γ计数仪和液体闪烁计数仪测定。H半衰期长,标记时需在特殊装置中进行,故多由放射性化学试剂中心做成药盒供应。其次β射线的检测需要昂贵的液体闪烁记数器测定,不易普及,故近来采用化学方法将被检测物和酪氨酸甲酯生成带
121125125或Ⅰ标记。Ⅰ半衰期为有苯酚基的衍生物,便可用Ⅰ
半衰期为8d,现今多趋向使用Ⅰ。60d,Ⅰ
121
125
3
Keywords:immunoassay;labeledtechnique;researchprogress 中图分类号:TS201.1 文献标识码:A 文章编号:1002-0306(2007)10-0221-05
免疫分析标记技术是指以抗原抗体间的特异性
反应为基础,研究标记以各种标记物(定量信号)来对某种物质进行定性或定量检测的研究。标记免疫
[1]
分析一般是将酶、荧光素、放射性核素等标记物对抗体或抗原进行标记,这种标记物既保持了抗体或抗原的活性,也不影响标记物的活性,当它与相应抗体或抗原反应后,可以直接测定复合物中的标记物,从而直接对目标物质进行定量分析。通过标记物的信号放大作用,可以提高免疫分析技术的敏感性。随着全世界对食品安全问题的关注程度越来越高,食品中污染物和危害物的检测日益重要,这就需要
[2]
快速、准确、灵敏、能进行多组分分析的检测技术。免疫学检测技术以其特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点,已成为21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。而在这一基础上,标记物的选择、研究就相应也成了免疫分析研究的重点内容。目前,应用到食品安全
收稿日期:2007-03-22 ＊通讯联系人
作者简介:王宇(1980-),男,硕士,研究方向:食品质量与安全。基金项目:国家自然科学基金(20377016);广东省自然科学基金
(032240)。
1.2 标记方法
放射物标记中最常用的是外标记。碘标记的方
法很多,最常用氯胺T法,氯胺T是一种氧化剂,它能使Ⅰ液中带负电荷的碘离子氧化成带正电荷的碘,然后取代抗原酪氨酸残基芳香环上的氢,如图1。
125
图1 氯胺-T法制备Ⅰ标记物
此外,氯胺T还可用于纯化乳过氧化酶
(Lactoperoxidase)作催化剂以碘化蛋白质,这是一种最温和的碘化法,其原理是将酶与过氧化氢形成络合物,然后使碘氧化。
1.3 应用现状
放射性标记法利用同位素标记的高灵敏性和抗
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原抗体反应的高特异性相结合,精确敏感性好(ng、pg),样品用量少,易规范化,是其他任何生物测定法所无法比拟的。而且最近有人研究放射性标记在两相溶液中的检测,克服了溶剂互不相溶影响抗原抗体特异性反应的灵敏度。然而,其在应用上的缺点也是显而易见的,如需特殊设备,虽涉及放射性微小,但仍会面临公众反核的负面影响。此外,放射免疫分析较难进行自动化分析,试剂盒的有效期短的缺点使其面临新一代更灵敏、稳定、快速而且自动化程度高的测量技术的挑战
[6][5]
[4]
综 述
干扰,分析灵敏度较低。随着现代免疫标记技术的
发展,目前应用荧光标记的主要有:
2.3.1 时间分辨荧光免疫分析(timed-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA) 这是20世纪80年代初Pettersson和Eskola等创立的一种非放射性标记免疫技术,与传统的荧光素标记不同,它是以镧系元素,如铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)和铌(Nd)等标记抗体,利用时间分辨荧光仪特定的延迟一段时间测量,
+
获得Eu的特异荧光信号,几乎能够完全消除各种非特异性荧光物质的干扰,并且实现了分析方法灵敏ol/L。镧系稀土元度的突破,灵敏度可高达10m
素(铕、钐、铽和镝)并非荧光素,但激发后能发射光谱范围较宽的荧光。以聚苯乙烯微孔板联结抗体,
3+
再以铕(Eu)与作为多羟酸螯合剂的联接桥形成
+
Eu3-螯合剂-抗体的螯合物,应用双位点免疫分析可测得待测抗原的浓度。测量时间延迟到400μs以上,而非特异性荧光发光时间仅为0.01μs,因此避免了高本底干扰的影响,故此称为时间分辨荧光免疫分析。2.3.2 荧光偏振免疫分析法(fluorescenepolarizedimmunoassay,FPIA) 这是1920年由Perrin建立的,是从光源发出的一束光线经垂直起偏器后成为垂直偏振光,样品被垂直偏振光激发而产生偏振荧光,此荧光经检偏器后可测出与样品浓度有关的水平或垂直方向的荧光偏振光强度,是利用荧光偏振的程度与标记结合物量成正比关系而建立的一种荧光免疫分析技术。FPIA常用于药物浓度测定,在高浓度药物中,因标记结合物少而呈现低偏振值,而在低浓度药物中,因标记结合物多呈高偏振值。2.3.3 酶促放大镧系荧光免疫分析 这是酶放大的酶免疫分析法、生物素-链霉亲和素的亲和反应和时间分辨荧光免疫分析相结合的方法。如标记以碱性磷酸酶(AKP),这种酶作用于底物5-氟水杨磷酸盐(5-FSAP),使水解脱去磷酸根,生成5-氟水杨酸(5-FSA)。当生物素(B)化的Tb抗体与链霉亲和素(A)结合,再与FSA结合时,形成FSA-BA抗体-3+Tb-EDTA三元荧光复合物,信号进一步放大,荧光的发光效应增强,检测灵敏度增加。
