毕业论文（设计）
题目名称： 香菇多糖提取方法的优化 题目类型： 毕业论文 学生姓名：院 (系) ： 生命科学学院 专业班级： 生物30901班 指导教师：
辅导教师： 时 间：
目 录
毕业论文任务书…………………………………………………………….. ……….. Ⅰ 开题报告…………………………………………………………………….. ……….. Ⅱ 指导教师审查意见………………………………………………………….. ……….. Ⅲ 评阅教师评语……………………………………………………………….. ……….. Ⅳ 答辩会议记录………………………………………………………………….. …….. Ⅴ 中文摘要…………………………………………………………………….. ……….. Ⅵ 外文摘要…………………………………………………………………….. ……….. Ⅶ 1 前言……………………………………………………………………….. ……… .1
1.1 立题的依据……………………………………………………….. ………….1
1.2 选题的背景…………………………………………………………….. …….3
1.3 国内外香菇多糖的研究现状……………………………………….. ……….3
1.4 研究的目的及意义………………………………………………….. ……….4
2 材料与方法………………………………………………………………….. ……..4
2.1 材料…………………………………………………………………….. …….4
2.2 实验方法……………………………………………………………….. …….6 3 结果与分析………………………………………………………………….. ……14
3.1 提取时间对香菇多糖得率的影响…………………………………………..14
3.2 提取温度对香菇多糖得率的影响…………….. …………….. ……………..14
3.3 提取次数对香菇多糖得率的影响………. ….. …………….. ……………....16
3.4 不同提取方法对香菇多糖得率的影响…………….. ….. ……….. ….. ……..17
3.5 碱浓度对香菇多糖得率的影响…………….. …. ……………. ………. …..18 4 结论………………………………………………………………………….. ……21 5 香菇多糖粗成品的提取………….. …. ………….. …. ………….. ……... …
参考文献………………………………………………………………………….. …..22 致谢………………………………………………………………………….. ………
摘要
香菇多糖提取方法的优化
学 生：，生命科学学院
指导教师：，命科学学院
[摘要] 香菇是现今药食两用的菌类物质，具有较好的医疗保健作用。香菇多糖是香菇中的重要的有效药用成分，具有抗病毒，抗肿瘤，调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。本论文主要对香菇子实体多糖的浸提方法进行比较和优化，为多糖得率和纯度的提高及其工业化生产提供理论基础及实验依据，选择出一种经济，操作简便，产量高的工业生产方法。主要的研究内容和结果如下：
从香菇子实体浸提方法的研究入手，探讨了热水浸提、碱法浸提（氢氧化钠提取）、酸法提取（草酸提取、稀盐酸提取）在最佳条件下的比较，热水提取法的最佳工艺条件为：温度65℃、提取2h 、提取2次；草酸、稀盐酸、氢氧化钠都可不同程度的提高多糖的提取得率，氢氧化钠和草酸对于减少多糖水解的效果较盐酸好，氢氧化钠的最佳浓度为1.0mol/L、温度65℃；草酸的最佳浓度为1.0mol/L、温度65℃。结果表明：碱法提取香菇多糖是最优的提取方法。最终用碱法提取出香菇多糖。
[关键词] 香菇多糖 碱法提取 得率
摘要
The Optimization of extraction method of
polysaccharides from mushrooms
Student ： College of life science，
T u t o r ： College of life science，
[Abstract] As we all know mushrooms are edible fungus material today, it has a greet function in medical and health. Mushrooms polysaccharide is one of the important components of effective medicinal mushrooms, it has antiviral function, antitumor function, regulation of immune function and stimulating the formation of interferon function, and so on. This thesis mainly on mushrooms fruitbody polysaccharide extraction methods were compared and optimized, so as to provide theoretical foundation and experimental basis for the yield of polysaccharide and improve the purity and its industrial production, choosing a economic, simple operation, high yield industrial production method. The main research contents and results are as follows:
Starting from the fruiting bodies of mushrooms soak method, discussing the hot water extraction; alkali extraction , that mainly including caustic sode; acid extraction, that including oxalic acid and dilute hydrochloric acid. Through a literature search to understand: the optimum process conditions of hot water extraction method were temperature 65, extraction2h, extraction times of 2. The experimental results show that caustic sode , oxalic acid, and dilute hydrochloric acle all can improve the extraction rate of polysaccharide to different degrees, but sodium hydroxide and hydrochloric acid oxalic acid is good for reducing the effect of polysaccharide hydrolysis. The optimum concentration of sodium hydroxide is 1.0mol/L, temperature 65℃; the optimum concentration of oxalic acid is 1.0mol/L, temperature 65℃. The results show that mushrooms polysaccharide extracted by alkali is the most appropriate method. The final extract mushrooms polysaccharides by alkali method.
[Key words] mushrooms polysaccharide alkali extraction the extraction rate
前言
香菇多糖提取方法的优化
1 前言
多糖是天然大分子物质，它几乎存在于所有生物体中，既是提供能量的主要物质（如淀粉、糖原等），又是生物的结构物质（如纤维素、半纤维素等）。近二十年来的研究表明，从一些生物体内体内提取出的多糖物质具有抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、增强免疫力等生理功能，具有显著的生物活性。现在，一些具有生物活性的多糖作为药品和保健品已经进入了工业化生产阶段。
迄今为止，几百种天然多糖的发现，给人类提供了丰富的生物多聚体宝库。多糖按其来源大致分为植物来源多糖、动物来源多糖、海藻来源多糖和微生物来源多糖。微生物来源多糖又包括细菌多糖和真菌多糖，是迄今研究得比较详尽的一类多糖。真菌多糖作为药物研究始于50年代，60年代以后成为免疫促进剂而引起人们的兴趣。随着新方法、新手段在多糖研究上的应用及新多糖物质的发现，国内外对真菌多糖的研究有了空前发展。一些真菌多糖的新功能相继被发现，多糖的组成与结构、分离及纯化、多糖的生物合成等方面的研究近年来都有了很大进展。
香菇(Lentinusedodes)为担子菌纲伞形科真菌，味甘性平，健脾益气，扶正祛 邪，调和阴阳(陶名熏，1986) ，食药兼用，堪称食用菌的上品。香菇中主要成份有香菇多糖(Lentinan)、香菇嘌呤(Eftadenine)、核苷酸、蛋白质、多种矿物质及膳食纤维素等(陶名熏，1986) ，香菇除含人体必需的八种氨基酸外，还含10种非必需氨基酸，含量达13％左右。干香菇的水浸物中含有组氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、撷氨酸、天门冬氨酸及天门冬素、乙酰胺、胆碱、腺嘌呤等成分，它们不仅是营养物质，有些还具有降低血脂等功效。香菇含丰富微量元素，其中钙、铁含量较其他元素高，对人体有利。故香菇可补充人体不足，增强食欲，帮助消化，改善睡眠，增强体质。
