黄酮提取实验方案
1材料与仪器
1.1 材料
1.2 试剂
芦丁，无水乙醇，氢氧化钠,石油醚，硝酸铝，三氯化铁，三氯化铝，浓氨水，浓盐酸，镁粉，亚硝酸钠（以上均为国产分析纯），实验所用水均为蒸馏水。
1.3 实验仪器
电热恒温水浴锅
电子天平（感量0.0001g）
722型光栅分光光度计
索氏提取器
量筒（100ml,10ml）25ml比色管 移液管 小试管 白瓷板 圆底烧瓶 100m容量瓶 锥形瓶
2 实验原理
2.1 提取原理
2.2 分离方法及原理
3 实验部分
3.1原料的预处理
金星科厥类叶→除杂→水洗→晾干→粉碎
3.2 芦丁—标准溶液的配制
将芦丁在干燥箱里用120℃条件下恒重1.5h,然后精确称取芦丁标准品0.01g用85%的乙醇溶液配制成100.00mL的溶液，备用。
3.3 测定波长的选择
精确移取芦丁标准溶液0.50mL,置于25.00mL的比色管中，用质量分数为85%的乙醇稀释到10.00mL处，加人5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min,加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后在460～560nm处测定吸光度,（以试剂样品做空白）选择最大吸收波长。 [4]
3.4 芦丁标准曲线的绘制
精确吸取芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL于6支25.00mL的比色管中，用质量分数为85%的乙醇稀释到10.00mL处，加人5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min，加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后于波长500nm处测定吸光度，（以第一瓶为空白溶液）然后以吸光度和芦丁溶液浓度做图，绘制标准曲线。
3.5 黄酮类化合物的特征性实验[5]-[6]
在一定条件下对提取的黄酮类化合物进行特征性实验，具体内容如下：
（1） 盐酸—镁粉反应：取1.00mL提取液于试管中加适量镁粉摇匀，再加入浓盐酸数滴（1次加入），观察其泡沫颜色。（2） 三氯化铝反应：取提取液点在滤纸上，滴加1%三氯化铝乙醇溶液，吹干，观察颜色变化。（3） 三氯化铁反应：取几滴提取液于白瓷板上，滴加1%三氯化铁乙醇溶液，观察其颜色。（4） 浓氨水反应：取乙醇提取液点在滤纸上，将滤纸在浓氨水上方熏0.5min，观察其颜色变化。
3.6 单因素实验
2.6.1 较佳提取剂质量分数的确定
准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用无水乙醇 、95%、85% 80%、75% 的乙醇60mL对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80℃下回流提取3h.提取完毕，用与提取剂的质量分数相同的乙醇反复洗涤圆底烧瓶、滤纸包，将其定容于100:00mL容量瓶中，然后精确吸取0.50mL提取液置于25.00mL的比色管中，用与提取剂质量分数相同的乙醇稀释到10.00mL处，加人5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min,加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后于波长500nm处测定其吸光度，同时做三组平行实验。
2.6.2 较佳提取时间的确定
准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用2h、2.5h 、3h 、3.5h提取时
间用60mL、85%的乙醇对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80℃下回流提取，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
2.6.3 较佳提取温度的确定
称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别在75℃、 80℃、85℃、 90℃的水
浴温度下用60mL、85%的乙醇对3g金星厥科叶样品回流提取2.5h，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
2.6.4较佳物料比的确定
称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用30mL、45mL 、60mL、75mL 、90mL
的85%的乙醇溶液在水浴温度为85℃下对3g金星厥科叶样品回流提取2.5h，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
3.7 叶绿素对黄酮类物质的影响
称取15g 金星厥科叶样品放于锥形瓶中用90mL的石油醚浸泡8个小时对其脱色，过滤、干燥。然后准确称取处理过的3g金星厥科叶样品用质量分数为85%的60mL乙醇溶液在水浴温度为85℃下对其回流提取2.5h，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