荧光标记免疫分析技术的发展是在荧光标记检测技术及其检测设备的发展基础上发展的,荧光标记技术由于其灵敏度高,检测精确,速度快,越来越
[9]
引起广泛的关注,国外已经有商品试剂盒推出。相信,荧光标记作为一种新的标记免疫分析技术将会有更广泛的应用。
3+
[8]
-19
。
2 荧光标记分析
以荧光标记的荧光免疫分析(fluoresceneimmunoassay,FIA)是由Conn等首创于20世纪40年代的一种标记免疫学技术,其所用标记物是荧光素和荧光染料,是将抗原或抗体标记以荧光物质与相应抗原或抗体结合,在荧光显微镜或紫外线照射下,检测荧光强度和荧光现象的一种检测方法。荧光标记免疫法灵敏度高,但荧光素常会产生生物学毒性,
[7]
导致抗体或抗原的灵敏度和选择性下降。
2.1 标记物
最早用于荧光标记的荧光素有:罗丹明(540nm,绿色)、得克萨斯红(595nm,橘红色)、俄勒冈绿(496nm,蓝色)、R-藻红蛋白(480nm,绿色)。作为一种蛋白质标记物的荧光化合物,必须具有高的荧光效率或离子产量,即发射的量子数和吸收的量子数之比应该尽可能的大,但大多数荧光素的这个比率是很小的。因此,并不是所有能产生荧光的化合物都能用作标记物。目前为止认为比较满意的有以下几种:异硫氰酸荧光素(FITC)、二氯三嗪氨基荧光素(DTAP)、四乙基罗丹明(RB200)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TMRITC)。然而,实际应用最广的只有异硫氰酸荧光素。这种标记免疫分析法主要是利用了免疫学反应的特异性和荧光素易被发现的敏感性的优点。但由于高本底影响和监测仪器的灵敏度低,荧光标记的技术一直受到限制。
[8]
2.2 标记方法
荧光素与蛋白质结合的化学反应基团主要有三种类型,即:酰基氯,由磺酸制备;异硫氰酸和重氮盐类,这两种通常由相应的胺制备,通过化学键作用于相应的抗原、抗体反应结合。目前标记方法主要是透析法和直接标记法两种。以FITC标记为例:FITC含有异硫氰基,在碱性条件下能与IgG的自由氨基结合,形成荧光抗体结合物,如图2。
3 酶标记分析
图2 异硫氰基与自由氨基结合
2.3 应用现状
传统荧光标记免疫分析(FIA)曾经一度起着非常重要的作用,其优越性也比较明显,但由于受到散射光、来源于样品的背景荧光和荧光淬灭等因素的期
以酶标记的酶免疫分析(Enzymeimmunoassay,[10]
EIA)是继RIA和FIA之后建立起来的一项将酶反应的高效性与免疫反应的特异性有机结合的标记免疫学技术。1966年,以Engvall和Perlmann等为先驱,发展了酶免疫测定法,主要是利用免疫复合物上的酶将特定的底物转化为特定的颜色,用分光光度
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其衍生物是最早在CLIA中使用的一种常用的化学
[13]
发光物质,其发光原理如图3。这些发光物质通常用N-羟基琥珀酰胺作为偶联试剂。目前用于标记的还有小分子吖啶酯,其具有空间阻碍小,增加标记物的扩散。只要在HH存在下就能迅速产2O2和O
生化学发光,且有很高的量子产率;1s内完成快速强发光;非靶物质不产生化学发光和37℃温育非平衡期反应等特点。
-
计测定,从而测得待测物的量。
3.1 标记物
到目前为止,酶标记法所用的酶大多是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶
等。每种酶通过与自己的特殊作用底物反应,而产生典型的有色沉淀物。通过反应的颜色与被检测物的相关关系,从而对被检物进行定量分析。
3.2 标记方法
目前标记的技术一般是通过交联剂将酶与抗体或抗原相结合。交联方法主要有:戊二醛法、酶醛化法、重氮化法、碳二亚胺法、混合酸酐法、二硝基苯酚法(FNPS)、二异氰酸甲苯法(TDI)。一般都是利用小分子上的活性部位与蛋白质上的氨基、羧基、酚基、巯基或羟基进行化学反应。
图3 化学发光原理
4.2 标记方法
发光物的标记方法一般也是根据参与标记双方的结构特点进行选择,同样也是利用蛋白质上的氨
基、羧基等。偶联方法主要有混合酸酐法、N-羟基琥珀酰亚氨法、过碘酸钠法、环内酸酐法、硫氰酸酯衍生物法等。抗原和抗体的标记是化学发光免疫分析中十分关键的一个环节。标记免疫步骤不仅要求标记产物不易脱落,性质稳定,更主要的是标记后标记物应保持原抗原或抗体的活性,保持标记基团的发光活性
