第33卷第4期2009年7月
水生生物学报
ACTAHYDROBIOLOGICASINICA
Vol 33,No 4Jul ,200 9
DOI号:10 3724/SP J 0000 2009 40717
铜对梨形环棱螺抗氧化酶活性和金属硫蛋白含量的影响
张清顺 侯建军 刘香江 罗洁璇 熊邦喜
(华中农业大学水产学院,武汉 430070)
摘要:本实验采用暴露重金属的方法,研究了不同浓度硫酸铜(Cu2+分别为0、0 005、0 01、0 02、0 05mg/L)在不同暴露时间(0 14d)下对梨形环棱螺(Bellamyapurificata)过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)的活性、还原性谷胱甘肽(GSH)和金属硫蛋白(MT)含量的影响,以探讨Cu2+对梨形环棱螺的氧化损伤及其防御作用的机理,并为水环境Cu2+污染的早期诊断及生态风险评价提供科学的依据。结果表明:Cu2+对梨形环棱螺肝脏和鳃中CAT、SOD、GST、GSH和MT均有明显影响,表现出时间剂量效应。SOD在前4天、CAT在前3天酶活性总体上表现出诱导趋势,GST在前4天酶活性处于诱导状态,随着暴露时间的延长,酶活性下降,到第5天时表现出抑制趋势;随着时间的进一步增长,至14d时,0 005mg/L剂量组酶活性维持在正常值附近波动,0 01mg/L剂量组酶活性被诱导,0 02mg/L剂量组酶活性在肝脏中表现为诱导而在鳃中则被抑制,0 05mg/L剂量组酶活性被抑制。肝脏和鳃GSH含量的变化与GST相似,在短时间内表现出诱导效应,肝脏GSH在暴露的前5天、鳃GSH在暴露的前4天均处于诱导状态,随着暴露时间的延长,0 005mg/L剂量组表现出诱导,0 05mg/L剂量组则受到抑制。MT在整个实验期间均处于诱导状态,各剂量组在0 5d被极显著诱导,随后MT含量出现起伏波动,有上升和下降,至第14天时达到一稳定水平。其中,0 01mg/L剂量组肝脏的MT在整个实验期间均被极显著地诱导(p
关键词:Cu2+;超氧化物歧化酶;过氧化氢酶;谷胱甘肽硫转移酶;谷胱甘肽;金属硫蛋白;梨形环棱螺中图分类号:Q494 文献标识码:A 文章编号:1000 3207(2009)04 0717 09
铜(Copper,Cu)是生物体内代谢的必需微量元素之一,是细胞色素c氧化酶、超氧化物歧化酶(Su
peroxidedismatase,SOD)、金属硫蛋白(Metallothio nein,MT)等酶或蛋白中的重要金属离子,在机体代谢中有着重要的作用。同时,铜又是有毒重金属元素,其浓度超过一定限度时,就会对水生生物产生一定的毒害作用。重金属离子污染对水生生物的毒性作用机制之一是其造成生物体内的过氧化胁迫,过量的重金属离子能导致体内产生大量的活性氧自由基(Reactiveoxygenspecies,ROS),这些活性氧又可使DNA断裂、酶蛋白失活等,从而引起机体的氧化应激,造成生物大分子和膜脂质过氧化,对机体诱发多种损害
[3,4][1,2]
体抗氧化防御系统中的一些成分会改变,如SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化酶(GPx)等可被诱导,从而使
[2,5]
机体免受氧化伤害。因而,这些生物标志物的活性变化间接反映了环境中氧化应激的存在,可作为环境污染胁迫的指标
[6,7]
[3]
。
目前关于重金属对软体动物毒理效应的研究以贝类为多,就重金属对腹足动物毒理效应的研
[8 12]
究主要集中在重金属的蓄积方面。关于腹足动物重金属毒理效应生物标志物的相关研究则鲜有报道。环棱螺在我国分布广泛,它们多生活在河流、池塘、湖泊等水体,是大型底栖生物的重要组成部
[13]
分,在水生态系统中起着重要的作用。我们在预实验中发现梨形环棱螺(BellamyapurificataHeude)对Cu敏感,因此选用梨形环棱螺为材料,采用暴露实验方法,研究了不同浓度Cu对梨形环棱螺肝
2+
2+
。在长期进化中,需氧生物发
展了防御过氧化损害的酶系统。在生理状态下,由代谢产生的活性氧可为抗氧化防御系统所控制,机
收稿日期:2007 11 12;修订日期:2009 02 26基金项目:国家自然科学基金(No 30470342)
作者简介:张清顺(1982 ),男,湖北省咸宁市人;硕士研究生;从事养殖环境和水生毒理学研究通讯作者:熊邦喜,教授,博士生导师;Te:l027 87283018;E mai:lbangxix8@mail hzau edu cn
脏、鳃中抗氧化指标(SOD、CAT、GST和GSH)的影响和MT的解毒效应,进一步探讨重金属对腹足动物的氧化损伤及其防御作用的机理,并为水环境重金属污染的早期诊断及生态风险评价提供科学的依据。
置于2 0mL离心管内,液氮速冻后于-80 冰箱中保存备测。
1 3 3 酶样的制备 取肝、鳃组织约0 1 0 2g,以1∃20(w/v)的比例加入预冷的0 01mol/LpH7 2磷酸盐缓冲液,冰水浴中低速匀浆,4 下离心(16000r/min,10min),取上清液,即为组织酶提取液。
1 3 4 抗氧化酶活性的测定 SOD活性的测定采用NBT法
[14]
1 材料与方法
1 1 实验材料 实验动物梨形环棱螺采集于武汉市南湖,在实验室进行培养。养殖池温度保持在20 25 ,pH控制在7 5左右。每天交替投喂新鲜的植物叶子和配合饲料。
1 2 主要仪器和试剂 主要实验仪器设备包括:TAS 990型原子吸收分光光度计(北京普析)、紫外可见分光光度计(美国Thermo公司)、高速冷冻离心机(美国Sigma公司)、DIAX900微量匀浆机(德国Heidolph公司)等。CuSO4!5H2O(AR)、GSH、NBT、EDTA、Tris、 巯基乙醇、蔗糖(Amresco公司生产)、L Met、DTNB、核黄素(Sigma公司生产)、Cd标准储备液(购自国标中心)外,其余均为国产分析纯。1 3 实验方法
1 3 1 试验质量浓度的设置及分组 首先对梨形环棱螺进行了96h的急性毒性实验,用寇氏(Kor bor)法计算出Cu对梨形环棱螺在96h的LC50及其95%致信区间分别为0 382(0 314 0 464)mg/L,其安全浓度为0 038mg/L。因本研究旨在探讨
