脂肪酶的结构特征和化学修饰

2003年第28卷第7期中国油脂

文章编号:1003) 7969(2003) 07) 0005) 06 中图分类号:TQ641 文献标识码:A

脂肪酶的结构特征和化学修饰

郭诤1, 2, 张根旺3

(1. 天津大学化工学院生物化工系, 300072天津市; 2. 郑州工程学院化学化工系, 450052郑州市嵩山南路140号; 3. 郑州工程学院食品工程系, 450052郑州市嵩山南路140号)

摘要:通过对脂肪酶的氨基酸组成、催化中心的构成特点和晶体结构等最新研究成果的综述, 阐明了脂肪酶的结构特征。重点讨论了脂肪酶的化学修饰, 尤其是在修饰方法和修饰机理方面的研究进展。并对脂肪酶化学修饰技术在生物技术与食品工程领域的应用前景进行了展望。

关键词:脂肪酶; 催化三元组; 化学修饰; 聚乙二醇; 活化

脂肪酶(lipase E. C. 3. 1. 1. 3) 亦称酰基甘油水解酶(acylglycerol hydrolases) , 广泛存在于原核生物(如细菌[1]) 和真核生物(如霉菌[2]、哺乳动物[3]、植物[4]等) 中。脂肪酶的天然底物是甘油酯类, 然而研究表明, 脂肪酶除了能够催化甘油酯类化合物的水解

[5]

囊化以及化学键合等) 、通过定点诱变或利用克隆技术对酶进行基因修饰和表达[17, 18]、以及对组成酶一级结构氨基酸侧链的修饰都属酶修饰的范畴。毫无疑问, 基因修饰能从根本上改变酶的结构, 使之满足研究及应用需要, 其稳定性和重复性比较好。然而基因修饰投资大、成本高、研究周期长。化学修饰则操作简便、方式灵活、周期短、见效快, 是一种颇具实用价值的生物工程技术。

关于酶修饰的策略, 人们提出了许多新奇的想法并进行了许多大胆的尝试。Mozhaev 等[19]用盐酸胍处理酶使其肽链完全伸展, 对酶分子内部的疏水基团进行修饰, 然后让它在适当的条件下重新折叠, 但未获成功。Saraswathi 等[20]先使核糖核酸酶变性, 然后加入丙酸作为酯酶的竞争性抑制剂, 再用戊二醛进行表面交联) ) ) 固定所希望的活性构象, 最后透析除去抑制剂。结果创造了一种新的/酸性酯酶0, 从而改变了酶的底物专一性, 获得了新的酶活力。Kilibanov 等[21]则提出了类似的/生物印迹法0(bio-imprinting) , 其原理是利用酶在水溶液中的柔性, 加入手性竞争性抑制剂, 然后将这种酶-抑制剂复合物转入亲脂性溶剂, 使酶的三维结构以一种改性的状态被/冻结0, 除去抑制剂的改性酶凭借其/记忆0功能就具有了对底物的立体选择性。

多数脂肪酶属单链蛋白酶, 无辅酶因子。脂肪酶分子的修饰可分为表面修饰和内部修饰[22]。化学固定化属于借助于某种共价键将酶连接到惰性载体表面的一种修饰方法。小分子修饰是利用小分子化学试剂与酶表面的) COOH 、) NH 2、) OH 、) C 6H 4OH 等反应, 如酰化、烷基化、糖基化等。小分子修饰也常常导致酶构象的改变, 甚至对底物立体专一性的改变。一些可溶性大分子如PEG 、右旋糖

和合成之外, 还可以用于催化酯交换反应

[6][7]

、

生物表面活性剂的合成[8]、多肽合成[9]、聚合物的合成[10]和药物的合成[11]等, 尤其是利用某些脂肪酶的立体专一性, 催化旋光异构体的拆分[12]和手性药物的合成[13]成为酶工程领域研究的新热点。因而脂肪酶及其改性制剂在食品与营养、日用化学工业、油脂化学品工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤和生物表面活性剂的合成、以及药物合成等许多领域得到广泛应用。

脂肪酶在许多领域展现出诱人的应用前景, 然而这种催化剂的许多/天然0性质如活性、选择性、稳定性等在多数情况下都不能满足其催化反应的要求, 这种基于拓展其应用空间和应用范围的/改进0可以通过化学修饰来实现。对酶的化学修饰的目的有两个:其一是通过对构成酶催化活性中心氨基酸残基的定向修饰, 揭示酶的活性中心构成和催化机理[3, 14]; 其二是通过对活性中心构成无关的氨基酸侧链的修饰, 改善酶原有的催化功能或者创造新的功能[15, 16]。从根本上讲, 前者属于一种分析手段; 后者则是酶工程研究的主要内容和重要手段。