[14]
3.3 应用现状
酶标记因其催化底物可与核素一样起到信息放大作用,而减少放射性废物,曾被认为可以完全取代RIA。目前,在我国酶标免疫检测由于其检测灵敏度高、方法简单、所用仪器相对便宜,因此发展空间也很大。开发商品试剂盒也有很好得实用价值。但是,这种依靠比色法的检测所受的干扰因素太多,其灵敏度和稳定性未能高于RIA,而且底物一旦显色后就难于复原,因此是一次性的。另外,酶结合反应时间很难确定,酶随着时间的延长很容易失活,影响测
[11]
定效果,结果也不容易保存。有研究者认为,把几种结构相关或非相关的农药抗体结合,利用这种混合技术进行几种农药的多残留分析,对于检测大批量且农药污染又没有规律的样品,可以节省大量的时间和工作量。
。
4.3 应用现状
吖啶酯体系的灵敏度与自动化程度较高,但发光时间短,重复性较差。最近出现一些新的酶促化学发光技术,如用AMPPD(二氧杂环丁烷)标记,碱性磷酸酶催化氧化,克服了传统发光标记物的固有发光不稳定,反应过程中发生裂变导致结果不稳定等缺陷,使检测更稳定。全自动微粒子化学发光免疫分析仪即采用此发光体系,但由于价格昂贵,目前国内还未广泛推广。CLIA除具有灵敏度高、特异性强等优点,日益受到人们的青睐。CLIA分析方法多样,适用面广,广泛地用于抗原、抗体和半抗原的免疫测定,其线性范围也较宽。CLIA技术不仅为临床诊断和科学研究提供了一种超微量的非同位素免疫检测手段,而且在食品分析、环境等方面具有广阔的应用前景。目前,CLIA在免疫分析方面取得了一些
[15]
。成就,但其发展空间仍然很大
4 发光标记分析
20世纪80年代末,国外开始用化学发光试剂来标记抗原或抗体,从而建立了发光免疫分析技术。
狭义的发光免疫分析(luminescenceimmunoassay,LIA)主要是指化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)。另外,还有酶放大化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay,ECLIA)。CLIA是Sohrocler和Halman在20世纪70年代末期建立的,该方法兼有发光分析的高灵敏度和免疫反
[12]
。其基本原理同酶标记分析法,是用应的特异性
化学发光反应的试剂(可以是发光剂或催化剂等)标记抗原或抗体,标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和理化步骤(如离心分离、洗涤等),最后以测定发光强度形式测定待测物的含量。
5 胶体金标记分析
胶体金标记分析主要有胶体金免疫分析
[16]
(Colloidal-goldimmunoassay,CGIA),是以胶体金为标记物,在光镜或电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术,它已成为继荧光素、酶等标记技术之后的一种新的标记技术。
4.1 标记物
用于标记的化学发光试剂应符合以下几个条
件:偶联后能保持发光试剂高的量子效应和反应动力;与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物;在很少程度的改变被标记物的理化特性,尤其是其免疫活性。鲁米诺(Luminol)、异鲁米诺(Isoluminol)及
5.1 标记物
胶体金标记是利用氯金酸(HAuCl在还原剂作4)用下聚合成直径1～150nm的金颗粒(图4),形成带
负电的疏水胶溶液。由于静电作用成为稳定的胶体状态,称胶体金。
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强磁场中,它们才有磁性。这对标记物的分离和检
测是非常关键的。如果每一个磁微粒都有微弱的磁性,那么它就成为一个磁偶极,这就会导致磁微粒聚集如胶体的不稳定或沉淀。为了进行实际利用,每一个顺磁微粒都应有能与抗体或识别单元与磁微粒连接的表面活性。然后,将这种带有合适识别单元的交联微粒置于含有目标分析物的流体中,在胶体微粒和抗体进行相对短暂的温育后,分析物带有磁性,将其放入磁场中便可达到检测目标。Lacava等研究用葡聚糖包裹磁性纳米颗粒对小鼠的毒性情况,实验表明磁性纳米粒子的生物相容性和生物
[22]
检测可行性。沈霞等选用葡萄糖包覆超顺磁性的Fe3O4纳米粒子,通过葡萄糖表面的酰基化实现与抗
葡聚糖-抗体磁性纳体或抗原的偶联,制得Fe3O4-米生物探针,结果表明,该探针完全适用于快速免疫检测需要。
[21]
图4 胶体金制备原理
5.2 标记方法
胶体金标记就是蛋白质等高分子被吸附到胶体