2+
低剂量Cu在较长时间暴露时对梨形环棱螺的影响,在预实验的基础上,保证试验中受试动物不死亡的前提条件,并结合渔业水质标准,来确定本实验中的Cu浓度,实验组设置如下:对照组,铜暴露组分别为0 005、0 01、0 02、0 05mg/L4个组,以下简称0 005、0 01、0 02、0 05剂量组。挑选比较活跃、体重在1 5g左右的动物进行实验。1 3 2 毒性暴露实验 实验在38cm∀28cm∀15cm的水箱内进行。温度为(24#1) ,自然光照,各梯度分别放1 4 1 6g健康、活动性强的梨形环棱螺50只,将实验螺进行不同离子浓度不同时间的毒性暴露,每个浓度梯度分别设置3个平行的水族箱。实验期间的管理与饲养期间一致,隔天换水一次,每次换水一半,换水时分别加入含有与毒性暴露重金属离子浓度一致的曝气自来水。实验开始后分别于0 5、1、2、3、4、5、7、10、14d取样,每个梯度各水族箱随机选取5只实验螺,用纱布擦干螺的体表,,
2+
2+
,酶活力单位定义为:每毫克组织蛋白
在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的
SOD量为1个活性单位(U)。CAT活性的测定采用紫外分光光度法
[15]
,酶活力单位定义为:每毫克
组织蛋白在1mL反应液中每分钟分解1 mol的H2O2的量为1个活性单位(U)。GST活性的测定采用CDNB法
[16]
,酶活力单位定义为:在25 ,pH
6 5,基质CDNB与GSH终浓度均为1mmol/L的条
件下,1min催化1 mol/LCDNB与GSH结合的GST酶量为1U。
1 3 5 GSH的测定 GSH采用DTNB法测定。1 3 6 MT的测定 MT采用隔/血红蛋白饱和法测定
[18]
[17]
;上述蛋白质含量均采用考马斯亮蓝试剂盒
测定(南京建成)。
1 4 数据处理方法 实验结果采用平均数#标准误(x#s d)表示,全部实验数据均采用SPSS15 0软件进行统计分析,各组间的显著性检验采用单因素方差分析,对照组与各剂量组的两两比较采用LSD法,抗氧化指标间的相关分析采用偏相关分析,绘图软件采用Sigmaplot10 0。
2 结 果
2 1 不同浓度的Cu对梨形环棱螺肝脏和鳃
SOD活性的影响
由图1A可知,螺肝脏的SOD活性表现出明显的时间剂量效应。暴露0 5d后各浓度组的SOD活性被显著诱导升高(p
0 01),其他剂量组则继续处于诱导状态。
图1B显示,螺鳃组织中的SOD活性变化和肝脏中的SOD变化相似,0 005和0 01剂量组在整个暴露实验中均处于诱导状态,0 02和0 05剂量组在暴露的前4天处于诱导状态,第5天时受到抑制。0 02剂量组酶活性随后回升,第7天和第10天时
酶活性均表现出极显著诱导效应(p
2 2 不同浓度Cu对梨形环棱螺肝脏和鳃CAT
酶活性的影响
图2A显示,肝脏CAT在暴露0 5d时活性被诱导升高,之后下降,在第1天时0 02剂量组被抑制,随后0 05和0 02剂量组活性上升,分别于第2天和第3天时达到最高(p0 05)外,其他各剂量组持续下降,在第5天均低于对照组,其中0 02剂量组被极显著抑制(p
2+
升高(p
在图2B中,鳃组织中的CAT在暴露的前3天,除0 02剂量组在第1天活性被极显著抑制(p
抑制(p0 05)。2 3 不同浓度Cu对梨形环棱螺肝脏和鳃GST
酶活性的影响
从图3A可见,不同剂量组对肝脏组织中的GST具有明显的诱导或抑制效应。0 01、0 02和0 05剂量组在暴露的前4天,GST活性均处于诱导状态,在第5天时均受到抑制,然后酶活性回升。0 01剂量组至第10天时处于极显著的诱导状态并维持这一水平(p
2+
在前5天均处于诱导状态,从第7天开始酶活性在对照组水平附近波动,但与对照组相比没有显著性差异。
在图3B中,鳃组织中的GST变化趋势与肝脏中的相似。各剂量组在暴露的前4天均处于诱导状态。而第5天时酶活性被极显著抑制(除了0 02剂量组差异不显著)(p
。
图3 Cu2+对梨形环棱螺肝脏(A)和鳃(B)中GST活性的影响
Fig 3 EffectsofCu2+onGSTactivitiesinliver(A)andgill(B)ofB purificata
2 4 不同浓度Cu对梨形环棱螺肝脏和鳃GSH
变化的影响
从图4A可见,不同剂量组对肝脏组织中的GSH具有明显效应。各剂量组在暴露的前5天GSH均处于诱导状态,在第7天时除0 02剂量组外均受到抑制,然后GSH含量回升,至第10天时已高于对照组,到14d时0 005、0 01和0 02剂量组仍处于诱导状态,而0 05剂量组则表现出抑制。
鳃组织中的GSH变化规律与肝脏中的相似(图4B)。各剂量组在暴露的前4天均处于诱导状态,而第5天时除0 02剂量组外均表现出抑制,但没有显著性差异,至第7天时,0 005、0 01和0 05剂量组仍表现出抑制,而0 02剂量组则显著地被诱导(p
2+
正常水平或略低于对照组,0 005剂量组则在第
14天时略高于对照组,而其他剂量组则表现出抑制。
2 5 不同浓度Cu对梨形环棱螺肝脏和鳃MT
的影响
图5的结果显示,肝脏(图A)和鳃(图B)组织中的MT在整个实验期间均处于诱导状态,各剂量组在0 5d被极显著地诱导(p
2+
3 讨 论
3 1 Cu胁迫对梨形环棱螺肝、鳃SOD和CAT
的协同诱导作用
SOD是一组金属酶,是生物体内清除活性氧自由基,使细胞免受氧化损伤的关键酶之一。SOD的生物学作用是催化超氧化物阴离子自由基歧化为H2O2和O2。CAT是血色素存在酶,作为生物机体的抗氧化酶,CAT能迅速分解H2O2,产生H2O和O2,它们的作用都是使机体免受氧自由基的攻击
2+2+
2+
[19]
2+
长,随着氧自由基的清除,其又迅速降至正常水平或略低于正常值。随着进入体内的Cu增多,产生大量的活性氧自由基,诱导SOD活性不断上升,从而导致H2O2升高。而CAT作为H2O2浓度的调节器,H2O2的升高,刺激体内CAT的表达释放和活力升高
[20]
2+
,加速分解H2O2。但随着暴露时间的进一步
