现代食品科技
Modern Food Science and Technology 2012, Vol.28, No.11
阪崎肠杆菌随机突变体库的构建
董晓晖，吴清平，莫树平，杨小鹃
（1.中国科学院南海海洋研究所，广东广州 510301）（2.广东省微生物应用新技术公共实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物研究所，广东广州 510070）（3.中国科学院研究生院，北京 100049）
摘要：阪崎肠杆菌（Cronobacter（Enterobacter sakazakii））是一种以婴幼儿奶粉为主要致病源的食源性致病菌。至今人们对其功能基因所知不多，毒力因子和致病机制研究都未能找到突破口。本研究利用质粒pTnMod-okm和变体库，最终以工程菌Escherichia coli WM3064 及其所含质粒pBSL180色培养技术和抗生素抗性标记（卡那霉素50 μg/mL
关键词：阪崎肠杆菌；转座子；突变体库 文章篇号：1673-9078(2012)11-1454-1458
1，2，3
2
2
2
Generation of a Cronobacter ()
DONG Xiao-hui 1,2,3, WU Qing-ping 222
Abstract: Cronobacter (Enterobacter , in powdered infant formula (PIF), is an important CronobacterCronobacter random mutant library. Finally, the mutant library of CronobacterEscherichia coli WM3064 through Chromogenic ). In subsequence research, gene assignment and finding the similar function Cronobacter.
Key words:
(sakazakii)][1]高达40%~起成人局部感染、菌血症以及骨髓炎等[2,3]。阪崎肠杆
收稿日期：2012-06-11
基金项目：广东省科技计划项目（2008A030203012）；广东省中国科学院全面战略合作专项（2010B090301037）
作者简介：董晓晖（1980-），女，博士研究生，主要从事食品微生物安全研究
通讯作者：吴清平（1962-），男，研究员，主要从事食品安全研究
菌在很多食品中被检测到，这些食品包括：奶酪、腌肉、水、蔬菜、大米、面包、茶叶、草药、调味料及豆腐等[4~6]，但在一些新生儿阪崎肠杆菌感染事件的调查中发现婴幼儿奶粉是主要感染渠道[7]。虽然阪崎肠杆菌的全基因组测序在2007年就已完成，但至今人们对其功能基因所知不多，毒力因子和致病机制研究都未能找到突破口。迄今为止该菌基因功能研究多集中于序列比对后进行基因敲除验证其功能，对于探索控制某类功能的多个基因和阪崎肠杆菌特有的基因有很大局限性，而诱变和转座子标签法可以打破现有局限。转座子是DNA插入因子的一种，又称跳跃因子，即能在基因组间或组内跳跃的DNA片段，其实质是基因组中不必借助于同源序列就可移动的核酸序列。自1951年美国Barbara Mclintock在玉米中首先发现了DNA转
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座子以来，许多转座子在各种原核与真核生物中陆续被发现[8]。
传统诱变方法是通过化学或物理作用破坏了细菌的DNA，而转座子标签法是直接将一段已知DNA序列插入到细菌的基因组中，二者本质是一样的，但转座子的方法更直接，获得突变体后可以利用基因工程技术进行功能基因组学的研究。作为研究基因功能的转座子具有以下优点：(1)转座子载体均为自杀性质粒，
需要鉴定待测基因的产物，只要转座因子插入可引起表型变化的基因均可用此法分离鉴定，这对于那些已知表型而未知其基因调控机制的微生物遗传学研究尤为有利。因此利用转座子构建随机突变体库并从与致病性相关的角度揭示一些重要基因的功能，不失为阪崎肠杆菌致病机制研究的突破点。本研究将转座突变技术应用于阪崎肠杆菌，通过阪崎肠杆菌显色培养技术和质粒中带有的抗生素抗性标记，建立了该菌的功50 LB和试验菌株Cronobacter sakazakii ATCC 29544分别接种于LB肉汤（DAP+Km+Amp）和LB肉汤中，37 ℃摇床培养。将过夜培养菌液分别划线阪崎肠杆菌显色培养基（DAP+Km+Amp）、阪崎肠杆菌显色培养基（Km）、阪崎肠杆菌显色培养基（Amp）和单纯的阪崎肠杆菌显色培养基平板上，评价工程菌是否是二氨基庚二酸缺陷型菌株、其所含构建突变体的质粒是否
ATCC 29544接合后初筛试验中长在阪崎肠杆菌显色培养基（Km）平板上的5株蓝色重组子接种至LB肉汤（Km）中，37 ℃摇床培养16~18 h，编号为t1~t5。每株重组子各取1.2 mL菌液提取质粒，以E. coli S17-1 (pTnMod-okm)和菌株C. sakazakii ATCC 29544分别作为阳性和阴性对照进行质粒提取和扩增验证。扩增验证的引物为:S17F：
