目 录
1. 显微镜基础知识………………………………………………………….1
1.1 显微镜成像原理………………………………………………………..1
1.2 显微镜总放大率……………………………………………………….1
1.3 显微镜的有效放大率…………………………………………………..1
1.4 显微镜鉴别率…………………………………………………………1
1.5 显微镜的景深…………………………………………………………2
1.6 光学系统的成象缺陷(象差) ……………………………………………2
z 球差……………………………………………………………..2 z 彗差……………………………………………………………..3 z 象散……………………………………………………………..3 z 场曲……………………………………………………………..4 z 畸变……………………………………………………………..4 z 位置色差…………………………………………………………4 z 放大色差…………………………………………………………5
2. 显微镜主要部件………………………………………………………….5 2.1物镜…………………………………………………………………... 5
2.2目镜……………………………………………………………………9
2.3双目(或叁)目镜筒……………………………………………………..10
2.4 支架组………………………………………………………………..11
2.5 粗微调焦装置………………………………………………………....12
2.6 机械工作台…………………………………………………………...12
2.7 照明系统………………………………………………………….….12
3. 显微镜的使用…………………………………………………………...14
3.1 对工作环境的要求…………………………………………………….14
3.2 操作步骤………………………………………………………….….14
3.3 光学系统的清洁……………………………………………………....15
3.4 图像欠佳原因分析…………………………………………………….17
4. 几种特殊的观察法……………………………………………………...18
4.1 暗场观察法…………………………………………………………...18
4.2 相衬观察法…………………………………………………………...20
4.3 偏光观察法…………………………………………………………...23
4.4 微分干涉相衬观察法…………………………………………………..27
4.5 荧光观察法…………………………………………………………...28
4.6 调制对比观察法………………………………………………………34
5. 产品介绍………………………………………………………………….36
5.1 BME…………………………………………………………………...36
5.2 DME…………………………………………………………………...39
5.3 DMLS………………………………………………………………….43
显微镜基础知识
显微镜成像原理
显微镜的光学成象系统由两部分组成,靠近物体部分的透镜组称
为物镜;靠近眼睛的透镜组称为目镜。物镜组把物体成象在目镜前焦
面上,形成一个放大倒立的实象,它称之为中间象,然后由目镜组再次
放大供目视观察。
图中：
1. 物体 2. 物镜 3. 中间像
4. 目镜 5. 眼睛
显微镜总放大率：
M =β×γ
式中：
M：显微镜总放大率
β：物镜放大率
γ：目镜放大率
即,显微镜总放大率=物镜放大率×目镜放大率
显微镜鉴别率σ
显微镜鉴别率是指刚能分开物平面两点的最小距离,则
σ=0.61λ/A
式中：
λ： 光波波长 （通常λ=0.00055mm）
A ： 物镜数值孔径NA
可见 ,鉴别率取决于物镜的数值孔径。 物镜
鉴别率
4/0.10 3.36μ 10/0.25 1.34μ 40/0.65 0.52μ 100/1.25 0.27μ
显微镜的有效放大率 M有效
500A≤M 有效≤1000A
满足此式的放大率就称有效放大率。
若总放大率M1000A,说明无效放大,原来看不清的细节,过分放大后。还是看不清。
成为彩色的弥散斑,使象模糊。
它在消色差物镜基础上,还校正了象散和场曲,象面平坦。清晰范围不低于90%。物镜外壳 刻有PL 或PLAN 字样。徕卡的产品目录中,N PLAN物镜就属于此类物镜。
3．平视场复消色差物镜
它在平视场消色差物镜的基础上,还对第三种色光校正了位置色差,这种物镜成象质量最佳,其数值孔径也较同倍率物镜大。因此,鉴别率也最高。物镜外壳刻有Planapo 字样,徕卡产品目录中PLAPO 就是此类物镜。
4．半平视场消色差物镜
这类物镜的清晰范围介于消色差物镜与平视场消色差物镜之间,但明显优于消色差物镜。接近平视场消色差物镜。其外壳常刻有SP(Semi.plan)字样。徕卡产品的目录中C PLAN的中,高倍物镜属于此类。
目前的趋势似乎很多厂商不认可这种分类。把他们并入消色差物镜中,作为新颖的或优化的消色差物镜如：徕卡CME 中, AchroE2就是此类物镜。
5.平视场半复消色差物镜
色差的校正程度介于平视场消色差物镜与平视场复消色差物镜之间。但较近于平视场复消色差物镜。徕卡产品目录中的PL Fluotar 就是这类物镜。
按筒长分类
1．筒长有限远
物镜的共轭距离(物到象的距离)为195mm,物镜的机械筒长(物镜螺纹端面到目镜支承面)为160mm。徕卡产品中BME,CME 采用此类物镜。
2．筒长无限远
物镜把物体成象于无限远, 因此, 必须要有镜筒透镜将无限远的光线聚焦到目镜焦面上才能观察。徕卡产品中DME,DMLS,DMLB… 等均采用此类物镜。
此类物镜的突出优点是,在物镜与镜筒透镜之间可方便地插入各种附件,而不会引起成象位置的变化。
物镜外壳的标记
40/0.65 40： 有限远物镜,放大率为40倍 160/0.17 0.65：数值孔径NA
160： 机械筒长160mm
0.17：盖玻璃厚度
N PLAN 40x/0.65 N PLAN：平视场消色差
∞/0.17 40x： 无限远物镜,放大率为40倍 0.65: 数值孔径NA
∞: 筒长无限远
0.17: 竖玻璃厚度
C PLAN 63x/0.75 C PLAN: 半平视场消色差物镜
∞/0.17 63 x: 无限远物镜,放大率为63倍
N PLAN5x/0.12 N PLAN: 平视场消色差物镜
∞/— 5 x: 无限远物镜,放大率为5倍
0.12: 数值孔径NA
—: 对有无盖玻片无要求
PLAPO 100x/0.95 PLAPO: 平视场复消色差物镜
∞/0 100x: 无限远物镜,放大率为100倍 0.95: 数值孔径NA
O: 无盖玻璃
放大 1
率
颜色 ～1.25 黑 灰 1.6 ～2 2.5 ～3.2 4 ～5 橙 6.3 ～8 10 ～12.5 黄 淡绿 深绿淡蓝 深蓝 白 16 25 40 63 100, ～20 ～32～50 ～80 125,160棕 红
盖玻璃厚度对成象质量的影响
当物镜的数值孔径大于0.65时,盖玻璃厚度误差对于物镜的成象质量影响十分明显。设计时,盖玻璃厚度采用标准值0.17mm。用高倍率物镜观察时,盖玻璃片厚度误差最好控制在+/-0.01mm 之内。
下图为普通带有玻璃片的物镜在两种情况下观察的结果
有盖玻片时的图像 无盖玻片时的图像
z 目镜
按放大色差校正状况可分为消放大色差目镜和补偿目镜。补偿目镜放大色差为1～1.5%。以补偿物镜残留的放大色差。通常,补偿目镜的视场光阑四周带特有的黄色。 对于筒长有限远的物镜,常与补偿目镜配合使用，如：徕卡BME 等。
对于筒长无限远的物镜,若镜筒透镜具有补偿放大色差功能的,则与普通目镜配合使用，如：徕卡DMLS,DMLB…。若镜筒透镜无补偿色差功能的。则必须与补偿目镜配合使用，如：徕卡DME。
按目镜视场数可分为：非广角目镜,广角目镜,超广角目镜等。 对于10 X目镜而言,
视场数20, 常称为超广角目镜。
目镜外壳标记 10X/20 10： 放大率 20: 视场数
各类目镜
z 双目(或叁)目镜筒
按机械结构可分为滑板式双目镜筒和铰链式双目镜筒。 1． 滑板式双目镜筒
优点: 用偏光观察时,改变瞳距不会产生光线或明或暗的变化。
缺点: 改变瞳距时,左,右目镜管的刻度值必须与瞳距值相等,否则会破坏显微镜的齐焦。徕卡的BME,CME 采用此类镜筒。
铰链式双目镜筒
优点: 改变瞳距时,显微镜的齐焦性能不变
缺点: 若用于偏光观察,分光膜必须具有消偏振性能。
按目镜的倾斜角可分为30°,45°及符合人机工程学倾斜角可变的双目镜筒。
倾角30°的双目镜筒 倾角0°～35°可变的双目镜筒
徕卡DME,DMLS,DMLB 等采用此类镜筒。 无论哪一种双目镜筒都必须满足下列要求 － 由两个目镜射出的光轴必须平行。 通常认为,发散度
会聚度
但徕卡的产品远远小于上述数值。 － 左右视场不允许明显的颜色差。 － 左右视场不允许明显的亮度差。 － 左右视场不允许明显的象偏转。 － 左右两系统放大率差≤2%。
叁目镜筒仅仅用转向分光镜代替转向棱镜,以便引出一条光路连接照相及CCD 等附件
z 支架组
支架组由支架,粗微调焦,机械工作台,转换器及照明系统构成,见下图：
支架是整个显微镜的基座,所有组件都要安装其中,它必须有足够的刚性,不致因组件过多而引起变形。支架加工精度必须严格保证,确保各组件间相互关系满足预定的要求。 徕卡的所有显微镜,无论低档,中档还是高档显微镜,支架一体化是其与众不同的特点,体现了先进的设计思想和高精度的机械加工完美结合。
定量的扭力矩控制,不会出现时松时紧不良现象。
z 照明系统
位于工作台下方的透镜组称为聚光镜,位于灯泡附近的透镜组称为集光镜。由聚光镜,反光镜及集光镜等构成了显微镜照明系统。 1．聚光镜:
聚光镜的作用是将光源发出的光线形成一束与物镜数值孔径相适应的光束,均匀地照明标本片。
由于各个物镜的数值孔径不同,要求照明光束的孔径角也相应的变化,因此,聚光镜中必定有一个能连续改变照明孔径角的可变光阑,此光阑称为可变孔径光阑。
z 粗微调焦装置
粗微调采用钢珠行星式结构,再配上硬度,光洁度出众的三角等轨和钢珠滑板,使调焦具有较高的灵敏度且有永不下滑的自锁功能。
z 机械工作台
工作台台面平面性好,利用同轴手轮可作X,Y 向移动,传动平稳舒适。手轮的长短充分考虑的人机工程的需要。凡是传动手轮应有
可变孔径光阑的功能及正确使用：
可变孔径光阑的大小除了会改变图像的亮度外,还直接影响到图像的鉴别率,对比度
和景深.其结果为下图所示.
孔径光阑完全打开 图像整个对比度降低
2/3～3/4
图像对比度增加,鉴别率充分展现
1/3
景深增加,但由于衍射致使图像鉴别率受到影响
如何正确调节孔径光阑大小?
把标本像调节清晰后, 把可变孔径光阑关小,取出目镜,肉眼距目镜筒口约100mm 处直接从目镜筒中观察物镜末端的通光孔,边观察边打开孔径光阑,直至孔径光阑象(多边形)为物镜通光孔的2/3～3/4, 见图示:
聚光镜分为干,湿两种。
所谓“ 湿”即使用时需滴上浸液.这类聚光镜NA,自1.2～1.4。“干”使用时不需
滴浸液,NA常为0.9。徕卡还备有干,湿两用的聚光镜，NA 0.9/NA 1.25。
数值孔径为0.9的聚光镜与孔径为1.25的100
倍油漆配合使用,其鉴别率会否降低？
由上所述,1.25*3/4=0.94,NA0.9干聚光镜正好与之相适应,也免去操作者滴油及清洁的麻烦。
对于特别追求鉴别率的场合,则应采用湿聚光镜,使用时,应在载玻片与聚光镜上表面滴上相应的浸液。
临界照明是指灯丝成象在标本面上或其附近。这样，光能得以充分的利用。即使小功 率的光源，也能给出足够的亮度。但其照明均匀性欠佳必须通过在照明光路中插入磨砂玻璃，才能满足使用的要求。
库勒照明是一种较为完善的照明方式，严格的库勒照明必须符合下面三个条件： － 照明均匀，灯丝像常在聚光镜的前焦面上，通过聚光镜以平行光束照明标本。 － 孔径光阑大小可任意改变，以适应不同倍率物镜的需要。
－ 具有可变的视场光阑，以适应不同倍率物镜的不同照明范围需要。
徕卡的BME 采用临界照明。DME采用临界照明也可采用库勒照明。DMLS，DMLB采用库勒照明。
视场光阑的功能及其正确使用：
视场光阑常位于支架底座上，其光阑大小能连续改变，它通过聚光镜能清晰地成象在标本面上。所以在目镜中看清标本的同时也能看到视场光阑多边形图像。可变视场光阑的像应外切于目镜中的视场光阑,使光线只能照明需观察的标本，尽可能减少标本四周的散射光。 2．集光镜
集光镜的作用是把光源射向四周的光线聚焦，把灯丝象成到聚光镜中，使聚光镜能起到改变灯丝大小的作用。 照明方式
常见的照明方式，有临界照明和库勒照明 两种.