延长,机体产生的大量氧自由基不能及时被清除,从而发生氧化损伤,在第5天时SOD和CAT活性开始下降甚至低于正常值以下。随后SOD和CAT活性的活性开始回升,此时可能是由于MT大量表达对自由基清除后所引起的变化。因MT富含巯基,具有清除自由基,抗脂质过氧化作用。Thornauey和Vasak
[21]
。
在Cu暴露过程中,在试验开始时,由于刚接触到Cu,而且时间短,进入机体的Cu含量极少,且此时的浓度不会产生显著的生物毒性。为了消除Cu胁迫的影响,机体应急诱导SOD和CAT的表达或其活力上升,以抵御外界氧化基团的入侵,因此组织中的SOD和CAT活性的显2+
用电子自旋公振(ESR)自旋标记技术证实
!
!-!
了MT可直接清除OH与O2,特别是清除OH的作用。另外,MT具有调节Cu储存、运输和代谢的2+
2+
722
[22]
水 生 生 物 学 报33卷
结构结合而产生自由基。于是SOD和CAT被修复或乃至重新合成,活性回升。基于上述分析,说明本实验中的0 005剂量组SOD和CAT酶活性增加不明显,0 01剂量组表现为显著的诱导效应,0 02mg/L剂量组酶活性在肝脏中表现为诱导而在鳃中则被抑制,0 05剂量组产生的自由基,因不能及时被清除,故而造成活性氧引起的氧化损伤。3 2 Cu胁迫对梨形环棱螺肝、鳃GSH系统的
影响
GSH是一种低分子氧自由基清除剂,它可清除O2!、H2O2、ROOH,是组织中重要的巯基短肽非蛋白质化合物,在解毒代谢中起着非常重要的作[23,24]用。GSH作为细胞抵抗氧化应激的主要抗氧化剂之一,不仅与GST催化功能的发挥直接有关,并且可清除氧自由基,对调节细胞内的氧化还原水平起着重要作用,所以细胞内GSH的含量调控GST的表达
[25]
2+
内被极显著的诱导(p
期比较短,于是MT的含量迅速下降,但机体仍处于诱导状态;随着暴露时间再度延长,进入体内的Cu继续增多,MT持续被诱导,其含量升高并出现一个峰值后,MT含量下降并保持稳定。MT在受到
2+
诱导后出现含量升高、降低的现象可能与Cu的储存、运输和代谢有关。Cu在体内各部位的分布不一样,进入体内的铜能在螺的体内重新分布。
[30]2+
Dallinger,etal 发现Cu在陆生蜗牛的软体组织中能大量累积,这与外套膜MT的Cu调节功能分不开。对本实验中的梨形环棱螺,其可能也有类似的调节机制,进入体内的Cu大量累积在除肝脏和鳃的其他组织中,因此,肝脏和鳃的MT含量受到一定的诱导后,其含量维持在较高水平而没有进一步增长。
2+
3 4 梨形环棱螺肝、鳃各抗氧化指标对Cu胁迫
的动态响应过程及其相互影响
Cu胁迫对梨形环棱螺抗氧化指标的影响表现为一个动态的变化过程,以往的研究中也出现类
[4,31]
似的结果。梨形环棱螺的鳃和肝组织的抗氧化酶活性变化有很大的差别,0 02剂量组在第14天时肝脏中的酶活性高于对照组而鳃中则低于对照
2+
组,这可能与Cu的储存、运输和代谢有关。研究表明不同浓度的Cu在不同组织中的浓缩系数是不一样的
[7,30]
2+
2+
2+
2+
2+
2+
。GST是生物体解毒系统%阶段重要的
酶。GST的主要作用是催化GSH的巯基攻击亲电子性物质的亲电子中心,产生一种硫醚连接的谷胱
甘肽结合物,以高亲合力结合胆红素、甾醇和其他亲脂性的物质;另外,某些GST具有GPx的活性,具有抑制脂质过氧化的作用。在活性氧的作用下,机体产生氧化应激,GST与其他抗氧化酶如SOD、GPx等在组织中协同表达而产生抗氧化效应
[27]
[26]
。在本
实验中,GST的变化与SOD的变化趋势总体上是一致的,这可能与这种协同表达有关。另外,GST的活性变化还可能与GSH密切相关。本实验中,GSH和GST的变化趋势十分相似。通常认为,GSH含量的增加可能代表了机体对污染物暴露的适应性反应,而GSH含量的降低则可能与细胞对污染物及其代谢物解毒能力的饱和效应有关,也可能是污染物暴露毒性效应的反应
2+
[29]
[28]
。作者认为梨形环棱螺暴露于Cu
2+
2+
2+
水体中,鳃丝直接同Cu接触,对Cu的吸收较
2+
大,由此说明0 02剂量组Cu对鳃丝抗氧化酶伤害和抑制较大。Cu可由鳃丝和消化道进入体内,通过循环系统到达肝脏,肝脏能将进入体内的毒物在肝脏内氧化、还原或水解,将毒物转化成为无毒、低毒易溶的代谢物排出体外,但如果高剂量长时间的暴露(0 05剂量组)导致进入体内的Cu超过肝脏的解毒极限时,则肝脏会受到损伤。机体抗氧化系统是一个复杂的系统,由非酶(抗氧化维生素、蛋白和非蛋白巯基)和抗氧化酶组成的抗氧化系统在机体抵抗氧化胁迫和消除自由基损伤时都发挥着非常重要的作用,并且某些抗氧化成分之间还相互影[19,32]响。本研究中CAT活性不仅受到SOD活性的影响,还受到GSH和MT含量的影响。对SOD、CAT、GSH和MT进行偏相关分析,在控制GSH和MT时,SOD和CAT之间的偏相关系数在肝脏(r=0 558,p=0 000)和鳃(r=0 666,p=0 000)中存在密切的相关关系。在控制MT时,GSH和GST之=0 0 2+
2+
。
3 3 Cu在梨形环棱螺体内分布的变化及对肝、
鳃MT的诱导作用
MT是一些低相对分子质量的、富含半胱氨酸和巯基、能够结合金属的蛋白或多肽。研究表明,MT具有调节微量元素(主要是Cu、Zn)储存、运输
[22]
和代谢的作用,对重金属具有解毒作用。MT具有很强的诱导性,当细胞内的Cu浓度增高时,可诱导MT合成。其诱导发生在转录水平,通过位于MT5& 端的金属调节因子实现。接触金属后,由于MT基因转录水平增加而引起MTmRNA迅速增加
[22]
2+
。本研究中,由于试验开始时的Cu暴露时
2+
4期张清顺等:铜对梨形环棱螺抗氧化酶活性和金属硫蛋白含量的影响 723
(r=0 655,p=0 000)中存在密切的相关关系,SOD和GST之间的偏相关系数在肝脏(r=0 806,p=0 000)和鳃(r=0 646,p=0 000)中存在密切的相关关系。Cu对梨形环棱螺的氧化损伤是一个综合的效应,其产生氧化应激后抗氧化系统启动,经历不同的暴露剂量和时间后产生损伤或修复。研究结果中各个指标反应灵敏而且相互间的相关性比较好,能有效的评价Cu对梨形环棱螺氧化损伤并作
2+
为Cu低浓度长期暴露的一种监测指标。参考文献:
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1997,
388:
EFFECTSOFCOPPERONANTIOXIDANTENZYMESACTIVITIESAND
METALLOTHIONEINCONCENTRATIONOFBELLAMYAPURIFICATA
ZHANGQing Shun,HOUJian Jun,LIUXiang Jiang,LUOJie Xuan,
andXIONGBang Xi
(CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan 430070,China)
Abstract:Anexpermientwasconductedtostudytheeffectsofcopper(Cu)ontheantioxidantenzymesactivitiesoftheBellamyapurificat,suchassuperoxidedismatase(SOD),catalase(CAT),glutathioneS transferase(GST),concentra tionsofglutathione(GSH)andmetallothionein(MT)atdifferentconcentrationsofCucationofCu
2+
2+
2+
(0,0 005,0 01,0 02and
0 05mg/L)anddifferentexposuretmies(0 14d) Inordertoevaluatethemechanismsofoxidativestressanddamnifi
onB purificat,gillsandliverswerechosentoanalysethebiochemicalresponses,becausetheseorgans
2+
werebroughtintocontactwithenvironmentalpollutantsnearly TheresultsshowedthatCuhadsignificantinfluenceon
theactivitiesofSOD,CAT,GSTandtheconcentrationsofGSH,MTinbothgillsandliversofB purificat,andsucheffectsaresignificantlyrelatedtoincreasedexposuretmieanddosage TheantioxidantenzymesactivitiesingillsandliverscouldbemarkedlyactivatedatthebeginningdaysofCu2+exposure,suchasSODin4d,CATin3d,andGSTin4dafterexposure TheactivitiesofSOD,CATandGSTdecreasedwiththeincreaseofexposuretmie,tilltheywereinclinedtobeinhibitedinthe5d Onthelastdayofexposure,theantioxidantenzymesactivitiesintreatmentswith0 005mg/LofCuapproachedtothenormalvalue,in0 05mg/LofCu
2+
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wereinhibited,andin0 01mg/LofCu
2+
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wereinduced Theac
tivitiesofenzymesintreatmentswith0 02mg/LofCutrationsinliverswereinducedafter5 day CutinuousCu
2+
2+
wasactivatedinliverandreversedingill ChangesofGSHin
exposurebeganinseveraldays GSHconcen
2+
liversandgillsconsistedwiththatofGST,whichwasenhancedwhenCu
exposure,whichingillswereinducedafter4 day Cuexposure GSH
contentsincreasedinlowdosage(0 005mg/L)groupanddecreasedinhighdosage(0 05mg/L)groupalongwithcon
exposure TheMTs(concentrationofmetallothionein)inliversandgillsofB purificatawereinducedduring
2+
inn(p
4期张清顺等:铜对梨形环棱螺抗氧化酶活性和金属硫蛋白含量的影响 725
slightlylater,thenincreasedagain,thereafter,reachedtoapeakvalue,andthendecreasedtoastablelevelonthe14datlast MTinliversintreatmentswith0 01mg/LofCu
2+
wasextremelysignificantlyinducedduringthewholeprocess
(p
2+
2+
and
couldbeusedasbiomarkerstoevaluatetheaquaticenvironmentCu
2+
2+
pollutionanditsecologicalrisk
Keywords:Cu;Superoxidedismatase;Catalase;GlutathioneS transferase;Glutathione;Metallothionein;Bellamyapurifi cata
第33卷第4期2009年7月
水生生物学报
ACTAHYDROBIOLOGICASINICA