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5′-GCAGGGCTTCCCAACCTTCCCAGAG-3；S17R：5′-GAGGCCACCACATTCCG CCACCGTAG-3′，上述引物由上海生工生物工程有限公司合成。25 μL PCR体系中含250 μmol/L 上游（S17F）/下游引物（S17R）、2×PCR TaqMix及50 ng~100 ng模板DNA。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。挑取E. coli WM3064 (pBSL180)和C. sakazakii ATCC 29544接合后初筛试验中长于阪崎肠杆菌显色培养基（Km）平板上的蓝色重组子分别划线于阪崎肠杆菌显色培养基（Km）和阪崎肠杆菌显色培养基（Amp）放于37 ℃培养24 h进行确证实验。 2 结果与讨论
2.1 工程菌株和试验菌株的确证
崎肠杆菌显色培养基（DAP+Km+Amp）上生长但不显色（图1B），同时在阪崎肠杆菌显色培养基（Km）上不生长（图1C）；说明此工程菌质粒未丢失，可以用阪崎肠杆菌显色培养基来筛选重组子，保证在后继的平板初筛试验中不会有假阳性。C. sakazakii ATCC 29544在含任何一种抗生素的培养基上都不生长；在阪崎肠杆菌显色培养基上显色（图1D），表明抗生素有效，这些条件满足了利用阪崎肠杆菌显色培养基（Km）作为求。
2.2 子，见图2。E. coli （）和ATCC 29544WM3064 (pBSL180)（图2B））上生长并显色，说明ATCC 29544都有接
A
B
A B
图2 结合实验结果
Fig.2 The results of conjugation tests
C D 图 A- S17-1（pTnMod-okm）B-(pBSL180)在加有卡那霉素、氨苄情况；C- WM3064 (pBSL180)在加有卡那霉素的阪崎肠杆菌显色培养基上的生长情况；D-Cronobacter sakazakii ATCC 29544在阪崎肠杆菌显色培养基上的生长情况。
注：A-Escherichia coli S17-1（pTnMod-okm）和Cronobacter sakazakii ATCC 29544的重组子；B-E. coli
WM3064 (pBSL180)和C. sakazakii ATCC 29544的重组子。
2.3 阪崎肠杆菌的随机突变体库确证试验
阪崎肠杆菌随机突变体的确证试验结果如图3所示。E. coli S17-1（pTnMod-okm）和C. sakazakii ATCC 29544的重组子t1~t5抽提质粒后用S17F/S17R引物扩增后电泳（图3A），显示所有的重组子和E. coli S17-1（pTnMod-okm）都有扩增条带，证明此质粒不能在菌株C. sakazakii ATCC 29544中自杀。不能应用pTnMod-okm质粒构建阪崎肠杆菌C. sakazakii ATCC 29544的随机突变体库。
E. coli WM3064 (pBSL180)和C. sakazakii ATCC 29544的重组子在阪崎肠杆菌显色培养基（Km）上生长（图3B）但是在LB琼脂平板（Amp）上不生长（图3C），这表明质粒pBSL180的启动子不能被阪崎肠杆菌
工程菌株和实验菌株的确证结果符合实验要求，结果如图1所示。工程菌株E. coli S17-1(pTnMod-okm)
在加有卡那霉素的阪崎肠杆菌显色培养基上生长但不显色（图1A）；工程菌E. coli WM3064 (pBSL180)在阪
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识别，可以在阪崎肠杆菌内“自杀”，不能自我复制和转座。利用工程菌E. coli WM3064 (pBSL180)成功构建了阪崎肠杆菌随机突变体库，至今已经分离保存了4000多株突变体，为进一步的表型筛选做准备。
复制，并在基因间跳跃，即转座子pTnMod-okm在C. sakazakii ATCC 29544中不“自杀”，不能抑制自身的转座，这样的重组子不稳定，无法对其插入的基因进行准确定位。而质粒pBSL180的复制起始点不能被C. sakazakii ATCC 29544识别，因此该转座子插入目标菌基因组后不能自我复制，能够在抗性标记的选择压力下稳定存在于其最初插入位点，可通过转座子序列对其插入失活的基因进行准确定位。并且质粒pBSL180可以用于基因功能研究。
A
质粒示意图
B C
图3 注：A-Escherichia coli S17-1（sakazakii ATCC 29544结果；1：E. coli S17-1（）2： ATCC 29544：（）和C. sakazakii ATCC 29544WM3064 (pBSL180)和的重组子在加有卡那霉素C-WM3064 (pBSL180)和图5 pBSL180质粒示意图
Fig.5 The sketch map of pBSL180 plasmid
3.2 质粒pBSL180的宿主细胞E. coli WM3064是二氨
基庚二酸（DAP）营养缺陷型，这是筛选重组子避免假阳性的又一保障。阪崎肠杆菌具有α-葡萄糖苷酶（α-transglucosidase）活性，在显色培养基中加有5-溴-4-氯-3-吲哚α-D葡萄糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl -D-glucopyranoside)，这种底物在葡萄糖苷酶的作用下使菌落呈蓝绿色，而工程菌E. coli WM3064不能在这样的显色培养基上显色，这种表型筛选重组子简单易行，并且避免了试验过程中出现其他菌污染后筛选目标菌重组子时的假阳性问题。