近年来，日本以香菇为原料制成的各种保健食品相继上市，提取抗肿瘤等药物的研究也有较大进展。我国是香菇栽培生产的第一大国，因此，香菇已成为食品工业的重要资源和制药工业的潜在资源。
香菇多糖提取方法的优化
1.1 立题依据
香菇是我国著名食用菌，在民间素有“山珍”之称。香菇属于高蛋白，低脂肪，高碳水化合物，高纤维素营养食品，还含有丰富的维生素和矿物元素。从香菇中提取的各种有效成分，研究最多的是香菇多糖，香菇中所含的多糖主要β-(1→3)-D-葡聚糖、β-（1→6）和β-（1→4）-D-葡聚糖混合物以及α-(1→6)-D-葡聚糖，已广泛地应用到医药行业中，近年来研究表明香菇多糖还具有抗病毒、提高免疫和刺激干扰素形成等功能，其毒副作用小，疗效高，具有重要的研究和开发价值。香菇多糖以独特的营养价值，在食品及保健品开发中成为热门的研究对象。
随着科学技术的不断发展，研究人员发现香菇中的β-葡萄糖苷酶能参与生物体的糖代谢，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用。如它在酶解纤维素时就起着至关重要的作用，它把由纤维素酶降解生成的纤维二糖和三糖转化成可发酵的葡萄糖。
最重要的是在肿瘤治疗中，由于化疗药物的细胞毒作用，同时也使患者机体的免疫系统受到损伤，免疫功能进一步降低。因此有学者认为，在肿瘤的治疗过程中，杀伤肿瘤细胞与保护机体免疫功能具有同等的重要性。寻找一种能增强化疗疗效，同时又能提高机体免疫力的药物，是当前肿瘤学研究的主要课题之一。香菇多糖是从香菇子实体中分离纯化的具有抗肿瘤活性的多糖类大分子物质，为生物反应调节剂。动物实验及体外研究证明，香菇多糖无直接细胞毒作用，但可激活巨噬细胞、T 细胞、NK 细胞等免疫活性细胞，从而杀灭肿瘤细胞。
1．特殊免疫功能
LNT （香菇多糖的简称）能使荷瘤或感染后机体的免疫应答能力得以提高，其制剂在动物体内筛选实验中能明显促进体外淋巴细胞培养物的转化作用。因此认为，LNT 是一种胸腺依赖型T 细胞导向并有巨噬细胞参与的特殊免疫佐剂。其免疫作用特点在于识别脾及肝脏中抗原的巨噬细胞，促进淋巴细胞活化因子(LAE)的产生，释放各种辅助性T 细胞因子。增强宿主腹腔巨噬细胞吞噬率．恢复或刺激辅助性T 细胞的功能。
2．抗肿瘤功能
大量实验结果认为LNT 提高了NK 细胞对某些血清因子的反应性。从而刺激免疫关键细胞并伴有干扰素分泌以达到杀伤肿瘤细胞的效果。LNT 还可以激活补体系统的的替代途径，导致巨噬细胞的非特异细胞毒性提高和中性自细胞对肿瘤组织的浸润。在活化T 细胞等的同时，也活化了能抵抗肿瘤的羟色胺和5一羟色胺的传递。与抗肿瘤活性关系密切的迟发性过敏反应(DHR)也得到恢复和增强。
3．其它作用
LNT 作为香菇中重要的药用成分。它除具有抑制肿瘤作用外，还具有降低转氨酶、使乙型肝炎表面抗原由阳性转为阴性以及降低胆固醇等作用。LNT 能增加宿主动物脾重，由脾切片可见，脾滤泡发生中心扩大，并出现大量浆细胞，说明LNT 能促进B 细胞增生并转化为浆细胞。LNT 具有增强阿状内皮系统，提高识别抗原的功能。它对外周免疫器官起促进作用。相应抑制了中枢免疫器官作用，达到抗肿瘤、抗感染免疫调节作用。LNT 被称为是免疫学中的外周疗法而应用于抗肿瘤临床。此外，香菇多糖可防止化学因素或病毒引起的致癌作用；同时它还能增强宿主对不同细菌、寄生虫和病毒包括艾滋病毒等引起疾病的抵抗力。
4．延缓衰老，抗氧化作用
自由基是指任何能独立存在、含有1个或更多不能配对电子的原子或基因。正常状态下，自由基能通过破坏细胞膜而引起病变并累积这种病变。通常情况下，针对代谢中自由基的产生，机体形成一套抗氧化系统，使自由基的产生和清除处于平衡状态，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。研究表明，香菇多糖能够提高肝脏GSH-Px 活性，降低游泳力竭后肝脏MDA 及血清GPT 活性，起到抗氧化、抗损伤等保肝作用，明显提高肝糖元的水平和运动能力，使膈肌组织内SOD 活性升高，NOS 活性、NO 及MDA 含量明显降低，从而减轻膈肌线粒体自由基损伤，改善了线粒体呼吸链的正常功能，促进ATP 合成，加强膈肌能量供应(史亚丽等，2004) 。黄国城(1995)报道，l%香菇多糖能使果蝇平均寿命延长21.50％(♀) 和11.24%(♂) ；同时香菇多糖能使巨噬细胞内MDA 含量下降，SOD 及GSH-Px 活性增高，提示巨噬细胞抗脂质过氧化作用增强(陈三妹等，2003) 。
5．抗突变作用
香菇多糖提取方法的优化
用香菇对纯种小白鼠活体的骨髓细胞SCE 为抗突变指标，并设空白的对照组，试验结果表明，高、低剂量香菇液均有抗突变的效应。抗突变机理是对诱变物直接阻止DNA 复制有很强的抑制作用。陈冠敏等(2000)用Ames 试验及活体小鼠骨进一步验证其抗突变功能，分别进行鼠伤寒沙门菌微粒体酶(Ames)试验、小鼠睾丸初级精母细胞染色体畸变试验、小鼠骨髓细胞微核试验，各受试物剂量组与致突变物组相比，经统计处理差异有显著性(P
1.2 选题背景
在肿瘤治疗中，由于化疗药物的细胞毒作用，同时也使患者机体的免疫系统受到损伤，免疫功能进一步降低。因此有学者认为，在肿瘤的治疗过程中，杀伤肿瘤细胞与保护机体免疫功能具有同等的重要性。寻找一种能增强化疗疗效，同时又能提高机体免疫力的药物，是当前肿瘤学研究的主要课题之一。
真菌多糖作为药物研究始于50年代，在60年代以后成为免疫促进剩而引起人们兴趣。香菇多糖就是研究较透彻的多糖之一。香菇是一种世界名贵食用兼药用菌，它含有多种有效药用组分，尤其是它含有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能的香菇多糖(1eminmu简称LNT) ，其药用生理活性引起人们广泛的重视。LNT 的药理作用是它并非直接攻击致病源，而是通过刺激免疫细胞成熟、分化和增殖，改善宿主机体平衡，达到恢复和提高宿主细胞对淋巴因子、激素及其它生理活性因子的反应性。因此，人们常称LNT 为生物反应修饰剂(biological response modifier) 。国内外研究的主要目标是：一方面通过对LNT 药理和临床实验的研究进一步寻找活性更高，特别是对肿瘤、艾滋病更有效的多糖；另一方面进行构效关系的研究。通过对LNT 化学修饰的研究，以寻找更有效的多糖药物．这将不仅对发现新多糖起指导作用，而且也对药物学、分子生物学的理论作出新贡献。通过对LNT 活性与其构效关系的进一步研究，结合生物工程技术及先进设备如NMR 、PMR 、IRRGC 、MC 等的应用，无疑能够将LNT 推向医药、食品、石油、纺织印染等工业应用的光明前景。
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香菇多糖提取方法的优化
1.3香菇多糖的理化性质
1.3.1 香菇及其培养
香菇(Lentinusedods (Berk) sing)在分类学上属真菌门，担子菌纲，伞菌目，侧耳
科，香菇属植物。香菇不但营养丰富，味道鲜美，同时还具有药用价值。香菇属于变温结实性的菌类，传统产区主要分布在南方各省。北方地区的气候变化剧烈，昼夜温差较大，适合香菇生长发育，尤其是夏季的7～9月份南方高温季节，香菇生产受到影响，市场供不应求。北方地区具备生产香菇的条件，特别是黑龙江省独特的气候自然资源优势，为夏季发展香菇的生产提供了保证。 1.3.2 香菇的化学组成
现今的药食两用菌类，具有较好医疗的保健作用，主要取决于其含有的化学成分。香菇属于高蛋白，低脂肪，高碳水化合物，高纤维素营养食品，还含有丰富的维生素和矿物元素(郭亚贞等，2000) 。据分析，鲜香菇中每100克含有的粗蛋白质为12～14克，远远超过一般的植物性食物蛋白含量；含有碳水化合物59.3克，磷415毫克，铁25.3毫克，钙124毫克，还含有多糖类，维生素Bl ，B2和维生素C 等。香菇中氨基酸含量丰富，含有人体内必需的8种氨基酸和lO 种非必需氨基酸。干香菇的水提取物中含有丙氨酸，组氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸，天门冬氨酸及天门冬素，乙酰胺，胆碱，腺嘌呤等成分，他们不仅是营养丰富，还具有降低血脂的功效。香菇中的碳水化合物含量约为50％～60％，其中最多的是半纤维素和多糖类物质。纤维素类的食物能够加强胃肠蠕动，预防便秘，食物纤维还能吸附血液中多余的胆固醇，经肠道排出体外。香菇的纤维素有助于预防高血压及胃肠系统肿瘤(刘国信,2005) 。 1.3.3 香菇多糖的结构
香菇多糖具有免疫激活作用的β-(1→3) 葡萄糖糖链，在主链上葡萄糖的C6位上含有支点(每5个D-葡萄糖就有2个支点) ，其侧链是由β-D-(1→6) 和β-D-(1→3) 键合相连的D-葡萄糖聚合体组成，在侧链也含有少数内部β-D-(1→6) 链。重复结构单位一般含有7个葡萄糖残基，其中2个残基在侧链上。(张海岚，2004)
X 射线衍射分析证明，其立体的结构为右旋三重螺旋的六方晶系，晶格常数
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a=b=1.5nm，c=0.6nm。采用高分辨13C-核磁共振(13CNMR)的研究表明，二级结构为凝结型的单螺旋构象，但经8mol/L的尿素溶解，再经过透析和冷冻、干燥后转变成为三重螺旋的构象。构效关系表明，分支程度、水溶性、分子量及高级结构是影响其生物活性的重要因素。在支链葡萄糖中，一重或三重螺旋结构所占比例与其活性呈正向相关。分支程度高而置换率低或分支程度低而置换率高均可降低其免疫激活作用。另外，其分子量若低于4万的则基本无抗肿瘤活性。香菇多糖的抗肿瘤作用与其化学结构尤其是β-D-(1→3) 链密切相关，其相对分子量为4×104～8×105。(金亨燮等，2004)