显 微 镜 的 使 用
对工作环境的要求：
－ 室温：5°～30℃
由于浸液的折射率会随着温度的变化而发生改变，使用油镜时，为了得到理想的象质，室温最好控制在22℃～25℃ － 湿度：相对湿度45％～85％
－ 振动小。显微镜最好能安放在防震的工作台上，否则，用油镜观察时，图像常处于抖动状态。 － 环境清洁。
操作步骤：
1． 接通电源，放置好标本。
2．先用10×物镜，将标本象调焦清晰。 3．若用双目镜筒观察：
1）滑板式双目镜筒
a. 推动连接目镜筒的滑板，调节
双目镜筒瞳距，使左右视场的图像和而为一，并且取瞳距值。
b. 转动左（或右）目镜筒视度
圈，使其指示值与瞳距值相等。
c. 用此目镜筒观察，精确调焦使
图像清晰。
d. 用另一眼睛及另一目镜筒观
察，转动此目镜筒视度圈使此眼也能同时看清图。（注意：不能使用调焦机构调焦。）
注：若瞳距值与某一目镜筒指示值不等，则会影响显微镜齐焦性能。
2）铰链式双目镜筒
a.用固定目镜筒观察，调焦，使图像清晰。
b.扳动铰链，使左，右视场的图像合二为一。
c.转动另一目镜筒视度圈，使另一眼睛同时能看到清晰的图像。 4．若用库勒照明：
a.关小可变视场光阑
b.上下调节聚光镜，使可变视场光阑的多边形图像在目镜中。可见，调节聚
光镜调中螺钉，使可变视场光阑居中，打开可变视场光阑，使其外切于目镜视场光阑。
C.拔出目镜，用肉眼直接观察物镜后焦面，调节可变孔径光阑，使可变孔径光阑的大小为物镜通光孔的2/3～3/4,插入目镜观察。
注：转动转换器改变物镜倍率后，还应拔出目镜，调节可变孔径光阑大小。
若被观察的标本，本身对比度很低，即使按上述步骤操作后，图像对比度仍很低。此时,可关小可变孔径光阑,用牺牲鉴别率来提高图像对比度。
反之,被观察的标本对比度很高,为追求鉴别率,可适当开大可变孔径光阑(改为物镜通光孔的90％～100％)。
光学系统的清洁
清洁剂
用70～80%乙醚+30～20%酒精配成混合剂 清洁工具 － 吹气球
－ 柳条棒,牙签或塑料棒 － 脱脂棉花,纱布或擦镜纸 － 放大镜(用目镜倒置也可)
目镜上的灰尘用吹气球吹
手指印,唾沫,油脂,用清洁剂擦拭。
对小面积的光学元件,用牙签卷纸棉花,由中心向外,按螺旋形运动方向轻轻擦拭,见图:
对大面积的光学元件用脱脂纱布或擦镜纸滴
上清洁剂,由中心向外,按螺旋形运动方向轻轻擦拭。
清洁完毕用放大镜检查:
油浸物镜的清洁
浸液物镜用毕后,必须及时清洁,否则,浸油在物镜表面会凝结成硬膜,使物镜失去透明度而无法使用。
由于浸液物镜最前端通光极小(
DME及DMLS 等显微镜配用的浸液物镜如图所示。由于孔大, 深度浅,只需用擦镜纸
蘸上清洁剂,用手指轻轻擦拭就能除去浸液.
DME, DMLS浸液物镜前端示意图
图像欠佳原因分析
现象
原因
经常与100倍油镜同时使用,物镜前端不小心沾上浸油
物镜前端有指印或其它脏东西
标本上无盖玻片或盖玻片太厚
用40×物镜成象模
糊
聚光镜可变孔径开得太大 长期未使用,储存又不当,物镜内镜片发雾,生霉 物镜前透镜沾有腐蚀性液体,未及时清除,使镜片失去透明度
物镜内部渗入浸油 物镜不小心跌落,各透镜中心走动
用100×物镜成象模
糊
没有使用浸油 没有使用规定的浸油 浸油中气泡未排除 室温与浸油标准温度(23℃左右)相差太多,以致油折射率发生变化
放置显微镜,工作台或工作环境振动太大,以致图像抖动不停
标本切片太厚
物镜前端镜片残留的固化的浸油
措施
用棉花签,清洁剂,清除浸油
用棉花签,清洁剂清除 改用0.17厚度的盖玻片
将可变孔径光阑大小打开为物镜的2/3～3/4 送工厂修理 送工厂修理
送工厂清除浸油 送工厂清除浸油 滴上浸油
用规定浸油
在物镜工作位置上,利用转换器多次正反向转动,排除气泡 调节室温
减少振动,或远离振动源
标本厚度2～3u为佳
用棉花签,清洁剂反复清除
显微镜总放大率过大,成无效放大
物镜内部渗油
操作不当,变换倍率时物镜前组碰歪
总放大率控制在1000NA 内 送工厂清除内部浸油 送工厂修理
几种特殊的观察方法
暗视场观察法
暗视场观察法可以观看通常的动植物组织切片、血液图片、硅藻片,但在观察透明的活 体标本方面如含有细菌的液体更显出其优越性。值得指出的是,它还能观察到小于物镜分辨率本领的微粒。这些微粒在黑暗的背景中以亮点形式出现，使观察者能观察到它们的存在和移动。有人称此为超显微术。
要实现暗场效应,最简单的方法是在普通的阿贝聚光镜下方插入一块环形光阑,使照明的最
小孔径角大于物镜数值孔径即可。 左图为暗场观察法的光学原理图。 图中：
1． 环形光阑 2． 阿贝聚光镜 3． 物镜
集光镜射出的光束,经暗场环形光阑后以环状光束射向阿贝聚光镜,然后以环状的光锥照明标本,光锥最小角度即照明孔径角，它必须大于物镜的数值孔径。
如果标本片内无任何东西,那么,照明光线不可能进入物镜,视场内漆黑一片。反之,标本片内存在某些东西如细菌等微粒，那么由于光的衍射与散射作用，这些光线就进入物镜并成象，视场内将看到漆黑的背景中存在许多明亮的标本象。
用插片方式实现简易暗场,价格低廉,但只能与放大率≤40x的物镜配合使用。由于阿贝聚光镜内的杂散光及色差等因素视场背景难达到完全漆黑的程度。
要达到理想的暗场效果,最好采用专用的暗场聚光镜。这种聚光镜有干燥型,浸液型之分。 干燥型暗场聚光镜有几种形式,它们的共同点是在一个透镜上有多个球面,其中两个是反射面,其余面是折射面,光束经过它们后,最小照明孔径约在0.75～0.78之间。因此,与倍率≤40倍物镜匹配可以获得很好的效果。下图为二种干燥型暗
浸液型暗场聚光镜由两个相同材料的透镜胶合而成。加上浸油后,最小照明孔径约1.22。适合与100倍油浸物镜配合使用,注意:物镜中必须带有可变孔径光阑,能减少物镜的数值孔径。否则,部分照明光束将直接进入物镜而破坏暗场效果。其光学原理如下图：
场聚光镜：
注意:
－ 浸液型暗场聚光镜使用时必须在载玻片与聚光镜间滴上浸油。
－ 这种聚光镜还能与干燥型物镜配合使用。特别是高倍率的干燥型物镜,能取得很好的效率。其缺点是照明范围较小,因此与低倍率物镜,特别是4
倍物镜,只能在视场中心部分可以进行暗
场观察，而四周无光线照明,呈现一片黑暗。
暗场效果的好坏与使用时聚光镜的调节有很大关系。举简单暗场调节实例： － 标本上放置一半透明纸。
－ 打开可变孔径光阑,升降带有暗场插片的聚光镜,使半透明的纸上呈现明亮圆形的光斑。 － 调整聚光镜对中螺钉,使照明光轴与物镜光轴重合,此时视场背景应均匀黑暗。 常见故障
现象
视场中一片漆黑
原因
可变孔径光阑未打开
浸油暗场聚光镜未滴油
照明光斑呈环形, 中心黑暗
载玻片太厚
纠正措施 打开孔径光阑
在载玻片与浸油暗场聚光镜之间滴上浸油
上下调节聚光镜使光斑呈圆形
对于专用暗场聚光镜, 由于工作距离较短, 载玻片厚度严格控制在1～1.1mm 之间
载玻片两面不允许有划痕, 麻点, 灰尘(包括盖玻片表面) 必须保持清洁透明 选用带有可变孔径的专用100倍油浸物镜
关小可变孔径光阑
改用浸液型暗场聚光镜
调节聚光镜对中螺钉
黑暗背景中出现许多点状亮点或划痕 载玻片及盖玻片上灰尘，麻点，划痕成象
视场背景很亮倍油镜物镜中无特殊的
可变孔径光阑
100倍物镜中孔径光阑未关闭至NA=1附近
100倍物镜使用了干燥型，暗场聚光镜
聚光镜光轴与物镜光轴不重合
视场背景暗度不均匀 暗场环形光阑中心与聚光
镜光轴不同轴, 使照明光斑非圆形
聚光镜光轴与物镜光轴微量编差
用低倍物镜(如4倍) 时, 视使用浸油暗场聚光镜 场中心有图像, 但四周黑暗
送工厂校正
调节聚光镜对中螺钉
改用干燥型暗场聚光镜
相衬观察法
相衬观察法用来观察无色透明或不染色的活体标本。因为人眼只对亮暗,颜色有识别能力。而这些无色透明的活体,除了折射率与周围介质不同而引起位相的不同外,其亮度与周围介质的亮度完全一样。所以用普通的明场观察无法察觉到这些透明体的存在。如下左图表示光线透过上述的标本。
光与电磁波一样也是以波动的形式存在。我们用一正弦波来描述。波峰值称为振幅,它的平方值即代表亮度(能量)。
下图中的1表示,透过周围介质的正弦波。3表示光线透过标本时产生的衍射光，它的能量很弱(图中已夸大了)。2是曲线1与曲线3迭加的波形。因此,曲线1表示观察背景光的亮度,曲线2表示标本成象的亮度。
可见曲线1与曲线2波形相同,仅仅位相不同而已,这就是明场观察所得的效果。成象光与背景光同样亮度。人眼无法察觉透明体的存在。
我们设法将直射光1的位相改变90°(超前或滞后).如下图,直射光1与衍射光3位相差180°.那么,合成波形2与波形1
相比振幅略有改变,但还不足以达到满意的程度.