Vol 33,No 4Jul ,200 9
DOI号:10 3724/SP J 0000 2009 40717
铜对梨形环棱螺抗氧化酶活性和金属硫蛋白含量的影响
张清顺 侯建军 刘香江 罗洁璇 熊邦喜
(华中农业大学水产学院,武汉 430070)
摘要:本实验采用暴露重金属的方法,研究了不同浓度硫酸铜(Cu2+分别为0、0 005、0 01、0 02、0 05mg/L)在不同暴露时间(0 14d)下对梨形环棱螺(Bellamyapurificata)过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)的活性、还原性谷胱甘肽(GSH)和金属硫蛋白(MT)含量的影响,以探讨Cu2+对梨形环棱螺的氧化损伤及其防御作用的机理,并为水环境Cu2+污染的早期诊断及生态风险评价提供科学的依据。结果表明:Cu2+对梨形环棱螺肝脏和鳃中CAT、SOD、GST、GSH和MT均有明显影响,表现出时间剂量效应。SOD在前4天、CAT在前3天酶活性总体上表现出诱导趋势,GST在前4天酶活性处于诱导状态,随着暴露时间的延长,酶活性下降,到第5天时表现出抑制趋势;随着时间的进一步增长,至14d时,0 005mg/L剂量组酶活性维持在正常值附近波动,0 01mg/L剂量组酶活性被诱导,0 02mg/L剂量组酶活性在肝脏中表现为诱导而在鳃中则被抑制,0 05mg/L剂量组酶活性被抑制。肝脏和鳃GSH含量的变化与GST相似,在短时间内表现出诱导效应,肝脏GSH在暴露的前5天、鳃GSH在暴露的前4天均处于诱导状态,随着暴露时间的延长,0 005mg/L剂量组表现出诱导,0 05mg/L剂量组则受到抑制。MT在整个实验期间均处于诱导状态,各剂量组在0 5d被极显著诱导,随后MT含量出现起伏波动,有上升和下降,至第14天时达到一稳定水平。其中,0 01mg/L剂量组肝脏的MT在整个实验期间均被极显著地诱导(p
关键词:Cu2+;超氧化物歧化酶;过氧化氢酶;谷胱甘肽硫转移酶;谷胱甘肽;金属硫蛋白;梨形环棱螺中图分类号:Q494 文献标识码:A 文章编号:1000 3207(2009)04 0717 09
铜(Copper,Cu)是生物体内代谢的必需微量元素之一,是细胞色素c氧化酶、超氧化物歧化酶(Su
peroxidedismatase,SOD)、金属硫蛋白(Metallothio nein,MT)等酶或蛋白中的重要金属离子,在机体代谢中有着重要的作用。同时,铜又是有毒重金属元素,其浓度超过一定限度时,就会对水生生物产生一定的毒害作用。重金属离子污染对水生生物的毒性作用机制之一是其造成生物体内的过氧化胁迫,过量的重金属离子能导致体内产生大量的活性氧自由基(Reactiveoxygenspecies,ROS),这些活性氧又可使DNA断裂、酶蛋白失活等,从而引起机体的氧化应激,造成生物大分子和膜脂质过氧化,对机体诱发多种损害
[3,4][1,2]
体抗氧化防御系统中的一些成分会改变,如SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化酶(GPx)等可被诱导,从而使
[2,5]
机体免受氧化伤害。因而,这些生物标志物的活性变化间接反映了环境中氧化应激的存在,可作为环境污染胁迫的指标
[6,7]
[3]
。
目前关于重金属对软体动物毒理效应的研究以贝类为多,就重金属对腹足动物毒理效应的研
[8 12]
究主要集中在重金属的蓄积方面。关于腹足动物重金属毒理效应生物标志物的相关研究则鲜有报道。环棱螺在我国分布广泛,它们多生活在河流、池塘、湖泊等水体,是大型底栖生物的重要组成部
[13]
分,在水生态系统中起着重要的作用。我们在预实验中发现梨形环棱螺(BellamyapurificataHeude)对Cu敏感,因此选用梨形环棱螺为材料,采用暴露实验方法,研究了不同浓度Cu对梨形环棱螺肝
2+
2+
。在长期进化中,需氧生物发
展了防御过氧化损害的酶系统。在生理状态下,由代谢产生的活性氧可为抗氧化防御系统所控制,机
收稿日期:2007 11 12;修订日期:2009 02 26基金项目:国家自然科学基金(No 30470342)
作者简介:张清顺(1982 ),男,湖北省咸宁市人;硕士研究生;从事养殖环境和水生毒理学研究通讯作者:熊邦喜,教授,博士生导师;Te:l027 87283018;E mai:lbangxix8@mail hzau edu cn
脏、鳃中抗氧化指标(SOD、CAT、GST和GSH)的影响和MT的解毒效应,进一步探讨重金属对腹足动物的氧化损伤及其防御作用的机理,并为水环境重金属污染的早期诊断及生态风险评价提供科学的依据。
置于2 0mL离心管内,液氮速冻后于-80 冰箱中保存备测。
1 3 3 酶样的制备 取肝、鳃组织约0 1 0 2g,以1∃20(w/v)的比例加入预冷的0 01mol/LpH7 2磷酸盐缓冲液,冰水浴中低速匀浆,4 下离心(16000r/min,10min),取上清液,即为组织酶提取液。
1 3 4 抗氧化酶活性的测定 SOD活性的测定采用NBT法
[14]
1 材料与方法
1 1 实验材料 实验动物梨形环棱螺采集于武汉市南湖,在实验室进行培养。养殖池温度保持在20 25 ,pH控制在7 5左右。每天交替投喂新鲜的植物叶子和配合饲料。
1 2 主要仪器和试剂 主要实验仪器设备包括:TAS 990型原子吸收分光光度计(北京普析)、紫外可见分光光度计(美国Thermo公司)、高速冷冻离心机(美国Sigma公司)、DIAX900微量匀浆机(德国Heidolph公司)等。CuSO4!5H2O(AR)、GSH、NBT、EDTA、Tris、 巯基乙醇、蔗糖(Amresco公司生产)、L Met、DTNB、核黄素(Sigma公司生产)、Cd标准储备液(购自国标中心)外,其余均为国产分析纯。1 3 实验方法
1 3 1 试验质量浓度的设置及分组 首先对梨形环棱螺进行了96h的急性毒性实验,用寇氏(Kor bor)法计算出Cu对梨形环棱螺在96h的LC50及其95%致信区间分别为0 382(0 314 0 464)mg/L,其安全浓度为0 038mg/L。因本研究旨在探讨
2+