广义而言, 凡是对酶的一、二、三级结构的改变都是酶修饰。因此酶的固定化(物理吸附、包埋或微

收稿日期:2003-04-18

作者简介:郭诤(1969-) , 男, 博士生; 主要从事酶工程和油脂化学研究。

中国油脂 2003年第28卷第7期

苷、肝素等通过共价键连接到酶分子表面, 形成一层覆盖层, 从而改变酶在有机溶剂中的溶解性, 当然也可能会伴随着酶对底物作用专一性的改变。酶分子的内部修饰包括非催化活性基团的修饰、酶(蛋白酶) 法对酶蛋白主链的修饰、催化活性基团的修饰及肽链伸展后的修饰等。

本文依据修饰机理、修饰剂的性质将脂肪酶的化学修饰分为小分子修饰、PEG(polyethylene glycol) 化修饰和其他大分子的修饰, 并就修饰机理、方法以及修饰后酶性质的变化展开讨论。1 脂肪酶的结构特征1. 1 分子结构特征

研究表明, 来源不同的脂肪酶, 其氨基酸组成数目从270~641不等, 其分子量为29000~100000。迄今为止, 人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达, 并利用X -衍射等手段和定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数, 确定了组成脂肪酶活性中心的三元组(triad) 结构。表1列出了几种常见的脂肪酶的结构特征参数。

表1 部分脂肪酶的结构特征参数

脂肪酶名称C CL

[23, 24]

类组分, 如CC L(A) 含有4. 2%葡萄糖、甘露糖和木糖等, 所以实际测得的分子量比理论分子量偏大157223(理论) , 60000(实测) 2[26]。

表2 CC L(A) 的氨基酸组成[29]

Phe Leu Ser(-OH) Ile Met

3148452914

Pro Thr(-OH)Ala Cys(2-S -S -) Ar g

313647514

Tyr(-C6H 4-O H) His G lu (-COOH) G ln Asn

205181632

Asp (-COOH) Trp Val Gly Lys(-NH 2)

345285620

从表2所列的数据我们知道, 对CC L(A) 而言, 除了端位游离的氨基和羧基之外, 可供修饰的官能团有Ser 和Thr 提供的游离羟基, Tyr 提供的酚羟基, Cys 提供的二硫键(2个) 和巯基(1个) , Glu 和Asp 提供的羧基, 以及Lys 提供的E ) NH 2。掌握这些结构信息, 对我们选择修饰方法和计算修饰度会大有帮助。

1. 2 脂肪酶催化中心三元组

研究表明[30], 尽管不同来源的脂肪酶(EC3. 1.

1. 3) 具有不同的氨基酸组成(残基数目、分子量、三维空间

PI 414

4194. 564. 3~4. 6

氨基酸残基数534

分子量(道尔顿) 57223(A) 57744(B) 60000

尺度(10

-10

m) 三元组催化中心

结构等) , 但由于生物的同源性和进化过程的保守性, 其催化中心拥有相似或相同的特征区His -X -Y -Gly -Z -Ser -W -Gly 或Y -Gly -His -Ser -W -Gly(W 、X 、Y 、Z 指非特异性氨基酸) 。如图1所示。绝大多数脂肪酶的活性中心都由Ser 和His 参与组成[31], His 、Ser 与另一种氨基酸残基(如CC L 和GCL 的Glu 、RML 和hPL 的Asp 等)

(CRL) GC L

[25]

64. 9@97. 5@175. 565@60@45(Ñ)

59. 4@84@56(Ò) 71. 6@75@5548. 3@93. 9@122. 1

His(449)-Ser(209) -Glu(341)

544His(483)-Ser(217) -Glu(364)

R ML

[26,27]

(M ML) hP L

[28]

269449

29472Se r(144) -Hi s(267) -Asp(203) Se r(152) -Hi s(263) -Asp(176)

注:CC L (Candida Cylindracea Lipase) ; CRL (Candida Rugosa Lipase) ; GC L (Geotrichum Candidum Lipase) ; RML(Rhizomucor M iehei Lipase) ; MML(Mucor Miehei Lipase) ; hPL(hu man Pancreatic Lipase) 。

正如表1中所示, 多数酶都有变种(如CCL(A) 和CCL(B) 、GCL Ñ和GC L Ò等) , 不过这些不同变种的酶具有绝大多数相同的氨基酸序列, 其氨基酸组成数目完全相同, 不同的只是个别氨基酸的差异。一般而言, 不仅构成活性中心的三元组氨基酸种类相同, 而且位置不变; 其分子量和等电点略有不同[25, 29]。