如果,我们设法将直射光1的能量衰减75%。如下图,那么波形2将与横坐标重合(为了识别,图中故意夸大),与波形1有明显的差别。观察的效果是,在较暗的背景下,看到黑色的透明体，这就是相衬观察法。
因为相衬板的膜层厚度根据绿光(e光)镀制的,使用时应用绿色滤光照明。
左图为实现相衬观察法的光学原理图。 图中：
1. 环形光阑 2. 聚光镜 3. 物镜 4. 相衬板 通过环形光阑的光束称为直射光。环形光阑常位于聚光镜的焦面上,光束经聚光镜后以倾斜的平行光束照明标本。再经物镜后,使环形光阑的象成在相衬板上。相衬板上镀有改变位相及减弱光能的膜层,它也是环状的,但其尺寸比环形光阑的象稍大。
相衬板的环形必须完全覆盖环形光阑的象(允许偏心),见图示,换句话说,也就是通过环形光阑的直射光,只能从环状相衬板中通过。不允许从环状相衬板外通过。
徕卡公司有简易相衬装置与标准相衬装置之分。所谓简易相衬装置由普通聚光度环形光阑插板,相衬物镜及绿色虑光片组成。不同倍率的相衬物镜必须与不同的环形光阑配合使用。
相衬物镜倍率 环形光阑插板代号
10倍及
20
倍
Ph1
40
倍 Ph2
100倍 Ph3
未对中 对中良好
由于产品离开公司前,环形光阑的中心与相衬环中心已校正好,因此,不再配对中望远镜。 标准相衬装置由转盘聚光镜,相衬物镜,绿色滤光片,对中望远镜及二个六角螺钉扳手组成。
转盘聚光镜带有五个园孔,内置ph1,ph2,ph3三种环形光阑,一个暗场环形光阑DF 和一个用于明场物镜观察的通孔。通过二个六角螺钉扳手可以对四个环形光阑进行调中。对中望远镜插入目镜管可以观察到环形光阑图像与环形相衬板对中状况。
转盘聚光镜
我们上面所介绍相衬图像比背景光暗,称为正相衬,反之,图像比背景明亮称为负相衬。 需要指出,相衬物镜可以作为普通的明场物镜使用,只是由于能量分布的改变,以及杂散光的增加,图像对比度稍逊一些。
相衬图片
偏光观察法
偏光观察法主要用来研究各向异性材料的一些特性。偏光显微镜与生物显微镜的主要区别在于具有偏振元件、波片、补偿器及勃氏镜等特殊组件。
偏振元件：
自然光通过某个光学元件后转换成某种形式的偏振光，这种元件称为偏振元件。更确切的说，应称为起偏振器。常用的起偏振器可用来使自然光转换成直线偏振光。它们是利用反射与折射，双折射和二向色性（或称选择吸收）的原理制成的。
利用反射与折射产生偏振光的元件由玻璃片堆组成；利用双折射产生偏光的元件由两块晶轴方向不同的晶体棱镜胶合而成。这两种方法制造成本比较高。
最常用的则是利用二向色性材料产生偏振光。例如：把一片清洁的聚乙烯醇薄膜浸在碘溶液里，在较高的温度下拉伸，取出后烘干制成偏振薄膜，把其胶合在两块平行度都较好的薄玻 璃中，就成为了一块偏振片。
下图形象地表示了自然光转换成直线偏振光的示意图：
同样的偏振片所处的位置不同名称也不同，如处于聚光镜前面的称为起偏振片，用来产生偏振光。位于物镜和目镜之间的称为验偏振片，用于分析偏振光。
双折射
各向异性材料，如：晶体，它们都具有双折射性能。光线射入的晶体，除了同晶体的晶轴（常称为光轴）同方向的光线不发生双折射外，其余方向的光线均产生双折射现象。
如左图：一根光线垂直射向晶体表面进入晶体后分成两根光线其中一根光线方向不变，垂直晶体另一表面射出，称O 光；另一根光线在晶体第一表面就发生折射，然后仍垂直晶体另一表面射出，称为e 光。这就是双折射。
同样，入射光线倾斜入射晶体，也会产生双折射。 常常将O 光，e 光的折射率差（n 0-n e ）作为双折射的光量量度。若晶体厚度为d ， 则（n 0-n e ）d ＝Δ，Δ称为光程差。
左图为偏光显微镜的原理图： 图中：
1．起偏振片 2. 聚光镜 3. 标本
4．物镜 5. 验偏振片 6. 目镜
自然光经起偏振片后以直线偏振光射向聚光镜并照明标本。若此标本是各向异性的物体，那么每根偏振光经过
标本后就会产生双折射而变成两根光线，它们再经物镜及验偏振片后干涉成像。如果这个标本不是单一的各向异性物体，那么标本各部位具有不同的光程差，于是干涉像各处呈现不同的干涉色。
由干涉色可推知光程差，若晶体厚度已知的话，则进一步推算出双折射（n 0-n e ），于是可以确定标本是什么材料。
起偏振片与验偏振片的透射轴常常互为90º放置（正交），如果标本是各向同性材料，则视场中漆黑一片。如果标本是各向异性材料，那么视场将会变亮，转动其中一个偏振片，使之再次变暗，从转动角度可以推知标本属于何种旋光特性材料。 波片：
波片是使光波经过它们后能对两个相互垂直方向的振动增加一个固定的位相差。位相差为1/4λ称为1/4波片，位相差为1/2λ称为1/2波片，位相差为λ称为全波片。
这些组件中常常标志出快轴的方向。所谓快轴是指光波沿着快轴传播得快，因此该方向的折射率最低。与快轴互为垂直的是慢轴，该方向的折射率最高。
1. 1/4波片
1/4波片常把直线偏振光转换成圆偏振光。当入射的直线偏振光振动的方向与波片的快轴成45度时，转换成圆偏振光。其余角度为椭圆偏振光。见下图，
2. 1/2波片
1/2波片是使直线偏振光的振动方向改变。例如，当直线偏振光的振动方向与1/2波片的快轴为90度时，则位相差改变为180度，振动方向转动了90度。见下图：
3. 全波片
在生物标本中，有时双折射很弱，干涉色常处于黑与灰黑之间，不足以区分。实验证明，当光程差在0.5—0.6微米之间，干涉色变化最灵敏，这种场合下，可插入全波片，让其附加0.56微米的光程差。使干涉色艳丽地呈现出来。
补偿器：
补偿器与波片的区别是前者相位差能连续可变，后者则是固定不变。补偿器可用两个光轴平行的石英楔和一个与石英楔光轴垂直的石英平板组成。利用测微鼓轮可以移动一个石英楔，由此改变位相差。
勃氏镜：
勃氏镜是将物镜的后焦面成像在目镜的焦平面上，供目视观察物镜后焦面的干涉图样。它设计成根据需要可以方便地移入光路中或移出光路。
偏光显微镜除了具备上述特殊组件外，对生物显微镜中原有的光学组件还有特殊要求。
物镜：
物镜是由许多各向同性的光学玻璃组成。如果这些玻璃存在内应力，或者有外界施加的机械力（如包边，胶合等），就会产生双折射，（应力）。破坏了正交的偏振状态，所以，物镜必须消除应力，物镜外毂上刻有Pol 标记以示区别。
聚光镜：
与物镜一样，必须消除应力。
工作台：
使用时，由于物体常需绕物镜光轴旋转，因此采用圆工作台，其四周带有360度等分的精确刻度，格值为1度，还带有游标读数，以提高读数的精度。
旋转时，物体必须仍在目视视野中，工作台的旋转中心跳动量必须在3—5微米内。 有时为了精确计算出光程差，物体的移动量必须高精度地控制。因此，对X.Y 向移动的精度须有定量指示。
转换器：
物体应位于物镜的光轴上，这样才能保证物体移动时不会越出视场。因此转换器孔的中心必须可调，
双目镜筒：
—对于铰链式双目镜筒其分光膜必须具有消偏振特性，这样才能保证改变瞳距时，左右镜筒中的图像的颜色和亮度不变。
—目镜管带有连动机构及限位装置，改变瞳距时确保目镜分划板的水平线位置不变。
目镜：
—带有十字分划板，视度可调。
—带有固定十字分划板水平线的限位机构。
微分干涉相衬观察法
微分干涉相衬观察法适合于观察物体表面存在微观高低差(1/10波长到1个波长的梯度差)的位相物体。可以把梯度差形象地转换成浮雕形式和具有彩色干涉对比色显示出来.且根据需要可以改变干涉对比色。
左图为微分干涉相衬法的光学原理图 图中：
1．起偏振片 2. 屋拉斯顿棱镜 3. 聚光镜 4. 位相物体 5. 物镜 6. 诺马斯基棱镜 7. 验偏振片 8. 镜筒透镜 9. 中间象面
自然光经过振动方向为45°起偏振片后成为线偏振光射向屋拉斯顿棱镜。此棱镜由二个光轴正交且平行于入射面。出射面的双折射晶体胶合而成。通常由石英晶体或方介石晶体制成。
一根入射线偏振光在棱镜的胶合斜面上分离成二个振动方向互相垂直的寻常光(O)和非常光(e),由于棱镜位于聚光镜的焦面上,经聚光镜后O 光和e 光平行地剪切位相物体。然后经物镜
后聚焦在物镜的后焦面上。
所谓诺马斯基棱镜与屋拉斯顿棱镜相仿,其差别仅仅其中一个棱镜的光轴与出射面成一定的角度.目的使O,e 光的交点移出,棱镜胶合面使它与物镜后焦面重合.这样,O,e光经此棱镜后,O光变e 光,e光变O 光,但又合二为一.但振动方向不在同一平面上,因此无法干涉.为此在其后方向安置一块振动方向为45°的验偏振片,使O,e 光在同一振动面内.相干成象于显微镜的中间象面。
综上所述,聚光镜,物镜必须消除应力。
实际情况是无数对O,e 光在物镜后焦面构成一个倾斜的平面,因此棱镜6也倾斜一定的角度。横向移动棱镜6可以改变光程差,来改变干涉对比色。
下列图片是用微分干涉相衬的标本图像:
荧光观察法
荧光观察法在医学领域有着广泛的用途，如免疫学研究的对象是抗原和抗体的反应问题，由
于抗体反应的高度特异性，所以当抗原体发生反应时，只要知道其中一个因子，也就可以知道另一个因子。但是这个过程必须通过染色，荧光染色剂就应运而生。
由于荧光染色的色素只需极稀的浓度便能使激发出明亮的荧光。因而，染色后不会破坏抗体（或抗原）原有的特异活性。
其光学原理示意图如下，以蓝光激发为例：
残余蓝光
紫外光
紫光 蓝光
绿光 蓝光 黄光 黄光 黄光 红光 红外光
激发滤光片 荧光标本 截止滤光片
光源发出多种波长的光线，经激发滤光片后只能通过某种单色的激发光，荧光标本在激发光作用下，激发出某种特定的颜色光（荧光）。由于被激发的荧光能量很弱，只能在黑暗的背景才易于观察到，所以增加了抑制滤光片使残余的激发光不能通过。
早期的荧光观察采用透射照明，它有很大的缺陷，当激发光透过标本组织时，很大部分的光线被衰减掉，到达我们需观察的标本上表面时，只能激发出微弱的荧光。
近代的荧光观察采用落射照明，如下图所示：
图中 ：
1．光源 2. 激发滤光片 3. 物镜 4. 标本 5. 二向性分光镜 6. 抑制滤光片 7. 目镜 光源
根据不同的激发光需要，可以选用三种光源，卤素灯，高压汞灯和氙灯。下图列出菲利浦公司高压汞灯和氙灯的光谱特性曲线。
高压汞灯光谱特性
氙灯光谱特性
由图知，高压汞灯是线状光谱，对于某些波长光线有很高的强度，它适用很多染色法。
氙灯在300～800nm波长内几乎可以看作连续光谱，虽然是某些波长的强度不如汞灯，但它适用于所有荧光染色法。
卤素灯也是连续光谱，它在蓝光，绿光处也有较高的强度（但远低于汞灯，氙灯）因此，对于只用蓝光，绿光激发的简易荧光显微镜可以选用卤素灯。
通常采用50W 汞灯，100W汞灯75W 氙灯及100W 卤素灯作荧光光源。
图中物镜既起成象作用，又起聚光镜作用。为了获得很好的观察效果，在荧光很微弱的场合如细菌发出的荧光。建议采用大数值孔径物镜，如徕卡的荧石物镜，平场复消色差物镜。
正因为物镜又兼聚光镜作用，所以物镜中玻璃材料，透镜间胶合剂，以及浸油必须确保在激发光下不会自发荧光。
为了使用方便，常将激发滤光片，二向性分光镜及抑制滤光片组合成一个模块。对于不同的荧光染色法，必须选用合适的模块才能得到满意的结果。所谓二向性分光镜对激发光具有高反射率，而对激发出的荧光具有高透过率。
常用模块至少四种：
z 近紫外光激发模块 UV z 紫光激发模块 V z 蓝光激发模块 B z 绿光激发模块 G
这些模块对应着不同染色法，如B 模块常用FITC 染色法，G模块常用罗达明B200染色法。
必须特别指出，激发光的波段曲线绝对不能与抑制光的波段曲线部分重迭，否则，视场中的背景光全部是激发光的颜色,而微弱的荧光完全被掩盖住,正如白天天空中无法看到星光一样。
1─激发光 1─激发光 2─抑制光 2─抑制光
蓝光激发如用FITC 染色法,它的激发波段为480～490nm,被激发的荧光波长为510nm。由图知,无论激发光或抑制光在500 nm处均截止,无相交重迭，所以残留的激发光无法通过截止滤光片,视场背景是黑暗的,而荧光则可顺利地透过截止滤光片，形成荧光图像。
徕卡公司设置了许多模块,供不同的染色法选用。 滤光片模块代号 激发光范围