低剂量Cu在较长时间暴露时对梨形环棱螺的影响,在预实验的基础上,保证试验中受试动物不死亡的前提条件,并结合渔业水质标准,来确定本实验中的Cu浓度,实验组设置如下:对照组,铜暴露组分别为0 005、0 01、0 02、0 05mg/L4个组,以下简称0 005、0 01、0 02、0 05剂量组。挑选比较活跃、体重在1 5g左右的动物进行实验。1 3 2 毒性暴露实验 实验在38cm∀28cm∀15cm的水箱内进行。温度为(24#1) ,自然光照,各梯度分别放1 4 1 6g健康、活动性强的梨形环棱螺50只,将实验螺进行不同离子浓度不同时间的毒性暴露,每个浓度梯度分别设置3个平行的水族箱。实验期间的管理与饲养期间一致,隔天换水一次,每次换水一半,换水时分别加入含有与毒性暴露重金属离子浓度一致的曝气自来水。实验开始后分别于0 5、1、2、3、4、5、7、10、14d取样,每个梯度各水族箱随机选取5只实验螺,用纱布擦干螺的体表,,
2+
2+
,酶活力单位定义为:每毫克组织蛋白
在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的
SOD量为1个活性单位(U)。CAT活性的测定采用紫外分光光度法
[15]
,酶活力单位定义为:每毫克
组织蛋白在1mL反应液中每分钟分解1 mol的H2O2的量为1个活性单位(U)。GST活性的测定采用CDNB法
[16]
,酶活力单位定义为:在25 ,pH
6 5,基质CDNB与GSH终浓度均为1mmol/L的条
件下,1min催化1 mol/LCDNB与GSH结合的GST酶量为1U。
1 3 5 GSH的测定 GSH采用DTNB法测定。1 3 6 MT的测定 MT采用隔/血红蛋白饱和法测定
[18]
[17]
;上述蛋白质含量均采用考马斯亮蓝试剂盒
测定(南京建成)。
1 4 数据处理方法 实验结果采用平均数#标准误(x#s d)表示,全部实验数据均采用SPSS15 0软件进行统计分析,各组间的显著性检验采用单因素方差分析,对照组与各剂量组的两两比较采用LSD法,抗氧化指标间的相关分析采用偏相关分析,绘图软件采用Sigmaplot10 0。
2 结 果
2 1 不同浓度的Cu对梨形环棱螺肝脏和鳃
SOD活性的影响
由图1A可知,螺肝脏的SOD活性表现出明显的时间剂量效应。暴露0 5d后各浓度组的SOD活性被显著诱导升高(p
0 01),其他剂量组则继续处于诱导状态。
图1B显示,螺鳃组织中的SOD活性变化和肝脏中的SOD变化相似,0 005和0 01剂量组在整个暴露实验中均处于诱导状态,0 02和0 05剂量组在暴露的前4天处于诱导状态,第5天时受到抑制。0 02剂量组酶活性随后回升,第7天和第10天时
酶活性均表现出极显著诱导效应(p
2 2 不同浓度Cu对梨形环棱螺肝脏和鳃CAT
酶活性的影响
图2A显示,肝脏CAT在暴露0 5d时活性被诱导升高,之后下降,在第1天时0 02剂量组被抑制,随后0 05和0 02剂量组活性上升,分别于第2天和第3天时达到最高(p0 05)外,其他各剂量组持续下降,在第5天均低于对照组,其中0 02剂量组被极显著抑制(p
2+
升高(p
在图2B中,鳃组织中的CAT在暴露的前3天,除0 02剂量组在第1天活性被极显著抑制(p
抑制(p0 05)。2 3 不同浓度Cu对梨形环棱螺肝脏和鳃GST
酶活性的影响
从图3A可见,不同剂量组对肝脏组织中的GST具有明显的诱导或抑制效应。0 01、0 02和0 05剂量组在暴露的前4天,GST活性均处于诱导状态,在第5天时均受到抑制,然后酶活性回升。0 01剂量组至第10天时处于极显著的诱导状态并维持这一水平(p
2+
在前5天均处于诱导状态,从第7天开始酶活性在对照组水平附近波动,但与对照组相比没有显著性差异。
在图3B中,鳃组织中的GST变化趋势与肝脏中的相似。各剂量组在暴露的前4天均处于诱导状态。而第5天时酶活性被极显著抑制(除了0 02剂量组差异不显著)(p
。
图3 Cu2+对梨形环棱螺肝脏(A)和鳃(B)中GST活性的影响
Fig 3 EffectsofCu2+onGSTactivitiesinliver(A)andgill(B)ofB purificata
2 4 不同浓度Cu对梨形环棱螺肝脏和鳃GSH
变化的影响
从图4A可见,不同剂量组对肝脏组织中的GSH具有明显效应。各剂量组在暴露的前5天GSH均处于诱导状态,在第7天时除0 02剂量组外均受到抑制,然后GSH含量回升,至第10天时已高于对照组,到14d时0 005、0 01和0 02剂量组仍处于诱导状态,而0 05剂量组则表现出抑制。
鳃组织中的GSH变化规律与肝脏中的相似(图4B)。各剂量组在暴露的前4天均处于诱导状态,而第5天时除0 02剂量组外均表现出抑制,但没有显著性差异,至第7天时,0 005、0 01和0 05剂量组仍表现出抑制,而0 02剂量组则显著地被诱导(p
2+
正常水平或略低于对照组,0 005剂量组则在第
14天时略高于对照组,而其他剂量组则表现出抑制。
2 5 不同浓度Cu对梨形环棱螺肝脏和鳃MT
的影响
图5的结果显示,肝脏(图A)和鳃(图B)组织中的MT在整个实验期间均处于诱导状态,各剂量组在0 5d被极显著地诱导(p
2+
3 讨 论
3 1 Cu胁迫对梨形环棱螺肝、鳃SOD和CAT
的协同诱导作用
SOD是一组金属酶,是生物体内清除活性氧自由基,使细胞免受氧化损伤的关键酶之一。SOD的生物学作用是催化超氧化物阴离子自由基歧化为H2O2和O2。CAT是血色素存在酶,作为生物机体的抗氧化酶,CAT能迅速分解H2O2,产生H2O和O2,它们的作用都是使机体免受氧自由基的攻击
2+2+
2+
[19]
2+
长,随着氧自由基的清除,其又迅速降至正常水平或略低于正常值。随着进入体内的Cu增多,产生大量的活性氧自由基,诱导SOD活性不断上升,从而导致H2O2升高。而CAT作为H2O2浓度的调节器,H2O2的升高,刺激体内CAT的表达释放和活力升高
[20]
2+
,加速分解H2O2。但随着暴露时间的进一步
延长,机体产生的大量氧自由基不能及时被清除,从而发生氧化损伤,在第5天时SOD和CAT活性开始下降甚至低于正常值以下。随后SOD和CAT活性的活性开始回升,此时可能是由于MT大量表达对自由基清除后所引起的变化。因MT富含巯基,具有清除自由基,抗脂质过氧化作用。Thornauey和Vasak