3.3 随着一系列与该菌相关的重大感染事件的爆发，阪崎肠杆菌受到全世界普遍关注。迄今对阪崎肠杆菌的致病机制尚无定论，建立阪崎肠杆菌随机突变体库并从与致病机制相关角度来筛选重组子可为当前阪崎
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3 结论3.1 4）是由Tn5转座子元件、来自RP4pMB1以及卡那霉素抗性基因组成的质粒[14]。可移动自杀质粒pBSL180（图5）携带卡那霉素抗性基因修饰的Tn10转座子，具有氨苄青霉素(Amp)和卡那霉素(Km)抗性。他们的宿主菌E. coli S17-1和E. coli WM3064均可与阪崎肠杆菌发生接合作用，产生重组子。但C. sakazakii ATCC 29544可以识别质粒pTnMod-okm的复制起点，从而使这个转座子能够在C. sakazakii ATCC 29544中
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肠杆菌研究带来新思路。利用转座子标签法构建突变体库，快速、稳定、突变位置清楚,便于后续操作、抗药性标记易于选择，为研究阪崎肠杆菌的各项功能提供了良好的素材和捷径，可节约时间、财力和人力并加快研究进程。 参考文献
[1] Farmer JJIII, Asbury MA, Hickman FW, et al. The
Enterobacteriaceae Study Group. Enterobacter sakazaki: a new species of “Enterobacteriaceae” isolated from clinical specimens [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1980, 30: 569-584
[2] Nazarowec-White M, Farber JM. Enterobacter sakazakii : a
review [J]. International Journal of Food Microbiology, 1997, 34(2): 103-113
[3] Corti G, Panunzi I, Losco M, et al. Postsurgical osteomyelitis
caused by Enterobacter sakazakii in a healthy young man [J]. Journal of Chemotherapy, 2007, 19(1): 94-96
[4] Leclercq A, Wanegue C, Baylac P. Comparison of fecal
coliform agar and violet red bile lactose agar for fecal coliform enumeration in foods [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(4): 1631-1638 [5] No HK, Park NY, Lee SH, et al. Antibacterial chitosans and chitosan oligomers with Food Science, 2002, 67(4): 1511-1514
[6] flora in lettuce, meat omelette
[7] Iversen C, Forsythe S. Isolation of Enterobacter sakazakii and
other Enterobacteriaceae from powdered infant formula milk and related products [J]. Food Microbiology, 2004, 21(6): 771-777
[8] Alfons G, Heinz S. Plant transposable elements and gene
tagging [J]. Plant Molecular Biology, 1992, 19: 39-49 [9] 年洪娟,陈丽梅,李昆志.Tn5转座突变技术在革兰氏阴性细
菌分子遗传研究中的应用[J].中国生物工程杂志, 2009, 29(12):114-118
[10] 李光飞,邓代永,许枚英,等.构建荧
光标记的脱色希瓦氏菌1174-1178
[11] Jonathan J J modular
self-cloning genetic [12] cells of S12 [J]. Journal of applied involve in azoreduction in Shewanella S12 [J]. Applied Microbiology and [14] Sinorhizobium meliloti strain carrying a stable and non-transmissible chromosomal single copy of the green fluorescent
protein
GFP‐P64L/S65T
[J].