A D E4 H3 I3 K3 L4 M2 N2.1 TX G/R B/G/R
紫外光 紫外光+紫光 蓝光 蓝光 蓝光 蓝光 蓝光 绿光 绿光 绿光 蓝光/绿光
紫外光/蓝光/绿光
注意:
许多荧光标本无法长期保存,特别在激发光照射下,荧光很快消失,所以在停止观察时,应该将激发光挡住,但是汞灯开启到熄灭后,第二次再启动时,必须待灯源冷却后才能进行。为此,须在模块前设置一挡板,可随时关闭,开启。
激发滤光片 BP340-380 BP355-425 BP436/7 BP420-490 BP450-490 BP470-490 BP450-490 BP546/14 BP515-560 BP530-595 BP490/20 BP575/30 BP400/20 BP495/15 BP570/30
二向性分光镜 RKP400 RKP455 RKP455 RKP510 RKP510 RKP510 RKP510 RKP580 RKP580 RKP600 RKP505 RKP600 RKP415 RKP510 RKP590
截止滤光片 LP425 LP470 LP470 LP515 LP515 LP515 BP515-560 LP590 LP590 LP615 BP525/20 BP635/40 BP530/30 BP640/40 BP610/75
荧光显微镜
标本图像(蓝光激发) 标本图像(绿光激发)
荧光模块 标本图像(紫外光激发)
标本图像(蓝光+紫外光激发)
调 制 对 比 观 察 法
调制对比观察法适合于观察表面具有微观高低差的物体。它与微分干涉相衬情况类似，也能把物体以立体的浮雕象呈现出来。但成像原理完全不同。它是把物体中存在的几何梯度差，所导致光学梯度差产生的光强，人为地调制成比背景亮，而另一侧调制成比背景暗，这些亮度差使物体的图像产生立体的效果。
调制板是一种特殊的光振幅滤波器，它有
示，透射率小于1示，透射率10～15可能接近100％。
物体的折射率为n 1
左图形象地表示调制板如何调制物体的光强。中间灰色为背景光强，这样物体细节一侧光强人为地变亮，另一侧人为地变暗，使图像出现立体感。
调制板参数的设计对立体像有很大影响，特别是灰区的宽度和透射率t G 直接影响到浮雕像的形成和成像的灵敏度。
减少t G 值可以提高成像对比度，但调制对比的灵敏度降低了。物体中的某些梯度无法检测出，像的对比度就不能形成。某一t G 值只适用于具有一定梯度范围的物体。实际上，同一物体中也存在很大的梯度差异。这也是这种方法的缺陷。
此外，调制板边界线与梯度的方位也有极大的关系。 如图。β梯度方位角，梯度的检测出是与Cos β成正比。 β越小，像的立体感越强，当β=90度时，像的立体感 就消失。这是这种方法的另一种缺陷。
产 品 介 绍
BME
BME 是一种机械筒长为160mm,教育用显微镜系列,共有八种标准配置,下图为部分外形照
片。
BME (H12) BME (F11)
它的主要部件和技术性能 物镜：
机械筒长160mm 消色差系列, 4/0.10, 10/0.25, 40/0.65, 100/1.25油 目镜：
10X/18带有补偿功能的指针目镜及10X 补偿目镜
BME (H11)
BME 目镜、物镜
镜筒：
－ 出射光轴倾斜45°的单目镜筒,可作360°旋转。
－ 出射光轴倾斜45°的滑板式双筒,可
作360°旋转,双目镜筒可作轴向移动,瞳距调节范围55～75 mm。 支架组:
－ 粗,微调手轮同轴,微调全行程,微调格值3μ,调焦范围:10mm － 四孔转换器,内倾式 － 工作台及聚光镜
1．固定工作台, 带二片压簧, NA0.65转盘式聚光镜
2．机械工作台， X向行程:78mm
Y 向行程:35mm NA1.2阿贝聚光镜,
上下升降范围,9mm － 照明
1． 7W荧光灯
2． 12W卤素灯,光亮连续可调
选构件:
－ 视场平坦度较好的E2物镜系列,或PL 平视场消色差物镜 － 5X惠更斯目镜 － 15X广角补偿目镜 － 反光镜 － 单目示教镜
仪器主要特点:
－ 成象清晰,鉴别率高； － 物镜齐焦性能好；
－ 转换器内倾式,属教育显微镜的创举； － 各传动部分平稳,舒适(扭力矩定量控制)使用寿命长；
－ 支架一体化,仪器刚性好,加工精度高； － 各组件互换性能好；
－ 双目镜筒光轴平行度好,长时间观察不易疲劳；
－ 外形美观,线条流畅； － 长寿命卤素灯(>1000小时)；
－ 电器系统符合UL,VDE,CE 等标准。
标准配置表 组件名称 F11 4X 消色差物镜 10X 消色差物镜 40X 消色差物镜 100X 消色差物镜 10X 指针目镜 10X 目镜
z z
z
z z
z z
z
z
z z
单目镜筒 z 双目镜筒 固定工作台, 转盘式聚光镜 机械工作台, 阿贝聚光镜 120V7W 荧光灯, 支架组 230V7W 荧光灯支架组 120V12W 卤素灯支架组 230V12W 卤素灯支架组
F12 z z z z
F21 z z z z z
F22 z z z z
H11 z z z z z
H12 z z z z
H21 z z z z
H22 z z z z z
z z z z z
z z z z z z
z z
z z
z z
z z
DME
DME 是徕卡公司成功地将无限远系统用于教育显微镜中的范例,它融入了高，精，尖端技术的高档次教育实验室显微镜,荣获了2000年瑞士苏黎士世界大奖。
图中:
1．目镜 2. 双目镜筒 3. 转换器 4. 物镜
5. 机械工作台 6. 阿贝聚光镜 7. 支架 8. 亮度调节手轮 9. 聚光镜对中螺钉 10. 聚光镜调节手轮. 11. 粗微调节手轮
它的主要部件和技术性能(基本配置) 物镜：
无限远消色差系列 4X/0.10 10X/0.22 40X/0.65 100X/1.25
油
目镜：
10X/18带有补偿功能的指针目镜及10X 补偿目镜
镜筒：
－ 出射光轴倾斜45°的铰链式双目镜筒,可作360°旋转
视度调节范围±5屈光度,瞳距调节范围:55～75mm － 分光比为1:1的叁目镜筒
双目镜筒 三目镜筒 支架组:
－ 粗微调手轮同轴,微调全行程,微调格值3μ,调焦范围17mm － 四孔转换器，内倾式 － 机械工作台: X向行程 76mm
Y 向行程 40mm
－ 聚光镜: 干湿二用,NA0.90 及NA1.25油
上下,升降范围: 15mm 带有调中装置
－ 照明系统:临界照明,或库勒照明
1. 12V20W卤素灯 2. 亮度连续可调
3. 电压自动识别
临界照明，右手轮工作台
选购件: － 物镜
1.视场较平坦的C 型消色差物镜: 10x/0.22, 20x/0.40, 40x/0.65, 63x/0.75, 100x/1.25油
2. N 型平场消色差物镜: 5x/0.12, 10x/0.25, 20x/0.40, 40x/0.65, 63x/0.80, 100X/1.25油
3. 视场较平坦的C 型消色差相衬物镜: 10x/0.22, 20x/0.40, 40x/0.65, 100x/1.25油
－ 镜筒:： 分光比1:1的三目镜筒
－ 工作台：左手机械工作台； 临床用机械工作台 － 暗场插片 － 起偏镜和验偏镜 － 15x/14广角补偿目镜
注： 除了上述选购件外,徕卡公司其余很多组件如HC 型镜筒,HC型目镜,落射照明装置,落射荧
光装置,CCD 摄影等均可互换。使显微镜除了适用生物领域,还适用其它领域中。
仪器主要特点
－ 采用无限远物镜视场清晰范围高于同类型物镜,且具有防盗装置； － 优越的齐焦性能,可以与徕卡公司的高档物镜(为荧石物镜)互换； － 各传动部件制造精良,灵敏度高,传动平稳,使用寿命长； － 支架一体化,刚性好,加上各种附件后不会改变仪器的原有精度；
－ 支架制造精度高,可以方便地安装徕卡公司的各种组件,为产品的升级带来极大的方便.； － 配用徕卡公司的合适的部件后,可以扩展到其它领域如金相,半导体等； － 铰链式双筒,操作方便,两光轴平行度好,长时间观察不会疲劳； － 仪器亮度高,灯泡寿命高于2000小时；
－ 仪器能110V～230V自动识别,电器系统符合UL,VDE,CE 标准； － 外形美观,充分考虑了人机工程学。
DMLS
DMLS 是一种高档次的实验室显微镜,它由许多种基本部件组合而成。标准化的部件使用户根据各自的需求,几乎可以组合成无限多的型式。
图中：
1． 目镜 2. 双目镜筒 3. 转换器 4. 物镜 5. 机械工作台 6. 聚光镜 7. 可变视场光阑 8. 支架 9. 亮度调节手轮 10. 粗,微调节手轮 11. 聚光镜对中螺钉 12.聚光镜调节手轮
它的主要部件和技术性能 物镜:
可以选用四种类型:
－视场较平坦的C 型消色差物镜：4x/0.1, 10x/0.22, 20x/0.40, 40x/0.65, 63x/0.75,
100x/1.25油
－平场消色差物镜：2.5x/0.07, 5x/0.12, 10x/0.25, 20x/0.40, 40x/0.65, 63x/0.80,
100x/1.25
油
－平场半复消色差物镜：1.6x/0.05, 5x/0.12, 10x/0.30, 20x/0.50, 40x/0.70,
100x/1.30油
－平场复消色差物镜：20x/0.60,40x/0.75,40x/1.25-0.7油,63x/1.40油,100x/1.40-0.70油 注: 这些物镜分别有用于相衬,偏光等观察法之分
目镜 (视场光阑四周无色, 用HC 字母区别) － HC 10X/20 广角目镜,视度可调,高眼点 － HC 10X/22 广角目镜,视度可调,高眼点 － HC10X/25 超广角目镜,视度可调,高眼点 － HC 12.5X/16 广角目镜
DMLS目镜、物镜 镜筒:
－ 出射光轴倾斜30°的铰链式双目镜筒,可作360°旋转,二目镜管带有弹性槽,瞳距调节范
围:55～75mm。
－ 出射光轴倾斜30°的铰链式用于偏光的双目镜筒,可作360°旋转, 二目镜管带有弹性槽,
瞳距调节范围:55～75mm。
－ 出射光轴倾斜可调(0°～35°)的铰链式双目镜筒,二目镜管带有弹性槽,瞳距调节范
围:55～75mm。
－ 分光比为1:1的三目镜筒。
HC
双 筒
HC三 筒 注:上述镜筒均有补偿物镜放大色差的功能。 支架组:
－ 粗微调手轮同轴,微调全行程,微调灵敏度≤0.1μ微调格值3μ调焦范围:20mm； － 五孔转换器，内倾式； － 机械工作台 X向行程：76mm Y向行程：50mm － 聚光镜
1．可插入多种插片的干湿二用的明场聚光镜(NA0.90/NA1.25油)
2．明场, 暗场, 相衬转盘式干, 湿二用聚光镜. (NA0.90/NA1.25油) 3．偏光聚光镜(NA0.85)
— 照明系统：库勒照明,12V30W
亮度连续可调 电压自动识别
选购件：
各种标准化部件不胜枚举。选用这些部件,可以实现暗场观察法,相衬观察法,微分干涉相衬观察法,荧光观察法,偏光观察法以及用于金相及半导体工业的落射照明装置等。
还有2人和5人示教系统,描绘装置,CCD
摄像装置等附件。
照相装置 CCD摄像装置
描绘装置 二人示教装置
目 录
1. 显微镜基础知识………………………………………………………….1
1.1 显微镜成像原理………………………………………………………..1
1.2 显微镜总放大率……………………………………………………….1
1.3 显微镜的有效放大率…………………………………………………..1
1.4 显微镜鉴别率…………………………………………………………1
1.5 显微镜的景深…………………………………………………………2
1.6 光学系统的成象缺陷(象差) ……………………………………………2
z 球差……………………………………………………………..2 z 彗差……………………………………………………………..3 z 象散……………………………………………………………..3 z 场曲……………………………………………………………..4 z 畸变……………………………………………………………..4 z 位置色差…………………………………………………………4 z 放大色差…………………………………………………………5