[21]
。
在Cu暴露过程中,在试验开始时,由于刚接触到Cu,而且时间短,进入机体的Cu含量极少,且此时的浓度不会产生显著的生物毒性。为了消除Cu胁迫的影响,机体应急诱导SOD和CAT的表达或其活力上升,以抵御外界氧化基团的入侵,因此组织中的SOD和CAT活性的显2+
用电子自旋公振(ESR)自旋标记技术证实
!
!-!
了MT可直接清除OH与O2,特别是清除OH的作用。另外,MT具有调节Cu储存、运输和代谢的2+
2+
722
[22]
水 生 生 物 学 报33卷
结构结合而产生自由基。于是SOD和CAT被修复或乃至重新合成,活性回升。基于上述分析,说明本实验中的0 005剂量组SOD和CAT酶活性增加不明显,0 01剂量组表现为显著的诱导效应,0 02mg/L剂量组酶活性在肝脏中表现为诱导而在鳃中则被抑制,0 05剂量组产生的自由基,因不能及时被清除,故而造成活性氧引起的氧化损伤。3 2 Cu胁迫对梨形环棱螺肝、鳃GSH系统的
影响
GSH是一种低分子氧自由基清除剂,它可清除O2!、H2O2、ROOH,是组织中重要的巯基短肽非蛋白质化合物,在解毒代谢中起着非常重要的作[23,24]用。GSH作为细胞抵抗氧化应激的主要抗氧化剂之一,不仅与GST催化功能的发挥直接有关,并且可清除氧自由基,对调节细胞内的氧化还原水平起着重要作用,所以细胞内GSH的含量调控GST的表达
[25]
2+
内被极显著的诱导(p
期比较短,于是MT的含量迅速下降,但机体仍处于诱导状态;随着暴露时间再度延长,进入体内的Cu继续增多,MT持续被诱导,其含量升高并出现一个峰值后,MT含量下降并保持稳定。MT在受到
2+
诱导后出现含量升高、降低的现象可能与Cu的储存、运输和代谢有关。Cu在体内各部位的分布不一样,进入体内的铜能在螺的体内重新分布。
[30]2+
Dallinger,etal 发现Cu在陆生蜗牛的软体组织中能大量累积,这与外套膜MT的Cu调节功能分不开。对本实验中的梨形环棱螺,其可能也有类似的调节机制,进入体内的Cu大量累积在除肝脏和鳃的其他组织中,因此,肝脏和鳃的MT含量受到一定的诱导后,其含量维持在较高水平而没有进一步增长。
2+
3 4 梨形环棱螺肝、鳃各抗氧化指标对Cu胁迫
的动态响应过程及其相互影响
Cu胁迫对梨形环棱螺抗氧化指标的影响表现为一个动态的变化过程,以往的研究中也出现类
[4,31]
似的结果。梨形环棱螺的鳃和肝组织的抗氧化酶活性变化有很大的差别,0 02剂量组在第14天时肝脏中的酶活性高于对照组而鳃中则低于对照
2+
组,这可能与Cu的储存、运输和代谢有关。研究表明不同浓度的Cu在不同组织中的浓缩系数是不一样的
[7,30]
2+
2+
2+
2+
2+
2+
。GST是生物体解毒系统%阶段重要的
酶。GST的主要作用是催化GSH的巯基攻击亲电子性物质的亲电子中心,产生一种硫醚连接的谷胱
甘肽结合物,以高亲合力结合胆红素、甾醇和其他亲脂性的物质;另外,某些GST具有GPx的活性,具有抑制脂质过氧化的作用。在活性氧的作用下,机体产生氧化应激,GST与其他抗氧化酶如SOD、GPx等在组织中协同表达而产生抗氧化效应
[27]
[26]
。在本
实验中,GST的变化与SOD的变化趋势总体上是一致的,这可能与这种协同表达有关。另外,GST的活性变化还可能与GSH密切相关。本实验中,GSH和GST的变化趋势十分相似。通常认为,GSH含量的增加可能代表了机体对污染物暴露的适应性反应,而GSH含量的降低则可能与细胞对污染物及其代谢物解毒能力的饱和效应有关,也可能是污染物暴露毒性效应的反应
2+
[29]
[28]
。作者认为梨形环棱螺暴露于Cu
2+
2+
2+
水体中,鳃丝直接同Cu接触,对Cu的吸收较
2+
大,由此说明0 02剂量组Cu对鳃丝抗氧化酶伤害和抑制较大。Cu可由鳃丝和消化道进入体内,通过循环系统到达肝脏,肝脏能将进入体内的毒物在肝脏内氧化、还原或水解,将毒物转化成为无毒、低毒易溶的代谢物排出体外,但如果高剂量长时间的暴露(0 05剂量组)导致进入体内的Cu超过肝脏的解毒极限时,则肝脏会受到损伤。机体抗氧化系统是一个复杂的系统,由非酶(抗氧化维生素、蛋白和非蛋白巯基)和抗氧化酶组成的抗氧化系统在机体抵抗氧化胁迫和消除自由基损伤时都发挥着非常重要的作用,并且某些抗氧化成分之间还相互影[19,32]响。本研究中CAT活性不仅受到SOD活性的影响,还受到GSH和MT含量的影响。对SOD、CAT、GSH和MT进行偏相关分析,在控制GSH和MT时,SOD和CAT之间的偏相关系数在肝脏(r=0 558,p=0 000)和鳃(r=0 666,p=0 000)中存在密切的相关关系。在控制MT时,GSH和GST之=0 0 2+
2+
。
3 3 Cu在梨形环棱螺体内分布的变化及对肝、
鳃MT的诱导作用
MT是一些低相对分子质量的、富含半胱氨酸和巯基、能够结合金属的蛋白或多肽。研究表明,MT具有调节微量元素(主要是Cu、Zn)储存、运输
[22]
和代谢的作用,对重金属具有解毒作用。MT具有很强的诱导性,当细胞内的Cu浓度增高时,可诱导MT合成。其诱导发生在转录水平,通过位于MT5& 端的金属调节因子实现。接触金属后,由于MT基因转录水平增加而引起MTmRNA迅速增加
[22]
2+
。本研究中,由于试验开始时的Cu暴露时
2+
4期张清顺等:铜对梨形环棱螺抗氧化酶活性和金属硫蛋白含量的影响 723
(r=0 655,p=0 000)中存在密切的相关关系,SOD和GST之间的偏相关系数在肝脏(r=0 806,p=0 000)和鳃(r=0 646,p=0 000)中存在密切的相关关系。Cu对梨形环棱螺的氧化损伤是一个综合的效应,其产生氧化应激后抗氧化系统启动,经历不同的暴露剂量和时间后产生损伤或修复。研究结果中各个指标反应灵敏而且相互间的相关性比较好,能有效的评价Cu对梨形环棱螺氧化损伤并作
2+
为Cu低浓度长期暴露的一种监测指标。参考文献:
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1997,