金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒具有高电子高密度的特性,其表面的负电荷能与蛋白质的正电荷基团静电吸附而牢固结合。在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而被用于定性或半定量的快速免疫检测中。这种胶体金能稳定迅速地吸附蛋白质而不改变其活性,用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽等非共价结合,因而在基础研究和检验检疫中成为非常有用的工具。
5.3 应用现状
胶体金免疫层析技术与ELISA技术原理不尽相同,前者技术要求更高,实施更为困难。其主要原因在于胶体金免疫层析技术发展快,时间较短;层析材料主要采用国外产品,国内产品尚无法达到要求。胶体金本身为红色,不需要加入发色试剂,省却了酶标的底物及终止液的步骤,金标记物比酶标记物更稳定,实验结果可以长期保存而不腿色。胶体金技术作为一种新的免疫学标记方法,因具有简单、快速、准确和无污染等优点,在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用[17]。目前发展的胶体金试纸条由于其方便、快捷、可操作性强而日益受到大家的重视。
图5 超顺磁性粒子结构图
6.2 标记方法
大多数免疫分析标记技术都采用了标记物与抗体或抗原通过一定长度的手臂经疏水作用力、静电力、双功能交联剂、硅烷化、酰胺键连接而成。如图5超顺磁性粒子与抗体或抗原的连接也不例外,只是针对不同的基团选择的交联物有所不同,如图6。
6 超顺磁微粒标记分析
以磁性粒子标记的磁性免疫分析技术(MagneticImmunoChromatofraphicTest,MICT)是现代物理学与生物技术结合研发生产的磁性分析检测技术,最早应用于基础医学领域。与其它标记技术不同,该技术一个显著的优点就是用磁性粒子标记不受有色杂质干扰,可用于直接测量血液、食品、污水等有色样品。其原理是利用超顺磁性纳米微粒作为标记物,由高灵敏度磁性检测仪器测定结合在免疫复合物上的磁性微粒所产生的局部磁场效应,从而得出
[20]
。所测分析物的定量结果
[18,19]
图6 磁性粒子与载体的连接方法
6.3 应用现状
磁性粒子标记技术最早是在临床医学中用于分
[23]
离的一种技术手段。随着现在仪器设备的更新换代,利用磁性微粒代替胶体金、炭素粒子作为标记物进行免疫检测已经取得了很好的结果。在与样本基质分离后,磁性微粒与固定在硝酸纤维膜上得配体结合时就形成了感应线,磁性微粒固定不动或浓缩聚集都可以被感应器检测到被分析物或测试线。传统的检测方法中,这些检测线是可以肉眼观察到或者用一些光学设备测定其反射系数、颜色变化或荧光,但在硝酸纤维膜测试线上的金微粒聚集线最大,很显然膜就有几百微米厚。由于胶只有10μm
体金标记分析物不仅分布在膜表面,而且分布在膜
[24,26]
6.1 标记物
超顺磁性微粒标记所用的是超顺磁性纳米粒子,免疫学检测中利用抗体和目标分析物特异性结合使其带有磁性微粒(如图5),从而便于检测和分离。无论被分析物是分子、细胞片段、完整细胞,都可以进行磁性微粒标记。这种磁性微粒必须是带有超顺磁性的纳米微粒,也就是说,只有将它们放到超期
综 述
食品工业科技Vol.28,No.10,2007
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内,大约90%的分析物不能被监测器、肉眼或分光光度计检测到。另外,由于基质、镜面反射、散射、自身吸收和光信号淬灭的干扰,光学设备检测生物样本显得有些困难。使用磁微粒标记技术克服了以上缺点。首先,磁性物质在生物基质中不常见,这就克服了传统光学分析中常见的基质干扰;第二,磁性免疫分析检测中,不仅仅是表面,全部分析物和测试区都可以被检测到,这就能对大部分的分析物进行定量分析。磁性标记检测方法的重现性达98%,最低检测水平误差仅仅为25pg、信噪比为3∶1,CV值
[25]
。
7 展望
总之,免疫学分析技术的发展也就是标记学的发展。目前,多种免疫分析标记方法并存,相互竞争,相互补充,但不管怎样,目前还没有一种免疫分析标记技术是完美无缺的。因此,各种标记技术还需要不断发展和完善,并且人们还在不断研究,以开发出更新、更理想的免疫分析标记技术。
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关键词:免疫分析,标记技术,研究进展
检测领域的免疫分析标记方法主要有放射物标记、
酶标记、荧光标记、化学发光标记、金标记外,还出现了超顺磁性粒子标记。
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用放射物标记抗原或抗体发展的放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)是美国科学家Yalow和Berson于1959年创立的一种微量分析法,它是将具有高灵敏度的放射性核素示踪技术和特异性免疫化
