嘉兴学院学报第２４卷第３期２Ｑ１２年５月
・８８“）ｕｒｎａＬｏｆｊｉａｃｃｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＶ０１．２４Ｎｏ．３２０ｌＺ．５１０．３９６９／ｉ．１ＳＳＦＩ．１００８～６７８ｌ，２０１２．０３，０１８
人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定
韩冬，徐煌，张新红，肖燕萍
（嘉兴学院医学院，浙江嘉兴３１４００１）
摘要：取脂肪吸脂术分离的脂肪细胞，在胰酶和胶原酶的作用下分离、培养ＡＤＳＣ并对其进行增殖能
力、干妇胞表面标志的测定以及转录因子水平的捡碱．分离、培养的ＡＤＳＣ在羌镜下呈圆形、贴壁生长，可见小的胞浆突起．经细胞增殖曲线绘制，细胞在ｌ～３ｄ处于生长适应期，而３～６ｄ处于对数生长期，８～１０ｄ后细胞增殖明显减缓．流式细胞术鉴定细胞表面标志结果显示分离培养的细胞表述间充质干细胞表面标志，而不表达造血干细胞和成纤维细胞表面标志．对培养的ＡＤＳ（；检演ｌ其转录冠子Ｎａｎｏｇ和ｏｃｔ一４曲表达，结果显示体外培养的ＡＤＳＣ在第１５代仍可稳定表达Ｎａｎｏｇ和ｏｃｔ一４．
关键词：脂肪间充质干细胞；分离；鉴定
中圈分类号：Ｑ２４文献标识码：Ａ．文章编号：１００８—６７８１（２０１２）０３—００８８—０４
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．ＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨ－，ｍａｎＡｄｉｐｏｓｅ－－ｄｅｒｉｖｅｄＳｔｅｍＣｅｌｌｓ
ＨＡＮＤｏｎｇ．ＸＵＨｕａｎｇ．ＺＨＡＮＧＸｉｎ—ｈｏｎｇ，ＸＩＡＯＹａｎ—ｐｉｎｇ
（ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅＤｆｊｉａｘｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉａｘｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ３１４００１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡＤＳＣｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｈｕｎ－ｔａｎｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅａｃｑｕｉｒｅｄｆｒｏｍｐｅｏｐｌｅｗｈｏ
ｕｎｄｅｒｗｅｎｔｅｌｅｃｔｉｖｅｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ．ＷｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｏｆｔｈｅＡＤＳＣｓ，ａｎｄｔｈｃｎａｎａｌｙｚｅｄＡＤＳＣｓｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｐｒｏ［（ｔｅｂｙｆｌｏｗｅｙｔｏｍｅｌｒｙ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓ？；ｉｃｍｌｅｖｅｌｓｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴＰＣＲ．ＴｈｅｒｅｓｕＩｔｓｏｆｆｌｏｗｃｖｔｏｍｅｔｒｙｉｄｅｉｌｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｈｏｗ－ｔｈａｔＡＤＳＣｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｔｈｅｓｕｒ｛ａｃｅｍａｒｋｅｒｓｏＩ１）ｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｔｅｍｃｅｉｌｓｉｎｓｔｅａｄｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｏｆｈｃｍａｔｏｐｏｉｅｔｔｃｓｔｅｍｃｅｌ［ｓｏｒｏｆｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ．Ｉｎｃｕｌｔｕｒｉｎｇｐｅｒｉｏｄｏｆｐａｓｓａｇｅ１Ｓ，ＡＦ）ＳＣｓａｌｓｏ＂ａｂｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄＮａｎｏｇａｎｄｏｃｖ４，
Ｋｅｙｗｎｒｄｓ：ａｄｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄｓｔｒｏｉｎａｌｃｅｌｌｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