2. 显微镜主要部件………………………………………………………….5 2.1物镜…………………………………………………………………... 5
2.2目镜……………………………………………………………………9
2.3双目(或叁)目镜筒……………………………………………………..10
2.4 支架组………………………………………………………………..11
2.5 粗微调焦装置………………………………………………………....12
2.6 机械工作台…………………………………………………………...12
2.7 照明系统………………………………………………………….….12
3. 显微镜的使用…………………………………………………………...14
3.1 对工作环境的要求…………………………………………………….14
3.2 操作步骤………………………………………………………….….14
3.3 光学系统的清洁……………………………………………………....15
3.4 图像欠佳原因分析…………………………………………………….17
4. 几种特殊的观察法……………………………………………………...18
4.1 暗场观察法…………………………………………………………...18
4.2 相衬观察法…………………………………………………………...20
4.3 偏光观察法…………………………………………………………...23
4.4 微分干涉相衬观察法…………………………………………………..27
4.5 荧光观察法…………………………………………………………...28
4.6 调制对比观察法………………………………………………………34
5. 产品介绍………………………………………………………………….36
5.1 BME…………………………………………………………………...36
5.2 DME…………………………………………………………………...39
5.3 DMLS………………………………………………………………….43
显微镜基础知识
显微镜成像原理
显微镜的光学成象系统由两部分组成,靠近物体部分的透镜组称
为物镜;靠近眼睛的透镜组称为目镜。物镜组把物体成象在目镜前焦
面上,形成一个放大倒立的实象,它称之为中间象,然后由目镜组再次
放大供目视观察。
图中：
1. 物体 2. 物镜 3. 中间像
4. 目镜 5. 眼睛
显微镜总放大率：
M =β×γ
式中：
M：显微镜总放大率
β：物镜放大率
γ：目镜放大率
即,显微镜总放大率=物镜放大率×目镜放大率
显微镜鉴别率σ
显微镜鉴别率是指刚能分开物平面两点的最小距离,则
σ=0.61λ/A
式中：
λ： 光波波长 （通常λ=0.00055mm）
A ： 物镜数值孔径NA
可见 ,鉴别率取决于物镜的数值孔径。 物镜
鉴别率
4/0.10 3.36μ 10/0.25 1.34μ 40/0.65 0.52μ 100/1.25 0.27μ
显微镜的有效放大率 M有效
500A≤M 有效≤1000A
满足此式的放大率就称有效放大率。
若总放大率M1000A,说明无效放大,原来看不清的细节,过分放大后。还是看不清。
成为彩色的弥散斑,使象模糊。
它在消色差物镜基础上,还校正了象散和场曲,象面平坦。清晰范围不低于90%。物镜外壳 刻有PL 或PLAN 字样。徕卡的产品目录中,N PLAN物镜就属于此类物镜。
3．平视场复消色差物镜
它在平视场消色差物镜的基础上,还对第三种色光校正了位置色差,这种物镜成象质量最佳,其数值孔径也较同倍率物镜大。因此,鉴别率也最高。物镜外壳刻有Planapo 字样,徕卡产品目录中PLAPO 就是此类物镜。
4．半平视场消色差物镜
这类物镜的清晰范围介于消色差物镜与平视场消色差物镜之间,但明显优于消色差物镜。接近平视场消色差物镜。其外壳常刻有SP(Semi.plan)字样。徕卡产品的目录中C PLAN的中,高倍物镜属于此类。
目前的趋势似乎很多厂商不认可这种分类。把他们并入消色差物镜中,作为新颖的或优化的消色差物镜如：徕卡CME 中, AchroE2就是此类物镜。
5.平视场半复消色差物镜
色差的校正程度介于平视场消色差物镜与平视场复消色差物镜之间。但较近于平视场复消色差物镜。徕卡产品目录中的PL Fluotar 就是这类物镜。
按筒长分类
1．筒长有限远
物镜的共轭距离(物到象的距离)为195mm,物镜的机械筒长(物镜螺纹端面到目镜支承面)为160mm。徕卡产品中BME,CME 采用此类物镜。
2．筒长无限远
物镜把物体成象于无限远, 因此, 必须要有镜筒透镜将无限远的光线聚焦到目镜焦面上才能观察。徕卡产品中DME,DMLS,DMLB… 等均采用此类物镜。
此类物镜的突出优点是,在物镜与镜筒透镜之间可方便地插入各种附件,而不会引起成象位置的变化。
物镜外壳的标记
40/0.65 40： 有限远物镜,放大率为40倍 160/0.17 0.65：数值孔径NA
160： 机械筒长160mm
0.17：盖玻璃厚度
N PLAN 40x/0.65 N PLAN：平视场消色差
∞/0.17 40x： 无限远物镜,放大率为40倍 0.65: 数值孔径NA
∞: 筒长无限远
0.17: 竖玻璃厚度
C PLAN 63x/0.75 C PLAN: 半平视场消色差物镜
∞/0.17 63 x: 无限远物镜,放大率为63倍
N PLAN5x/0.12 N PLAN: 平视场消色差物镜
∞/— 5 x: 无限远物镜,放大率为5倍
0.12: 数值孔径NA
—: 对有无盖玻片无要求
PLAPO 100x/0.95 PLAPO: 平视场复消色差物镜
∞/0 100x: 无限远物镜,放大率为100倍 0.95: 数值孔径NA
O: 无盖玻璃
放大 1
率
颜色 ～1.25 黑 灰 1.6 ～2 2.5 ～3.2 4 ～5 橙 6.3 ～8 10 ～12.5 黄 淡绿 深绿淡蓝 深蓝 白 16 25 40 63 100, ～20 ～32～50 ～80 125,160棕 红
盖玻璃厚度对成象质量的影响
当物镜的数值孔径大于0.65时,盖玻璃厚度误差对于物镜的成象质量影响十分明显。设计时,盖玻璃厚度采用标准值0.17mm。用高倍率物镜观察时,盖玻璃片厚度误差最好控制在+/-0.01mm 之内。
下图为普通带有玻璃片的物镜在两种情况下观察的结果
有盖玻片时的图像 无盖玻片时的图像
z 目镜
按放大色差校正状况可分为消放大色差目镜和补偿目镜。补偿目镜放大色差为1～1.5%。以补偿物镜残留的放大色差。通常,补偿目镜的视场光阑四周带特有的黄色。 对于筒长有限远的物镜,常与补偿目镜配合使用，如：徕卡BME 等。
对于筒长无限远的物镜,若镜筒透镜具有补偿放大色差功能的,则与普通目镜配合使用，如：徕卡DMLS,DMLB…。若镜筒透镜无补偿色差功能的。则必须与补偿目镜配合使用，如：徕卡DME。
按目镜视场数可分为：非广角目镜,广角目镜,超广角目镜等。 对于10 X目镜而言,
视场数20, 常称为超广角目镜。
目镜外壳标记 10X/20 10： 放大率 20: 视场数
各类目镜
z 双目(或叁)目镜筒
按机械结构可分为滑板式双目镜筒和铰链式双目镜筒。 1． 滑板式双目镜筒
优点: 用偏光观察时,改变瞳距不会产生光线或明或暗的变化。
缺点: 改变瞳距时,左,右目镜管的刻度值必须与瞳距值相等,否则会破坏显微镜的齐焦。徕卡的BME,CME 采用此类镜筒。
铰链式双目镜筒
优点: 改变瞳距时,显微镜的齐焦性能不变
缺点: 若用于偏光观察,分光膜必须具有消偏振性能。
按目镜的倾斜角可分为30°,45°及符合人机工程学倾斜角可变的双目镜筒。
倾角30°的双目镜筒 倾角0°～35°可变的双目镜筒
徕卡DME,DMLS,DMLB 等采用此类镜筒。 无论哪一种双目镜筒都必须满足下列要求 － 由两个目镜射出的光轴必须平行。 通常认为,发散度
会聚度
但徕卡的产品远远小于上述数值。 － 左右视场不允许明显的颜色差。 － 左右视场不允许明显的亮度差。 － 左右视场不允许明显的象偏转。 － 左右两系统放大率差≤2%。
叁目镜筒仅仅用转向分光镜代替转向棱镜,以便引出一条光路连接照相及CCD 等附件
z 支架组
支架组由支架,粗微调焦,机械工作台,转换器及照明系统构成,见下图：
支架是整个显微镜的基座,所有组件都要安装其中,它必须有足够的刚性,不致因组件过多而引起变形。支架加工精度必须严格保证,确保各组件间相互关系满足预定的要求。 徕卡的所有显微镜,无论低档,中档还是高档显微镜,支架一体化是其与众不同的特点,体现了先进的设计思想和高精度的机械加工完美结合。
定量的扭力矩控制,不会出现时松时紧不良现象。
z 照明系统
位于工作台下方的透镜组称为聚光镜,位于灯泡附近的透镜组称为集光镜。由聚光镜,反光镜及集光镜等构成了显微镜照明系统。 1．聚光镜:
聚光镜的作用是将光源发出的光线形成一束与物镜数值孔径相适应的光束,均匀地照明标本片。
由于各个物镜的数值孔径不同,要求照明光束的孔径角也相应的变化,因此,聚光镜中必定有一个能连续改变照明孔径角的可变光阑,此光阑称为可变孔径光阑。
z 粗微调焦装置
粗微调采用钢珠行星式结构,再配上硬度,光洁度出众的三角等轨和钢珠滑板,使调焦具有较高的灵敏度且有永不下滑的自锁功能。
z 机械工作台
工作台台面平面性好,利用同轴手轮可作X,Y 向移动,传动平稳舒适。手轮的长短充分考虑的人机工程的需要。凡是传动手轮应有
可变孔径光阑的功能及正确使用：
可变孔径光阑的大小除了会改变图像的亮度外,还直接影响到图像的鉴别率,对比度
和景深.其结果为下图所示.
孔径光阑完全打开 图像整个对比度降低
2/3～3/4
图像对比度增加,鉴别率充分展现
1/3
景深增加,但由于衍射致使图像鉴别率受到影响
如何正确调节孔径光阑大小?
把标本像调节清晰后, 把可变孔径光阑关小,取出目镜,肉眼距目镜筒口约100mm 处直接从目镜筒中观察物镜末端的通光孔,边观察边打开孔径光阑,直至孔径光阑象(多边形)为物镜通光孔的2/3～3/4, 见图示:
聚光镜分为干,湿两种。
所谓“ 湿”即使用时需滴上浸液.这类聚光镜NA,自1.2～1.4。“干”使用时不需
滴浸液,NA常为0.9。徕卡还备有干,湿两用的聚光镜，NA 0.9/NA 1.25。
数值孔径为0.9的聚光镜与孔径为1.25的100
倍油漆配合使用,其鉴别率会否降低？
由上所述,1.25*3/4=0.94,NA0.9干聚光镜正好与之相适应,也免去操作者滴油及清洁的麻烦。
对于特别追求鉴别率的场合,则应采用湿聚光镜,使用时,应在载玻片与聚光镜上表面滴上相应的浸液。
临界照明是指灯丝成象在标本面上或其附近。这样，光能得以充分的利用。即使小功 率的光源，也能给出足够的亮度。但其照明均匀性欠佳必须通过在照明光路中插入磨砂玻璃，才能满足使用的要求。
库勒照明是一种较为完善的照明方式，严格的库勒照明必须符合下面三个条件： － 照明均匀，灯丝像常在聚光镜的前焦面上，通过聚光镜以平行光束照明标本。 － 孔径光阑大小可任意改变，以适应不同倍率物镜的需要。
－ 具有可变的视场光阑，以适应不同倍率物镜的不同照明范围需要。
徕卡的BME 采用临界照明。DME采用临界照明也可采用库勒照明。DMLS，DMLB采用库勒照明。
视场光阑的功能及其正确使用：
视场光阑常位于支架底座上，其光阑大小能连续改变，它通过聚光镜能清晰地成象在标本面上。所以在目镜中看清标本的同时也能看到视场光阑多边形图像。可变视场光阑的像应外切于目镜中的视场光阑,使光线只能照明需观察的标本，尽可能减少标本四周的散射光。 2．集光镜
集光镜的作用是把光源射向四周的光线聚焦，把灯丝象成到聚光镜中，使聚光镜能起到改变灯丝大小的作用。 照明方式
常见的照明方式，有临界照明和库勒照明 两种.