多数脂肪酶都是单链蛋白, 比如CCL(A) 含有534个氨基酸残基, 其组成3个小的和11个大的B -折叠及10个A -螺旋。其催化活性三元组由Ser -209、His-449和Glu341组成, Ser-209处于超二级结构折叠-螺旋1B -折叠(202~208)-A -螺旋(210~

一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组(triad) 。如图2所示[3]。

图1 脂肪酶二级结构的一般形式

研究证实, 脂肪酶是一种/丝氨酸水解酶0(ser -

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旋盖0的重新定向排列(构象改变) 有关。侧链基团的化学修饰和固定化对脂肪酶催化活性的改变与/A -螺旋盖0的重新定向排列不无关系[33]。2 脂肪酶的化学修饰2. 1 小分子修饰

脂肪酶表面暴露有许多游离的羟基、酚羟基、巯

图2 Candida rugosa lipase 多肽的拓扑和立体图解

基、羧基、氨基等官能团, 可以与一些小分子化合物如醛、酮、羧酸等发生烷基化、酰化、醚化等反应。尤其是赖氨酸末端的E ) NH 2具有较强的亲核性, 能够与许多亲电试剂在温和的条件下发生反应, 这对在修饰过程中保持酶的活性、减少酶活损失是十分有利的。因此, E ) NH 2成为化学修饰的首选官能团。

1968年Means 和Feeney [34]首先报道了用乙醛和丙酮借助于与氨基形成Schiff 碱对蛋白质进行了修饰。Kaimal 和Saroja [35]采用类似的方法, 用丁醛、异丁醛和丙酮对猪胰脂酶进行了化学修饰, 结果发现修饰后脂肪酶的V ma x 提高了50%, 催化水解和酯化的活性都有所提高, 而酶原有1, 3-专一性未受影响。用5-磷酸吡哆醛修饰CC L 赖氨酸残基、用二硫苏糖醇还原其二硫键得到的结果都表明[36], 修饰后的CC L 催化酯化活性有较大提高而水解活性不受影响。

丝氨酸残基通过氢键与组氨酸相连, 另一种氨基酸(谷氨酸或天冬氨酸) 也通过羧基形成的氢键与组氨酸相连。在反应过程中, 三者通过与底物形成四面体中间体复合物完成催化过程。如图3

所示。

图3 脂肪酶催化甘三酯水解过程中形成的四面体中间态

Basri 等[37]利用氨基酯的盐酸盐使CRL 发生脒化反应, 引入了疏水的长链烷基, 大大改善了脂肪酶在有机溶剂中的溶解度和热稳定性, 催化酯化反应的活性有很大提高, 但水解活性有所下降。Tsuzuki 等[38]在RDL(Rhizopus dele mar lipase) 上引入双十二烷基葡萄糖基谷氨酸而得到的修饰脂肪酶, 除热稳定性有所提高外, 对长碳链甘三酯的催化专一性增加, 但与游离酶相比, 易受钙离子的抑制。

经过活化的脂肪酸可以在温和的条件下与赖氨酸残基的E ) NH 2发生酰化反应, 从而在脂肪酶侧链偶联上不同链长的脂肪酸, 进而改变酶的理化性质和催化活性。如图5所示

[39, 40]

另一个令人感兴趣的特征是Ser-residue 被一/A -螺旋盖0掩蔽起来, 与分子表面被一界面所隔开, 形成由暴露憎水基包围的由亲水基组成的脂肪酶亲电区(氧负离子洞) , 如图4[32]所示。这种结构有利于催化过程中底物对活性中心亲和力的提高以及活性中间体的稳定。所以界面激活现象通常与/A -

螺

, 脂肪酸的主要活化

方法有3种[39, 40]:制备成酰氯的形式、制成琥珀酰亚胺的形式、制成对-二甲硫苯酚酯的形式。酰氯制备方法简单但反应剧烈、修饰过程中易造成酶的失活; 对二甲硫酚酯反应条件温和, 但成本较高,

图4 P. aeruginosa lipase 活性位点的三维结构

活性位点残基为Ser 82, His 251和Asp 229; 残基261和257的羰基氧原子为Ca 2+配基;

() /盖子0图5 脂肪酸的活化方法

琥珀酰亚胺是常用的修饰方法。

1993年, Murakami

[39]

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用和长链分子的缠绕作用牢牢地固定于磁粒上。游离的羧基经N-羟基琥珀酰亚胺的活化作用即可用于脂肪酶的化学修饰。这种酶既保持了酶在反应体系中的较好的分散性, 又可借助于磁响应快速地实现酶从体系中的分离。2. 3 多糖及其他大分子的修饰

右旋糖苷

[47]

利用对-二甲硫基苯酚酯

(DSP, Dimethylsulfoniophenyl ester) 于温和条件下在酶上引入了脂肪酸, 这种脂肪酸修饰的脂肪酶在正己烷等有机溶剂中催化酯化反应的能力优于天然酶, 而且改变了天然酶对不同底物的亲和力(即改变了脂肪酸与酶结合的特异性) , 这种改变与引入的脂肪酸相关。2. 2 PEG 化修饰