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Abstract:Variouslabeledtechniquethathavebeenappliedin
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,H能放射出β射线,而核素,最常用的是Ⅰ、Ⅰ、H
121Ⅰ、Ⅰ能放射出γ射线,然后用γ计数仪和液体闪烁计数仪测定。H半衰期长,标记时需在特殊装置中进行,故多由放射性化学试剂中心做成药盒供应。其次β射线的检测需要昂贵的液体闪烁记数器测定,不易普及,故近来采用化学方法将被检测物和酪氨酸甲酯生成带
121125125或Ⅰ标记。Ⅰ半衰期为有苯酚基的衍生物,便可用Ⅰ
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Keywords:immunoassay;labeledtechnique;researchprogress 中图分类号:TS201.1 文献标识码:A 文章编号:1002-0306(2007)10-0221-05
免疫分析标记技术是指以抗原抗体间的特异性
反应为基础,研究标记以各种标记物(定量信号)来对某种物质进行定性或定量检测的研究。标记免疫
[1]
分析一般是将酶、荧光素、放射性核素等标记物对抗体或抗原进行标记,这种标记物既保持了抗体或抗原的活性,也不影响标记物的活性,当它与相应抗体或抗原反应后,可以直接测定复合物中的标记物,从而直接对目标物质进行定量分析。通过标记物的信号放大作用,可以提高免疫分析技术的敏感性。随着全世界对食品安全问题的关注程度越来越高,食品中污染物和危害物的检测日益重要,这就需要
[2]
快速、准确、灵敏、能进行多组分分析的检测技术。免疫学检测技术以其特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点,已成为21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。而在这一基础上,标记物的选择、研究就相应也成了免疫分析研究的重点内容。目前,应用到食品安全
收稿日期:2007-03-22 ＊通讯联系人
作者简介:王宇(1980-),男,硕士,研究方向:食品质量与安全。基金项目:国家自然科学基金(20377016);广东省自然科学基金
(032240)。
1.2 标记方法
放射物标记中最常用的是外标记。碘标记的方
法很多,最常用氯胺T法,氯胺T是一种氧化剂,它能使Ⅰ液中带负电荷的碘离子氧化成带正电荷的碘,然后取代抗原酪氨酸残基芳香环上的氢,如图1。
125
图1 氯胺-T法制备Ⅰ标记物
此外,氯胺T还可用于纯化乳过氧化酶
(Lactoperoxidase)作催化剂以碘化蛋白质,这是一种最温和的碘化法,其原理是将酶与过氧化氢形成络合物,然后使碘氧化。
1.3 应用现状
放射性标记法利用同位素标记的高灵敏性和抗
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原抗体反应的高特异性相结合,精确敏感性好(ng、pg),样品用量少,易规范化,是其他任何生物测定法所无法比拟的。而且最近有人研究放射性标记在两相溶液中的检测,克服了溶剂互不相溶影响抗原抗体特异性反应的灵敏度。然而,其在应用上的缺点也是显而易见的,如需特殊设备,虽涉及放射性微小,但仍会面临公众反核的负面影响。此外,放射免疫分析较难进行自动化分析,试剂盒的有效期短的缺点使其面临新一代更灵敏、稳定、快速而且自动化程度高的测量技术的挑战
[6][5]
[4]
综 述
干扰,分析灵敏度较低。随着现代免疫标记技术的
发展,目前应用荧光标记的主要有:
2.3.1 时间分辨荧光免疫分析(timed-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA) 这是20世纪80年代初Pettersson和Eskola等创立的一种非放射性标记免疫技术,与传统的荧光素标记不同,它是以镧系元素,如铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)和铌(Nd)等标记抗体,利用时间分辨荧光仪特定的延迟一段时间测量,
+
获得Eu的特异荧光信号,几乎能够完全消除各种非特异性荧光物质的干扰,并且实现了分析方法灵敏ol/L。镧系稀土元度的突破,灵敏度可高达10m
素(铕、钐、铽和镝)并非荧光素,但激发后能发射光谱范围较宽的荧光。以聚苯乙烯微孔板联结抗体,
3+
再以铕(Eu)与作为多羟酸螯合剂的联接桥形成
+