显 微 镜 的 使 用
对工作环境的要求：
－ 室温：5°～30℃
由于浸液的折射率会随着温度的变化而发生改变，使用油镜时，为了得到理想的象质，室温最好控制在22℃～25℃ － 湿度：相对湿度45％～85％
－ 振动小。显微镜最好能安放在防震的工作台上，否则，用油镜观察时，图像常处于抖动状态。 － 环境清洁。
操作步骤：
1． 接通电源，放置好标本。
2．先用10×物镜，将标本象调焦清晰。 3．若用双目镜筒观察：
1）滑板式双目镜筒
a. 推动连接目镜筒的滑板，调节
双目镜筒瞳距，使左右视场的图像和而为一，并且取瞳距值。
b. 转动左（或右）目镜筒视度
圈，使其指示值与瞳距值相等。
c. 用此目镜筒观察，精确调焦使
图像清晰。
d. 用另一眼睛及另一目镜筒观
察，转动此目镜筒视度圈使此眼也能同时看清图。（注意：不能使用调焦机构调焦。）
注：若瞳距值与某一目镜筒指示值不等，则会影响显微镜齐焦性能。
2）铰链式双目镜筒
a.用固定目镜筒观察，调焦，使图像清晰。
b.扳动铰链，使左，右视场的图像合二为一。
c.转动另一目镜筒视度圈，使另一眼睛同时能看到清晰的图像。 4．若用库勒照明：
a.关小可变视场光阑
b.上下调节聚光镜，使可变视场光阑的多边形图像在目镜中。可见，调节聚
光镜调中螺钉，使可变视场光阑居中，打开可变视场光阑，使其外切于目镜视场光阑。
C.拔出目镜，用肉眼直接观察物镜后焦面，调节可变孔径光阑，使可变孔径光阑的大小为物镜通光孔的2/3～3/4,插入目镜观察。
注：转动转换器改变物镜倍率后，还应拔出目镜，调节可变孔径光阑大小。
若被观察的标本，本身对比度很低，即使按上述步骤操作后，图像对比度仍很低。此时,可关小可变孔径光阑,用牺牲鉴别率来提高图像对比度。
反之,被观察的标本对比度很高,为追求鉴别率,可适当开大可变孔径光阑(改为物镜通光孔的90％～100％)。
光学系统的清洁
清洁剂
用70～80%乙醚+30～20%酒精配成混合剂 清洁工具 － 吹气球
－ 柳条棒,牙签或塑料棒 － 脱脂棉花,纱布或擦镜纸 － 放大镜(用目镜倒置也可)
目镜上的灰尘用吹气球吹
手指印,唾沫,油脂,用清洁剂擦拭。
对小面积的光学元件,用牙签卷纸棉花,由中心向外,按螺旋形运动方向轻轻擦拭,见图:
对大面积的光学元件用脱脂纱布或擦镜纸滴
上清洁剂,由中心向外,按螺旋形运动方向轻轻擦拭。
清洁完毕用放大镜检查:
油浸物镜的清洁
浸液物镜用毕后,必须及时清洁,否则,浸油在物镜表面会凝结成硬膜,使物镜失去透明度而无法使用。
由于浸液物镜最前端通光极小(
DME及DMLS 等显微镜配用的浸液物镜如图所示。由于孔大, 深度浅,只需用擦镜纸
蘸上清洁剂,用手指轻轻擦拭就能除去浸液.
DME, DMLS浸液物镜前端示意图
图像欠佳原因分析
现象
原因
经常与100倍油镜同时使用,物镜前端不小心沾上浸油
物镜前端有指印或其它脏东西
标本上无盖玻片或盖玻片太厚
用40×物镜成象模
糊
聚光镜可变孔径开得太大 长期未使用,储存又不当,物镜内镜片发雾,生霉 物镜前透镜沾有腐蚀性液体,未及时清除,使镜片失去透明度
物镜内部渗入浸油 物镜不小心跌落,各透镜中心走动
用100×物镜成象模
糊
没有使用浸油 没有使用规定的浸油 浸油中气泡未排除 室温与浸油标准温度(23℃左右)相差太多,以致油折射率发生变化
放置显微镜,工作台或工作环境振动太大,以致图像抖动不停
标本切片太厚
物镜前端镜片残留的固化的浸油
措施
用棉花签,清洁剂,清除浸油
用棉花签,清洁剂清除 改用0.17厚度的盖玻片
将可变孔径光阑大小打开为物镜的2/3～3/4 送工厂修理 送工厂修理
送工厂清除浸油 送工厂清除浸油 滴上浸油
用规定浸油
在物镜工作位置上,利用转换器多次正反向转动,排除气泡 调节室温
减少振动,或远离振动源
标本厚度2～3u为佳
用棉花签,清洁剂反复清除
显微镜总放大率过大,成无效放大
物镜内部渗油
操作不当,变换倍率时物镜前组碰歪
总放大率控制在1000NA 内 送工厂清除内部浸油 送工厂修理
几种特殊的观察方法
暗视场观察法
暗视场观察法可以观看通常的动植物组织切片、血液图片、硅藻片,但在观察透明的活 体标本方面如含有细菌的液体更显出其优越性。值得指出的是,它还能观察到小于物镜分辨率本领的微粒。这些微粒在黑暗的背景中以亮点形式出现，使观察者能观察到它们的存在和移动。有人称此为超显微术。
要实现暗场效应,最简单的方法是在普通的阿贝聚光镜下方插入一块环形光阑,使照明的最
小孔径角大于物镜数值孔径即可。 左图为暗场观察法的光学原理图。 图中：
1． 环形光阑 2． 阿贝聚光镜 3． 物镜
集光镜射出的光束,经暗场环形光阑后以环状光束射向阿贝聚光镜,然后以环状的光锥照明标本,光锥最小角度即照明孔径角，它必须大于物镜的数值孔径。
如果标本片内无任何东西,那么,照明光线不可能进入物镜,视场内漆黑一片。反之,标本片内存在某些东西如细菌等微粒，那么由于光的衍射与散射作用，这些光线就进入物镜并成象，视场内将看到漆黑的背景中存在许多明亮的标本象。
用插片方式实现简易暗场,价格低廉,但只能与放大率≤40x的物镜配合使用。由于阿贝聚光镜内的杂散光及色差等因素视场背景难达到完全漆黑的程度。
要达到理想的暗场效果,最好采用专用的暗场聚光镜。这种聚光镜有干燥型,浸液型之分。 干燥型暗场聚光镜有几种形式,它们的共同点是在一个透镜上有多个球面,其中两个是反射面,其余面是折射面,光束经过它们后,最小照明孔径约在0.75～0.78之间。因此,与倍率≤40倍物镜匹配可以获得很好的效果。下图为二种干燥型暗
浸液型暗场聚光镜由两个相同材料的透镜胶合而成。加上浸油后,最小照明孔径约1.22。适合与100倍油浸物镜配合使用,注意:物镜中必须带有可变孔径光阑,能减少物镜的数值孔径。否则,部分照明光束将直接进入物镜而破坏暗场效果。其光学原理如下图：
场聚光镜：
注意:
－ 浸液型暗场聚光镜使用时必须在载玻片与聚光镜间滴上浸油。
－ 这种聚光镜还能与干燥型物镜配合使用。特别是高倍率的干燥型物镜,能取得很好的效率。其缺点是照明范围较小,因此与低倍率物镜,特别是4
倍物镜,只能在视场中心部分可以进行暗
场观察，而四周无光线照明,呈现一片黑暗。
暗场效果的好坏与使用时聚光镜的调节有很大关系。举简单暗场调节实例： － 标本上放置一半透明纸。
－ 打开可变孔径光阑,升降带有暗场插片的聚光镜,使半透明的纸上呈现明亮圆形的光斑。 － 调整聚光镜对中螺钉,使照明光轴与物镜光轴重合,此时视场背景应均匀黑暗。 常见故障
现象
视场中一片漆黑
原因
可变孔径光阑未打开
浸油暗场聚光镜未滴油
照明光斑呈环形, 中心黑暗
载玻片太厚
纠正措施 打开孔径光阑
在载玻片与浸油暗场聚光镜之间滴上浸油
上下调节聚光镜使光斑呈圆形
对于专用暗场聚光镜, 由于工作距离较短, 载玻片厚度严格控制在1～1.1mm 之间
载玻片两面不允许有划痕, 麻点, 灰尘(包括盖玻片表面) 必须保持清洁透明 选用带有可变孔径的专用100倍油浸物镜
关小可变孔径光阑
改用浸液型暗场聚光镜
调节聚光镜对中螺钉
黑暗背景中出现许多点状亮点或划痕 载玻片及盖玻片上灰尘，麻点，划痕成象
视场背景很亮倍油镜物镜中无特殊的
可变孔径光阑
100倍物镜中孔径光阑未关闭至NA=1附近
100倍物镜使用了干燥型，暗场聚光镜
聚光镜光轴与物镜光轴不重合
视场背景暗度不均匀 暗场环形光阑中心与聚光
镜光轴不同轴, 使照明光斑非圆形
聚光镜光轴与物镜光轴微量编差
用低倍物镜(如4倍) 时, 视使用浸油暗场聚光镜 场中心有图像, 但四周黑暗
送工厂校正
调节聚光镜对中螺钉
改用干燥型暗场聚光镜
相衬观察法
相衬观察法用来观察无色透明或不染色的活体标本。因为人眼只对亮暗,颜色有识别能力。而这些无色透明的活体,除了折射率与周围介质不同而引起位相的不同外,其亮度与周围介质的亮度完全一样。所以用普通的明场观察无法察觉到这些透明体的存在。如下左图表示光线透过上述的标本。
光与电磁波一样也是以波动的形式存在。我们用一正弦波来描述。波峰值称为振幅,它的平方值即代表亮度(能量)。
下图中的1表示,透过周围介质的正弦波。3表示光线透过标本时产生的衍射光，它的能量很弱(图中已夸大了)。2是曲线1与曲线3迭加的波形。因此,曲线1表示观察背景光的亮度,曲线2表示标本成象的亮度。
可见曲线1与曲线2波形相同,仅仅位相不同而已,这就是明场观察所得的效果。成象光与背景光同样亮度。人眼无法察觉透明体的存在。
我们设法将直射光1的位相改变90°(超前或滞后).如下图,直射光1与衍射光3位相差180°.那么,合成波形2与波形1
相比振幅略有改变,但还不足以达到满意的程度.