因分离方法不同，所得到多糖结构也不同，从子实体和发酵培养菌丝体中提取分离的多糖分子结构上也有一定的差异。本试验是从香菇子实体中分离多糖。
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香菇多糖提取方法的优化
1.4 国内外研究现状
近年来，随着对香菇多糖的深入研究，香菇多糖的临床应用研究引起越来越多的科研人员的重视。研究者发现，香菇多糖是一种重要的生物调节剂，尤其在抗肿瘤治疗方面，香菇多糖已作为—种较好的辅助药物运用于临床。就恶性肿瘤而言，多数患者伴有细胞免疫功能缺陷、免疫监控失调，另外化疗、放疗、手术等治疗手段的运用，使机体的免疫力进一步受损，导致机体免疫功能低下，香菇多糖能够提高机体的免疫力，从而间接发挥抑制肿瘤的效应。
早在1989年，Kaneko 等人就发现香菇多糖对艾滋病有一定疗效。Kiraura 等人用香菇多糖与化疗药物联运用治疗初治及复发的胃癌，研究发现香菇多糖能够减少化疗副作用、提高各项免疫指标及营养指标，改善胃癌患者的免疫及营养低下状态，并认为香菇多糖是有效安全的。
杨金龙等将香菇多糖配合其它药物治疗慢性乙型肝炎。研究发现不仅可提高乙肝病毒标志物的阴转作用，还可减少抗病毒药物的副作用，降酶作用快而且稳定。
王如伟等将香菇多糖注射液和化学疗法并用起来治疗肺癌、肝癌及晚期癌症，发现LCL 超过正常水平，NK 细胞接近正常水平，患者LCL 和NK 细胞比率得到提高，机体免疫状况得到明显改善。在提高恶性肿瘤患者细胞免疫功能及化学治疗效果的基础上，并来发现不良反应。因此香菇多糖有望成为一种新型的商效低毒的提高免疫力的保健食品及药物。
刘世新等应用香菇多糖冲剂治疗反复呼吸道感染患儿60例，临床观察有效率达96.7%，说明香菇多糖对反复呼吸道感染患儿有广泛的免疫刺激作用。而且疗效好。无任何毒副作用。
尹光文等采用口服香菇多糖加二氧化碳激光治疗尖锐湿疣比单独用二氧化碳激光治疗复发率明显降低。
钱龙宝等研究发现，香菇多糖口服每次20mg ，每日2次，连服2个月，皮肤处外用皮质类固醇制剂治疗银屑病，有效率为92. 11%。
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1.4 研究目的和意义
由于香菇多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒等方面的生物活性，不仅是一种比较理想的药物，也是一类重要的保健食品功能因子，因此对香菇多糖的研究备受重视。目前，国内外学者在香菇多糖的分离提取、化学组成、结果分析、生物活性等方面做了大量的研究工作。对香菇多糖分离纯化技术进行研究，开发出一条简单、经济、高效的香菇多糖制备工艺，具有重要的现实意义和应用价值。
香菇多糖工业提取方法有热水浸提法、碱法提取、酸法提取、和酶法提取，本论文主要研究经济简便的工业提取方式及前三种提取方式，通过综合参考的大量文献找出了热水浸提的最佳条件为温度65℃、提取2h 、提取2次；碱法提取中属氢氧化钠的效果最好，氢氧化钠提取的最佳条件为浓度为1.0mol/L、温度65℃、提取2h 、提取2次；酸法提取中属稀盐酸和草酸的效果较好，草酸的最佳浓度为1.0mol/L、温度65℃、提取2h 、提取2次；盐酸的最佳浓度为0.1mol/L、温度65℃、提取2h 、提取2次，多糖在强酸的作用下能水解成单糖，并迅速生成糖醛或者其他的衍生物，所以一般选择弱酸提取。
本文的研究内容：
1. 比较四种提取方法在最佳条件下的提取率，选择出最适合工业生产的提取方法；
2. 检测各种提取方法最终提取液中总糖和还原糖的量； 3. 用最佳的提取方法提取出香菇多糖的成品；
4. 香菇多糖的分离及纯化，以便得到纯度较高的香菇多糖；
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香菇多糖提取方法的优化
2 材料和方法 2.1 材料
2.1.1样品
从长江大学西校区附近的菜市场购买的干香菇，香菇样品颜色正常，无发霉腐烂的现象。
2.1.2 药品与器材
3,5—二硝基水杨酸、葡萄糖、苯酚、氢氧化钠、草酸、无水乙醇、盐酸、丙三醇、硫酸、乙醚、氯仿、戊醇。
移液器、EP 离心管、震荡器、水浴锅、电子天平、离心机、冰箱。 2.1.3 试剂
表1 需配制的试剂
试剂 NaOH 草酸 葡萄糖标准液
苯酚 盐酸 DNS 显色剂
酒精
含量/成分 1.0 mol/L 1.0mol/L
40g/L 0.1 mol/L
3,5—二硝基水杨酸+氢氧化钠
95 %
2.2 方法
2.2.1 香菇多糖的常用工业提取方法
通过查阅相关文献了解到了几种实验方案主要有：热水浸提法、酸法提取、和碱法提取，其中酸法提取中效果较好的是稀盐酸和草酸，碱法提取中效果最好的是氢氧
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化钠。
1. 热水浸提法
准确称取一定量的香菇子实体干品粉末，加入一定量蒸馏水，然后在一定的恒温水浴中提取一定时间，3000rpm 离心10min ，测量总糖、还原糖的量。 2. 酸提法
准确称取一定量的香菇予实体干品粉末，加入一定量标准浓度的酸溶液，然后在一定的恒温水浴中提取一定时间，3000rpm 离心10min 。测量总糖、还原糖的量。 3. 碱提法
准确称取一定量的香菇子实体干品粉末，加入一定量浓度的氢氧化钠溶液，然后在一定的恒温水浴中提取一定时问，3000rpm 离心10min ，测量总糖、还原糖的量。 2.2.2 总糖的测定
采用硫酸一苯酚法，以葡萄糖为标准品。 （1）原理
硫酸一苯酚法原理是糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10-100mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在490nm 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。 (2) 溶液的配制
对照品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖60. 8mg ，置100mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
40g/L的苯酚溶液：精密称取2.0g 苯酚试剂，置50mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
(3) 标准曲线的绘制及样品的测定
精密量取对照品溶液0.0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL ，分别置50mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取上述各溶液2.0mL ，置具塞试管中，分别加40g/L苯酚溶液1mL ，混匀，迅速加入硫酸7.0mL ，摇匀，于40℃水浴中保温30 min，取出，置冰浴中5min ，取出，以第一份为空白，照分光光度法，在490nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。如下所示
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香菇多糖提取方法的优化
表2 糖浓度与吸光度的关系
葡萄糖标准溶液的量
0.0ml 1.0ml 1.5ml 2.0ml 2.5ml 3.0ml
吸光度A 490
0 0.116 0.129 0.201 0.212 0.364
标准曲线的绘制： 硫酸一苯酚法测定的葡萄糖标准曲线
* 横坐标表示葡萄糖溶液的浓度，g/L。 * 纵坐标表示吸光度A 。
将样品准确稀释一定倍数，吸取1.0mL(相当于40微克左右的多糖) ，按上述步骤操作，测光密度，以标准曲线即可计算样品中多糖含量。计算公式为：
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待测液总糖浓度=（ OD 样品+0.0011）/0.1126„„„„„(1) 总糖百分含量=[ (总糖浓度*N *V) /M)]*100%„„„„„„(2) 其中，OD 样品：样品在490nm 处的光密度值； N ：稀释倍数； V ：提取液的体积； M ：原料干重。 2.2.3 还原糖的测定
采用3,5--二硝基水杨酸(DNS)比色法测定，以葡萄糖为标准品。 (1) 原理
3,5一二硝基水杨酸在碱性溶液中被还原糖还原成氨基化合物，在沸水浴中显色时间5min ，波长在540nm 下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。
(2)溶液的配制
1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取0.5g 无水葡萄糖待溶解后定容至500mL 。 DNS 显色剂：准确称取无水的3，5-----硝基水杨酸3. 25g 待用，无水氢氧化钠20g 溶解后移入250mL 容量瓶冷却后定容，将水杨酸溶解液移入500mL 容量瓶并加入162. 5mL 的氢氧化物，再加入7. 5mL 丙三醇溶解定容摇匀，贮存在棕色试剂瓶中，以上试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
(3)标准曲线的绘制及样品的测定
准确取0、1、2、3、4、5、6、7、8mL 的葡萄糖标准液分别加入到50mL 的容量瓶中，各加5mL 的DNS ，在沸水浴中煮5min 后流水迅速冷却，定容摇匀，空白调零。20min 后在所确定的吸收光谱波长下测定吸收值。以第一份为空白，照分光光度法，在540nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。本试验获得的3，5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖的标准曲线如图所示。