3.8 金星厥科叶中黄酮类化合物含量的测定
精密量取石油醚处理过的提取液0.50mL，置于25.00mL 的比色管中。加85%的乙醇稀释到
10.00mL,加入5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min，加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后于波长500nm处测定吸光度。
同时做样品空白管.根据标准曲线计算提取物中黄酮类化合物的含量.(把样品所测得吸光度的
平均值代入标准曲线方程,再算出0.50mL提取液中黄酮类化合物的浓度,然后再根据浓度算出样品中黄酮类化合物的百分含量.)计算方法(公式)如下：
设样品中黄酮类化合物的含量为 ,稀释以后的浓度为C;原提取液的浓度为C0 ;
3.000g⨯1000 x=⨯100%Co=Vo
4 结果与讨论
4.1 最大吸收波长的选择
将定量的黄酮提取液显色以后在460～560nm处测定吸光度,（以试剂样品做空白）选择最大吸收波长，测定结果如下：
表1 波长与吸光度的关系
波长(nm)
吸光度(A)
波长(nm)
吸光度(A)
从表1中可以知道当波长在什么时候有最大吸收波峰。
4.2 芦丁的标准曲线的绘制
精确吸取0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL的芦丁标准溶液稀释、显色以后在波长500nm
处测定吸光度（以第一瓶为空白溶液），以浓度(c)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，结果如下： 表2 芦丁溶液浓度与吸光度的关系
浓度(mg/mL) 0.002 0.004
吸光度
实验结果表明黄酮类化合物含量在0～100ug/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，其回归方程为Y=11.5548X-0.00406 R=0.99342, 0.008 0.012 0.016
4.3黄酮类化合物的特征性实验
对所提取的黄酮类化合物进行特征性实验的结果如下表：
表3定性实验结果
试剂 现象
盐酸—镁粉
1%三氯化铝
1%三氯化铁
浓氨水
从表3可知，黄酮类化合物的特征性实验结果较符合黄酮类化合物的特征颜色反应，证明所提取中含有黄酮类化合物。
4.4 单因素实验的结果
4.4.1较佳提取剂质量分数的确定
准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用无水乙醇 、95%、85% 80%、75% 的乙醇60mL对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80℃下回流提取3h.显色后测其吸光度，测定结果如下：
表4 不同乙醇质量分数对西山中黄酮类物质提取的结果
乙醇的质量分数 (%)
吸光度1 无水乙醇 95 85 80 75
吸光度2
吸光度3
平均值
4.4.2 较佳提取时间的确定
准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用2h、2.5h 、3h 、3.5h提取时间用60mL，85%的乙醇对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80℃下回流提取。显色后测其吸光度，测定结果如下：
表5 不同提取时间对西山中黄酮类物质的提取结果
提取时间（h） 吸光度1
吸光度2
吸光度3
平均值
4.4.3较佳提取温度的确定
称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别在75℃、 80℃、85℃、 90℃的水浴
温度
下用60mL，85%的乙醇对3g金星厥科叶样品回流提取2.5h。显色后测其吸光度，测定结果如下：
表6 不同提取温度对西山中黄酮类物质的提取结果
提取温度（℃） 75 80 85 90
吸光度1
吸光度2
吸光度3
平均值 2 2.5 3 3.5
4.4.4较佳物料比的确定
称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用30mL、45mL 、60mL、75mL 、90mL
质量分数为85%的乙醇在水浴温度为85℃下对3g样品回流提取2.5h。显色后测其吸光度，测定结果如下：
表7 不同物料比对金星厥科叶中黄酮类物质的提取结果
物料比（w/v） 1:10 1:15 1:20 1:25 1:30
吸光度1
吸光度2
吸光度3
平均值
4.5 叶绿素对黄酮类物质含量测定的影响
准确称取用石油醚脱色过的3g金星厥科叶样品用质量分数为85%的乙醇60mL在水浴温度为85℃下对其回流提取2.5h，显色后测其吸光度，测定结果如下：
表8 叶绿素和脂肪对黄酮类物质提取效果的影响
样品
吸光度1
吸光度2
吸光度3
平均值 石油醚浸泡 对照样
4.6金星厥科叶中黄酮类化合物含量
取黄酮提取液（用石油醚浸泡过的）0.50mL测定其吸光度并按公式计算其含量，实验结果如下：
表9金星厥科叶中黄酮类化合物含量
项目
吸光度(C) 浓度(mg/mL ) 黄酮类化合物含量(%) 标准曲线