如果,我们设法将直射光1的能量衰减75%。如下图,那么波形2将与横坐标重合(为了识别,图中故意夸大),与波形1有明显的差别。观察的效果是,在较暗的背景下,看到黑色的透明体，这就是相衬观察法。
因为相衬板的膜层厚度根据绿光(e光)镀制的,使用时应用绿色滤光照明。
左图为实现相衬观察法的光学原理图。 图中：
1. 环形光阑 2. 聚光镜 3. 物镜 4. 相衬板 通过环形光阑的光束称为直射光。环形光阑常位于聚光镜的焦面上,光束经聚光镜后以倾斜的平行光束照明标本。再经物镜后,使环形光阑的象成在相衬板上。相衬板上镀有改变位相及减弱光能的膜层,它也是环状的,但其尺寸比环形光阑的象稍大。
相衬板的环形必须完全覆盖环形光阑的象(允许偏心),见图示,换句话说,也就是通过环形光阑的直射光,只能从环状相衬板中通过。不允许从环状相衬板外通过。
徕卡公司有简易相衬装置与标准相衬装置之分。所谓简易相衬装置由普通聚光度环形光阑插板,相衬物镜及绿色虑光片组成。不同倍率的相衬物镜必须与不同的环形光阑配合使用。
相衬物镜倍率 环形光阑插板代号
10倍及
20
倍
Ph1
40
倍 Ph2
100倍 Ph3
未对中 对中良好
由于产品离开公司前,环形光阑的中心与相衬环中心已校正好,因此,不再配对中望远镜。 标准相衬装置由转盘聚光镜,相衬物镜,绿色滤光片,对中望远镜及二个六角螺钉扳手组成。
转盘聚光镜带有五个园孔,内置ph1,ph2,ph3三种环形光阑,一个暗场环形光阑DF 和一个用于明场物镜观察的通孔。通过二个六角螺钉扳手可以对四个环形光阑进行调中。对中望远镜插入目镜管可以观察到环形光阑图像与环形相衬板对中状况。
转盘聚光镜
我们上面所介绍相衬图像比背景光暗,称为正相衬,反之,图像比背景明亮称为负相衬。 需要指出,相衬物镜可以作为普通的明场物镜使用,只是由于能量分布的改变,以及杂散光的增加,图像对比度稍逊一些。
相衬图片
偏光观察法
偏光观察法主要用来研究各向异性材料的一些特性。偏光显微镜与生物显微镜的主要区别在于具有偏振元件、波片、补偿器及勃氏镜等特殊组件。
偏振元件：
自然光通过某个光学元件后转换成某种形式的偏振光，这种元件称为偏振元件。更确切的说，应称为起偏振器。常用的起偏振器可用来使自然光转换成直线偏振光。它们是利用反射与折射，双折射和二向色性（或称选择吸收）的原理制成的。
利用反射与折射产生偏振光的元件由玻璃片堆组成；利用双折射产生偏光的元件由两块晶轴方向不同的晶体棱镜胶合而成。这两种方法制造成本比较高。
最常用的则是利用二向色性材料产生偏振光。例如：把一片清洁的聚乙烯醇薄膜浸在碘溶液里，在较高的温度下拉伸，取出后烘干制成偏振薄膜，把其胶合在两块平行度都较好的薄玻 璃中，就成为了一块偏振片。
下图形象地表示了自然光转换成直线偏振光的示意图：
同样的偏振片所处的位置不同名称也不同，如处于聚光镜前面的称为起偏振片，用来产生偏振光。位于物镜和目镜之间的称为验偏振片，用于分析偏振光。
双折射
各向异性材料，如：晶体，它们都具有双折射性能。光线射入的晶体，除了同晶体的晶轴（常称为光轴）同方向的光线不发生双折射外，其余方向的光线均产生双折射现象。
如左图：一根光线垂直射向晶体表面进入晶体后分成两根光线其中一根光线方向不变，垂直晶体另一表面射出，称O 光；另一根光线在晶体第一表面就发生折射，然后仍垂直晶体另一表面射出，称为e 光。这就是双折射。
同样，入射光线倾斜入射晶体，也会产生双折射。 常常将O 光，e 光的折射率差（n 0-n e ）作为双折射的光量量度。若晶体厚度为d ， 则（n 0-n e ）d ＝Δ，Δ称为光程差。
左图为偏光显微镜的原理图： 图中：
1．起偏振片 2. 聚光镜 3. 标本
4．物镜 5. 验偏振片 6. 目镜
自然光经起偏振片后以直线偏振光射向聚光镜并照明标本。若此标本是各向异性的物体，那么每根偏振光经过
标本后就会产生双折射而变成两根光线，它们再经物镜及验偏振片后干涉成像。如果这个标本不是单一的各向异性物体，那么标本各部位具有不同的光程差，于是干涉像各处呈现不同的干涉色。
由干涉色可推知光程差，若晶体厚度已知的话，则进一步推算出双折射（n 0-n e ），于是可以确定标本是什么材料。
起偏振片与验偏振片的透射轴常常互为90º放置（正交），如果标本是各向同性材料，则视场中漆黑一片。如果标本是各向异性材料，那么视场将会变亮，转动其中一个偏振片，使之再次变暗，从转动角度可以推知标本属于何种旋光特性材料。 波片：
波片是使光波经过它们后能对两个相互垂直方向的振动增加一个固定的位相差。位相差为1/4λ称为1/4波片，位相差为1/2λ称为1/2波片，位相差为λ称为全波片。
这些组件中常常标志出快轴的方向。所谓快轴是指光波沿着快轴传播得快，因此该方向的折射率最低。与快轴互为垂直的是慢轴，该方向的折射率最高。
1. 1/4波片
1/4波片常把直线偏振光转换成圆偏振光。当入射的直线偏振光振动的方向与波片的快轴成45度时，转换成圆偏振光。其余角度为椭圆偏振光。见下图，
2. 1/2波片
1/2波片是使直线偏振光的振动方向改变。例如，当直线偏振光的振动方向与1/2波片的快轴为90度时，则位相差改变为180度，振动方向转动了90度。见下图：
3. 全波片
在生物标本中，有时双折射很弱，干涉色常处于黑与灰黑之间，不足以区分。实验证明，当光程差在0.5—0.6微米之间，干涉色变化最灵敏，这种场合下，可插入全波片，让其附加0.56微米的光程差。使干涉色艳丽地呈现出来。
补偿器：
补偿器与波片的区别是前者相位差能连续可变，后者则是固定不变。补偿器可用两个光轴平行的石英楔和一个与石英楔光轴垂直的石英平板组成。利用测微鼓轮可以移动一个石英楔，由此改变位相差。
勃氏镜：
勃氏镜是将物镜的后焦面成像在目镜的焦平面上，供目视观察物镜后焦面的干涉图样。它设计成根据需要可以方便地移入光路中或移出光路。
偏光显微镜除了具备上述特殊组件外，对生物显微镜中原有的光学组件还有特殊要求。
物镜：
物镜是由许多各向同性的光学玻璃组成。如果这些玻璃存在内应力，或者有外界施加的机械力（如包边，胶合等），就会产生双折射，（应力）。破坏了正交的偏振状态，所以，物镜必须消除应力，物镜外毂上刻有Pol 标记以示区别。
聚光镜：
与物镜一样，必须消除应力。
工作台：
使用时，由于物体常需绕物镜光轴旋转，因此采用圆工作台，其四周带有360度等分的精确刻度，格值为1度，还带有游标读数，以提高读数的精度。
旋转时，物体必须仍在目视视野中，工作台的旋转中心跳动量必须在3—5微米内。 有时为了精确计算出光程差，物体的移动量必须高精度地控制。因此，对X.Y 向移动的精度须有定量指示。
转换器：
物体应位于物镜的光轴上，这样才能保证物体移动时不会越出视场。因此转换器孔的中心必须可调，
双目镜筒：
—对于铰链式双目镜筒其分光膜必须具有消偏振特性，这样才能保证改变瞳距时，左右镜筒中的图像的颜色和亮度不变。
—目镜管带有连动机构及限位装置，改变瞳距时确保目镜分划板的水平线位置不变。
目镜：
—带有十字分划板，视度可调。
—带有固定十字分划板水平线的限位机构。
微分干涉相衬观察法
微分干涉相衬观察法适合于观察物体表面存在微观高低差(1/10波长到1个波长的梯度差)的位相物体。可以把梯度差形象地转换成浮雕形式和具有彩色干涉对比色显示出来.且根据需要可以改变干涉对比色。
左图为微分干涉相衬法的光学原理图 图中：
1．起偏振片 2. 屋拉斯顿棱镜 3. 聚光镜 4. 位相物体 5. 物镜 6. 诺马斯基棱镜 7. 验偏振片 8. 镜筒透镜 9. 中间象面
自然光经过振动方向为45°起偏振片后成为线偏振光射向屋拉斯顿棱镜。此棱镜由二个光轴正交且平行于入射面。出射面的双折射晶体胶合而成。通常由石英晶体或方介石晶体制成。
一根入射线偏振光在棱镜的胶合斜面上分离成二个振动方向互相垂直的寻常光(O)和非常光(e),由于棱镜位于聚光镜的焦面上,经聚光镜后O 光和e 光平行地剪切位相物体。然后经物镜
后聚焦在物镜的后焦面上。
所谓诺马斯基棱镜与屋拉斯顿棱镜相仿,其差别仅仅其中一个棱镜的光轴与出射面成一定的角度.目的使O,e 光的交点移出,棱镜胶合面使它与物镜后焦面重合.这样,O,e光经此棱镜后,O光变e 光,e光变O 光,但又合二为一.但振动方向不在同一平面上,因此无法干涉.为此在其后方向安置一块振动方向为45°的验偏振片,使O,e 光在同一振动面内.相干成象于显微镜的中间象面。
综上所述,聚光镜,物镜必须消除应力。
实际情况是无数对O,e 光在物镜后焦面构成一个倾斜的平面,因此棱镜6也倾斜一定的角度。横向移动棱镜6可以改变光程差,来改变干涉对比色。
下列图片是用微分干涉相衬的标本图像:
荧光观察法
荧光观察法在医学领域有着广泛的用途，如免疫学研究的对象是抗原和抗体的反应问题，由
于抗体反应的高度特异性，所以当抗原体发生反应时，只要知道其中一个因子，也就可以知道另一个因子。但是这个过程必须通过染色，荧光染色剂就应运而生。
由于荧光染色的色素只需极稀的浓度便能使激发出明亮的荧光。因而，染色后不会破坏抗体（或抗原）原有的特异活性。
其光学原理示意图如下，以蓝光激发为例：
残余蓝光
紫外光
紫光 蓝光
绿光 蓝光 黄光 黄光 黄光 红光 红外光
激发滤光片 荧光标本 截止滤光片
光源发出多种波长的光线，经激发滤光片后只能通过某种单色的激发光，荧光标本在激发光作用下，激发出某种特定的颜色光（荧光）。由于被激发的荧光能量很弱，只能在黑暗的背景才易于观察到，所以增加了抑制滤光片使残余的激发光不能通过。
早期的荧光观察采用透射照明，它有很大的缺陷，当激发光透过标本组织时，很大部分的光线被衰减掉，到达我们需观察的标本上表面时，只能激发出微弱的荧光。
近代的荧光观察采用落射照明，如下图所示：
图中 ：
1．光源 2. 激发滤光片 3. 物镜 4. 标本 5. 二向性分光镜 6. 抑制滤光片 7. 目镜 光源
根据不同的激发光需要，可以选用三种光源，卤素灯，高压汞灯和氙灯。下图列出菲利浦公司高压汞灯和氙灯的光谱特性曲线。
高压汞灯光谱特性
氙灯光谱特性
由图知，高压汞灯是线状光谱，对于某些波长光线有很高的强度，它适用很多染色法。
氙灯在300～800nm波长内几乎可以看作连续光谱，虽然是某些波长的强度不如汞灯，但它适用于所有荧光染色法。
卤素灯也是连续光谱，它在蓝光，绿光处也有较高的强度（但远低于汞灯，氙灯）因此，对于只用蓝光，绿光激发的简易荧光显微镜可以选用卤素灯。
通常采用50W 汞灯，100W汞灯75W 氙灯及100W 卤素灯作荧光光源。
图中物镜既起成象作用，又起聚光镜作用。为了获得很好的观察效果，在荧光很微弱的场合如细菌发出的荧光。建议采用大数值孔径物镜，如徕卡的荧石物镜，平场复消色差物镜。
正因为物镜又兼聚光镜作用，所以物镜中玻璃材料，透镜间胶合剂，以及浸油必须确保在激发光下不会自发荧光。
为了使用方便，常将激发滤光片，二向性分光镜及抑制滤光片组合成一个模块。对于不同的荧光染色法，必须选用合适的模块才能得到满意的结果。所谓二向性分光镜对激发光具有高反射率，而对激发出的荧光具有高透过率。
常用模块至少四种：
z 近紫外光激发模块 UV z 紫光激发模块 V z 蓝光激发模块 B z 绿光激发模块 G
这些模块对应着不同染色法，如B 模块常用FITC 染色法，G模块常用罗达明B200染色法。
必须特别指出，激发光的波段曲线绝对不能与抑制光的波段曲线部分重迭，否则，视场中的背景光全部是激发光的颜色,而微弱的荧光完全被掩盖住,正如白天天空中无法看到星光一样。
1─激发光 1─激发光 2─抑制光 2─抑制光