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香菇多糖提取方法的优化
还原糖的浓度与吸光度的关系
葡萄糖标准溶液的量
0.0ml 1.0ml 2.0ml 3.0ml 4.0ml 5.0ml 6.0ml 7.0ml 8.0ml
吸光度A 490
0 0.015 0.032 0.051 0.068 0.082 0.101 0.124 0.139
还原糖标准曲线的绘制:
3，5一二硝基水杨酸法测定的葡萄糖标准曲线
* 横坐标为葡萄糖的浓度，g/L。 * 纵坐标为540nm 下的吸光度。
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测定样品时，将提取液准确稀释一定倍数，然后准确吸取lmL 置于50mL 容量
瓶中，加5mL 的DNS ，在沸水浴中煮5min 后流水迅速冷却，定容摇匀。20min 后
在所确定的吸收光谱波长下测定吸收值。从标准曲线上读出样品溶液中还原糖浓
度，计算其还原糖含量。计算公式为：
还原糖浓度=( OD样品+0.0038)/ 0.9979„„„„„(3)
还原糖百分含量=[(还原糖浓度*N *V )/ M]* 100%„„„„„(4)
其中，OD 样品：在540nm 处的光密度值。
N ：稀释倍数
V ：提取液的体积
M ：原料干重
2.2.4 多糖含量的计算
多糖含量：0.9 * (总糖百分含量一还原糖的百分含量) ···················(5)
其中，0.9为还原糖换算为多糖的系数。
2.2.5 多糖得率的计算
多糖得率=(多糖含量／总糖含量)*100％„„„„„(6)
2.3 香菇多糖中除蛋白的方法比较
有关香菇多糖分离纯化的报道很多，主要方法有Sevag 法脱蛋白、三氟三氯乙
烷法、三氯醋酸法、酶法脱蛋白。
2.3.1 Sevag 法
Sevag 法是利用有机溶剂使蛋白质沉淀而分离蛋白。根据蛋白质在氯仿等有机
溶剂中变性的特点，用氯仿:戊醇为5:1或4:l 的二元溶剂体系与粗多糖混合，剧烈
振摇20~30min，蛋白质与氯仿一戊醇体系生成凝胶物而分离，分区水层和溶剂层交
界处变形蛋白质即得到较高纯度的多糖。此法在避免多糖降解方面有较好的效果，
但效果低。此法条件温和，缺点是效率不高，一般要重复5次左右方能去尽蛋白。
香菇多糖提取方法的优化
该法常用于微生物来源的多糖去蛋白。
2.3.2 三氟三氯乙烷法
为等体积的三氟三氯乙烷加入到提取液中，在冷却的情况下搅拌10min ，蛋白
质成胶冻状，离心除去胶状蛋白质。上层水相再用上述溶剂处理几次，即得无蛋白
质的多糖。此法效率较高，但因溶剂沸点较低(56℃) ，易挥发，必须在低温条件下
进行，不宜大量应用。
2.3.3 三氯乙酸法
在冰浴中搅拌的情况下缓缓加入15%~30%三氯乙酸于提取液中，直至溶液不
再继续混浊。在低温下(4℃) 放置4h 。离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖提取液，
由于三氯乙酸的酸性较强，往往会引起某些多糖的降解，所以操作必须在低温下进
行，该法效率较高，常用于植物多糖的去蛋白。
2.3.4 酶法脱蛋白
近年来生物酶广泛应用各个领域。多糖通常被包裹在植物细胞壁内，并且多糖
往往和蛋白质结合在一起，以蛋白多糖的形式存在。试验发现中性蛋白酶能有效酶
解与多糖结合在一起的蛋白质，从而将多糖释放出来而提高多糖的得率，同时降低
了多糖中蛋白质的含量，提高了多糖的纯度。酶法脱蛋白多采用中性蛋白、果胶酶、
纤维素酶和酸性蛋白酶。研究表明中性蛋白酶的蛋白质脱除率最高，可达32%。
3 . 结果与分析
1. 提取时间的影响
准确称取10.00g 的香菇子实体干品到500mL 的烧杯，加入140mL 的蒸馏水，
然后在65℃恒温水浴中按规定的时间进行提取，3000rpm 离心10min ，测量总糖、
还原糖。下图给出不同提取时间下所对应的多糖得率。
提取时间对多糖得率的影响
由图可以看出：当提取时间小于2h 时，随着提取时问的增加，多糖的提取得率
增加比较快，在最初的几十分钟里，甚至呈指数趋势增加；但是，达到2h 以后，
多糖提取率则无明显增加。分析其原因，主要是由于随着提取时问的增长，溶剂中
的多糖浓度越高，与固体原料粉末中的多糖浓度差变小，扩散速度减慢，基本达到
平衡状态。考虑到能耗和生产周期等因素，提取2h 为宜。
2．提取温度的影响
准确称取10.00g 的香菇子实体干品，加入140mL 的蒸馏水，然后在一定温度下
恒温水浴中提取2h ，3000rpm 离心10min ，测量总糖、还原糖。图给出不下同提取
温度下所对应的多糖得率。
香菇多糖提取方法的优化
提取温度对多糖提取得率的影响
由图可看出，随着温度的升高，多糖的提取得率逐渐升高，因为随着温度的升
高提取液的粘度增大，加快了扩散速度，而且温度越高对香菇子实体的破坏作用越
大，有利于多糖的浸出。但是，考虑到温度越高耗能越多，而且高温容易破坏多糖
结构，所以，应该采用比较温和的温度，即65℃。
3. 提取次数的影响
准确称取4.00g 的香菇子实体干品于烧杯中，加入140mL 的蒸馏水，然后在
65℃的恒温水浴中提取2h ，3000rpm 离心10min 测量总糖、还原糖。取其离心分离
得到的固体部分以相同的方法提取第二次和第三次，分别测量第二、三次提取液的
总糖、还原糖。下表给出了几次提取的测量结果。
提取次数对香菇多糖得率的影响
从表可看出以热水法提取多糖提取效率较低，一次提取后仍有一部分多糖组分未被提取出来，需经二次提取才可以得到较高得率。
4. 不同提取方法下香菇多糖提取得率的影响
因为不同溶剂对香菇子实体及其多糖的作用不同，所以，用不同溶剂进行提取时，应该具有不同的多糖提取得率。酸可以破坏细胞壁结构，使提取得率增加，但
同时也使多糖水解，所以，本论文采用较弱的草酸和浓度较稀的盐酸提取；碱提法
可以使更多的碱溶性多糖提取出来。本论文采用的是1.0mol/L的氢氧化钠溶液，
1.0mol/L的草酸溶液，0.1mol/L的盐酸溶液分别进行提取。
不同提取液的提取结果
不同的提取液
热水
NaOH(aq)
草酸溶液
稀盐酸溶液 多糖的提取得率 10.79 20.54 17.32 12.65
由表可看出，用草酸提取得率比用水提高60.5％，这是因为酸溶液对香菇子实
体的细胞有一定的破坏作用，使细胞壁因水解而变得疏松，从而有利于糖分的浸出．
用氢氧化钠提取得率比热水提取得率提高近一倍，这主要是因为香菇子实体中
大都为酸性多糖，碱有利于酸性多糖的浸出。稀盐酸也能提高多糖的得率，但是多
糖在强酸的作用下能水解成单糖，并迅速生成糖醛或者其他的衍生物，所以稀盐酸
的效果不是很佳，综合可知，碱法提取的效果相对最好。
香菇多糖提取方法的优化
5. 碱溶液浓度对多糖提取得率的影响
准确称取4.00g 的香菇子实体干品，加入一定浓度的氢氧化钠溶液75ml ，然后
在65℃恒温水浴中提取2h ，3000rpm 离心10min ，测量总糖、还原糖的量。
氢氧化钠浓度对多糖提取得率的影响
氢氧化钠的浓度（mol/L）
0 0.25
0.5
0.75
1.0
1.25
1.5 多糖的提取得率 10.79 12.10 15.33 17.28 20.54 18.50 17.45
* 横坐标为氢氧化钠溶液的浓度，mol/L。
* 纵坐标为多糖的得率。
从图可以看出，随着碱浓度的升高，多糖的提取得率也升高，当碱浓度达到
1.0mol/L时提取得率基本上达到最高，如果碱浓度继续升高，多糖提取率反而会降
低，这是因为多糖在高浓度的碱溶液中降解比较严重，使得还原糖增加而多糖得率
降低。
4. 结论
综合可知，香菇多糖工业上常用的三种提取方法中，碱法提取的效果最好。本
实验最终利用氢氧化钠提取出香菇多糖的成品。
5. 香菇多糖粗成品的提取
1. 实验操作流程：
1) 准确称取20.0g 粉碎的干香菇。
2) 加入140mL 的1mol/L的氢氧化钠溶液，在65℃的水浴锅中提取2h 。
3) 然后分离出第一次的提取液，在加入140mL 的1mol/L的氢氧化钠溶液，在65℃
的水浴锅中再次提取2h 。
4) 合并两次提取液，3000rpm 离心10min ，将提取液的体积浓缩一倍。
5) 由于提取液的颜色较深，所以需要脱色，本实验中采用的是碳粉脱色。
6) 除蛋白质利用 Sevag法 Sevag 法是利用有机溶剂使蛋白质沉淀而分离蛋白。蛋白质在氯仿等有机溶
剂中变性的特点，用氯仿:戊醇为5:1或4:l 的二元溶剂体系与粗多糖混合，剧烈
振摇20~30min，蛋白质与氯仿一戊醇体系生成凝胶物而分离，分区水层和溶剂层
交界处变形蛋白质即得到较高纯度的多糖。此法在避免多糖降解方面有较好的效
果，但效果低。
7）沉淀 在提取液中加入3倍体积的乙醇搅拌。
8）干燥 即可得到香菇多糖的粗成品
香菇多糖提取方法的优化
2. 实验所得的粗成品
图片：
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致谢
本论文是在指导老师momo 教授的悉心关怀和精心指导下完成的。从论文的选题、实验设计到论文的定稿全过程都渗透着导师辛勤的汗水。马老师严谨的治学态度和诲人不倦的精神令我终身受益，对学生负责的态度是很值得肯定的。因此，在论文完成之际，我要对我的老师致以最崇高的敬意和最真挚的感谢。
在本课题的研究过程中，生命科学学院的momo 老师，momo 老师，momo 老师在实验仪器和试剂方面提供了诸多便利条件，同时也给了我多方面的关心指导，才让我的实验得以顺利的完成, 对此表示衷心地感谢。
最后感谢我的同学，他们在我的实验过程中，给我热心的帮助，细心的指导，以及我们共同的探讨，让我的实验得以顺利的完成，在此致以最诚挚的谢意。
学生：
2013年6月4日
[键入文字]
毕业论文（设计）