Eu3-螯合剂-抗体的螯合物,应用双位点免疫分析可测得待测抗原的浓度。测量时间延迟到400μs以上,而非特异性荧光发光时间仅为0.01μs,因此避免了高本底干扰的影响,故此称为时间分辨荧光免疫分析。2.3.2 荧光偏振免疫分析法(fluorescenepolarizedimmunoassay,FPIA) 这是1920年由Perrin建立的,是从光源发出的一束光线经垂直起偏器后成为垂直偏振光,样品被垂直偏振光激发而产生偏振荧光,此荧光经检偏器后可测出与样品浓度有关的水平或垂直方向的荧光偏振光强度,是利用荧光偏振的程度与标记结合物量成正比关系而建立的一种荧光免疫分析技术。FPIA常用于药物浓度测定,在高浓度药物中,因标记结合物少而呈现低偏振值,而在低浓度药物中,因标记结合物多呈高偏振值。2.3.3 酶促放大镧系荧光免疫分析 这是酶放大的酶免疫分析法、生物素-链霉亲和素的亲和反应和时间分辨荧光免疫分析相结合的方法。如标记以碱性磷酸酶(AKP),这种酶作用于底物5-氟水杨磷酸盐(5-FSAP),使水解脱去磷酸根,生成5-氟水杨酸(5-FSA)。当生物素(B)化的Tb抗体与链霉亲和素(A)结合,再与FSA结合时,形成FSA-BA抗体-3+Tb-EDTA三元荧光复合物,信号进一步放大,荧光的发光效应增强,检测灵敏度增加。
荧光标记免疫分析技术的发展是在荧光标记检测技术及其检测设备的发展基础上发展的,荧光标记技术由于其灵敏度高,检测精确,速度快,越来越
[9]
引起广泛的关注,国外已经有商品试剂盒推出。相信,荧光标记作为一种新的标记免疫分析技术将会有更广泛的应用。
3+
[8]
-19
。
2 荧光标记分析
以荧光标记的荧光免疫分析(fluoresceneimmunoassay,FIA)是由Conn等首创于20世纪40年代的一种标记免疫学技术,其所用标记物是荧光素和荧光染料,是将抗原或抗体标记以荧光物质与相应抗原或抗体结合,在荧光显微镜或紫外线照射下,检测荧光强度和荧光现象的一种检测方法。荧光标记免疫法灵敏度高,但荧光素常会产生生物学毒性,
[7]
导致抗体或抗原的灵敏度和选择性下降。
2.1 标记物
最早用于荧光标记的荧光素有:罗丹明(540nm,绿色)、得克萨斯红(595nm,橘红色)、俄勒冈绿(496nm,蓝色)、R-藻红蛋白(480nm,绿色)。作为一种蛋白质标记物的荧光化合物,必须具有高的荧光效率或离子产量,即发射的量子数和吸收的量子数之比应该尽可能的大,但大多数荧光素的这个比率是很小的。因此,并不是所有能产生荧光的化合物都能用作标记物。目前为止认为比较满意的有以下几种:异硫氰酸荧光素(FITC)、二氯三嗪氨基荧光素(DTAP)、四乙基罗丹明(RB200)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TMRITC)。然而,实际应用最广的只有异硫氰酸荧光素。这种标记免疫分析法主要是利用了免疫学反应的特异性和荧光素易被发现的敏感性的优点。但由于高本底影响和监测仪器的灵敏度低,荧光标记的技术一直受到限制。
[8]
2.2 标记方法
荧光素与蛋白质结合的化学反应基团主要有三种类型,即:酰基氯,由磺酸制备;异硫氰酸和重氮盐类,这两种通常由相应的胺制备,通过化学键作用于相应的抗原、抗体反应结合。目前标记方法主要是透析法和直接标记法两种。以FITC标记为例:FITC含有异硫氰基,在碱性条件下能与IgG的自由氨基结合,形成荧光抗体结合物,如图2。
3 酶标记分析
图2 异硫氰基与自由氨基结合
2.3 应用现状
传统荧光标记免疫分析(FIA)曾经一度起着非常重要的作用,其优越性也比较明显,但由于受到散射光、来源于样品的背景荧光和荧光淬灭等因素的期
以酶标记的酶免疫分析(Enzymeimmunoassay,[10]
EIA)是继RIA和FIA之后建立起来的一项将酶反应的高效性与免疫反应的特异性有机结合的标记免疫学技术。1966年,以Engvall和Perlmann等为先驱,发展了酶免疫测定法,主要是利用免疫复合物上的酶将特定的底物转化为特定的颜色,用分光光度
综 述
食品工业科技Vol.28,No.10,2007
其衍生物是最早在CLIA中使用的一种常用的化学
[13]
发光物质,其发光原理如图3。这些发光物质通常用N-羟基琥珀酰胺作为偶联试剂。目前用于标记的还有小分子吖啶酯,其具有空间阻碍小,增加标记物的扩散。只要在HH存在下就能迅速产2O2和O
生化学发光,且有很高的量子产率;1s内完成快速强发光;非靶物质不产生化学发光和37℃温育非平衡期反应等特点。
-
计测定,从而测得待测物的量。
3.1 标记物
到目前为止,酶标记法所用的酶大多是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶
等。每种酶通过与自己的特殊作用底物反应,而产生典型的有色沉淀物。通过反应的颜色与被检测物的相关关系,从而对被检物进行定量分析。
3.2 标记方法