聚乙二醇或甲基聚乙二醇1(monomethoxy ) polyethylene glycol, (M)PEG 2有一系列不同分子量分布的产品(常用的分子量分布在5000~10000之间) , 无毒副作用, 无免疫原性, 具有良好的生物相容性。1977年Abuchowski 等[41]率先用PE G 修饰牛血清蛋白B SA(bovine serum albumin) , 发现PE G 化的BSA 保持了蛋白质的原有活性, 在体内的半衰期大大延长, 且无免疫原性。其后人们利用PEG 化技术先后对大量的蛋白和酶制剂进行了修饰, PEG 化的药物能大大延长其在体内的半衰期, 进而延长药物的作用时间、减少服药次数。部分PE G 化的药品已获美国食品与药物管理局(FDA) 批准上市。

PE G 必须经活化才能用于脂肪酶的化学修饰。活化的方法[42~

47]

、肝素

[51]

、葡聚糖、B -C D 等经过活

化可用于脂肪酶的修饰。脱酰壳聚糖也可以借助于戊二醛偶联到酶分子上。图7表示出了多糖常用的活化方法。溴化氰活化的原理是溴化氰与多糖反应生成的酰亚胺碳酸能够与脂肪酶的侧链氨基作用, 将多糖偶联到酶分子上。用高碘酸氧化多糖得到邻二醛, 邻二醛可以和侧链氨基形成亚胺衍生物, 从而实现酶与多糖的偶联。

如图6所示, 三聚氯氰(cyanuric

图7 多糖的活化方法

chloride) 是一种常用的活化剂, 价廉易得但毒性较大; 羟化琥珀酰亚胺、1-羧基咪唑、取代苯基氯甲酸酚酯等都是经常使用的PEG 活化剂。

Inada [48]等、Baillargeon 和Sonnet [49]采用三聚氯氰活化技术, 将PEG 共价偶联到不同的脂肪酶制备出具有双亲的性质的改性脂肪酶, 修饰酶在有机溶剂中的溶解度和催化酯化的活性都大大提高。1986年, Ta maura 等

[50]

其他合成高分子如聚马来酸酐[52]、PAA 、PVA 等也用来修饰脂肪酶。Yashimoto 等将聚乙二醇乙烯基甲基二醚与马来酸酐共聚得到一种新的修饰剂聚(PEG -马来酸酐) , 该聚合物不需活化可直接用于酶的修饰。3 结束语

综上所述, 脂肪酶的化学修饰不仅在研究酶活性中心的结构, 揭示酶结构与其生物学功能之间的

关系等方面起着重要作用。而且在提高酶的稳定性、延长半衰期、提高其催化活性、强化或改变其催化的专一性、甚至创造新的功能、扩大酶的工业应用等方面也有着十分重要的意义。然而, 必须看到与基因修饰和酶工程相比, 其局限性是显而易见的。而且, 目前的研究主要局限于酶侧链的修饰, 在蛋白质一级结构的修饰、化学突变、肽链展开后的修饰等方面进行的研究工作较

合成了纳米级磁性PEG 修饰脂肪

酶(magneticPEG -modified lipase) 。作者将A , X -二羧基聚乙二醇溶于亚铁盐溶液中, 用H 2O 2将亚铁离子氧化成Fe 3O 4磁粒, 双羧基PEG 通过羧基的配位作

图6 MPEG 的,

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cation of oil by fatty acid -modi fied lipase [J]. J. Am. Oil Chem. Soc. , 1993, 70:571.

上, 如何寻找新的专一性更强的修饰剂, 使化学修饰在生物技术领域发挥更重要的作用, 是今后研究中应重点解决的问题。

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Structural Characteristics and Chemical Modification of Lipase

GUO Zheng 1, 2, Z HANG Gen -wang 3

(1. Department of Biochemical Engineering, School of Chemical Engineering, Tianjin University, 300072Tianjin, China; 2. Department of Chemistry &Chemical Engineering, Zhengzhou Institute of Technology, 450052Zhengzhou, China;

3. Department of Food Engineering, Zhengzhou Institute of Technology, 450052Zhengzhou, China) Abstract:This revie w a ttempts to provide a rough updated compilation of the studies reported in the literature per -taining to the structural characteristics of lipase, especially for composition of amino acids, c omposing characteristics of catalytic center, crystal structure etc. Highlights were given to the developments of che mical modification which focusing on the modification methods and ac tivation mechanism. The application of the chemical modification of lipase in biotech -nology and food engineering fields was also looked into.

catalytic