脂肪阏充质干细胞（ａｄｉｐｏｓｅ—ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ，ＡＤＳＣｓ）是一类存在于脂肪基质的具有多向分化潜能的成体干细胞．『１＿２１脂肪问充质于细胞相对于目前应用较多的骨髓问充质于细胞（ＢＭＳＣ）来说，具有来源丰富、容易获得这一独特优点．ｒ。１因此，为确定其是否适合细胞治疗，需要对ＡＤＳＣ进行生物学性质及其体外增殖能力和干细胞特性的鉴定．本研究对来源于脂肪吸脂术分离的ＡＤＳＣ进行细胞增殖能力、细胞表面标志和转录因子表达水平的检测．为以ＡＤＳＣ为种子细胞进行的细胞治疗提供实验基础，
收稿日期：２０ｌｌ一１２—０３
基金项目：浙江省教育厅科研项目（Ｙ２００９０９４４６）；嘉兴市科技局一般科研项目（２９１ｌＡＹｌ０４８—４）．浙江省优秀青年教师资叻计划ｌ
作者简介：韩冬（１９７６）．男，吉林吉林人，博士．嘉兴学院医学院教师，从事干细胞研究；通讯作者；徐煌ｆ１９７４一）－女，吉林吉林人，博士，嘉兴学院医学院教师．从事干细胞研究
网络出版日寸间：２０１２—０４—２８０８，２９网络Ｈ｛版地ｔｌ｝：ｈｔｔｐ：／ｉｗｗｗ．ｃｎｋｉ．鹏ｔ，＋ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３３１２７３．Ｚ．２０１Ｚ（］４２８．０８２９．００９ｈｒｍｌ？ｕｉｄ＝
韩冬．徐煌，张新红，等：人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定・８９・
１方法
１．１ＡＤＳＣ的分离
取脂肪吸脂术抽取的脂肪组织ｌＯＯｍｇ，加入ＰＢＳ盐溶液冲洗３次，然后加入０．５％的胰酶和０．１％胶原酶各１０ｍＩ。，在３７℃的恒温摇床中振荡培养１５ｒａｉｎ，１０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ去上清，以去除悬浮脂肪，用０．１６ｍｏｌ／Ｌ的ＮＨ。ＣＩ溶解红细胞，ＰＢＳ洗涤３次，２００目纱网过滤，分离单个核细胞，移人培养皿中加入ｌｏ％含ＦＢＳ的ＤＭＥＭ，在３７℃５％ＣＯ：条件下培养．
１．２ｃｃｋ一８测定细胞增殖
将密度分别为１．２５×１０５／ｍｌ。、２．５×１０５／ｍｌ。、５×１０５／ｍＩ。、１×１０６／ｍ！，、２×１０６／ｍＬ细胞接种于９６孔板内，以细胞数为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线．在９６孔板中每孔加入第３代ＡＤＳＣ的５×１０３／ｍＩ。细胞悬液１００ｐＬ，放人培养箱中培养，然后再每孑Ｌ加入ＣＣＫ一８溶液ｌｏ“Ｉ。，放入培养箱中培养１ｈ，在酶标仪上４５０ｎｍ处测定吸光度，以６３０ｎｍ的波长为参比波长，每组设３个复孔．
１．３流式细胞仪鉴定细胞表面标志
分别取第３和第７代分离培养的ＡＤＳＣ，重新调整细胞浓度至１×１０７／ｍＩ。，分别与ＣＤｌ３、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤｌ０５、ＨＬＡ—ＤＲ的抗体作用２０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３次，再用２００ｐＬＰＢＳ重悬细胞，流式细胞仪上进行检测．
１．４ＲＴ—ＰＣＲ测定转录因子
Ｔｒｉｚｏｌ法提取第３和第１５代培养的ＡＤＳＣ的ＲＮＡ．用ＲＴ—ＰＣＲ扩增转录因子Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ一４并以ＧＡＰＤＨ作对照．ＰＣＲ扩增条件为：９５℃４ｍｉｎ，９５℃３０Ｓ，５５℃３０Ｓ，７２℃１ｒａｉｎ，４０个循环，７２℃１０ｍｉｎ，ＰＣＲ产物经ｌ％琼脂糖凝胶电泳检测．ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅＶ４．６软件分析数据计算ｍＲＮＡ的相对表达量．
２结果
２．１ＡＤＳＣｓ光镜观察结果
分离培养的脂肪间充质干细胞大部分在２４ｈ内贴壁，在显微
镜下观察，贴壁细胞呈圆形，核大呈椭圆形，有小的胞浆突起，
原代培养的细胞在３～４ｄ达到９０％融合，见图１．
２．２体外培养ＡＤＳＣｓ的增殖
从图２可以看出，在最初的３天ＡＤＳＣ的生长处于适应阶段，
在３～６ｄ进入对数生长期，而第８ｄ开始细胞的生长明显减慢．图１体外培养的ＡＤＳＣＩ×１００）细胞增殖试验说明第８～１２ｄ细胞的增殖受到抑制．。
２．３脂肪干细胞表面标志鉴定（见表１）。
表１ＡＤＳＣ表面标志的鉴定善”
——磊ｉ———１两西百—丙聂耳ｒ１商聂面Ｆ至”
《４０
柏
∞
蕾
曩∞
ｏ２４时『Ｈ】‰８””
图２ＡＤＳＣ体外培养的经时变化由表１可见，分离培养的细胞在传代至第３、７、１５代时
均高表达特异的干细胞表面标志ＣＤｌ３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤｌ０５，而ＣＤ３４、ＣＤ４５和ＨＩ。Ａ—ＤＲ呈阴性
嘉兴擘院学报第２４卷第３期
表达．
∞
２。４ＲＴ—ＰＣＲ结果分析
转录因子Ｎａｎｏｇ、ＯＣｔ一４和对照ＧＡＰＤＨ的ＰＣＲ产物墓”