目前标记的技术一般是通过交联剂将酶与抗体或抗原相结合。交联方法主要有:戊二醛法、酶醛化法、重氮化法、碳二亚胺法、混合酸酐法、二硝基苯酚法(FNPS)、二异氰酸甲苯法(TDI)。一般都是利用小分子上的活性部位与蛋白质上的氨基、羧基、酚基、巯基或羟基进行化学反应。
图3 化学发光原理
4.2 标记方法
发光物的标记方法一般也是根据参与标记双方的结构特点进行选择,同样也是利用蛋白质上的氨
基、羧基等。偶联方法主要有混合酸酐法、N-羟基琥珀酰亚氨法、过碘酸钠法、环内酸酐法、硫氰酸酯衍生物法等。抗原和抗体的标记是化学发光免疫分析中十分关键的一个环节。标记免疫步骤不仅要求标记产物不易脱落,性质稳定,更主要的是标记后标记物应保持原抗原或抗体的活性,保持标记基团的发光活性
[14]
3.3 应用现状
酶标记因其催化底物可与核素一样起到信息放大作用,而减少放射性废物,曾被认为可以完全取代RIA。目前,在我国酶标免疫检测由于其检测灵敏度高、方法简单、所用仪器相对便宜,因此发展空间也很大。开发商品试剂盒也有很好得实用价值。但是,这种依靠比色法的检测所受的干扰因素太多,其灵敏度和稳定性未能高于RIA,而且底物一旦显色后就难于复原,因此是一次性的。另外,酶结合反应时间很难确定,酶随着时间的延长很容易失活,影响测
[11]
定效果,结果也不容易保存。有研究者认为,把几种结构相关或非相关的农药抗体结合,利用这种混合技术进行几种农药的多残留分析,对于检测大批量且农药污染又没有规律的样品,可以节省大量的时间和工作量。
。
4.3 应用现状
吖啶酯体系的灵敏度与自动化程度较高,但发光时间短,重复性较差。最近出现一些新的酶促化学发光技术,如用AMPPD(二氧杂环丁烷)标记,碱性磷酸酶催化氧化,克服了传统发光标记物的固有发光不稳定,反应过程中发生裂变导致结果不稳定等缺陷,使检测更稳定。全自动微粒子化学发光免疫分析仪即采用此发光体系,但由于价格昂贵,目前国内还未广泛推广。CLIA除具有灵敏度高、特异性强等优点,日益受到人们的青睐。CLIA分析方法多样,适用面广,广泛地用于抗原、抗体和半抗原的免疫测定,其线性范围也较宽。CLIA技术不仅为临床诊断和科学研究提供了一种超微量的非同位素免疫检测手段,而且在食品分析、环境等方面具有广阔的应用前景。目前,CLIA在免疫分析方面取得了一些
[15]
。成就,但其发展空间仍然很大
4 发光标记分析
20世纪80年代末,国外开始用化学发光试剂来标记抗原或抗体,从而建立了发光免疫分析技术。
狭义的发光免疫分析(luminescenceimmunoassay,LIA)主要是指化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)。另外,还有酶放大化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay,ECLIA)。CLIA是Sohrocler和Halman在20世纪70年代末期建立的,该方法兼有发光分析的高灵敏度和免疫反
[12]
。其基本原理同酶标记分析法,是用应的特异性
化学发光反应的试剂(可以是发光剂或催化剂等)标记抗原或抗体,标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和理化步骤(如离心分离、洗涤等),最后以测定发光强度形式测定待测物的含量。
5 胶体金标记分析
胶体金标记分析主要有胶体金免疫分析
[16]
(Colloidal-goldimmunoassay,CGIA),是以胶体金为标记物,在光镜或电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术,它已成为继荧光素、酶等标记技术之后的一种新的标记技术。
4.1 标记物
用于标记的化学发光试剂应符合以下几个条
件:偶联后能保持发光试剂高的量子效应和反应动力;与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物;在很少程度的改变被标记物的理化特性,尤其是其免疫活性。鲁米诺(Luminol)、异鲁米诺(Isoluminol)及
5.1 标记物
胶体金标记是利用氯金酸(HAuCl在还原剂作4)用下聚合成直径1～150nm的金颗粒(图4),形成带
负电的疏水胶溶液。由于静电作用成为稳定的胶体状态,称胶体金。
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综 述
强磁场中,它们才有磁性。这对标记物的分离和检
测是非常关键的。如果每一个磁微粒都有微弱的磁性,那么它就成为一个磁偶极,这就会导致磁微粒聚集如胶体的不稳定或沉淀。为了进行实际利用,每一个顺磁微粒都应有能与抗体或识别单元与磁微粒连接的表面活性。然后,将这种带有合适识别单元的交联微粒置于含有目标分析物的流体中,在胶体微粒和抗体进行相对短暂的温育后,分析物带有磁性,将其放入磁场中便可达到检测目标。Lacava等研究用葡聚糖包裹磁性纳米颗粒对小鼠的毒性情况,实验表明磁性纳米粒子的生物相容性和生物