题目名称： 香菇多糖提取方法的优化 题目类型： 毕业论文 学生姓名：院 (系) ： 生命科学学院 专业班级： 生物30901班 指导教师：
辅导教师： 时 间：
目 录
毕业论文任务书…………………………………………………………….. ……….. Ⅰ 开题报告…………………………………………………………………….. ……….. Ⅱ 指导教师审查意见………………………………………………………….. ……….. Ⅲ 评阅教师评语……………………………………………………………….. ……….. Ⅳ 答辩会议记录………………………………………………………………….. …….. Ⅴ 中文摘要…………………………………………………………………….. ……….. Ⅵ 外文摘要…………………………………………………………………….. ……….. Ⅶ 1 前言……………………………………………………………………….. ……… .1
1.1 立题的依据……………………………………………………….. ………….1
1.2 选题的背景…………………………………………………………….. …….3
1.3 国内外香菇多糖的研究现状……………………………………….. ……….3
1.4 研究的目的及意义………………………………………………….. ……….4
2 材料与方法………………………………………………………………….. ……..4
2.1 材料…………………………………………………………………….. …….4
2.2 实验方法……………………………………………………………….. …….6 3 结果与分析………………………………………………………………….. ……14
3.1 提取时间对香菇多糖得率的影响…………………………………………..14
3.2 提取温度对香菇多糖得率的影响…………….. …………….. ……………..14
3.3 提取次数对香菇多糖得率的影响………. ….. …………….. ……………....16
3.4 不同提取方法对香菇多糖得率的影响…………….. ….. ……….. ….. ……..17
3.5 碱浓度对香菇多糖得率的影响…………….. …. ……………. ………. …..18 4 结论………………………………………………………………………….. ……21 5 香菇多糖粗成品的提取………….. …. ………….. …. ………….. ……... …
参考文献………………………………………………………………………….. …..22 致谢………………………………………………………………………….. ………
摘要
香菇多糖提取方法的优化
学 生：，生命科学学院
指导教师：，命科学学院
[摘要] 香菇是现今药食两用的菌类物质，具有较好的医疗保健作用。香菇多糖是香菇中的重要的有效药用成分，具有抗病毒，抗肿瘤，调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。本论文主要对香菇子实体多糖的浸提方法进行比较和优化，为多糖得率和纯度的提高及其工业化生产提供理论基础及实验依据，选择出一种经济，操作简便，产量高的工业生产方法。主要的研究内容和结果如下：
从香菇子实体浸提方法的研究入手，探讨了热水浸提、碱法浸提（氢氧化钠提取）、酸法提取（草酸提取、稀盐酸提取）在最佳条件下的比较，热水提取法的最佳工艺条件为：温度65℃、提取2h 、提取2次；草酸、稀盐酸、氢氧化钠都可不同程度的提高多糖的提取得率，氢氧化钠和草酸对于减少多糖水解的效果较盐酸好，氢氧化钠的最佳浓度为1.0mol/L、温度65℃；草酸的最佳浓度为1.0mol/L、温度65℃。结果表明：碱法提取香菇多糖是最优的提取方法。最终用碱法提取出香菇多糖。
[关键词] 香菇多糖 碱法提取 得率
摘要
The Optimization of extraction method of
polysaccharides from mushrooms
Student ： College of life science，
T u t o r ： College of life science，
[Abstract] As we all know mushrooms are edible fungus material today, it has a greet function in medical and health. Mushrooms polysaccharide is one of the important components of effective medicinal mushrooms, it has antiviral function, antitumor function, regulation of immune function and stimulating the formation of interferon function, and so on. This thesis mainly on mushrooms fruitbody polysaccharide extraction methods were compared and optimized, so as to provide theoretical foundation and experimental basis for the yield of polysaccharide and improve the purity and its industrial production, choosing a economic, simple operation, high yield industrial production method. The main research contents and results are as follows:
Starting from the fruiting bodies of mushrooms soak method, discussing the hot water extraction; alkali extraction , that mainly including caustic sode; acid extraction, that including oxalic acid and dilute hydrochloric acid. Through a literature search to understand: the optimum process conditions of hot water extraction method were temperature 65, extraction2h, extraction times of 2. The experimental results show that caustic sode , oxalic acid, and dilute hydrochloric acle all can improve the extraction rate of polysaccharide to different degrees, but sodium hydroxide and hydrochloric acid oxalic acid is good for reducing the effect of polysaccharide hydrolysis. The optimum concentration of sodium hydroxide is 1.0mol/L, temperature 65℃; the optimum concentration of oxalic acid is 1.0mol/L, temperature 65℃. The results show that mushrooms polysaccharide extracted by alkali is the most appropriate method. The final extract mushrooms polysaccharides by alkali method.
[Key words] mushrooms polysaccharide alkali extraction the extraction rate
前言
香菇多糖提取方法的优化
1 前言
多糖是天然大分子物质，它几乎存在于所有生物体中，既是提供能量的主要物质（如淀粉、糖原等），又是生物的结构物质（如纤维素、半纤维素等）。近二十年来的研究表明，从一些生物体内体内提取出的多糖物质具有抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、增强免疫力等生理功能，具有显著的生物活性。现在，一些具有生物活性的多糖作为药品和保健品已经进入了工业化生产阶段。
迄今为止，几百种天然多糖的发现，给人类提供了丰富的生物多聚体宝库。多糖按其来源大致分为植物来源多糖、动物来源多糖、海藻来源多糖和微生物来源多糖。微生物来源多糖又包括细菌多糖和真菌多糖，是迄今研究得比较详尽的一类多糖。真菌多糖作为药物研究始于50年代，60年代以后成为免疫促进剂而引起人们的兴趣。随着新方法、新手段在多糖研究上的应用及新多糖物质的发现，国内外对真菌多糖的研究有了空前发展。一些真菌多糖的新功能相继被发现，多糖的组成与结构、分离及纯化、多糖的生物合成等方面的研究近年来都有了很大进展。
香菇(Lentinusedodes)为担子菌纲伞形科真菌，味甘性平，健脾益气，扶正祛 邪，调和阴阳(陶名熏，1986) ，食药兼用，堪称食用菌的上品。香菇中主要成份有香菇多糖(Lentinan)、香菇嘌呤(Eftadenine)、核苷酸、蛋白质、多种矿物质及膳食纤维素等(陶名熏，1986) ，香菇除含人体必需的八种氨基酸外，还含10种非必需氨基酸，含量达13％左右。干香菇的水浸物中含有组氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、撷氨酸、天门冬氨酸及天门冬素、乙酰胺、胆碱、腺嘌呤等成分，它们不仅是营养物质，有些还具有降低血脂等功效。香菇含丰富微量元素，其中钙、铁含量较其他元素高，对人体有利。故香菇可补充人体不足，增强食欲，帮助消化，改善睡眠，增强体质。