FEMS
Microbiology Letters, 2002, 214(2): 165-170
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阪崎肠杆菌随机突变体库的构建
董晓晖，吴清平，莫树平，杨小鹃
（1.中国科学院南海海洋研究所，广东广州 510301）（2.广东省微生物应用新技术公共实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物研究所，广东广州 510070）（3.中国科学院研究生院，北京 100049）
摘要：阪崎肠杆菌（Cronobacter（Enterobacter sakazakii））是一种以婴幼儿奶粉为主要致病源的食源性致病菌。至今人们对其功能基因所知不多，毒力因子和致病机制研究都未能找到突破口。本研究利用质粒pTnMod-okm和变体库，最终以工程菌Escherichia coli WM3064 及其所含质粒pBSL180色培养技术和抗生素抗性标记（卡那霉素50 μg/mL
关键词：阪崎肠杆菌；转座子；突变体库 文章篇号：1673-9078(2012)11-1454-1458
1，2，3
2
2
2
Generation of a Cronobacter ()
DONG Xiao-hui 1,2,3, WU Qing-ping 222
Abstract: Cronobacter (Enterobacter , in powdered infant formula (PIF), is an important CronobacterCronobacter random mutant library. Finally, the mutant library of CronobacterEscherichia coli WM3064 through Chromogenic ). In subsequence research, gene assignment and finding the similar function Cronobacter.
Key words:
(sakazakii)][1]高达40%~起成人局部感染、菌血症以及骨髓炎等[2,3]。阪崎肠杆
收稿日期：2012-06-11
基金项目：广东省科技计划项目（2008A030203012）；广东省中国科学院全面战略合作专项（2010B090301037）
作者简介：董晓晖（1980-），女，博士研究生，主要从事食品微生物安全研究
通讯作者：吴清平（1962-），男，研究员，主要从事食品安全研究
菌在很多食品中被检测到，这些食品包括：奶酪、腌肉、水、蔬菜、大米、面包、茶叶、草药、调味料及豆腐等[4~6]，但在一些新生儿阪崎肠杆菌感染事件的调查中发现婴幼儿奶粉是主要感染渠道[7]。虽然阪崎肠杆菌的全基因组测序在2007年就已完成，但至今人们对其功能基因所知不多，毒力因子和致病机制研究都未能找到突破口。迄今为止该菌基因功能研究多集中于序列比对后进行基因敲除验证其功能，对于探索控制某类功能的多个基因和阪崎肠杆菌特有的基因有很大局限性，而诱变和转座子标签法可以打破现有局限。转座子是DNA插入因子的一种，又称跳跃因子，即能在基因组间或组内跳跃的DNA片段，其实质是基因组中不必借助于同源序列就可移动的核酸序列。自1951年美国Barbara Mclintock在玉米中首先发现了DNA转
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现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2012, Vol.28, No.11
座子以来，许多转座子在各种原核与真核生物中陆续被发现[8]。
传统诱变方法是通过化学或物理作用破坏了细菌的DNA，而转座子标签法是直接将一段已知DNA序列插入到细菌的基因组中，二者本质是一样的，但转座子的方法更直接，获得突变体后可以利用基因工程技术进行功能基因组学的研究。作为研究基因功能的转座子具有以下优点：(1)转座子载体均为自杀性质粒，
需要鉴定待测基因的产物，只要转座因子插入可引起表型变化的基因均可用此法分离鉴定，这对于那些已知表型而未知其基因调控机制的微生物遗传学研究尤为有利。因此利用转座子构建随机突变体库并从与致病性相关的角度揭示一些重要基因的功能，不失为阪崎肠杆菌致病机制研究的突破点。本研究将转座突变技术应用于阪崎肠杆菌，通过阪崎肠杆菌显色培养技术和质粒中带有的抗生素抗性标记，建立了该菌的功50 LB和试验菌株Cronobacter sakazakii ATCC 29544分别接种于LB肉汤（DAP+Km+Amp）和LB肉汤中，37 ℃摇床培养。将过夜培养菌液分别划线阪崎肠杆菌显色培养基（DAP+Km+Amp）、阪崎肠杆菌显色培养基（Km）、阪崎肠杆菌显色培养基（Amp）和单纯的阪崎肠杆菌显色培养基平板上，评价工程菌是否是二氨基庚二酸缺陷型菌株、其所含构建突变体的质粒是否
ATCC 29544接合后初筛试验中长在阪崎肠杆菌显色培养基（Km）平板上的5株蓝色重组子接种至LB肉汤（Km）中，37 ℃摇床培养16~18 h，编号为t1~t5。每株重组子各取1.2 mL菌液提取质粒，以E. coli S17-1 (pTnMod-okm)和菌株C. sakazakii ATCC 29544分别作为阳性和阴性对照进行质粒提取和扩增验证。扩增验证的引物为:S17F：