[22]
检测可行性。沈霞等选用葡萄糖包覆超顺磁性的Fe3O4纳米粒子,通过葡萄糖表面的酰基化实现与抗
葡聚糖-抗体磁性纳体或抗原的偶联,制得Fe3O4-米生物探针,结果表明,该探针完全适用于快速免疫检测需要。
[21]
图4 胶体金制备原理
5.2 标记方法
胶体金标记就是蛋白质等高分子被吸附到胶体
金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒具有高电子高密度的特性,其表面的负电荷能与蛋白质的正电荷基团静电吸附而牢固结合。在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而被用于定性或半定量的快速免疫检测中。这种胶体金能稳定迅速地吸附蛋白质而不改变其活性,用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽等非共价结合,因而在基础研究和检验检疫中成为非常有用的工具。
5.3 应用现状
胶体金免疫层析技术与ELISA技术原理不尽相同,前者技术要求更高,实施更为困难。其主要原因在于胶体金免疫层析技术发展快,时间较短;层析材料主要采用国外产品,国内产品尚无法达到要求。胶体金本身为红色,不需要加入发色试剂,省却了酶标的底物及终止液的步骤,金标记物比酶标记物更稳定,实验结果可以长期保存而不腿色。胶体金技术作为一种新的免疫学标记方法,因具有简单、快速、准确和无污染等优点,在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用[17]。目前发展的胶体金试纸条由于其方便、快捷、可操作性强而日益受到大家的重视。
图5 超顺磁性粒子结构图
6.2 标记方法
大多数免疫分析标记技术都采用了标记物与抗体或抗原通过一定长度的手臂经疏水作用力、静电力、双功能交联剂、硅烷化、酰胺键连接而成。如图5超顺磁性粒子与抗体或抗原的连接也不例外,只是针对不同的基团选择的交联物有所不同,如图6。
6 超顺磁微粒标记分析
以磁性粒子标记的磁性免疫分析技术(MagneticImmunoChromatofraphicTest,MICT)是现代物理学与生物技术结合研发生产的磁性分析检测技术,最早应用于基础医学领域。与其它标记技术不同,该技术一个显著的优点就是用磁性粒子标记不受有色杂质干扰,可用于直接测量血液、食品、污水等有色样品。其原理是利用超顺磁性纳米微粒作为标记物,由高灵敏度磁性检测仪器测定结合在免疫复合物上的磁性微粒所产生的局部磁场效应,从而得出
[20]
。所测分析物的定量结果
[18,19]
图6 磁性粒子与载体的连接方法
6.3 应用现状
磁性粒子标记技术最早是在临床医学中用于分
[23]
离的一种技术手段。随着现在仪器设备的更新换代,利用磁性微粒代替胶体金、炭素粒子作为标记物进行免疫检测已经取得了很好的结果。在与样本基质分离后,磁性微粒与固定在硝酸纤维膜上得配体结合时就形成了感应线,磁性微粒固定不动或浓缩聚集都可以被感应器检测到被分析物或测试线。传统的检测方法中,这些检测线是可以肉眼观察到或者用一些光学设备测定其反射系数、颜色变化或荧光,但在硝酸纤维膜测试线上的金微粒聚集线最大,很显然膜就有几百微米厚。由于胶只有10μm
体金标记分析物不仅分布在膜表面,而且分布在膜
[24,26]
6.1 标记物
超顺磁性微粒标记所用的是超顺磁性纳米粒子,免疫学检测中利用抗体和目标分析物特异性结合使其带有磁性微粒(如图5),从而便于检测和分离。无论被分析物是分子、细胞片段、完整细胞,都可以进行磁性微粒标记。这种磁性微粒必须是带有超顺磁性的纳米微粒,也就是说,只有将它们放到超期
综 述
食品工业科技Vol.28,No.10,2007
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内,大约90%的分析物不能被监测器、肉眼或分光光度计检测到。另外,由于基质、镜面反射、散射、自身吸收和光信号淬灭的干扰,光学设备检测生物样本显得有些困难。使用磁微粒标记技术克服了以上缺点。首先,磁性物质在生物基质中不常见,这就克服了传统光学分析中常见的基质干扰;第二,磁性免疫分析检测中,不仅仅是表面,全部分析物和测试区都可以被检测到,这就能对大部分的分析物进行定量分析。磁性标记检测方法的重现性达98%,最低检测水平误差仅仅为25pg、信噪比为3∶1,CV值
[25]
。
7 展望
总之,免疫学分析技术的发展也就是标记学的发展。目前,多种免疫分析标记方法并存,相互竞争,相互补充,但不管怎样,目前还没有一种免疫分析标记技术是完美无缺的。因此,各种标记技术还需要不断发展和完善,并且人们还在不断研究,以开发出更新、更理想的免疫分析标记技术。
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