经凝胶呈像分析结果显示，第３和第１５代ＡＤＳＣ的干细簪”
胞特征性转录因子Ｎ。ｎ。ｇ秘ｏｃｔ一４都呈阳性表达，强者之ｉ＊
岩
间的表达没有明显差异，见图３．１２０
Ｅ
３讨论”
与ＢＭＳＣ相比ＡＤＳＣ具有来源充足的优点，与胚胎干“”“４
细胞相比ＡＤＳＣ的应用不涉及伦理学问题，同时ＡＤＳＣ的图３转录因子Ｎａｎ。ｇ／ｏｃｔ４ｍＲＮＡ表达水平自体移植无免疫排斥反应的发生，因此ＡＤＳＣ作为组织工程良好种子细胞来源，临床应用前景ｔ分广阔．卜６１但目前对ＡＤＳＣ的研究还不深入，有些研究结论互相之问存在差异，因此有必要深入地研究ＡＤＳＣ的生物学特性，为其进一步应用提供实验数据．
通过绘制细胞生长曲线可知，本研究分离培养的ＡＤＳＣ在体外培养时，可连续传代２０代以上，片保持较强的增殖活力．从图２中可知，在最初的３ｄ，分离培养的ＡＤＳＣ处于生长适应阶段；在第３～６ｄ，进入对数生长阶段；而从第８ｄ开始，细胞的生长速度明显减慢，细胞增殖受到抑制．
通过流式细胞术分析，本研究分离培养的细胞可知第３、７、１５代时均高表达特异的细胞表面标志ＣＤ］３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤｌ０５，而ＣＤ３４、ＣＤ４５和ＨＬＡ—ＤＲ呈阴’眭表达．ＣＤ３４和ＣＤ４５是已知的造血于细胞表面标记，干缨胞表面标记ＣＤｌ３、ＣＤ２９、ＣＤ４４・在分离细胞的第３、７、１５｛弋持续阳性表达，说明分离的脂肪米源的间充质细胞具有干细胞的特征．而ＣＤ３４和ＣＤ４５是造血干细胞表面标记，ＨＩ。Ａ—ＤＲ是成纤维细胞的表面标记，Ｅｒ－ａ］经本实验分离培养的ＡＤＳＣ中这三种细胞表面标记在第３、７、１５代持续阴性表达，说明分离的细胞不表达造血干细胞表面标志和成纤维细胞表面标志及肉皮细胞表面标志，不是造血干细胞和成纤维细胞．
通过ＲＴ—ＰＣＲ法，本研究检测了维持胚胎干细胞全能性的重要转录因子ｏｃｔ４以及维持干细胞自我更耨潜能重要的转录因子Ｎａｎｏｇ二者的ｍＲＮＡ水平．干细胞相关转录因子的表达是鉴定细胞具有多能性和自我更新潜能的重要指标．在干细胞转录因子巾，ＯＣｔ～４被认为是维持其全能性不可缺少的，在卵细胞、早期胚胎和其他大部分具有分化潜能的下细胞中均表达ｏｃｔ一４，其可通过与其他转录因子协调作用，调控下游的关键基因表达，决定细胞的命运，分化成不同胚层的细胞．本研究分离培养的细胞ｏｃｔ一４在第３代和第１５代培中呈阳性表达，说明其具有干细胞的基本生物学特性．Ｎａｎｏｇ在胚胎干细胞，胚胎生殖细胞以及胚胎癌细胞中表达高，在成体组织中不表达Ｎａｎｏｇ．凹１。］Ｎａｎｏｇ基因可维持胚胎肝细胞的多熊性，Ｎａｎｏｇ处于于细胞多向分化调控网络的上游，可与ｇａｔａ６／４和Ｓｏｘ２等等其他转录因子作用，调节下游基因，决定细胞命运．＝ｌ¨本研究的结果显示，在第３代和第１５代培养的ＡＤＳＣ中ｎａｎｏｇ都呈阳性表达，且鼹者之间的表达无明显差异，说明分离培养的ＡＤＳＣ在体外连续传代１５代以上仍具有干细胞特性．
本研究从人吸脂术抽吸物中，通过酶消化法进行分离具有干细胞特性的ＡＤＳＣ，并在体外进行培养和鉴定，结果表明该细胞具有很强的增殖活性，且能稳定表达干细胞表面标志，为进一步研究ＡＤＳＣ的生物学特征奠定了基础．
参考文献：。
［１］ＮｔＮ（ｉＨ，ｌ，】ＮＧ．ＬＵＥ’ＪＦ．ｅｔａ１．Ｎｔｕｉ＇ｏｎｌｉｋｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ。ｆａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ—ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｓｍｃ）ｏｌｈ
ｒａｕｓｃ［ｅｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２００６，７４（９／Ｉｏ）：５１０—５１８．
ｒ２］ＳＡＦＦＯＲＩ）ＫＭ，ＳＡＦＦＯＲＤＳＤ，ＧｉｍｂｅｌｅｊＭ，ｅｔａｌＣｈａｒａｃｔｅｒ［ｚａｌｉｏｎｏｆｎｅｕｒｏｎａｌ／ｇｌｉａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｔｍｕｒｉｎｅａｄｉｐｏｓｅ
韩冬，徐煌，张新红，等：人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定
表ｌ茶新那敏包衣片含量测定结果（开＝３
磊戛号ｌ——蝴ｍｇ兰＂Ｒ星竺－Ｉ！！！！兰竺篓ｒａｇ＂片窆－Ｉ！竺兰
１１０３０３１４．９０．７４６０．００・９８
１１１１１１１１：！！：！！坠旦——————土坠—一
考察了包衣材料在０．０１ｔｏｏｌ・Ｌ＿１氢氧化钠溶液和０．１ｍｏ］・Ｌ“盐酸溶液介质中的紫外吸收，结果表明，按片重增重３％，所用包衣材料在２７５ｎｍ和３１ｌｎｍ处均无紫外吸收．图１、图２表明，缺氨茶碱的李白样品在无水茶碱最大吸收波长２７５ｎｍ处无吸收；缺盐酸溴己新的空白样品在盐酸溴己新最大吸收波长３１１ｎｍ处几乎无吸收，均不会干扰测定，故选择波长２７５ｎｍ与３１１ｎｍ分别作为氨茶碱和盐酸溴己新的测定波长．