近年来，日本以香菇为原料制成的各种保健食品相继上市，提取抗肿瘤等药物的研究也有较大进展。我国是香菇栽培生产的第一大国，因此，香菇已成为食品工业的重要资源和制药工业的潜在资源。
香菇多糖提取方法的优化
1.1 立题依据
香菇是我国著名食用菌，在民间素有“山珍”之称。香菇属于高蛋白，低脂肪，高碳水化合物，高纤维素营养食品，还含有丰富的维生素和矿物元素。从香菇中提取的各种有效成分，研究最多的是香菇多糖，香菇中所含的多糖主要β-(1→3)-D-葡聚糖、β-（1→6）和β-（1→4）-D-葡聚糖混合物以及α-(1→6)-D-葡聚糖，已广泛地应用到医药行业中，近年来研究表明香菇多糖还具有抗病毒、提高免疫和刺激干扰素形成等功能，其毒副作用小，疗效高，具有重要的研究和开发价值。香菇多糖以独特的营养价值，在食品及保健品开发中成为热门的研究对象。
随着科学技术的不断发展，研究人员发现香菇中的β-葡萄糖苷酶能参与生物体的糖代谢，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用。如它在酶解纤维素时就起着至关重要的作用，它把由纤维素酶降解生成的纤维二糖和三糖转化成可发酵的葡萄糖。
最重要的是在肿瘤治疗中，由于化疗药物的细胞毒作用，同时也使患者机体的免疫系统受到损伤，免疫功能进一步降低。因此有学者认为，在肿瘤的治疗过程中，杀伤肿瘤细胞与保护机体免疫功能具有同等的重要性。寻找一种能增强化疗疗效，同时又能提高机体免疫力的药物，是当前肿瘤学研究的主要课题之一。香菇多糖是从香菇子实体中分离纯化的具有抗肿瘤活性的多糖类大分子物质，为生物反应调节剂。动物实验及体外研究证明，香菇多糖无直接细胞毒作用，但可激活巨噬细胞、T 细胞、NK 细胞等免疫活性细胞，从而杀灭肿瘤细胞。
1．特殊免疫功能
LNT （香菇多糖的简称）能使荷瘤或感染后机体的免疫应答能力得以提高，其制剂在动物体内筛选实验中能明显促进体外淋巴细胞培养物的转化作用。因此认为，LNT 是一种胸腺依赖型T 细胞导向并有巨噬细胞参与的特殊免疫佐剂。其免疫作用特点在于识别脾及肝脏中抗原的巨噬细胞，促进淋巴细胞活化因子(LAE)的产生，释放各种辅助性T 细胞因子。增强宿主腹腔巨噬细胞吞噬率．恢复或刺激辅助性T 细胞的功能。
2．抗肿瘤功能
大量实验结果认为LNT 提高了NK 细胞对某些血清因子的反应性。从而刺激免疫关键细胞并伴有干扰素分泌以达到杀伤肿瘤细胞的效果。LNT 还可以激活补体系统的的替代途径，导致巨噬细胞的非特异细胞毒性提高和中性自细胞对肿瘤组织的浸润。在活化T 细胞等的同时，也活化了能抵抗肿瘤的羟色胺和5一羟色胺的传递。与抗肿瘤活性关系密切的迟发性过敏反应(DHR)也得到恢复和增强。
3．其它作用
LNT 作为香菇中重要的药用成分。它除具有抑制肿瘤作用外，还具有降低转氨酶、使乙型肝炎表面抗原由阳性转为阴性以及降低胆固醇等作用。LNT 能增加宿主动物脾重，由脾切片可见，脾滤泡发生中心扩大，并出现大量浆细胞，说明LNT 能促进B 细胞增生并转化为浆细胞。LNT 具有增强阿状内皮系统，提高识别抗原的功能。它对外周免疫器官起促进作用。相应抑制了中枢免疫器官作用，达到抗肿瘤、抗感染免疫调节作用。LNT 被称为是免疫学中的外周疗法而应用于抗肿瘤临床。此外，香菇多糖可防止化学因素或病毒引起的致癌作用；同时它还能增强宿主对不同细菌、寄生虫和病毒包括艾滋病毒等引起疾病的抵抗力。
4．延缓衰老，抗氧化作用
自由基是指任何能独立存在、含有1个或更多不能配对电子的原子或基因。正常状态下，自由基能通过破坏细胞膜而引起病变并累积这种病变。通常情况下，针对代谢中自由基的产生，机体形成一套抗氧化系统，使自由基的产生和清除处于平衡状态，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。研究表明，香菇多糖能够提高肝脏GSH-Px 活性，降低游泳力竭后肝脏MDA 及血清GPT 活性，起到抗氧化、抗损伤等保肝作用，明显提高肝糖元的水平和运动能力，使膈肌组织内SOD 活性升高，NOS 活性、NO 及MDA 含量明显降低，从而减轻膈肌线粒体自由基损伤，改善了线粒体呼吸链的正常功能，促进ATP 合成，加强膈肌能量供应(史亚丽等，2004) 。黄国城(1995)报道，l%香菇多糖能使果蝇平均寿命延长21.50％(♀) 和11.24%(♂) ；同时香菇多糖能使巨噬细胞内MDA 含量下降，SOD 及GSH-Px 活性增高，提示巨噬细胞抗脂质过氧化作用增强(陈三妹等，2003) 。
5．抗突变作用
香菇多糖提取方法的优化
用香菇对纯种小白鼠活体的骨髓细胞SCE 为抗突变指标，并设空白的对照组，试验结果表明，高、低剂量香菇液均有抗突变的效应。抗突变机理是对诱变物直接阻止DNA 复制有很强的抑制作用。陈冠敏等(2000)用Ames 试验及活体小鼠骨进一步验证其抗突变功能，分别进行鼠伤寒沙门菌微粒体酶(Ames)试验、小鼠睾丸初级精母细胞染色体畸变试验、小鼠骨髓细胞微核试验，各受试物剂量组与致突变物组相比，经统计处理差异有显著性(P
1.2 选题背景
在肿瘤治疗中，由于化疗药物的细胞毒作用，同时也使患者机体的免疫系统受到损伤，免疫功能进一步降低。因此有学者认为，在肿瘤的治疗过程中，杀伤肿瘤细胞与保护机体免疫功能具有同等的重要性。寻找一种能增强化疗疗效，同时又能提高机体免疫力的药物，是当前肿瘤学研究的主要课题之一。
真菌多糖作为药物研究始于50年代，在60年代以后成为免疫促进剩而引起人们兴趣。香菇多糖就是研究较透彻的多糖之一。香菇是一种世界名贵食用兼药用菌，它含有多种有效药用组分，尤其是它含有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能的香菇多糖(1eminmu简称LNT) ，其药用生理活性引起人们广泛的重视。LNT 的药理作用是它并非直接攻击致病源，而是通过刺激免疫细胞成熟、分化和增殖，改善宿主机体平衡，达到恢复和提高宿主细胞对淋巴因子、激素及其它生理活性因子的反应性。因此，人们常称LNT 为生物反应修饰剂(biological response modifier) 。国内外研究的主要目标是：一方面通过对LNT 药理和临床实验的研究进一步寻找活性更高，特别是对肿瘤、艾滋病更有效的多糖；另一方面进行构效关系的研究。通过对LNT 化学修饰的研究，以寻找更有效的多糖药物．这将不仅对发现新多糖起指导作用，而且也对药物学、分子生物学的理论作出新贡献。通过对LNT 活性与其构效关系的进一步研究，结合生物工程技术及先进设备如NMR 、PMR 、IRRGC 、MC 等的应用，无疑能够将LNT 推向医药、食品、石油、纺织印染等工业应用的光明前景。
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香菇多糖提取方法的优化
1.3香菇多糖的理化性质
1.3.1 香菇及其培养
香菇(Lentinusedods (Berk) sing)在分类学上属真菌门，担子菌纲，伞菌目，侧耳
科，香菇属植物。香菇不但营养丰富，味道鲜美，同时还具有药用价值。香菇属于变温结实性的菌类，传统产区主要分布在南方各省。北方地区的气候变化剧烈，昼夜温差较大，适合香菇生长发育，尤其是夏季的7～9月份南方高温季节，香菇生产受到影响，市场供不应求。北方地区具备生产香菇的条件，特别是黑龙江省独特的气候自然资源优势，为夏季发展香菇的生产提供了保证。 1.3.2 香菇的化学组成
现今的药食两用菌类，具有较好医疗的保健作用，主要取决于其含有的化学成分。香菇属于高蛋白，低脂肪，高碳水化合物，高纤维素营养食品，还含有丰富的维生素和矿物元素(郭亚贞等，2000) 。据分析，鲜香菇中每100克含有的粗蛋白质为12～14克，远远超过一般的植物性食物蛋白含量；含有碳水化合物59.3克，磷415毫克，铁25.3毫克，钙124毫克，还含有多糖类，维生素Bl ，B2和维生素C 等。香菇中氨基酸含量丰富，含有人体内必需的8种氨基酸和lO 种非必需氨基酸。干香菇的水提取物中含有丙氨酸，组氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸，天门冬氨酸及天门冬素，乙酰胺，胆碱，腺嘌呤等成分，他们不仅是营养丰富，还具有降低血脂的功效。香菇中的碳水化合物含量约为50％～60％，其中最多的是半纤维素和多糖类物质。纤维素类的食物能够加强胃肠蠕动，预防便秘，食物纤维还能吸附血液中多余的胆固醇，经肠道排出体外。香菇的纤维素有助于预防高血压及胃肠系统肿瘤(刘国信,2005) 。 1.3.3 香菇多糖的结构
香菇多糖具有免疫激活作用的β-(1→3) 葡萄糖糖链，在主链上葡萄糖的C6位上含有支点(每5个D-葡萄糖就有2个支点) ，其侧链是由β-D-(1→6) 和β-D-(1→3) 键合相连的D-葡萄糖聚合体组成，在侧链也含有少数内部β-D-(1→6) 链。重复结构单位一般含有7个葡萄糖残基，其中2个残基在侧链上。(张海岚，2004)
X 射线衍射分析证明，其立体的结构为右旋三重螺旋的六方晶系，晶格常数
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a=b=1.5nm，c=0.6nm。采用高分辨13C-核磁共振(13CNMR)的研究表明，二级结构为凝结型的单螺旋构象，但经8mol/L的尿素溶解，再经过透析和冷冻、干燥后转变成为三重螺旋的构象。构效关系表明，分支程度、水溶性、分子量及高级结构是影响其生物活性的重要因素。在支链葡萄糖中，一重或三重螺旋结构所占比例与其活性呈正向相关。分支程度高而置换率低或分支程度低而置换率高均可降低其免疫激活作用。另外，其分子量若低于4万的则基本无抗肿瘤活性。香菇多糖的抗肿瘤作用与其化学结构尤其是β-D-(1→3) 链密切相关，其相对分子量为4×104～8×105。(金亨燮等，2004)