388:
EFFECTSOFCOPPERONANTIOXIDANTENZYMESACTIVITIESAND
METALLOTHIONEINCONCENTRATIONOFBELLAMYAPURIFICATA
ZHANGQing Shun,HOUJian Jun,LIUXiang Jiang,LUOJie Xuan,
andXIONGBang Xi
(CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan 430070,China)
Abstract:Anexpermientwasconductedtostudytheeffectsofcopper(Cu)ontheantioxidantenzymesactivitiesoftheBellamyapurificat,suchassuperoxidedismatase(SOD),catalase(CAT),glutathioneS transferase(GST),concentra tionsofglutathione(GSH)andmetallothionein(MT)atdifferentconcentrationsofCucationofCu
2+
2+
2+
(0,0 005,0 01,0 02and
0 05mg/L)anddifferentexposuretmies(0 14d) Inordertoevaluatethemechanismsofoxidativestressanddamnifi
onB purificat,gillsandliverswerechosentoanalysethebiochemicalresponses,becausetheseorgans
2+
werebroughtintocontactwithenvironmentalpollutantsnearly TheresultsshowedthatCuhadsignificantinfluenceon
theactivitiesofSOD,CAT,GSTandtheconcentrationsofGSH,MTinbothgillsandliversofB purificat,andsucheffectsaresignificantlyrelatedtoincreasedexposuretmieanddosage TheantioxidantenzymesactivitiesingillsandliverscouldbemarkedlyactivatedatthebeginningdaysofCu2+exposure,suchasSODin4d,CATin3d,andGSTin4dafterexposure TheactivitiesofSOD,CATandGSTdecreasedwiththeincreaseofexposuretmie,tilltheywereinclinedtobeinhibitedinthe5d Onthelastdayofexposure,theantioxidantenzymesactivitiesintreatmentswith0 005mg/LofCuapproachedtothenormalvalue,in0 05mg/LofCu
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2+
wereinhibited,andin0 01mg/LofCu
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2+
2+
wereinduced Theac
tivitiesofenzymesintreatmentswith0 02mg/LofCutrationsinliverswereinducedafter5 day CutinuousCu
2+
2+
wasactivatedinliverandreversedingill ChangesofGSHin
exposurebeganinseveraldays GSHconcen
2+
liversandgillsconsistedwiththatofGST,whichwasenhancedwhenCu
exposure,whichingillswereinducedafter4 day Cuexposure GSH
contentsincreasedinlowdosage(0 005mg/L)groupanddecreasedinhighdosage(0 05mg/L)groupalongwithcon
exposure TheMTs(concentrationofmetallothionein)inliversandgillsofB purificatawereinducedduring
2+
inn(p
4期张清顺等:铜对梨形环棱螺抗氧化酶活性和金属硫蛋白含量的影响 725
slightlylater,thenincreasedagain,thereafter,reachedtoapeakvalue,andthendecreasedtoastablelevelonthe14datlast MTinliversintreatmentswith0 01mg/LofCu
2+
wasextremelysignificantlyinducedduringthewholeprocess
(p
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and
couldbeusedasbiomarkerstoevaluatetheaquaticenvironmentCu
2+
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pollutionanditsecologicalrisk
Keywords:Cu;Superoxidedismatase;Catalase;GlutathioneS transferase;Glutathione;Metallothionein;Bellamyapurifi cata