对茶新那敏包衣片可能影响氨茶碱和盐酸溴己新含量测定的各因素进行了考察，方法验证表明，茶新那敏片经包衣后不影响原质量标准中氨茶碱和盐酸溴己新含量测定结果，见表１数据．茶新那敏包衣片不需除去包衣材料，叮直接取样测定．建立的方法可作为茶新那敏包衣片含量测定及稳定性考察方法．
对茶新那敏包衣片３批中试样品６个月加速试验和长期稳定性考察，结果表明・与茶新那敏片比较，包衣后能显著提高茶新那敏片的稳定性，效果良好．
参考文献：
［１］国家食品药品监督管理局．ＷＳ一１０００１一（ＨＤ－０３３６）一２００２药品标准茶新那敏片质量标准［ｓ］－２００２・
［２］吕长淮盐酸溴己新片溶出度测定方法的研究［】：．药物分析杂志，２００８，２８（１０）：１７４４—１７４６・
［３］丁洁，王伟宁，孙玲．ＲＰｊ－ＨＰＩ。Ｃ法测定盐酸溴已新片含量及有关物质［Ｊ］．药物分析杂志・２００６，２６（４１ｔ５０８—５ｌ。・［４］卓丌华．唐彦．高效液相色谱法测定茶新那敏片含量与含量均匀度［』］．医药导撤・２００８・２７（ｚ）：２１９—２２０・
（责任编辑王连桥）
人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定
作者：
作者单位：
刊名：
英文刊名：
年，卷(期)：韩冬， 徐煌， 张新红， 肖燕萍， HAN Dong， XU Huang， ZHANG Xin-hong， XIAO Yan-ping嘉兴学院医学院,浙江嘉兴,314001嘉兴学院学报Journal of Jiaxing University2012,24(3)
1.NING H;LIN G;LUE T F Neuron-like differentiation of adipose tissue-derived stromal cells andvascular smooth musclecells 2006(9/10)
2.SAFFORD K M;SAFFORD S D;Gimbelej M Characterization of neuronal/glial differentiation of murineadiposederived adult stromal cells 2004(02)
3.LOUIS CASTEILLA;VALERIE P B;PATRICK LAHARRAGUE Adipose-derived stromal cells:Their identity anduses in clinical trials,an update 2011(04)
4.DRAPER J S;MOORE H D;RUBAN L N Culture and characterization of human embryonic stem cells 2004(04)
5.RARK S R;OREFFO R O;TRIFFIT J T Interconversion potential of cloned human marrow adipocytes invitro 1999(06)
6.KOCH R J;GORTI G K Tissue engineering with chondrocytes 2002(01)
7.LIN C S;XIN Z C;DENG C H Defining adipose tissue derived stem cell in tissue and in culture2010(06)
8.MADDOX J R;LIAO X;LI F Effects of Culturing on the stability of the Putative Murine Adipose DerivedStem Cells Markers 2009(01)
9.NADRISS;SOLEIMANIM;KIANIJ Multipotenet mesenchymal stem cells from adult human eye conjunctivastromal cells 2008(03)
10.EZEH U I;TUREK P J;REIJO R A Human embryonic stem cell genes OCT4,NANOG,STELLAR,and GDF3areexpressed in both seminoma and breast carcinona[外文期刊] 2005(10)
11.PRINGLES;DEBARIC;DELLACCRIOF Mesenchymal differentiation propensity of a human embryonic stemcelll line 2011(02)
引用本文格式：韩冬.徐煌.张新红.肖燕萍.HAN Dong.XU Huang.ZHANG Xin-hong.XIAO Yan-ping 人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定[期刊论文]-嘉兴学院学报 2012(3)