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5′-GCAGGGCTTCCCAACCTTCCCAGAG-3；S17R：5′-GAGGCCACCACATTCCG CCACCGTAG-3′，上述引物由上海生工生物工程有限公司合成。25 μL PCR体系中含250 μmol/L 上游（S17F）/下游引物（S17R）、2×PCR TaqMix及50 ng~100 ng模板DNA。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。挑取E. coli WM3064 (pBSL180)和C. sakazakii ATCC 29544接合后初筛试验中长于阪崎肠杆菌显色培养基（Km）平板上的蓝色重组子分别划线于阪崎肠杆菌显色培养基（Km）和阪崎肠杆菌显色培养基（Amp）放于37 ℃培养24 h进行确证实验。 2 结果与讨论
2.1 工程菌株和试验菌株的确证
崎肠杆菌显色培养基（DAP+Km+Amp）上生长但不显色（图1B），同时在阪崎肠杆菌显色培养基（Km）上不生长（图1C）；说明此工程菌质粒未丢失，可以用阪崎肠杆菌显色培养基来筛选重组子，保证在后继的平板初筛试验中不会有假阳性。C. sakazakii ATCC 29544在含任何一种抗生素的培养基上都不生长；在阪崎肠杆菌显色培养基上显色（图1D），表明抗生素有效，这些条件满足了利用阪崎肠杆菌显色培养基（Km）作为求。
2.2 子，见图2。E. coli （）和ATCC 29544WM3064 (pBSL180)（图2B））上生长并显色，说明ATCC 29544都有接
A
B
A B
图2 结合实验结果
Fig.2 The results of conjugation tests
C D 图 A- S17-1（pTnMod-okm）B-(pBSL180)在加有卡那霉素、氨苄情况；C- WM3064 (pBSL180)在加有卡那霉素的阪崎肠杆菌显色培养基上的生长情况；D-Cronobacter sakazakii ATCC 29544在阪崎肠杆菌显色培养基上的生长情况。
注：A-Escherichia coli S17-1（pTnMod-okm）和Cronobacter sakazakii ATCC 29544的重组子；B-E. coli
WM3064 (pBSL180)和C. sakazakii ATCC 29544的重组子。
2.3 阪崎肠杆菌的随机突变体库确证试验
阪崎肠杆菌随机突变体的确证试验结果如图3所示。E. coli S17-1（pTnMod-okm）和C. sakazakii ATCC 29544的重组子t1~t5抽提质粒后用S17F/S17R引物扩增后电泳（图3A），显示所有的重组子和E. coli S17-1（pTnMod-okm）都有扩增条带，证明此质粒不能在菌株C. sakazakii ATCC 29544中自杀。不能应用pTnMod-okm质粒构建阪崎肠杆菌C. sakazakii ATCC 29544的随机突变体库。
E. coli WM3064 (pBSL180)和C. sakazakii ATCC 29544的重组子在阪崎肠杆菌显色培养基（Km）上生长（图3B）但是在LB琼脂平板（Amp）上不生长（图3C），这表明质粒pBSL180的启动子不能被阪崎肠杆菌
工程菌株和实验菌株的确证结果符合实验要求，结果如图1所示。工程菌株E. coli S17-1(pTnMod-okm)
在加有卡那霉素的阪崎肠杆菌显色培养基上生长但不显色（图1A）；工程菌E. coli WM3064 (pBSL180)在阪
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识别，可以在阪崎肠杆菌内“自杀”，不能自我复制和转座。利用工程菌E. coli WM3064 (pBSL180)成功构建了阪崎肠杆菌随机突变体库，至今已经分离保存了4000多株突变体，为进一步的表型筛选做准备。
复制，并在基因间跳跃，即转座子pTnMod-okm在C. sakazakii ATCC 29544中不“自杀”，不能抑制自身的转座，这样的重组子不稳定，无法对其插入的基因进行准确定位。而质粒pBSL180的复制起始点不能被C. sakazakii ATCC 29544识别，因此该转座子插入目标菌基因组后不能自我复制，能够在抗性标记的选择压力下稳定存在于其最初插入位点，可通过转座子序列对其插入失活的基因进行准确定位。并且质粒pBSL180可以用于基因功能研究。
A
质粒示意图
B C
图3 注：A-Escherichia coli S17-1（sakazakii ATCC 29544结果；1：E. coli S17-1（）2： ATCC 29544：（）和C. sakazakii ATCC 29544WM3064 (pBSL180)和的重组子在加有卡那霉素C-WM3064 (pBSL180)和图5 pBSL180质粒示意图
Fig.5 The sketch map of pBSL180 plasmid
3.2 质粒pBSL180的宿主细胞E. coli WM3064是二氨
基庚二酸（DAP）营养缺陷型，这是筛选重组子避免假阳性的又一保障。阪崎肠杆菌具有α-葡萄糖苷酶（α-transglucosidase）活性，在显色培养基中加有5-溴-4-氯-3-吲哚α-D葡萄糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl -D-glucopyranoside)，这种底物在葡萄糖苷酶的作用下使菌落呈蓝绿色，而工程菌E. coli WM3064不能在这样的显色培养基上显色，这种表型筛选重组子简单易行，并且避免了试验过程中出现其他菌污染后筛选目标菌重组子时的假阳性问题。