因分离方法不同，所得到多糖结构也不同，从子实体和发酵培养菌丝体中提取分离的多糖分子结构上也有一定的差异。本试验是从香菇子实体中分离多糖。
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香菇多糖提取方法的优化
1.4 国内外研究现状
近年来，随着对香菇多糖的深入研究，香菇多糖的临床应用研究引起越来越多的科研人员的重视。研究者发现，香菇多糖是一种重要的生物调节剂，尤其在抗肿瘤治疗方面，香菇多糖已作为—种较好的辅助药物运用于临床。就恶性肿瘤而言，多数患者伴有细胞免疫功能缺陷、免疫监控失调，另外化疗、放疗、手术等治疗手段的运用，使机体的免疫力进一步受损，导致机体免疫功能低下，香菇多糖能够提高机体的免疫力，从而间接发挥抑制肿瘤的效应。
早在1989年，Kaneko 等人就发现香菇多糖对艾滋病有一定疗效。Kiraura 等人用香菇多糖与化疗药物联运用治疗初治及复发的胃癌，研究发现香菇多糖能够减少化疗副作用、提高各项免疫指标及营养指标，改善胃癌患者的免疫及营养低下状态，并认为香菇多糖是有效安全的。
杨金龙等将香菇多糖配合其它药物治疗慢性乙型肝炎。研究发现不仅可提高乙肝病毒标志物的阴转作用，还可减少抗病毒药物的副作用，降酶作用快而且稳定。
王如伟等将香菇多糖注射液和化学疗法并用起来治疗肺癌、肝癌及晚期癌症，发现LCL 超过正常水平，NK 细胞接近正常水平，患者LCL 和NK 细胞比率得到提高，机体免疫状况得到明显改善。在提高恶性肿瘤患者细胞免疫功能及化学治疗效果的基础上，并来发现不良反应。因此香菇多糖有望成为一种新型的商效低毒的提高免疫力的保健食品及药物。
刘世新等应用香菇多糖冲剂治疗反复呼吸道感染患儿60例，临床观察有效率达96.7%，说明香菇多糖对反复呼吸道感染患儿有广泛的免疫刺激作用。而且疗效好。无任何毒副作用。
尹光文等采用口服香菇多糖加二氧化碳激光治疗尖锐湿疣比单独用二氧化碳激光治疗复发率明显降低。
钱龙宝等研究发现，香菇多糖口服每次20mg ，每日2次，连服2个月，皮肤处外用皮质类固醇制剂治疗银屑病，有效率为92. 11%。
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1.4 研究目的和意义
由于香菇多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒等方面的生物活性，不仅是一种比较理想的药物，也是一类重要的保健食品功能因子，因此对香菇多糖的研究备受重视。目前，国内外学者在香菇多糖的分离提取、化学组成、结果分析、生物活性等方面做了大量的研究工作。对香菇多糖分离纯化技术进行研究，开发出一条简单、经济、高效的香菇多糖制备工艺，具有重要的现实意义和应用价值。
香菇多糖工业提取方法有热水浸提法、碱法提取、酸法提取、和酶法提取，本论文主要研究经济简便的工业提取方式及前三种提取方式，通过综合参考的大量文献找出了热水浸提的最佳条件为温度65℃、提取2h 、提取2次；碱法提取中属氢氧化钠的效果最好，氢氧化钠提取的最佳条件为浓度为1.0mol/L、温度65℃、提取2h 、提取2次；酸法提取中属稀盐酸和草酸的效果较好，草酸的最佳浓度为1.0mol/L、温度65℃、提取2h 、提取2次；盐酸的最佳浓度为0.1mol/L、温度65℃、提取2h 、提取2次，多糖在强酸的作用下能水解成单糖，并迅速生成糖醛或者其他的衍生物，所以一般选择弱酸提取。
本文的研究内容：
1. 比较四种提取方法在最佳条件下的提取率，选择出最适合工业生产的提取方法；
2. 检测各种提取方法最终提取液中总糖和还原糖的量； 3. 用最佳的提取方法提取出香菇多糖的成品；
4. 香菇多糖的分离及纯化，以便得到纯度较高的香菇多糖；
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香菇多糖提取方法的优化
2 材料和方法 2.1 材料
2.1.1样品
从长江大学西校区附近的菜市场购买的干香菇，香菇样品颜色正常，无发霉腐烂的现象。
2.1.2 药品与器材
3,5—二硝基水杨酸、葡萄糖、苯酚、氢氧化钠、草酸、无水乙醇、盐酸、丙三醇、硫酸、乙醚、氯仿、戊醇。
移液器、EP 离心管、震荡器、水浴锅、电子天平、离心机、冰箱。 2.1.3 试剂
表1 需配制的试剂
试剂 NaOH 草酸 葡萄糖标准液
苯酚 盐酸 DNS 显色剂
酒精
含量/成分 1.0 mol/L 1.0mol/L
40g/L 0.1 mol/L
3,5—二硝基水杨酸+氢氧化钠
95 %
2.2 方法
2.2.1 香菇多糖的常用工业提取方法
通过查阅相关文献了解到了几种实验方案主要有：热水浸提法、酸法提取、和碱法提取，其中酸法提取中效果较好的是稀盐酸和草酸，碱法提取中效果最好的是氢氧
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化钠。
1. 热水浸提法
准确称取一定量的香菇子实体干品粉末，加入一定量蒸馏水，然后在一定的恒温水浴中提取一定时间，3000rpm 离心10min ，测量总糖、还原糖的量。 2. 酸提法
准确称取一定量的香菇予实体干品粉末，加入一定量标准浓度的酸溶液，然后在一定的恒温水浴中提取一定时间，3000rpm 离心10min 。测量总糖、还原糖的量。 3. 碱提法
准确称取一定量的香菇子实体干品粉末，加入一定量浓度的氢氧化钠溶液，然后在一定的恒温水浴中提取一定时问，3000rpm 离心10min ，测量总糖、还原糖的量。 2.2.2 总糖的测定
采用硫酸一苯酚法，以葡萄糖为标准品。 （1）原理
硫酸一苯酚法原理是糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10-100mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在490nm 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。 (2) 溶液的配制
对照品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖60. 8mg ，置100mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
40g/L的苯酚溶液：精密称取2.0g 苯酚试剂，置50mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
(3) 标准曲线的绘制及样品的测定
精密量取对照品溶液0.0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL ，分别置50mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取上述各溶液2.0mL ，置具塞试管中，分别加40g/L苯酚溶液1mL ，混匀，迅速加入硫酸7.0mL ，摇匀，于40℃水浴中保温30 min，取出，置冰浴中5min ，取出，以第一份为空白，照分光光度法，在490nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。如下所示
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香菇多糖提取方法的优化
表2 糖浓度与吸光度的关系
葡萄糖标准溶液的量
0.0ml 1.0ml 1.5ml 2.0ml 2.5ml 3.0ml
吸光度A 490
0 0.116 0.129 0.201 0.212 0.364
标准曲线的绘制： 硫酸一苯酚法测定的葡萄糖标准曲线
* 横坐标表示葡萄糖溶液的浓度，g/L。 * 纵坐标表示吸光度A 。
将样品准确稀释一定倍数，吸取1.0mL(相当于40微克左右的多糖) ，按上述步骤操作，测光密度，以标准曲线即可计算样品中多糖含量。计算公式为：
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待测液总糖浓度=（ OD 样品+0.0011）/0.1126„„„„„(1) 总糖百分含量=[ (总糖浓度*N *V) /M)]*100%„„„„„„(2) 其中，OD 样品：样品在490nm 处的光密度值； N ：稀释倍数； V ：提取液的体积； M ：原料干重。 2.2.3 还原糖的测定
采用3,5--二硝基水杨酸(DNS)比色法测定，以葡萄糖为标准品。 (1) 原理
3,5一二硝基水杨酸在碱性溶液中被还原糖还原成氨基化合物，在沸水浴中显色时间5min ，波长在540nm 下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。
(2)溶液的配制
1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取0.5g 无水葡萄糖待溶解后定容至500mL 。 DNS 显色剂：准确称取无水的3，5-----硝基水杨酸3. 25g 待用，无水氢氧化钠20g 溶解后移入250mL 容量瓶冷却后定容，将水杨酸溶解液移入500mL 容量瓶并加入162. 5mL 的氢氧化物，再加入7. 5mL 丙三醇溶解定容摇匀，贮存在棕色试剂瓶中，以上试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
(3)标准曲线的绘制及样品的测定
准确取0、1、2、3、4、5、6、7、8mL 的葡萄糖标准液分别加入到50mL 的容量瓶中，各加5mL 的DNS ，在沸水浴中煮5min 后流水迅速冷却，定容摇匀，空白调零。20min 后在所确定的吸收光谱波长下测定吸收值。以第一份为空白，照分光光度法，在540nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。本试验获得的3，5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖的标准曲线如图所示。