嘉兴学院学报第２４卷第３期２Ｑ１２年５月
・８８“）ｕｒｎａＬｏｆｊｉａｃｃｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＶ０１．２４Ｎｏ．３２０ｌＺ．５１０．３９６９／ｉ．１ＳＳＦＩ．１００８～６７８ｌ，２０１２．０３，０１８
人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定
韩冬，徐煌，张新红，肖燕萍
（嘉兴学院医学院，浙江嘉兴３１４００１）
摘要：取脂肪吸脂术分离的脂肪细胞，在胰酶和胶原酶的作用下分离、培养ＡＤＳＣ并对其进行增殖能
力、干妇胞表面标志的测定以及转录因子水平的捡碱．分离、培养的ＡＤＳＣ在羌镜下呈圆形、贴壁生长，可见小的胞浆突起．经细胞增殖曲线绘制，细胞在ｌ～３ｄ处于生长适应期，而３～６ｄ处于对数生长期，８～１０ｄ后细胞增殖明显减缓．流式细胞术鉴定细胞表面标志结果显示分离培养的细胞表述间充质干细胞表面标志，而不表达造血干细胞和成纤维细胞表面标志．对培养的ＡＤＳ（；检演ｌ其转录冠子Ｎａｎｏｇ和ｏｃｔ一４曲表达，结果显示体外培养的ＡＤＳＣ在第１５代仍可稳定表达Ｎａｎｏｇ和ｏｃｔ一４．
关键词：脂肪间充质干细胞；分离；鉴定
中圈分类号：Ｑ２４文献标识码：Ａ．文章编号：１００８—６７８１（２０１２）０３—００８８—０４
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．ＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨ－，ｍａｎＡｄｉｐｏｓｅ－－ｄｅｒｉｖｅｄＳｔｅｍＣｅｌｌｓ
ＨＡＮＤｏｎｇ．ＸＵＨｕａｎｇ．ＺＨＡＮＧＸｉｎ—ｈｏｎｇ，ＸＩＡＯＹａｎ—ｐｉｎｇ
（ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅＤｆｊｉａｘｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉａｘｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ３１４００１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡＤＳＣｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｈｕｎ－ｔａｎｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅａｃｑｕｉｒｅｄｆｒｏｍｐｅｏｐｌｅｗｈｏ
ｕｎｄｅｒｗｅｎｔｅｌｅｃｔｉｖｅｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ．ＷｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｏｆｔｈｅＡＤＳＣｓ，ａｎｄｔｈｃｎａｎａｌｙｚｅｄＡＤＳＣｓｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｐｒｏ［（ｔｅｂｙｆｌｏｗｅｙｔｏｍｅｌｒｙ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓ？；ｉｃｍｌｅｖｅｌｓｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴＰＣＲ．ＴｈｅｒｅｓｕＩｔｓｏｆｆｌｏｗｃｖｔｏｍｅｔｒｙｉｄｅｉｌｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｈｏｗ－ｔｈａｔＡＤＳＣｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｔｈｅｓｕｒ｛ａｃｅｍａｒｋｅｒｓｏＩ１）ｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｔｅｍｃｅｉｌｓｉｎｓｔｅａｄｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｏｆｈｃｍａｔｏｐｏｉｅｔｔｃｓｔｅｍｃｅｌ［ｓｏｒｏｆｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ．Ｉｎｃｕｌｔｕｒｉｎｇｐｅｒｉｏｄｏｆｐａｓｓａｇｅ１Ｓ，ＡＦ）ＳＣｓａｌｓｏ＂ａｂｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄＮａｎｏｇａｎｄｏｃｖ４，
Ｋｅｙｗｎｒｄｓ：ａｄｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄｓｔｒｏｉｎａｌｃｅｌｌｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