蓝光激发如用FITC 染色法,它的激发波段为480～490nm,被激发的荧光波长为510nm。由图知,无论激发光或抑制光在500 nm处均截止,无相交重迭，所以残留的激发光无法通过截止滤光片,视场背景是黑暗的,而荧光则可顺利地透过截止滤光片，形成荧光图像。
徕卡公司设置了许多模块,供不同的染色法选用。 滤光片模块代号 激发光范围
A D E4 H3 I3 K3 L4 M2 N2.1 TX G/R B/G/R
紫外光 紫外光+紫光 蓝光 蓝光 蓝光 蓝光 蓝光 绿光 绿光 绿光 蓝光/绿光
紫外光/蓝光/绿光
注意:
许多荧光标本无法长期保存,特别在激发光照射下,荧光很快消失,所以在停止观察时,应该将激发光挡住,但是汞灯开启到熄灭后,第二次再启动时,必须待灯源冷却后才能进行。为此,须在模块前设置一挡板,可随时关闭,开启。
激发滤光片 BP340-380 BP355-425 BP436/7 BP420-490 BP450-490 BP470-490 BP450-490 BP546/14 BP515-560 BP530-595 BP490/20 BP575/30 BP400/20 BP495/15 BP570/30
二向性分光镜 RKP400 RKP455 RKP455 RKP510 RKP510 RKP510 RKP510 RKP580 RKP580 RKP600 RKP505 RKP600 RKP415 RKP510 RKP590
截止滤光片 LP425 LP470 LP470 LP515 LP515 LP515 BP515-560 LP590 LP590 LP615 BP525/20 BP635/40 BP530/30 BP640/40 BP610/75
荧光显微镜
标本图像(蓝光激发) 标本图像(绿光激发)
荧光模块 标本图像(紫外光激发)
标本图像(蓝光+紫外光激发)
调 制 对 比 观 察 法
调制对比观察法适合于观察表面具有微观高低差的物体。它与微分干涉相衬情况类似，也能把物体以立体的浮雕象呈现出来。但成像原理完全不同。它是把物体中存在的几何梯度差，所导致光学梯度差产生的光强，人为地调制成比背景亮，而另一侧调制成比背景暗，这些亮度差使物体的图像产生立体的效果。
调制板是一种特殊的光振幅滤波器，它有
示，透射率小于1示，透射率10～15可能接近100％。
物体的折射率为n 1
左图形象地表示调制板如何调制物体的光强。中间灰色为背景光强，这样物体细节一侧光强人为地变亮，另一侧人为地变暗，使图像出现立体感。
调制板参数的设计对立体像有很大影响，特别是灰区的宽度和透射率t G 直接影响到浮雕像的形成和成像的灵敏度。
减少t G 值可以提高成像对比度，但调制对比的灵敏度降低了。物体中的某些梯度无法检测出，像的对比度就不能形成。某一t G 值只适用于具有一定梯度范围的物体。实际上，同一物体中也存在很大的梯度差异。这也是这种方法的缺陷。
此外，调制板边界线与梯度的方位也有极大的关系。 如图。β梯度方位角，梯度的检测出是与Cos β成正比。 β越小，像的立体感越强，当β=90度时，像的立体感 就消失。这是这种方法的另一种缺陷。
产 品 介 绍
BME
BME 是一种机械筒长为160mm,教育用显微镜系列,共有八种标准配置,下图为部分外形照
片。
BME (H12) BME (F11)
它的主要部件和技术性能 物镜：
机械筒长160mm 消色差系列, 4/0.10, 10/0.25, 40/0.65, 100/1.25油 目镜：
10X/18带有补偿功能的指针目镜及10X 补偿目镜
BME (H11)
BME 目镜、物镜
镜筒：
－ 出射光轴倾斜45°的单目镜筒,可作360°旋转。
－ 出射光轴倾斜45°的滑板式双筒,可
作360°旋转,双目镜筒可作轴向移动,瞳距调节范围55～75 mm。 支架组:
－ 粗,微调手轮同轴,微调全行程,微调格值3μ,调焦范围:10mm － 四孔转换器,内倾式 － 工作台及聚光镜
1．固定工作台, 带二片压簧, NA0.65转盘式聚光镜
2．机械工作台， X向行程:78mm
Y 向行程:35mm NA1.2阿贝聚光镜,
上下升降范围,9mm － 照明
1． 7W荧光灯
2． 12W卤素灯,光亮连续可调
选构件:
－ 视场平坦度较好的E2物镜系列,或PL 平视场消色差物镜 － 5X惠更斯目镜 － 15X广角补偿目镜 － 反光镜 － 单目示教镜
仪器主要特点:
－ 成象清晰,鉴别率高； － 物镜齐焦性能好；
－ 转换器内倾式,属教育显微镜的创举； － 各传动部分平稳,舒适(扭力矩定量控制)使用寿命长；
－ 支架一体化,仪器刚性好,加工精度高； － 各组件互换性能好；
－ 双目镜筒光轴平行度好,长时间观察不易疲劳；
－ 外形美观,线条流畅； － 长寿命卤素灯(>1000小时)；
－ 电器系统符合UL,VDE,CE 等标准。
标准配置表 组件名称 F11 4X 消色差物镜 10X 消色差物镜 40X 消色差物镜 100X 消色差物镜 10X 指针目镜 10X 目镜
z z
z
z z
z z
z
z
z z
单目镜筒 z 双目镜筒 固定工作台, 转盘式聚光镜 机械工作台, 阿贝聚光镜 120V7W 荧光灯, 支架组 230V7W 荧光灯支架组 120V12W 卤素灯支架组 230V12W 卤素灯支架组
F12 z z z z
F21 z z z z z
F22 z z z z
H11 z z z z z
H12 z z z z
H21 z z z z
H22 z z z z z
z z z z z
z z z z z z
z z
z z
z z
z z
DME
DME 是徕卡公司成功地将无限远系统用于教育显微镜中的范例,它融入了高，精，尖端技术的高档次教育实验室显微镜,荣获了2000年瑞士苏黎士世界大奖。
图中:
1．目镜 2. 双目镜筒 3. 转换器 4. 物镜
5. 机械工作台 6. 阿贝聚光镜 7. 支架 8. 亮度调节手轮 9. 聚光镜对中螺钉 10. 聚光镜调节手轮. 11. 粗微调节手轮
它的主要部件和技术性能(基本配置) 物镜：
无限远消色差系列 4X/0.10 10X/0.22 40X/0.65 100X/1.25
油
目镜：
10X/18带有补偿功能的指针目镜及10X 补偿目镜
镜筒：
－ 出射光轴倾斜45°的铰链式双目镜筒,可作360°旋转
视度调节范围±5屈光度,瞳距调节范围:55～75mm － 分光比为1:1的叁目镜筒
双目镜筒 三目镜筒 支架组:
－ 粗微调手轮同轴,微调全行程,微调格值3μ,调焦范围17mm － 四孔转换器，内倾式 － 机械工作台: X向行程 76mm
Y 向行程 40mm
－ 聚光镜: 干湿二用,NA0.90 及NA1.25油
上下,升降范围: 15mm 带有调中装置
－ 照明系统:临界照明,或库勒照明
1. 12V20W卤素灯 2. 亮度连续可调
3. 电压自动识别
临界照明，右手轮工作台
选购件: － 物镜
1.视场较平坦的C 型消色差物镜: 10x/0.22, 20x/0.40, 40x/0.65, 63x/0.75, 100x/1.25油
2. N 型平场消色差物镜: 5x/0.12, 10x/0.25, 20x/0.40, 40x/0.65, 63x/0.80, 100X/1.25油
3. 视场较平坦的C 型消色差相衬物镜: 10x/0.22, 20x/0.40, 40x/0.65, 100x/1.25油
－ 镜筒:： 分光比1:1的三目镜筒
－ 工作台：左手机械工作台； 临床用机械工作台 － 暗场插片 － 起偏镜和验偏镜 － 15x/14广角补偿目镜
注： 除了上述选购件外,徕卡公司其余很多组件如HC 型镜筒,HC型目镜,落射照明装置,落射荧
光装置,CCD 摄影等均可互换。使显微镜除了适用生物领域,还适用其它领域中。
仪器主要特点
－ 采用无限远物镜视场清晰范围高于同类型物镜,且具有防盗装置； － 优越的齐焦性能,可以与徕卡公司的高档物镜(为荧石物镜)互换； － 各传动部件制造精良,灵敏度高,传动平稳,使用寿命长； － 支架一体化,刚性好,加上各种附件后不会改变仪器的原有精度；
－ 支架制造精度高,可以方便地安装徕卡公司的各种组件,为产品的升级带来极大的方便.； － 配用徕卡公司的合适的部件后,可以扩展到其它领域如金相,半导体等； － 铰链式双筒,操作方便,两光轴平行度好,长时间观察不会疲劳； － 仪器亮度高,灯泡寿命高于2000小时；
－ 仪器能110V～230V自动识别,电器系统符合UL,VDE,CE 标准； － 外形美观,充分考虑了人机工程学。
DMLS
DMLS 是一种高档次的实验室显微镜,它由许多种基本部件组合而成。标准化的部件使用户根据各自的需求,几乎可以组合成无限多的型式。
图中：
1． 目镜 2. 双目镜筒 3. 转换器 4. 物镜 5. 机械工作台 6. 聚光镜 7. 可变视场光阑 8. 支架 9. 亮度调节手轮 10. 粗,微调节手轮 11. 聚光镜对中螺钉 12.聚光镜调节手轮
它的主要部件和技术性能 物镜:
可以选用四种类型:
－视场较平坦的C 型消色差物镜：4x/0.1, 10x/0.22, 20x/0.40, 40x/0.65, 63x/0.75,
100x/1.25油
－平场消色差物镜：2.5x/0.07, 5x/0.12, 10x/0.25, 20x/0.40, 40x/0.65, 63x/0.80,
100x/1.25
油
－平场半复消色差物镜：1.6x/0.05, 5x/0.12, 10x/0.30, 20x/0.50, 40x/0.70,
100x/1.30油
－平场复消色差物镜：20x/0.60,40x/0.75,40x/1.25-0.7油,63x/1.40油,100x/1.40-0.70油 注: 这些物镜分别有用于相衬,偏光等观察法之分
目镜 (视场光阑四周无色, 用HC 字母区别) － HC 10X/20 广角目镜,视度可调,高眼点 － HC 10X/22 广角目镜,视度可调,高眼点 － HC10X/25 超广角目镜,视度可调,高眼点 － HC 12.5X/16 广角目镜
DMLS目镜、物镜 镜筒:
－ 出射光轴倾斜30°的铰链式双目镜筒,可作360°旋转,二目镜管带有弹性槽,瞳距调节范
围:55～75mm。
－ 出射光轴倾斜30°的铰链式用于偏光的双目镜筒,可作360°旋转, 二目镜管带有弹性槽,
瞳距调节范围:55～75mm。
－ 出射光轴倾斜可调(0°～35°)的铰链式双目镜筒,二目镜管带有弹性槽,瞳距调节范
围:55～75mm。
－ 分光比为1:1的三目镜筒。
HC
双 筒
HC三 筒 注:上述镜筒均有补偿物镜放大色差的功能。 支架组:
－ 粗微调手轮同轴,微调全行程,微调灵敏度≤0.1μ微调格值3μ调焦范围:20mm； － 五孔转换器，内倾式； － 机械工作台 X向行程：76mm Y向行程：50mm － 聚光镜
1．可插入多种插片的干湿二用的明场聚光镜(NA0.90/NA1.25油)
2．明场, 暗场, 相衬转盘式干, 湿二用聚光镜. (NA0.90/NA1.25油) 3．偏光聚光镜(NA0.85)
— 照明系统：库勒照明,12V30W
亮度连续可调 电压自动识别
选购件：
各种标准化部件不胜枚举。选用这些部件,可以实现暗场观察法,相衬观察法,微分干涉相衬观察法,荧光观察法,偏光观察法以及用于金相及半导体工业的落射照明装置等。
还有2人和5人示教系统,描绘装置,CCD
摄像装置等附件。
照相装置 CCD摄像装置
描绘装置 二人示教装置