黄酮提取实验方案
1材料与仪器
1.1 材料
1.2 试剂
芦丁，无水乙醇，氢氧化钠,石油醚，硝酸铝，三氯化铁，三氯化铝，浓氨水，浓盐酸，镁粉，亚硝酸钠（以上均为国产分析纯），实验所用水均为蒸馏水。
1.3 实验仪器
电热恒温水浴锅
电子天平（感量0.0001g）
722型光栅分光光度计
索氏提取器
量筒（100ml,10ml）25ml比色管 移液管 小试管 白瓷板 圆底烧瓶 100m容量瓶 锥形瓶
2 实验原理
2.1 提取原理
2.2 分离方法及原理
3 实验部分
3.1原料的预处理
金星科厥类叶→除杂→水洗→晾干→粉碎
3.2 芦丁—标准溶液的配制
将芦丁在干燥箱里用120℃条件下恒重1.5h,然后精确称取芦丁标准品0.01g用85%的乙醇溶液配制成100.00mL的溶液，备用。
3.3 测定波长的选择
精确移取芦丁标准溶液0.50mL,置于25.00mL的比色管中，用质量分数为85%的乙醇稀释到10.00mL处，加人5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min,加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后在460～560nm处测定吸光度,（以试剂样品做空白）选择最大吸收波长。 [4]
3.4 芦丁标准曲线的绘制
精确吸取芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL于6支25.00mL的比色管中，用质量分数为85%的乙醇稀释到10.00mL处，加人5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min，加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后于波长500nm处测定吸光度，（以第一瓶为空白溶液）然后以吸光度和芦丁溶液浓度做图，绘制标准曲线。
3.5 黄酮类化合物的特征性实验[5]-[6]
在一定条件下对提取的黄酮类化合物进行特征性实验，具体内容如下：
（1） 盐酸—镁粉反应：取1.00mL提取液于试管中加适量镁粉摇匀，再加入浓盐酸数滴（1次加入），观察其泡沫颜色。（2） 三氯化铝反应：取提取液点在滤纸上，滴加1%三氯化铝乙醇溶液，吹干，观察颜色变化。（3） 三氯化铁反应：取几滴提取液于白瓷板上，滴加1%三氯化铁乙醇溶液，观察其颜色。（4） 浓氨水反应：取乙醇提取液点在滤纸上，将滤纸在浓氨水上方熏0.5min，观察其颜色变化。
3.6 单因素实验
2.6.1 较佳提取剂质量分数的确定
准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用无水乙醇 、95%、85% 80%、75% 的乙醇60mL对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80℃下回流提取3h.提取完毕，用与提取剂的质量分数相同的乙醇反复洗涤圆底烧瓶、滤纸包，将其定容于100:00mL容量瓶中，然后精确吸取0.50mL提取液置于25.00mL的比色管中，用与提取剂质量分数相同的乙醇稀释到10.00mL处，加人5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min,加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后于波长500nm处测定其吸光度，同时做三组平行实验。
2.6.2 较佳提取时间的确定
准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用2h、2.5h 、3h 、3.5h提取时
间用60mL、85%的乙醇对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80℃下回流提取，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
2.6.3 较佳提取温度的确定
称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别在75℃、 80℃、85℃、 90℃的水
浴温度下用60mL、85%的乙醇对3g金星厥科叶样品回流提取2.5h，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
2.6.4较佳物料比的确定
称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用30mL、45mL 、60mL、75mL 、90mL
的85%的乙醇溶液在水浴温度为85℃下对3g金星厥科叶样品回流提取2.5h，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
3.7 叶绿素对黄酮类物质的影响
称取15g 金星厥科叶样品放于锥形瓶中用90mL的石油醚浸泡8个小时对其脱色，过滤、干燥。然后准确称取处理过的3g金星厥科叶样品用质量分数为85%的60mL乙醇溶液在水浴温度为85℃下对其回流提取2.5h，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