脂肪阏充质干细胞（ａｄｉｐｏｓｅ—ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ，ＡＤＳＣｓ）是一类存在于脂肪基质的具有多向分化潜能的成体干细胞．『１＿２１脂肪问充质于细胞相对于目前应用较多的骨髓问充质于细胞（ＢＭＳＣ）来说，具有来源丰富、容易获得这一独特优点．ｒ。１因此，为确定其是否适合细胞治疗，需要对ＡＤＳＣ进行生物学性质及其体外增殖能力和干细胞特性的鉴定．本研究对来源于脂肪吸脂术分离的ＡＤＳＣ进行细胞增殖能力、细胞表面标志和转录因子表达水平的检测．为以ＡＤＳＣ为种子细胞进行的细胞治疗提供实验基础，
收稿日期：２０ｌｌ一１２—０３
基金项目：浙江省教育厅科研项目（Ｙ２００９０９４４６）；嘉兴市科技局一般科研项目（２９１ｌＡＹｌ０４８—４）．浙江省优秀青年教师资叻计划ｌ
作者简介：韩冬（１９７６）．男，吉林吉林人，博士．嘉兴学院医学院教师，从事干细胞研究；通讯作者；徐煌ｆ１９７４一）－女，吉林吉林人，博士，嘉兴学院医学院教师．从事干细胞研究
网络出版日寸间：２０１２—０４—２８０８，２９网络Ｈ｛版地ｔｌ｝：ｈｔｔｐ：／ｉｗｗｗ．ｃｎｋｉ．鹏ｔ，＋ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３３１２７３．Ｚ．２０１Ｚ（］４２８．０８２９．００９ｈｒｍｌ？ｕｉｄ＝
韩冬．徐煌，张新红，等：人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定・８９・
１方法
１．１ＡＤＳＣ的分离
取脂肪吸脂术抽取的脂肪组织ｌＯＯｍｇ，加入ＰＢＳ盐溶液冲洗３次，然后加入０．５％的胰酶和０．１％胶原酶各１０ｍＩ。，在３７℃的恒温摇床中振荡培养１５ｒａｉｎ，１０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ去上清，以去除悬浮脂肪，用０．１６ｍｏｌ／Ｌ的ＮＨ。ＣＩ溶解红细胞，ＰＢＳ洗涤３次，２００目纱网过滤，分离单个核细胞，移人培养皿中加入ｌｏ％含ＦＢＳ的ＤＭＥＭ，在３７℃５％ＣＯ：条件下培养．
１．２ｃｃｋ一８测定细胞增殖
将密度分别为１．２５×１０５／ｍｌ。、２．５×１０５／ｍｌ。、５×１０５／ｍＩ。、１×１０６／ｍ！，、２×１０６／ｍＬ细胞接种于９６孔板内，以细胞数为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线．在９６孔板中每孔加入第３代ＡＤＳＣ的５×１０３／ｍＩ。细胞悬液１００ｐＬ，放人培养箱中培养，然后再每孑Ｌ加入ＣＣＫ一８溶液ｌｏ“Ｉ。，放入培养箱中培养１ｈ，在酶标仪上４５０ｎｍ处测定吸光度，以６３０ｎｍ的波长为参比波长，每组设３个复孔．
１．３流式细胞仪鉴定细胞表面标志
分别取第３和第７代分离培养的ＡＤＳＣ，重新调整细胞浓度至１×１０７／ｍＩ。，分别与ＣＤｌ３、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤｌ０５、ＨＬＡ—ＤＲ的抗体作用２０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３次，再用２００ｐＬＰＢＳ重悬细胞，流式细胞仪上进行检测．
１．４ＲＴ—ＰＣＲ测定转录因子
Ｔｒｉｚｏｌ法提取第３和第１５代培养的ＡＤＳＣ的ＲＮＡ．用ＲＴ—ＰＣＲ扩增转录因子Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ一４并以ＧＡＰＤＨ作对照．ＰＣＲ扩增条件为：９５℃４ｍｉｎ，９５℃３０Ｓ，５５℃３０Ｓ，７２℃１ｒａｉｎ，４０个循环，７２℃１０ｍｉｎ，ＰＣＲ产物经ｌ％琼脂糖凝胶电泳检测．ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅＶ４．６软件分析数据计算ｍＲＮＡ的相对表达量．
２结果
２．１ＡＤＳＣｓ光镜观察结果
分离培养的脂肪间充质干细胞大部分在２４ｈ内贴壁，在显微
镜下观察，贴壁细胞呈圆形，核大呈椭圆形，有小的胞浆突起，
原代培养的细胞在３～４ｄ达到９０％融合，见图１．
２．２体外培养ＡＤＳＣｓ的增殖
从图２可以看出，在最初的３天ＡＤＳＣ的生长处于适应阶段，
在３～６ｄ进入对数生长期，而第８ｄ开始细胞的生长明显减慢．图１体外培养的ＡＤＳＣＩ×１００）细胞增殖试验说明第８～１２ｄ细胞的增殖受到抑制．。
２．３脂肪干细胞表面标志鉴定（见表１）。
表１ＡＤＳＣ表面标志的鉴定善”
——磊ｉ———１两西百—丙聂耳ｒ１商聂面Ｆ至”
《４０
柏
∞
蕾
曩∞
ｏ２４时『Ｈ】‰８””
图２ＡＤＳＣ体外培养的经时变化由表１可见，分离培养的细胞在传代至第３、７、１５代时
均高表达特异的干细胞表面标志ＣＤｌ３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤｌ０５，而ＣＤ３４、ＣＤ４５和ＨＩ。Ａ—ＤＲ呈阴性
嘉兴擘院学报第２４卷第３期
表达．
∞
２。４ＲＴ—ＰＣＲ结果分析
转录因子Ｎａｎｏｇ、ＯＣｔ一４和对照ＧＡＰＤＨ的ＰＣＲ产物墓”