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香菇多糖提取方法的优化
还原糖的浓度与吸光度的关系
葡萄糖标准溶液的量
0.0ml 1.0ml 2.0ml 3.0ml 4.0ml 5.0ml 6.0ml 7.0ml 8.0ml
吸光度A 490
0 0.015 0.032 0.051 0.068 0.082 0.101 0.124 0.139
还原糖标准曲线的绘制:
3，5一二硝基水杨酸法测定的葡萄糖标准曲线
* 横坐标为葡萄糖的浓度，g/L。 * 纵坐标为540nm 下的吸光度。
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测定样品时，将提取液准确稀释一定倍数，然后准确吸取lmL 置于50mL 容量
瓶中，加5mL 的DNS ，在沸水浴中煮5min 后流水迅速冷却，定容摇匀。20min 后
在所确定的吸收光谱波长下测定吸收值。从标准曲线上读出样品溶液中还原糖浓
度，计算其还原糖含量。计算公式为：
还原糖浓度=( OD样品+0.0038)/ 0.9979„„„„„(3)
还原糖百分含量=[(还原糖浓度*N *V )/ M]* 100%„„„„„(4)
其中，OD 样品：在540nm 处的光密度值。
N ：稀释倍数
V ：提取液的体积
M ：原料干重
2.2.4 多糖含量的计算
多糖含量：0.9 * (总糖百分含量一还原糖的百分含量) ···················(5)
其中，0.9为还原糖换算为多糖的系数。
2.2.5 多糖得率的计算
多糖得率=(多糖含量／总糖含量)*100％„„„„„(6)
2.3 香菇多糖中除蛋白的方法比较
有关香菇多糖分离纯化的报道很多，主要方法有Sevag 法脱蛋白、三氟三氯乙
烷法、三氯醋酸法、酶法脱蛋白。
2.3.1 Sevag 法
Sevag 法是利用有机溶剂使蛋白质沉淀而分离蛋白。根据蛋白质在氯仿等有机
溶剂中变性的特点，用氯仿:戊醇为5:1或4:l 的二元溶剂体系与粗多糖混合，剧烈
振摇20~30min，蛋白质与氯仿一戊醇体系生成凝胶物而分离，分区水层和溶剂层交
界处变形蛋白质即得到较高纯度的多糖。此法在避免多糖降解方面有较好的效果，
但效果低。此法条件温和，缺点是效率不高，一般要重复5次左右方能去尽蛋白。
香菇多糖提取方法的优化
该法常用于微生物来源的多糖去蛋白。
2.3.2 三氟三氯乙烷法
为等体积的三氟三氯乙烷加入到提取液中，在冷却的情况下搅拌10min ，蛋白
质成胶冻状，离心除去胶状蛋白质。上层水相再用上述溶剂处理几次，即得无蛋白
质的多糖。此法效率较高，但因溶剂沸点较低(56℃) ，易挥发，必须在低温条件下
进行，不宜大量应用。
2.3.3 三氯乙酸法
在冰浴中搅拌的情况下缓缓加入15%~30%三氯乙酸于提取液中，直至溶液不
再继续混浊。在低温下(4℃) 放置4h 。离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖提取液，
由于三氯乙酸的酸性较强，往往会引起某些多糖的降解，所以操作必须在低温下进
行，该法效率较高，常用于植物多糖的去蛋白。
2.3.4 酶法脱蛋白
近年来生物酶广泛应用各个领域。多糖通常被包裹在植物细胞壁内，并且多糖
往往和蛋白质结合在一起，以蛋白多糖的形式存在。试验发现中性蛋白酶能有效酶
解与多糖结合在一起的蛋白质，从而将多糖释放出来而提高多糖的得率，同时降低
了多糖中蛋白质的含量，提高了多糖的纯度。酶法脱蛋白多采用中性蛋白、果胶酶、
纤维素酶和酸性蛋白酶。研究表明中性蛋白酶的蛋白质脱除率最高，可达32%。
3 . 结果与分析
1. 提取时间的影响
准确称取10.00g 的香菇子实体干品到500mL 的烧杯，加入140mL 的蒸馏水，
然后在65℃恒温水浴中按规定的时间进行提取，3000rpm 离心10min ，测量总糖、
还原糖。下图给出不同提取时间下所对应的多糖得率。
提取时间对多糖得率的影响
由图可以看出：当提取时间小于2h 时，随着提取时问的增加，多糖的提取得率
增加比较快，在最初的几十分钟里，甚至呈指数趋势增加；但是，达到2h 以后，
多糖提取率则无明显增加。分析其原因，主要是由于随着提取时问的增长，溶剂中
的多糖浓度越高，与固体原料粉末中的多糖浓度差变小，扩散速度减慢，基本达到
平衡状态。考虑到能耗和生产周期等因素，提取2h 为宜。
2．提取温度的影响
准确称取10.00g 的香菇子实体干品，加入140mL 的蒸馏水，然后在一定温度下
恒温水浴中提取2h ，3000rpm 离心10min ，测量总糖、还原糖。图给出不下同提取
温度下所对应的多糖得率。
香菇多糖提取方法的优化
提取温度对多糖提取得率的影响
由图可看出，随着温度的升高，多糖的提取得率逐渐升高，因为随着温度的升
高提取液的粘度增大，加快了扩散速度，而且温度越高对香菇子实体的破坏作用越
大，有利于多糖的浸出。但是，考虑到温度越高耗能越多，而且高温容易破坏多糖
结构，所以，应该采用比较温和的温度，即65℃。
3. 提取次数的影响
准确称取4.00g 的香菇子实体干品于烧杯中，加入140mL 的蒸馏水，然后在
65℃的恒温水浴中提取2h ，3000rpm 离心10min 测量总糖、还原糖。取其离心分离
得到的固体部分以相同的方法提取第二次和第三次，分别测量第二、三次提取液的
总糖、还原糖。下表给出了几次提取的测量结果。
提取次数对香菇多糖得率的影响
从表可看出以热水法提取多糖提取效率较低，一次提取后仍有一部分多糖组分未被提取出来，需经二次提取才可以得到较高得率。
4. 不同提取方法下香菇多糖提取得率的影响
因为不同溶剂对香菇子实体及其多糖的作用不同，所以，用不同溶剂进行提取时，应该具有不同的多糖提取得率。酸可以破坏细胞壁结构，使提取得率增加，但
同时也使多糖水解，所以，本论文采用较弱的草酸和浓度较稀的盐酸提取；碱提法
可以使更多的碱溶性多糖提取出来。本论文采用的是1.0mol/L的氢氧化钠溶液，
1.0mol/L的草酸溶液，0.1mol/L的盐酸溶液分别进行提取。
不同提取液的提取结果
不同的提取液
热水
NaOH(aq)
草酸溶液
稀盐酸溶液 多糖的提取得率 10.79 20.54 17.32 12.65
由表可看出，用草酸提取得率比用水提高60.5％，这是因为酸溶液对香菇子实
体的细胞有一定的破坏作用，使细胞壁因水解而变得疏松，从而有利于糖分的浸出．
用氢氧化钠提取得率比热水提取得率提高近一倍，这主要是因为香菇子实体中
大都为酸性多糖，碱有利于酸性多糖的浸出。稀盐酸也能提高多糖的得率，但是多
糖在强酸的作用下能水解成单糖，并迅速生成糖醛或者其他的衍生物，所以稀盐酸
的效果不是很佳，综合可知，碱法提取的效果相对最好。
香菇多糖提取方法的优化
5. 碱溶液浓度对多糖提取得率的影响
准确称取4.00g 的香菇子实体干品，加入一定浓度的氢氧化钠溶液75ml ，然后
在65℃恒温水浴中提取2h ，3000rpm 离心10min ，测量总糖、还原糖的量。
氢氧化钠浓度对多糖提取得率的影响
氢氧化钠的浓度（mol/L）
0 0.25
0.5
0.75
1.0
1.25
1.5 多糖的提取得率 10.79 12.10 15.33 17.28 20.54 18.50 17.45
* 横坐标为氢氧化钠溶液的浓度，mol/L。
* 纵坐标为多糖的得率。
从图可以看出，随着碱浓度的升高，多糖的提取得率也升高，当碱浓度达到
1.0mol/L时提取得率基本上达到最高，如果碱浓度继续升高，多糖提取率反而会降
低，这是因为多糖在高浓度的碱溶液中降解比较严重，使得还原糖增加而多糖得率
降低。
4. 结论
综合可知，香菇多糖工业上常用的三种提取方法中，碱法提取的效果最好。本
实验最终利用氢氧化钠提取出香菇多糖的成品。
5. 香菇多糖粗成品的提取
1. 实验操作流程：
1) 准确称取20.0g 粉碎的干香菇。
2) 加入140mL 的1mol/L的氢氧化钠溶液，在65℃的水浴锅中提取2h 。
3) 然后分离出第一次的提取液，在加入140mL 的1mol/L的氢氧化钠溶液，在65℃
的水浴锅中再次提取2h 。
4) 合并两次提取液，3000rpm 离心10min ，将提取液的体积浓缩一倍。
5) 由于提取液的颜色较深，所以需要脱色，本实验中采用的是碳粉脱色。
6) 除蛋白质利用 Sevag法 Sevag 法是利用有机溶剂使蛋白质沉淀而分离蛋白。蛋白质在氯仿等有机溶
剂中变性的特点，用氯仿:戊醇为5:1或4:l 的二元溶剂体系与粗多糖混合，剧烈
振摇20~30min，蛋白质与氯仿一戊醇体系生成凝胶物而分离，分区水层和溶剂层
交界处变形蛋白质即得到较高纯度的多糖。此法在避免多糖降解方面有较好的效
果，但效果低。
7）沉淀 在提取液中加入3倍体积的乙醇搅拌。
8）干燥 即可得到香菇多糖的粗成品
香菇多糖提取方法的优化
2. 实验所得的粗成品
图片：
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致谢
本论文是在指导老师momo 教授的悉心关怀和精心指导下完成的。从论文的选题、实验设计到论文的定稿全过程都渗透着导师辛勤的汗水。马老师严谨的治学态度和诲人不倦的精神令我终身受益，对学生负责的态度是很值得肯定的。因此，在论文完成之际，我要对我的老师致以最崇高的敬意和最真挚的感谢。
在本课题的研究过程中，生命科学学院的momo 老师，momo 老师，momo 老师在实验仪器和试剂方面提供了诸多便利条件，同时也给了我多方面的关心指导，才让我的实验得以顺利的完成, 对此表示衷心地感谢。
最后感谢我的同学，他们在我的实验过程中，给我热心的帮助，细心的指导，以及我们共同的探讨，让我的实验得以顺利的完成，在此致以最诚挚的谢意。
学生：
2013年6月4日
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