3.3 随着一系列与该菌相关的重大感染事件的爆发，阪崎肠杆菌受到全世界普遍关注。迄今对阪崎肠杆菌的致病机制尚无定论，建立阪崎肠杆菌随机突变体库并从与致病机制相关角度来筛选重组子可为当前阪崎
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3 结论3.1 4）是由Tn5转座子元件、来自RP4pMB1以及卡那霉素抗性基因组成的质粒[14]。可移动自杀质粒pBSL180（图5）携带卡那霉素抗性基因修饰的Tn10转座子，具有氨苄青霉素(Amp)和卡那霉素(Km)抗性。他们的宿主菌E. coli S17-1和E. coli WM3064均可与阪崎肠杆菌发生接合作用，产生重组子。但C. sakazakii ATCC 29544可以识别质粒pTnMod-okm的复制起点，从而使这个转座子能够在C. sakazakii ATCC 29544中
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肠杆菌研究带来新思路。利用转座子标签法构建突变体库，快速、稳定、突变位置清楚,便于后续操作、抗药性标记易于选择，为研究阪崎肠杆菌的各项功能提供了良好的素材和捷径，可节约时间、财力和人力并加快研究进程。 参考文献
[1] Farmer JJIII, Asbury MA, Hickman FW, et al. The
Enterobacteriaceae Study Group. Enterobacter sakazaki: a new species of “Enterobacteriaceae” isolated from clinical specimens [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1980, 30: 569-584
[2] Nazarowec-White M, Farber JM. Enterobacter sakazakii : a
review [J]. International Journal of Food Microbiology, 1997, 34(2): 103-113
[3] Corti G, Panunzi I, Losco M, et al. Postsurgical osteomyelitis
caused by Enterobacter sakazakii in a healthy young man [J]. Journal of Chemotherapy, 2007, 19(1): 94-96
[4] Leclercq A, Wanegue C, Baylac P. Comparison of fecal
coliform agar and violet red bile lactose agar for fecal coliform enumeration in foods [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(4): 1631-1638 [5] No HK, Park NY, Lee SH, et al. Antibacterial chitosans and chitosan oligomers with Food Science, 2002, 67(4): 1511-1514
[6] flora in lettuce, meat omelette
[7] Iversen C, Forsythe S. Isolation of Enterobacter sakazakii and
other Enterobacteriaceae from powdered infant formula milk and related products [J]. Food Microbiology, 2004, 21(6): 771-777
[8] Alfons G, Heinz S. Plant transposable elements and gene
tagging [J]. Plant Molecular Biology, 1992, 19: 39-49 [9] 年洪娟,陈丽梅,李昆志.Tn5转座突变技术在革兰氏阴性细
菌分子遗传研究中的应用[J].中国生物工程杂志, 2009, 29(12):114-118
[10] 李光飞,邓代永,许枚英,等.构建荧
光标记的脱色希瓦氏菌1174-1178
[11] Jonathan J J modular
self-cloning genetic [12] cells of S12 [J]. Journal of applied involve in azoreduction in Shewanella S12 [J]. Applied Microbiology and [14] Sinorhizobium meliloti strain carrying a stable and non-transmissible chromosomal single copy of the green fluorescent
protein
GFP‐P64L/S65T
[J].
FEMS
Microbiology Letters, 2002, 214(2): 165-170
1458