经凝胶呈像分析结果显示，第３和第１５代ＡＤＳＣ的干细簪”
胞特征性转录因子Ｎ。ｎ。ｇ秘ｏｃｔ一４都呈阳性表达，强者之ｉ＊
岩
间的表达没有明显差异，见图３．１２０
Ｅ
３讨论”
与ＢＭＳＣ相比ＡＤＳＣ具有来源充足的优点，与胚胎干“”“４
细胞相比ＡＤＳＣ的应用不涉及伦理学问题，同时ＡＤＳＣ的图３转录因子Ｎａｎ。ｇ／ｏｃｔ４ｍＲＮＡ表达水平自体移植无免疫排斥反应的发生，因此ＡＤＳＣ作为组织工程良好种子细胞来源，临床应用前景ｔ分广阔．卜６１但目前对ＡＤＳＣ的研究还不深入，有些研究结论互相之问存在差异，因此有必要深入地研究ＡＤＳＣ的生物学特性，为其进一步应用提供实验数据．
通过绘制细胞生长曲线可知，本研究分离培养的ＡＤＳＣ在体外培养时，可连续传代２０代以上，片保持较强的增殖活力．从图２中可知，在最初的３ｄ，分离培养的ＡＤＳＣ处于生长适应阶段；在第３～６ｄ，进入对数生长阶段；而从第８ｄ开始，细胞的生长速度明显减慢，细胞增殖受到抑制．
通过流式细胞术分析，本研究分离培养的细胞可知第３、７、１５代时均高表达特异的细胞表面标志ＣＤ］３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤｌ０５，而ＣＤ３４、ＣＤ４５和ＨＬＡ—ＤＲ呈阴’眭表达．ＣＤ３４和ＣＤ４５是已知的造血于细胞表面标记，干缨胞表面标记ＣＤｌ３、ＣＤ２９、ＣＤ４４・在分离细胞的第３、７、１５｛弋持续阳性表达，说明分离的脂肪米源的间充质细胞具有干细胞的特征．而ＣＤ３４和ＣＤ４５是造血干细胞表面标记，ＨＩ。Ａ—ＤＲ是成纤维细胞的表面标记，Ｅｒ－ａ］经本实验分离培养的ＡＤＳＣ中这三种细胞表面标记在第３、７、１５代持续阴性表达，说明分离的细胞不表达造血干细胞表面标志和成纤维细胞表面标志及肉皮细胞表面标志，不是造血干细胞和成纤维细胞．
通过ＲＴ—ＰＣＲ法，本研究检测了维持胚胎干细胞全能性的重要转录因子ｏｃｔ４以及维持干细胞自我更耨潜能重要的转录因子Ｎａｎｏｇ二者的ｍＲＮＡ水平．干细胞相关转录因子的表达是鉴定细胞具有多能性和自我更新潜能的重要指标．在干细胞转录因子巾，ＯＣｔ～４被认为是维持其全能性不可缺少的，在卵细胞、早期胚胎和其他大部分具有分化潜能的下细胞中均表达ｏｃｔ一４，其可通过与其他转录因子协调作用，调控下游的关键基因表达，决定细胞的命运，分化成不同胚层的细胞．本研究分离培养的细胞ｏｃｔ一４在第３代和第１５代培中呈阳性表达，说明其具有干细胞的基本生物学特性．Ｎａｎｏｇ在胚胎干细胞，胚胎生殖细胞以及胚胎癌细胞中表达高，在成体组织中不表达Ｎａｎｏｇ．凹１。］Ｎａｎｏｇ基因可维持胚胎肝细胞的多熊性，Ｎａｎｏｇ处于于细胞多向分化调控网络的上游，可与ｇａｔａ６／４和Ｓｏｘ２等等其他转录因子作用，调节下游基因，决定细胞命运．＝ｌ¨本研究的结果显示，在第３代和第１５代培养的ＡＤＳＣ中ｎａｎｏｇ都呈阳性表达，且鼹者之间的表达无明显差异，说明分离培养的ＡＤＳＣ在体外连续传代１５代以上仍具有干细胞特性．
本研究从人吸脂术抽吸物中，通过酶消化法进行分离具有干细胞特性的ＡＤＳＣ，并在体外进行培养和鉴定，结果表明该细胞具有很强的增殖活性，且能稳定表达干细胞表面标志，为进一步研究ＡＤＳＣ的生物学特征奠定了基础．
参考文献：。
［１］ＮｔＮ（ｉＨ，ｌ，】ＮＧ．ＬＵＥ’ＪＦ．ｅｔａ１．Ｎｔｕｉ＇ｏｎｌｉｋｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ。ｆａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ—ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｓｍｃ）ｏｌｈ
ｒａｕｓｃ［ｅｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２００６，７４（９／Ｉｏ）：５１０—５１８．
ｒ２］ＳＡＦＦＯＲＩ）ＫＭ，ＳＡＦＦＯＲＤＳＤ，ＧｉｍｂｅｌｅｊＭ，ｅｔａｌＣｈａｒａｃｔｅｒ［ｚａｌｉｏｎｏｆｎｅｕｒｏｎａｌ／ｇｌｉａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｔｍｕｒｉｎｅａｄｉｐｏｓｅ
韩冬，徐煌，张新红，等：人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定
表ｌ茶新那敏包衣片含量测定结果（开＝３
磊戛号ｌ——蝴ｍｇ兰＂Ｒ星竺－Ｉ！！！！兰竺篓ｒａｇ＂片窆－Ｉ！竺兰
１１０３０３１４．９０．７４６０．００・９８
１１１１１１１１：！！：！！坠旦——————土坠—一
考察了包衣材料在０．０１ｔｏｏｌ・Ｌ＿１氢氧化钠溶液和０．１ｍｏ］・Ｌ“盐酸溶液介质中的紫外吸收，结果表明，按片重增重３％，所用包衣材料在２７５ｎｍ和３１ｌｎｍ处均无紫外吸收．图１、图２表明，缺氨茶碱的李白样品在无水茶碱最大吸收波长２７５ｎｍ处无吸收；缺盐酸溴己新的空白样品在盐酸溴己新最大吸收波长３１１ｎｍ处几乎无吸收，均不会干扰测定，故选择波长２７５ｎｍ与３１１ｎｍ分别作为氨茶碱和盐酸溴己新的测定波长．