3.8 金星厥科叶中黄酮类化合物含量的测定
精密量取石油醚处理过的提取液0.50mL，置于25.00mL 的比色管中。加85%的乙醇稀释到
10.00mL,加入5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min，加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后于波长500nm处测定吸光度。
同时做样品空白管.根据标准曲线计算提取物中黄酮类化合物的含量.(把样品所测得吸光度的
平均值代入标准曲线方程,再算出0.50mL提取液中黄酮类化合物的浓度,然后再根据浓度算出样品中黄酮类化合物的百分含量.)计算方法(公式)如下：
设样品中黄酮类化合物的含量为 ,稀释以后的浓度为C;原提取液的浓度为C0 ;
3.000g⨯1000 x=⨯100%Co=Vo
4 结果与讨论
4.1 最大吸收波长的选择
将定量的黄酮提取液显色以后在460～560nm处测定吸光度,（以试剂样品做空白）选择最大吸收波长，测定结果如下：
表1 波长与吸光度的关系
波长(nm)
吸光度(A)
波长(nm)
吸光度(A)
从表1中可以知道当波长在什么时候有最大吸收波峰。
4.2 芦丁的标准曲线的绘制
精确吸取0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL的芦丁标准溶液稀释、显色以后在波长500nm
处测定吸光度（以第一瓶为空白溶液），以浓度(c)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，结果如下： 表2 芦丁溶液浓度与吸光度的关系
浓度(mg/mL) 0.002 0.004
吸光度
实验结果表明黄酮类化合物含量在0～100ug/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，其回归方程为Y=11.5548X-0.00406 R=0.99342, 0.008 0.012 0.016
4.3黄酮类化合物的特征性实验
对所提取的黄酮类化合物进行特征性实验的结果如下表：
表3定性实验结果
试剂 现象
盐酸—镁粉
1%三氯化铝
1%三氯化铁
浓氨水
从表3可知，黄酮类化合物的特征性实验结果较符合黄酮类化合物的特征颜色反应，证明所提取中含有黄酮类化合物。
4.4 单因素实验的结果
4.4.1较佳提取剂质量分数的确定
准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用无水乙醇 、95%、85% 80%、75% 的乙醇60mL对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80℃下回流提取3h.显色后测其吸光度，测定结果如下：
表4 不同乙醇质量分数对西山中黄酮类物质提取的结果
乙醇的质量分数 (%)
吸光度1 无水乙醇 95 85 80 75
吸光度2
吸光度3
平均值
4.4.2 较佳提取时间的确定
准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用2h、2.5h 、3h 、3.5h提取时间用60mL，85%的乙醇对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80℃下回流提取。显色后测其吸光度，测定结果如下：
表5 不同提取时间对西山中黄酮类物质的提取结果
提取时间（h） 吸光度1
吸光度2
吸光度3
平均值
4.4.3较佳提取温度的确定
称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别在75℃、 80℃、85℃、 90℃的水浴
温度
下用60mL，85%的乙醇对3g金星厥科叶样品回流提取2.5h。显色后测其吸光度，测定结果如下：
表6 不同提取温度对西山中黄酮类物质的提取结果
提取温度（℃） 75 80 85 90
吸光度1
吸光度2
吸光度3
平均值 2 2.5 3 3.5
4.4.4较佳物料比的确定
称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用30mL、45mL 、60mL、75mL 、90mL
质量分数为85%的乙醇在水浴温度为85℃下对3g样品回流提取2.5h。显色后测其吸光度，测定结果如下：
表7 不同物料比对金星厥科叶中黄酮类物质的提取结果
物料比（w/v） 1:10 1:15 1:20 1:25 1:30
吸光度1
吸光度2
吸光度3
平均值
4.5 叶绿素对黄酮类物质含量测定的影响
准确称取用石油醚脱色过的3g金星厥科叶样品用质量分数为85%的乙醇60mL在水浴温度为85℃下对其回流提取2.5h，显色后测其吸光度，测定结果如下：
表8 叶绿素和脂肪对黄酮类物质提取效果的影响
样品
吸光度1
吸光度2
吸光度3
平均值 石油醚浸泡 对照样
4.6金星厥科叶中黄酮类化合物含量
取黄酮提取液（用石油醚浸泡过的）0.50mL测定其吸光度并按公式计算其含量，实验结果如下：
表9金星厥科叶中黄酮类化合物含量
项目
吸光度(C) 浓度(mg/mL ) 黄酮类化合物含量(%) 标准曲线