对茶新那敏包衣片可能影响氨茶碱和盐酸溴己新含量测定的各因素进行了考察，方法验证表明，茶新那敏片经包衣后不影响原质量标准中氨茶碱和盐酸溴己新含量测定结果，见表１数据．茶新那敏包衣片不需除去包衣材料，叮直接取样测定．建立的方法可作为茶新那敏包衣片含量测定及稳定性考察方法．
对茶新那敏包衣片３批中试样品６个月加速试验和长期稳定性考察，结果表明・与茶新那敏片比较，包衣后能显著提高茶新那敏片的稳定性，效果良好．
参考文献：
［１］国家食品药品监督管理局．ＷＳ一１０００１一（ＨＤ－０３３６）一２００２药品标准茶新那敏片质量标准［ｓ］－２００２・
［２］吕长淮盐酸溴己新片溶出度测定方法的研究［】：．药物分析杂志，２００８，２８（１０）：１７４４—１７４６・
［３］丁洁，王伟宁，孙玲．ＲＰｊ－ＨＰＩ。Ｃ法测定盐酸溴已新片含量及有关物质［Ｊ］．药物分析杂志・２００６，２６（４１ｔ５０８—５ｌ。・［４］卓丌华．唐彦．高效液相色谱法测定茶新那敏片含量与含量均匀度［』］．医药导撤・２００８・２７（ｚ）：２１９—２２０・
（责任编辑王连桥）
人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定
作者：
作者单位：
刊名：
英文刊名：
年，卷(期)：韩冬， 徐煌， 张新红， 肖燕萍， HAN Dong， XU Huang， ZHANG Xin-hong， XIAO Yan-ping嘉兴学院医学院,浙江嘉兴,314001嘉兴学院学报Journal of Jiaxing University2012,24(3)
1.NING H;LIN G;LUE T F Neuron-like differentiation of adipose tissue-derived stromal cells andvascular smooth musclecells 2006(9/10)
2.SAFFORD K M;SAFFORD S D;Gimbelej M Characterization of neuronal/glial differentiation of murineadiposederived adult stromal cells 2004(02)
3.LOUIS CASTEILLA;VALERIE P B;PATRICK LAHARRAGUE Adipose-derived stromal cells:Their identity anduses in clinical trials,an update 2011(04)
4.DRAPER J S;MOORE H D;RUBAN L N Culture and characterization of human embryonic stem cells 2004(04)
5.RARK S R;OREFFO R O;TRIFFIT J T Interconversion potential of cloned human marrow adipocytes invitro 1999(06)
6.KOCH R J;GORTI G K Tissue engineering with chondrocytes 2002(01)
7.LIN C S;XIN Z C;DENG C H Defining adipose tissue derived stem cell in tissue and in culture2010(06)
8.MADDOX J R;LIAO X;LI F Effects of Culturing on the stability of the Putative Murine Adipose DerivedStem Cells Markers 2009(01)
9.NADRISS;SOLEIMANIM;KIANIJ Multipotenet mesenchymal stem cells from adult human eye conjunctivastromal cells 2008(03)
10.EZEH U I;TUREK P J;REIJO R A Human embryonic stem cell genes OCT4,NANOG,STELLAR,and GDF3areexpressed in both seminoma and breast carcinona[外文期刊] 2005(10)
11.PRINGLES;DEBARIC;DELLACCRIOF Mesenchymal differentiation propensity of a human embryonic stemcelll line 2011(02)
引用本文格式：韩冬.徐煌.张新红.肖燕萍.HAN Dong.XU Huang.ZHANG Xin-hong.XIAO Yan-ping 人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定[期刊论文]-嘉兴学院学报 2012(3)